ES2286276T3 - Sistema analitico de tira de ensayo y metodo para la deteccion de secuencias de acido nucleico especificas. - Google Patents
Sistema analitico de tira de ensayo y metodo para la deteccion de secuencias de acido nucleico especificas. Download PDFInfo
- Publication number
- ES2286276T3 ES2286276T3 ES02765125T ES02765125T ES2286276T3 ES 2286276 T3 ES2286276 T3 ES 2286276T3 ES 02765125 T ES02765125 T ES 02765125T ES 02765125 T ES02765125 T ES 02765125T ES 2286276 T3 ES2286276 T3 ES 2286276T3
- Authority
- ES
- Spain
- Prior art keywords
- test strip
- area
- oligonucleotide
- nucleic acid
- analytical
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 title claims abstract description 38
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 title claims description 45
- 238000001514 detection method Methods 0.000 title claims description 35
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 27
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims abstract description 101
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 claims abstract description 48
- 239000002245 particle Substances 0.000 claims abstract description 40
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 35
- 238000011161 development Methods 0.000 claims abstract description 29
- 238000007654 immersion Methods 0.000 claims abstract description 27
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims abstract description 22
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims abstract description 21
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims abstract description 21
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims abstract description 21
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims abstract description 19
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims abstract description 19
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims abstract description 14
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 claims abstract description 13
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims abstract description 12
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims abstract description 8
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 6
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims abstract description 5
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 claims abstract 2
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 claims description 41
- RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N thymine Chemical compound CC1=CNC(=O)NC1=O RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 28
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 21
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims description 17
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 claims description 14
- 229940113082 thymine Drugs 0.000 claims description 14
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 claims description 12
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 claims description 12
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 8
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 claims description 7
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 claims description 7
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 claims description 7
- 239000011616 biotin Substances 0.000 claims description 7
- 239000010931 gold Substances 0.000 claims description 7
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 claims description 7
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 claims description 7
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 claims description 7
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N Adenine Chemical compound NC1=NC=NC2=C1N=CN2 GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 claims description 6
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims description 5
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims description 5
- 239000003599 detergent Substances 0.000 claims description 4
- 238000001035 drying Methods 0.000 claims description 4
- 239000002736 nonionic surfactant Substances 0.000 claims description 4
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 claims description 4
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 claims description 3
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 claims description 3
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 claims description 3
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 claims description 3
- 229930024421 Adenine Natural products 0.000 claims description 2
- 108020000946 Bacterial DNA Proteins 0.000 claims description 2
- 108020005202 Viral DNA Proteins 0.000 claims description 2
- 229960000643 adenine Drugs 0.000 claims description 2
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 claims description 2
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 claims 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 abstract description 4
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 54
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 33
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 29
- 239000000047 product Substances 0.000 description 28
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 22
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 20
- 239000013615 primer Substances 0.000 description 16
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 8
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 8
