ES2237377T3 - Deteccion especifica de especies de acidos nucleicos mediante un elemento de analisis. - Google Patents
Deteccion especifica de especies de acidos nucleicos mediante un elemento de analisis.Info
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Abstract
Procedimiento para la detección de ácidos nucleicos sobre un elemento de análisis, que contiene una zona de aplicación de la muestra y una zona de detección, en donde el elemento de análisis hace posible un transporte del líquido desde la zona de aplicación de la muestra hasta la zona de detección, el cual comprende los pasos: - aplicación de la muestra que contiene los ácidos nucleicos que hay que detectar, sobre la zona de aplicación de la muestra, - detecciones de los ácidos nucleicos en la zona de detección mediante hibridación con una sonda de detección, caracterizado porque, los ácidos nucleicos que hay que detectar se desnaturalizan solamente después de la aplicación sobre el elemento de análisis.
Description
Detección específica de especies de ácidos
nucleicos mediante un elemento de análisis.
La presente invención se refiere a un
procedimiento para la detección de ácidos nucleicos sobre un
elemento de análisis el cual tiene una zona de aplicación de la
muestra y una zona de detección, de forma que el elemento de
análisis hace posible el transporte de líquido desde la zona de
aplicación de la muestra a la zona de detección, de manera que se
añade una muestra sobre la zona de aplicación de muestras del
elemento de análisis y los ácidos nucleicos contenidos en la
muestra, pueden ser detectados en la zona de detección mediante
hibridación cualitativamente, pero también cuantitativamente, de
preferencia mediante grupos marcadores. Además, se han desarrollado
nuevos elementos de análisis y kits de reactivos para la detección
de ácidos nucleicos.
La detección habitual de ácidos nucleicos por
ejemplo, en los productos de amplificación de una PCR, en el marco
de aplicaciones diagnósticas, se efectúa mediante la hibridación
específica de los ácidos nucleicos que van a detectarse con una
sonda de detección, habitualmente un oligonucleótido, y una reacción
de detección no radiactiva sobre grupos marcadores que pueden estar
presentes en los ácidos nucleicos que hay que detectar o/y en las
sondas de detección. Para esta reacción de detección existen
diferentes variantes del procedimiento. Así p. ej., puede tener
lugar un hibridación directa de los ácidos nucleicos que hay que
detectar, con una sonda de detección inmovilizada en una fase
sólida, por ejemplo en una placa de microtitulación (Kit de
detección Amplicor, Roche Diagnostics,
EP-A-0 420 260). Además, el ácido
nucleico que va a detectarse puede hibridarse previamente con una
sonda de detección marcada, y el complejo que se forma puede ser
capturado en una fase sólida, por ejemplo, en una placa de
microtitulación (Kit de detección PCR, Roche Diagnostics).
En las técnicas de los
Southern-Blot o respectivamente
Northern-Blot convencionales (ver p. ej., Cerda
et al., FEBS Letters 431 (1998), 12-18;
Doerner et al., FEBS Letters 414 (1997),
258-262) tiene lugar primero una separación de los
ácidos nucleicos mediante una electroforesis sobre gel. Después de
la desnaturalización se transfieren los ácidos nucleicos sobre una
membrana de nylon, allí se fijan y se detectan mediante hibridación
con sondas de hibridación marcadas, en particular con sondas de
hibridación marcadas radiactivamente.
El empleo de tiras de análisis en los
procedimientos de diagnóstico es conocido desde hace tiempo. Así p.
ej., la detección de analitos con tiras de análisis, se describe en
las patentes EP-B-O 186 799,
EP-B-O 262 328 y
EP-A-O 926 498, que principalmente
se refieren a formatos de análisis ejecutados inmunológicamente.
Jou et al. (Human Mutation 5 (1995),
86-93) describen un procedimiento para la detección
de ácidos nucleicos sobre tiras de análisis cromatográficas, en
donde se introducen grupos haptenos en los ácidos nucleicos que hay
que detectar, de manera que es posible una inmovilización
inmunológica de los ácidos nucleicos sobre las tiras de análisis
mediante los anticuerpos antihaptenos. La captura de los ácidos
nucleicos que hay que detectar, mediante la hibridación específica
en sondas de detección inmovilizadas sobre tiras de análisis está
descrita por ejemplo en las patentes US 5.310.650,
EP-B-0 612 354 y en Reinhartz et
al. (Gene 136 (1993), 221-226) y Rule et
al., (Clin. Chem. 42 (1996), 1206-1209).
Los procedimientos antes citados, en los cuales
se describe la detección de ácidos nucleicos aplicados sobre tiras
de análisis, presentan sin embargo una serie de desventajas. Así p.
ej., debido a la inmovilización de los ácidos nucleicos sobre los
complejos sandwich, disminuye la sensibilidad. Un aumento de la
sensibilidad por ejemplo mediante el aumento del volumen de
detección tiene sus límites debido a la limitada incorporación de
grupos marcadores en los ácidos nucleicos.
Con los citados procedimientos sin embargo, los
ácidos nucleicos no pueden detectarse de forma inmediata. En un paso
previo se forma en primer lugar el complejo entre el ácido nucleico
diana y la sonda de hibridación. Para ello se desnaturaliza el
ácido nucleico diana (térmicamente o por adición de una solución
alcalina), en caso necesario se neutraliza, se añade la sonda y se
ajustan las condiciones de hibridación. Unicamente efectuando este
procesado previo puede tener lugar la propia detección sobre el
soporte de análisis. Dado que este procesado previo está conectado
con adiciones dosificadas de reactivos y el empleo de aparatos, p.
ej., dispositivos para atemperar, las ventajas esenciales de los
procedimientos basados en tiras de análisis, como p. ej., una más
pequeña necesidad de aparatos, un fácil manejo, pocos pasos de
trabajo y la fácil ejecución del procedimiento, no pueden ser
aprovechados por personas no adiestradas. Además, en estos pasos
previos se corren riesgos de contaminación, lo cual en la detección
de ácidos nucleicos amplificados puede conducir a resultados
falsamente posi-
tivos.
tivos.
También en procedimientos que permiten una
directa hibridación de los ácidos nucleicos que hay que detectar, a
la sonda de hibridación sobre el elemento de análisis, no se conoce
en el estado actual de la técnica, ningún procedimiento sensible de
detección, que renuncie a un procesado previo de los ácidos
nucleicos que hay que detectar, de forma que tampoco en este
procedimiento el ácido nucleico puede ser detectado directamente o
respectivamente no puede ser detectado directamente después de un
proceso de amplificación. En este procedimiento el ácido nucleico
diana que por regla general se encuentra en forma de doble cadena,
se convierte para la hibridación en una estructura de una sola
cadena. Para ello se han descrito varios procedimientos. Así,
mediante un procedimiento de hibridación conocido en general, se
desnaturaliza completamente el ácido nucleico antes de ser aplicado
al elemento de análisis, p. ej., térmicamente o mediante la adición
de reactivos alcalinos. Además, se conocen también procedimientos
enzimáticos que permiten la digestión selectiva de una cadena del
ácido nucleico diana (Rule et al. Clinical Chemistry
("Química clínica"), 42, p. 1206-1209
(1996)).
Se puede renunciar a un procesado previo
únicamente cuando los ácidos nucleicos diana ya están presentes
completamente en forma monocatenaria. Así se producen normalmente
dificultades en la detección de ácidos nucleicos diana ribosómicos,
porque estos ácidos nucleicos de una sola cadena se encuentran en su
estructura nativa secundaria en grandes regiones en forma de doble
cadena (por ejemplo ARNr). Una teórica alternativa son los procesos
de amplificación que permiten una síntesis selectiva solamente de
una cadena de ácido nucleico. Un ejemplo de ello es la PCR
asimétrica. Puesto que este procedimiento debido a su amplificación
lineal es claramente ineficiente como procedimiento de PCR
convencional, la sensibilidad está claramente limitada y en el caso
de la detección de analitos que están sólo en poca cantidad, es
insuficiente. Por ello existen en el estado actual de la técnica,
conocidos procedimientos que permiten una directa hibridación de
los ácidos nucleicos que hay que detectar, sobre un elemento de
análisis, las mismas desventajas que se pueden comprobar en
procedimientos indirectos de detección.