- 108010008286 DNA nucleotidylexotransferase Proteins 0.000 description 7
- 102100029764 DNA-directed DNA/RNA polymerase mu Human genes 0.000 description 7
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 6
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 6
- 108020005187 Oligonucleotide Probes Proteins 0.000 description 5
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 5
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 5
- 239000000463 material Substances 0.000 description 5
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 5
- 239000002751 oligonucleotide probe Substances 0.000 description 5
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 5
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 5
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 4
- 108010071390 Serum Albumin Proteins 0.000 description 4
- 102000007562 Serum Albumin Human genes 0.000 description 4
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 4
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 4
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 4
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 4
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 4
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 4
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 3
- 239000012491 analyte Substances 0.000 description 3
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 3
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 3
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 3
- SWGJCIMEBVHMTA-UHFFFAOYSA-K trisodium;6-oxido-4-sulfo-5-[(4-sulfonatonaphthalen-1-yl)diazenyl]naphthalene-2-sulfonate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].C1=CC=C2C(N=NC3=C4C(=CC(=CC4=CC=C3O)S([O-])(=O)=O)S([O-])(=O)=O)=CC=C(S([O-])(=O)=O)C2=C1 SWGJCIMEBVHMTA-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 3
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 2
- 229920000742 Cotton Polymers 0.000 description 2
- 241000701022 Cytomegalovirus Species 0.000 description 2
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108020004711 Nucleic Acid Probes Proteins 0.000 description 2
- OFOBLEOULBTSOW-UHFFFAOYSA-N Propanedioic acid Natural products OC(=O)CC(O)=O OFOBLEOULBTSOW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000002250 absorbent Substances 0.000 description 2
- 230000002745 absorbent Effects 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N dATP Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 2
- SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N dATP Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1CC(O)C(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 2
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 2
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 2
- VZCYOOQTPOCHFL-UPHRSURJSA-N maleic acid Chemical compound OC(=O)\C=C/C(O)=O VZCYOOQTPOCHFL-UPHRSURJSA-N 0.000 description 2
- 239000011976 maleic acid Substances 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000001823 molecular biology technique Methods 0.000 description 2
- 238000007857 nested PCR Methods 0.000 description 2
- 239000002853 nucleic acid probe Substances 0.000 description 2
- 229920000036 polyvinylpyrrolidone Polymers 0.000 description 2
- 235000013855 polyvinylpyrrolidone Nutrition 0.000 description 2
- 239000001267 polyvinylpyrrolidone Substances 0.000 description 2
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 2
- HJRIWDYVYNNCFY-UHFFFAOYSA-M potassium;dimethylarsinate Chemical compound [K+].C[As](C)([O-])=O HJRIWDYVYNNCFY-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 244000062645 predators Species 0.000 description 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 2
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 2
- VZCYOOQTPOCHFL-UHFFFAOYSA-N trans-butenedioic acid Natural products OC(=O)C=CC(O)=O VZCYOOQTPOCHFL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 description 1
- 208000035143 Bacterial infection Diseases 0.000 description 1
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 description 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- 229920001917 Ficoll Polymers 0.000 description 1
- 101000829171 Hypocrea virens (strain Gv29-8 / FGSC 10586) Effector TSP1 Proteins 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 239000004677 Nylon Substances 0.000 description 1
- 239000004695 Polyether sulfone Substances 0.000 description 1
- 206010060862 Prostate cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000000236 Prostatic Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 1
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 1
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 1
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 1
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- 239000013566 allergen Substances 0.000 description 1
- 208000022362 bacterial infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000000721 bacterilogical effect Effects 0.000 description 1
- 208000005980 beta thalassemia Diseases 0.000 description 1
- 239000003124 biologic agent Substances 0.000 description 1
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- 238000003935 denaturing gradient gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 229960000633 dextran sulfate Drugs 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 239000011152 fibreglass Substances 0.000 description 1
- 239000000383 hazardous chemical Substances 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 1