Una ventaja esencial de la invención consiste en
que no es necesario el procesado previo antes descrito de los
ácidos nucleicos que hay que detectar, de manera que los ácidos
nucleicos pueden ser procesados directamente o respectivamente en
conexión con un proceso de amplificación sobre un elemento de
análisis. Los reactivos que se encuentran sobre el elemento de
análisis de preferencia impregnados, permiten una completa, o
respectivamente parcial desnaturalización de los ácidos nucleicos
diana sobre el elemento de análisis, de forma que también es
posible una hibridación de la conformación de doble cadena de los
ácidos nucleicos aplicados. Para ello existen varias posibilidades,
según la invención. Así pueden introducirse en el soporte de
análisis, reactivos desnaturalizados en una concentración adecuada
y de preferencia en forma seca, para producir una completa
desnaturalización de los ácidos nucleicos. El ácido nucleico diana
puede aplicarse en forma líquida, por ejemplo, como está presente
en la solución de reacción de la PCR, sobre el elemento de
análisis. Después de mezclar los reactivos, el ácido nucleico diana
se desnaturaliza completamente. Puesto que con estas condiciones no
puede tener lugar una hibridación en los oligonucleótidos de la
sonda, hay que modificar correspondientemente el medio químico en
el que se efectúa el transporte cromatográfico preferido del
analito en el soporte de análisis. Esto puede suceder por un lado
mediante el correspondiente tampón de cromatografía o mediante los
reactivos colocados más adelante. Para ello se prefiere una
desnaturalización mediante una base, en particular NaOH, y la
consiguiente neutralización con un ácido. Alternativamente puede
ajustarse el medio químico de tal manera que la conformación en
forma de doble cadena del ácido nucleico diana se desestabiliza
(parcialmente desnaturalizado), y hace posible o respectivamente
apoya la hibridación en el oligonucleótido de la sonda. Una
modificación del medio químico durante la cromatografía no es
necesaria en esta variante del procedimiento. Los reactivos
preferidos para esta versión son las sales caotrópicas, siendo
especialmente preferido el tiocianato de guanidinio (GuSCN).
Para poder detectar los ácidos nucleicos
hibridados en el nucleótido de la sonda, es necesario además el
marcado del complejo. Los grupos marcadores pueden introducirse
tanto mediante una acción enzimática durante un procedimiento de
amplificación opcionalmente preconectado en el ácido nucleico diana
amplificado, o pueden unirse al ácido nucleico diana mediante
hibridación de otro oligonucleótido de sonda correspondientemente
marcado.
Sorprendentemente se comprobó que al emplear el
procedimiento descrito más arriba, los ácidos nucleicos diana que se
aplican en forma de doble cadena sobre el elemento de análisis, a
pesar del muy corto tiempo del que se dispone durante el transporte
cromatográfico del ácido nucleico diana sobre el elemento de
análisis, pueden ser muy efectivos en la hibridación del
oligonucleótido de la sonda y pueden detectarse con más alta
sensibilidad.
Un objeto de la invención es por ello un
procedimiento para la detección de ácidos nucleicos sobre un
elemento de análisis el cual contiene una zona de aplicación de la
muestra y una zona de detección, en donde el elemento de análisis
hace posible un transporte del líquido desde la zona de aplicación
de la muestra a la zona de detección, y comprende los pasos
siguientes:
- Aplicación de la muestra que contiene los
ácidos nucleicos que hay que detectar, sobre la zona de aplicación
de muestras,
- Detección de los ácidos nucleicos en la zona de
detección mediante hibridación con una sonda de detección,
caracterizado porque los ácidos nucleicos que hay
que detectar se desnaturalizan sobre el elemento de análisis.
Bajo el término "desnaturalización" debe
comprenderse aquí no solamente una desnaturalización completa en el
sentido clásico, sino que debe comprenderse también una
desnaturalización parcial, debido a la cual una doble cadena de
ácido nucleico se desestabiliza tanto que puede tener lugar una
hibridación con una sonda. No es tampoco necesaria una
descomposición de la doble cadena, aunque naturalmente esta versión
según la invención está también incluida.
Según la invención, tiene lugar una
desnaturalización de los ácidos nucleicos que hay que detectar
sobre el elemento de análisis, es decir, los ácidos nucleicos se
aplican sobre el elemento de análisis en forma no desnaturalizada,
de preferencia con las dos cadenas, y se ponen en contacto con el
reactivo de desnaturalización solamente después de su aplicación
sobre el elemento de análisis. El reactivo de desnaturalización
puede contener una base o/y una substancia caotrópica en una
cantidad suficiente para la desnaturalización de los ácidos
nucleicos que se encuentran en la muestra. Ejemplos preferidos para
las bases son los hidroxidos alcalinos, en particular el NaOH.
Ejemplos preferidos de substancias caotrópicas son los yoduros,
acetatos, percloratos, tiocianatos, trifluoracetatos,
tricloracetatos o/y compuestos de guanidinio. Es particularmente
preferido el tiocianato de guanidinio. Mediante el empleo de
substancias caotrópicas se consigue por un lado un efecto
desestabilizador de la doble cadena y una aceleración de la
hibridación entre los ácidos nucleicos que hay que detectar y la
sonda de detección. Otra importante función consiste en la
disminución del punto de fusión específico del ácido nucleico, que
permite una hibridación específica a temperatura ambiente.
Este efecto de las substancias caotrópicas para
la hibridación en soluciones, ya es conocido
(WO-A-87 06621, Thompson y
Gillespie, Anal. Biochem. 163 (1987), 281-291; Van
Ness und Chen, Nucleic Acid Res. 19 (1991),
5143-5151), se emplea en el marco de la presente
invención en primer lugar para la detección de ácidos nucleicos
mediante hibridación sobre el elemento de análisis. Una
transferencia de esta técnica sobre un elemento de análisis no se
ha producido para el experto de manera fácilmente comprensible en
el estado actual de la técnica, puesto que en este caso se
recomiendan como necesarios tiempos de hibridación de un orden de
magnitud de aproximadamente una hora. En los elementos de análisis
según la invención, la investigación de la aplicación de la muestra
hasta la detección se concluye en menos de 10 minutos. La
hibridación con la sonda de detección se efectúa durante el
transporte cromatográfico de la muestra sobre la zona de detección
de forma que el contacto entre la sonda y la muestra tiene lugar
solamente durante pocos segundos, en cualquier caso sin embargo, en
menos de 1 minuto.
Es esencial para el elemento de análisis según la
invención, que el líquido aplicado sobre el elemento de análisis
pueda moverse desde la zona de aplicación de la muestra en
dirección a la zona de detección. Esta corriente líquida es posible
por ejemplo en un cuerpo hueco correspondientemente adaptado
aprovechando la fuerza de la gravedad. Los dispositivos, que hacen
posible un transporte líquido mediante la fuerza centrífuga como
una forma de fuerza de gravedad, son conocidos por ejemplo a partir
de la patente EP-B-0 052 769. De
preferencia, los elementos de análisis según la invención contienen
materiales absorbentes que hacen que el líquido se mueva por
capilaridad. Los materiales de las zonas individuales del elemento
de análisis según la invención pueden ser iguales o diferentes. A
menudo ocurre que las zonas diferentes están constituidas también
por materiales diferentes, cuando éstas han de cumplir de forma
óptima su cometido.
Como posibles materiales absorbentes capilares,
entran fundamentalmente en cuestión aquellos que pueden ser
empleados en general para la absorción de líquidos en los llamados
"ensayos secos" como están descritos por ejemplo en las
patentes US-A-4.861.711,
US-A-5.591.645 ó
EP-A-0 291 194. Se han acreditado
como ventajosos por ejemplo materiales porosos como las membranas,
por ejemplo membranas de nitrocelulosa. Sin embargo pueden
emplearse también materiales matriz a base de fibras, absorbentes,
como napas, tejidos, o géneros de punto. Las napas son
particularmente preferidas. Los materiales matriz a base de fibras
pueden contener vidrio, celulosa, derivados de celulosa, poliéster,
poliamida, pero también viscosa, viscosilla o/y alcohol
polivinílico. Las napas de fibras a base de celulosa, fibras de
polimerizados a base de poliéster y/o poliamida y un aglutinante
orgánico que tiene grupos OH y/o grupos éster, como se describen en
la patente EP-B-O 326 135, pueden
por ejemplo emplearse según la invención. Los materiales de napa,
que contienen fibras de copoliésteres fundibles, fibras de celulosa
o fibras de derivados de celulosa, como están descritas en la
solicitud de patente europea 0 571 941, pueden también emplearse en
el elemento de análisis según la invención. Papeles como por
ejemplo papel para bolsas de té, pueden también emplearse.
Para mejorar la manipulación del elemento de
análisis según la invención, el material absorbente capilar se puede
encontrar, o diferentes materiales absorbentes capilares pueden
encontrarse colocados sobre un material de soporte rígido, que por
su parte no es permeable para el líquido pero no influye
negativamente en el flujo de líquido en el material de la matriz, y
se mantiene inerte con respecto a las reacciones que tienen lugar
en el elemento de análisis. Un material de soporte preferido pueden
ser por ejemplo folios de poliéster, sobre los cuales está fijado
el material de la matriz que permite el transporte de líquido.
En el elemento de análisis según la invención,
las zonas individuales pueden estar colocadas sobre el material de
transporte unas encima de otras, unas al lado de otras, o en parte
unas encima de otras y en parte unas al lado de otras. Es
particularmente preferido un elemento de análisis según la
invención en el que la zona de aplicación de la muestra y la zona
de detección se encuentran una al lado de la otra sobre el material
de soporte. Una al lado de la otra significa en este contexto que
estas zonas están colocadas en contacto directo entre sí, o que
están separadas mediante otras zonas, esencialmente todas ellas
situadas en un mismo plano.
La zona de aplicación de la muestra es la zona
del elemento de análisis según la invención, sobre la cual se aplica
la muestra. La zona de detección es la zona del elemento de
análisis según la invención, en la cual tiene lugar la
determinación, tanto si en la muestra añadida sobre el elemento de
análisis está presente el analito investigado o respectivamente la
substancia derivada del analito representativa del mismo. Esta
determinación puede ser cualitativa, semicuantitativa o
cuantitativa. Semicuantitativa significa a este respecto, que para
el analito o respectivamente para la substancia derivada y
representativa del mismo, no se determina ningún valor en concreto
de la concentración sino que se determina un margen de
concentraciones en el cual se encuentra la concentración del
analito.
En una primera versión de la invención, el
elemento de análisis se impregna con el reactivo de
desnaturalización antes de la aplicación de la muestra. El reactivo
de desnaturalización puede encontrarse en forma líquida o seca sobre
el elemento de análisis, o de preferencia sobre la zona de
aplicación de la muestra. De particular preferencia, el reactivo de
desnaturalización se encuentra en forma seca. En otra versión el
elemento de análisis puede impregnarse únicamente después de la
aplicación de la muestra con el reactivo de desnaturalización.
Debido al contacto de los ácidos nucleicos existentes en la muestra
que hay que detectar, con el reactivo de desnaturalización, tiene
lugar una desnaturalización de las dobles cadenas de los ácidos
nucleicos, con lo cual es posible la hibridación de los ácidos
nucleicos monocatenarios resultantes con la sonda de detección.
Cuando el reactivo de desnaturalización contenga una base, puede ser
conveniente en determinadas circunstancias que el elemento de
análisis, entre la zona de aplicación de la muestra y la zona de
detección, contenga un reactivo de neutralización por contacto con
los líquidos, p. ej., una sal de reacción ácida, p. ej., un
hidrógenofosfato o un hidrógenosulfato, de preferencia en forma
seca.
La sonda de detección empleada para unirse a los
ácidos nucleicos que hay que detectar presentes en la muestra, es de
preferencia un oligonucleótido, el cual contiene una secuencia lo
suficientemente complementaria para los ácidos nucleicos que hay
que detectar, para que sea posible una hibridación en las
condiciones del ensayo. De preferencia la sonda de detección es un
oligodesoxirribonucleótido, aunque pueden utilizarse también
análogos de ácidos nucleicos con unidades constructivas modificadas
de nucleótidos o ácidos nucleicos peptídicos como sondas de
detección. La sonda de detección se encuentra de preferencia en la
zona de detección en forma inmovilizada, es decir, esencialmente no
se eluye en las condiciones del ensayo de la zona de detección. La
inmovilización puede tener lugar mediante aplicación de la sonda de
detección y subsiguiente fijación mediante métodos adecuados p.
ej., mediante elevación de la temperatura, irradiación con rayos,
etc. Alternativamente, la sonda puede ser inmovilizada mediante
acciones recíprocas altamente afines, p. ej.,
biotina/estreptavidina o respectivamente avidina, ó
hapteno/anticuerpo antihapteno. azúcar/lectina, en la zona de
detección. La preparación correspondientemente modificada, p. ej.,
sondas de detección biotiniladas es corriente para el experto y no
es necesario describirla aquí con más detalle. Alternativamente, la
hibridación entre los ácidos nucleicos que hay que detectar y la
sonda de detección puede tener lugar también más arriba de la zona
de detección y el complejo de hibridación puede ser fijado
selectivamente, p. ej., mediante acciones recíprocas altamente
afines como se ha descrito anteriormente, en el transporte a través
del elemento de análisis hacia la zona de detección.
La detección de los ácidos nucleicos tiene lugar
de preferencia mediante grupos marcadores, entre los cuales son
adecuados fundamentalmente todos los grupos marcadores conocidos en
el estado actual de la técnica. Se prefieren los grupos marcadores
que pueden reconocerse visualmente como p. ej., los marcadores a
base de enzimas, en particular marcadores particulares como
partículas de oro o partículas de látex. El marcador puede ser
localizado directamente sobre los ácidos nucleicos que hay que
detectar (marcado directo) y puede también estar unido
indirectamente p. ej., mediante acciones recíprocas altamente
afines como se ha descrito anteriormente, por ejemplo, mediante
hapteno/anticuerpo antihapteno, a los ácidos nucleicos (marcado
indirecto). La unión de grupos marcadores indirectos con los ácidos
nucleicos que hay que detectar puede efectuarse durante la
hibridación o sólo después de un paso de lavado.
Mediante la presente invención se da a conocer un
procedimiento sencillo para la detección de ácidos nucleicos sobre
tiras de ensayo. Respecto a los ácidos nucleicos que hay que
detectar, se trata de preferencia de productos de amplificación, p.
ej., productos de amplificación generados mediante una PCR. Con
ello, los productos de amplificación pueden aplicarse
inmediatamente mediante el empleo de la misma solución tampón en la
que había sido realizada la reacción de amplificación, como eluyente
cromatográfico sobre las tiras de ensayo.
Otro objeto de la invención es un elemento de
análisis para la detección de ácidos nucleicos, el cual contiene
una zona de aplicación de la muestra y una zona de detección, en
donde el elemento de análisis hace posible el transporte del líquido
desde la zona de aplicación de la muestra hasta la zona de
detección, la cual está impregnada con un reactivo de
desnaturalización para los ácidos nucleicos, en donde el reactivo de
desnaturalización está presente de preferencia en forma seca. El
elemento de análisis puede contener un material absorbente, el cual
hace posible un transporte cromatográfico, y de preferencia toma la
forma de tiras de ensayo. En la zona de detección del elemento de
análisis existe de preferencia una sonda de detección complementaria
de los ácidos nucleicos que hay que detectar en forma
inmovilizada.
Finalmente la invención se refiere a un kit para
la detección de ácidos nucleicos que comprende un elemento de
análisis según la invención y otros reactivos necesarios para la
detección de los ácidos nucleicos, p. ej., reactivos marcadores,
tampones, etc.
Los procedimientos, elementos de análisis y kits
de reactivos proporcionados por la presente invención son
particularmente apropiados para la detección de productos de la
amplificación de ácidos nucleicos, p. ej., para la detección de la
presencia o de la cantidad de organismos o partes de organismos
seleccionados, p. ej., células en una muestra. Para ello puede
efectuarse por ejemplo una detección específica del género y especie
de ácidos nucleicos en una muestra, p. ej., mediante amplificación
del ARN ribosómico o de una secuencia de ADN que lo codifica de
organismos o células presentes en una muestra. El procedimiento
puede emplearse para la detección de microorganismos, p. ej., de
microorganismos o virus patógenos en muestras clínicas, alimentos,
muestras de aguas, etc. Además, el procedimiento puede emplearse
también en análisis forenses para la detección de individuos
específicos. En los ejemplos siguientes se muestra la detección de
los ácidos nucleicos procedentes de la Chlamydia trachomatis
mediante el procedimiento según la invención.
La figura 1 describe la construcción esquemática
de una tira de ensayo según la invención, con una zona de aplicación
para la muestra (1) la cual está formada de una napa absorbente,
una zona de transporte del líquido (2) en la que se encuentra una
zona de detección (4) y una zona de absorción (3) la cual está
formada igualmente de napa absorbente.
La figura 2 muestra una comparación entre la
sensibilidad del procedimiento según la invención (B) y el
procedimiento descrito en la patente
EP-A-O 926 498 (A).
La figura 3 muestra la sensibilidad de un
elemento de análisis en función de la concentración de tiocianato de
guanidinio (GuSCN.
La napa absorbente (1) del elemento de análisis
mostrado en la figura 1 se impregnó con tampón de impregnación (10
mM de KPO_{4} pH 7,5, 100 mM de NaCl, 2 ó 2,5 M de tiocianato de
guanidinio (GuSCN), 0,5% de Triton-X100, 25 mM de
NaOH, 2% de RPLA tipo 4 (Roche Diagnostics, cat. nº
1726544-106) y 3 mg/ml de ADN de esperma de arenque.
Para ello, la napa absorbente se mojó completamente en una cápsula
de Petri con tampón de impregnación y se secó durante 3 horas a
45ºC en corriente de aire.
Como zona de transporte de líquido (2) se empleó
una membrana de nitrocelulosa de 15 mm. Para la preparación de la
zona de detección (4) se aplicaron sondas de detección de
oligonucleótidos (40 pmoles por tira de ensayo) sobre la membrana.
Se aplicó una solución de oligonucleótidos (200 \muM) en forma de
una pincelada de detección sobre un dispensador automático
(Hamilton Microlab N) y los oligonucleótidos se fijaron sobre la
membrana a 80ºC durante 30 minutos. Alternativamente, se aplicaron
oligonucleótidos marcados con biotina sobre una zona de detección
previamente recubierta con poliestreptavidina (4). Para ello se
añadió una solución de oligonucleótidos (8 pmoles/tira de ensayo)
sobre la membrana de nitrocelulosa y con 10 \mul de tampón
estándar de cromatografía se cromatografió sobre la zona de
detección previamente recubierta de poliestreptavidina.
Como sonda de detección se utilizó un
oligonucleótido con la secuencia 5'-GTC TCT CAT CGA
GAC AAA GTG-3' del plásmido Chlamydia
trachomatis pCTT1 (Bases de la C. trachomatis
1-7496) posición correspondiente
354-374 de pCTT1 (Sriprakash y Macavoy, Plasmid 18
(1987), 205-214).
Como cebadores para la amplificación se
utilizaron los oligonucleótidos CP24
5'-GGGATTCCTGTAACAACAAGTCAGG-3'
(posición 195-219 de pCTT1) y CP27:
5'-CCTCTTCCCCAGAACAATAAGAACAC-3'
(posición 401-376 de pCTT1) eventualmente en la
forma 5'-biotinilada ó
5'-digoxigenilada.
El volumen de reacción fue de 100 \mul (4 mM de
NgCl_{2}, en cada caso 0,1 mM de dNTP, en cada caso 300 nM del
cebador CP24 y CP27, 2,5 U de Taq-polimerasa, 2 U
de UNG (uracilo-ADN-glicosilasa, y
matrices en tampón de PCR (catálogo de Roche Diagnostics nº
1600753).
La reacción se efectuó como sigue:
- -
- 10 minutos a 37ºC, 5 minutos a 95ºC, 1 minuto a 60ºC
- -
- 34 ciclos con 30 segundos cada vez a 95ºC, y 60 segundos a 60ºC
- -
- 10 minutos a 72ºC
- -
- mantener a 50ºC.
La reacción PCR se efectuó con diferentes
cantidades de matriz (0 a 100 000 copias de plásmidos) por
mezcla.
Se aplicaron 50 \mul del producto amplificado
(ejemplo 2) a la napa absorbente de la tira de ensayo y se
cromatografiaron durante 4 minutos. A continuación se añadieron 30
\mul de tampón estándar de cromatografía (0,15 M de NaCl, 9,6 mM
de KH_{2}PO_{4}, 40,5 mM de K_{2}HPO_{4}, 0,25% de Tween
20, 2% de RPLA tipo 4, 0,09% de azida de sodio) y se
cromatografiaron durante 4 minutos. A continuación se añadieron 20
\mul de solución conjugada de anticuerpo de antidigoxigeninaoro
(2,1 pmoles) y se cromatografió durante 4 minutos. A continuación
se añadieron 2 veces 50 \mul de tampón estándar de cromatografía
cada vez y se cromatografió durante 4 minutos.
Los resultados de este ensayo están representados
en la figura 2. La figura 2A muestra el resultado con una tira de
ensayo según la patente EP-A-0 926
489 en la cual la detección de ácidos nucleicos tiene lugar
mediante métodos inmunológicos mediante un formato sandwich. La
figura 2B muestra el resultado de un procedimiento de detección
según la invención con una tira de ensayo según el ejemplo 1.
Mientras que en la tira de ensayo según la figura 2A, se encontró
una pequeña sensibilidad (detección sólo a partir de > 1000
copias de plásmido por mezcla), en el procedimiento según la
invención ya es posible una detección en un considerablemente
pequeño número de copias del plásmido (50). En general. se da una
detección positiva en el caso de \Delta Rem-% \geq 3. Junto a
una sensibilidad más alta, el procedimiento según la invención
muestra también un margen dinámico esencialmente mayor, es decir una
clara modificación de la señal mediante un gran margen de
concentración de los ácidos nucleicos que hay que detectar.
Se prepararon elementos de análisis según la
figura 1.1 con la excepción de que el tampón de impregnación de la
napa absorbente no contenía NaOH. Se analizaron las concentraciones
de guanidinio de 0,5 M, 1,5 M y 2,5 M (próximas al límite de la
saturación).
Sobre el elemento de análisis se aplicó cada vez
50 \mul de producto amplificado de PCR (100 plásmidos por
mezcla), que había sido obtenido de acuerdo con el ejemplo 1.2. La
detección se efectuó correspondientemente al ejemplo 1.3.
Los resultados están representados en la figura
3. De los mismas se deduce que la adición de tiocianato de
guanidinio mejora significativamente la sensibilidad de la
detección.
Claims (23)
1. Procedimiento para la detección de ácidos
nucleicos sobre un elemento de análisis, que contiene una zona de
aplicación de la muestra y una zona de detección, en donde el
elemento de análisis hace posible un transporte del líquido desde la
zona de aplicación de la muestra hasta la zona de detección, el cual
comprende los pasos:
- aplicación de la muestra que contiene los
ácidos nucleicos que hay que detectar, sobre la zona de aplicación
de la muestra,
- detecciones de los ácidos nucleicos en la zona
de detección mediante hibridación con una sonda de detección,
caracterizado porque,
los ácidos nucleicos que hay que detectar se
desnaturalizan solamente después de la aplicación sobre el elemento
de análisis.
2. Procedimiento según la reivindicación 1,
caracterizado porque,
los ácidos nucleicos se desnaturalizan por
contacto con un agente desnaturalizante que contiene una base o/y
una substancia caotrópica.
3. Procedimiento según la reivindicación 2,
caracterizado porque,
la base se escoge entre los hidróxidos alcalinos,
en particular el NaOH.
4. Procedimiento según la reivindicación 2,
caracterizado porque,
la substancia caotrópica se escoge entre los
yoduros, acetatos, percloratos, tiocianatos, trifluoracetatos,
tricloracetatos o/y compuestos de guanidinio.
5. Procedimiento según la reivindicación 4,
caracterizado porque,
la substancia caotrópica es el tiocianato de
guanidinio.
6. Procedimiento según una de las
reivindicaciones precedentes,
caracterizado porque,
el elemento de análisis contiene un material
absorbente que hace posible un transporte cromatográfico.
7. Procedimiento según una de las
reivindicaciones 1 a 6,
caracterizado porque,
el elemento de análisis se impregna con el agente
desnaturalizante antes de la aplicación de la muestra.
8. Procedimiento según la reivindicación 7,
caracterizado porque,
el agente desnaturalizante está presente sobre el
elemento de análisis en forma seca.
9. Procedimiento según la reivindicación 7 u
8,
caracterizado porque,
la zona de aplicación de la muestra está
previamente impregnada con el agente desnaturalizante.
\newpage
10. Procedimiento según una de las
reivindicaciones 1 a 6,
caracterizado porque,
el elemento de análisis se impregna con el agente
desnaturalizante después de la aplicación de la muestra.
11. Procedimiento según una de las
reivindicaciones precedentes,
caracterizado porque,
el elemento de análisis entre la zona de
aplicación de la muestra y la zona de detección, contiene un
reactivo de neutralización.
12. Procedimiento según una de las
reivindicaciones precedentes,
caracterizado porque,
los ácidos nucleicos que hay que detectar son
productos procedentes de una amplificación.
13. Procedimiento según una de las
reivindicaciones precedentes,
caracterizado porque,
la sonda de detección está en la zona de
detección en forma inmovilizada.
14. Procedimiento según una de las
reivindicaciones precedentes,
caracterizado porque,
la detección de los ácidos nucleicos se efectúa
mediante grupos marcadores.
15. Procedimiento según la reivindicación 14,
caracterizado porque,
se emplean grupos marcadores indirectos.
16. Elemento de análisis para la detección de
ácidos nucleicos, el cual contiene una zona de aplicación de la
muestra y una zona de detección, en donde el elemento de análisis
hace posible un transporte del líquido por dentro del elemento de
análisis desde la zona de aplicación de la muestra en dirección a la
zona de detección,
caracterizado porque,
está impregnado con un reactivo de
desnaturalización para ácidos nucleicos, y los ácidos nucleicos que
hay que detectar sobre el elemento de análisis se desnaturalizan
con ayuda de este reactivo de desnaturalización.
17. Elemento de análisis según la reivindicación
16,
caracterizado porque,
el reactivo de desnaturalización está presente en
forma seca.
18. Elemento de análisis según la reivindicación
16 ó 17,
caracterizado porque,
contiene un material absorbente, el cual hace
posible un transporte cromatográfico.
19. Elemento de análisis según una de las
reivindicaciones 16 a 18,
caracterizado porque,
está formado por una tira de ensayo.
20. Elemento de análisis según una de las
reivindicaciones 16 a 19,
caracterizado porque,
contiene en la zona de detección una sonda de
detección en forma inmovilizada, complementaria de los ácidos
nucleicos que hay que detectar.
21. Kit de detección de ácidos nucleicos que
comprende
(a) un elemento de análisis según una de las
reivindicaciones 16 a 20, y
(b) otros reactivos necesarios para la detección
de los ácidos nucleicos.
22. Empleo del elemento de análisis según una de
las reivindicaciones 16 a 20, ó del kit según la reivindicación 21,
para la detección de productos de amplificación de los ácidos
nucleicos.
23. Empleo según la reivindicación 22, para la
detección de la presencia o cantidad de organismos o partes de
organismos escogidos en una muestra.
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