- 230000000155 isotopic effect Effects 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 239000004005 microsphere Substances 0.000 description 1
- 238000007479 molecular analysis Methods 0.000 description 1
- 125000000449 nitro group Chemical group [O-][N+](*)=O 0.000 description 1
- 229920001778 nylon Polymers 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 229920006393 polyether sulfone Polymers 0.000 description 1
- 238000009597 pregnancy test Methods 0.000 description 1
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 230000001869 rapid Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 238000007894 restriction fragment length polymorphism technique Methods 0.000 description 1
- 210000003296 saliva Anatomy 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 230000005582 sexual transmission Effects 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 1
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 1
- 108700012359 toxins Proteins 0.000 description 1
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 1
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6813—Hybridisation assays
- C12Q1/6834—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Un sistema analítico de tira de ensayo por inmersión para la determinación cualitativa y/o cuantitativa en una etapa de una secuencia de ácido nucleico específico (16, 19) en una muestra líquida, que comprende: A) una tira de ensayo (1), teniendo dicha tira de ensayo (1) cuatro áreas distintas: a) una primera área (2), que pone en contacto dicha muestra o solución de revelado de ensayo; b) una segunda área (3) sobre la que se seca la sustancia que produce la señal visible; c) una tercera área (6) para el desarrollo de la señal y seguimiento de la terminación del ensayo, que comprende una primera zona (8) que contiene estreptavidina inmovilizada y una segunda zona (9) que contiene un oligonucleótido inmovilizado; y d) una cuarta área (7) para retener el exceso de dicha muestra líquida; caracterizado porque dicha sustancia que produce la señal visible consiste en partículas de oro coloidal (14) conjugadas con un oligonucleótido (15) de una determinada longitud y que tieneuna secuencia nucleotídica definida y puede ser solubilizado por la muestra líquida o la disolución de desarrollo del ensayo; dicho oligonucleótido (12) inmovilizado en la segunda zona (9) de dicho tercer área (6) de la tira de ensayo (1) tiene una secuencia nucleotídica complementaria con la secuencia nucleotídica de dicho oligonucleótido (15) conjugado con dichas partículas de oro coloidal (14); y en el que dicho sistema analítico de tira de ensayo por inmersión comprende además: B) un reactivo distinto (17; 20, 21) consistente en uno o más oligonucleótidos que se hibridan de manera específica con dicho ácido nucleico y que proporciona a dicho ácido nucleico hibridado la capacidad para hibidarse simultáneamente con dicho oligonucleótido (15) que se conjuga con dichas partículas de oro coloidal (14) y para unirse a dicha estreptavidina inmovilizada de la primera zona (8) de dicha tercer área (6).
Description
Sistema analítico de tira de ensayo y método
para la detección de secuencias de ácido nucleico específicas.
La presente invención se refiere a un
dispositivo analítico, específicamente a un sistema analítico de
tira de ensayo por inmersión con reactivos secados, así como un
método analítico para la detección y/o determinación de secuencias
de ácidos nucleicos específicas de interés clínico mediante la
utilización de dicha tira de ensayo.
Más específicamente, la presente invención se
refiere a un sistema analítico de una etapa que es particularmente
útil para dispositivos de diagnóstico de análisis sensible y rápido:
un sistema analítico de tira de ensayo por inmersión con reactivos
secados, así como al desarrollo de análisis de hibridación en dicha
tira de ensayo por inmersión, con la que es posible detectar la
presencia o ausencia de una secuencia de ácidos nucleicos
específica en una muestra biológica, con gran facilidad y
rapidez.
Las tiras de ensayo por inmersión son sistemas
que consisten en diferentes tipos de materiales y reactivos,
secados o inmovilizados en estos materiales, soportados por una
película flexible de poliestireno, que se utiliza realmente como
base para la construcción del sistema. El sistema consiste en al
menos cuatro áreas distintas/perceptibles: a) el área o parte de la
tira de ensayo que se pone en contacto con la muestra o con la
solución de revelado de ensayo en la tira, b) el área o parte de la
tira de ensayo sobre la que se seca el reactivo que lleva la señal
visible o es responsable de la misma, c) el área o parte de la tira
de ensayo sobre la que se desarrolla la señal (área de la
membrana), d) el área o parte de la tira de ensayo con la misión de
retener el exceso de la muestra líquida o del líquido que contiene
el analito. En determinados casos, las áreas a) y b) o b) y c)
pueden no ser perceptibles. El sistema analítico de tira de ensayo
por inmersión de la presente invención consiste en las cuatro áreas
diferenciadas mencionadas anteriormente y lleva en el área b):
microesferas coloreadas y en el área c): reactivos inmovilizados en
dos zonas perceptibles (bandas o puntos) que indican la presencia o
ausencia del ácido nucleico detectado y que confirman la terminación
[así como la utilización correcta y buen estado de la tira de
ensayo por goteo] del análisis respectivamente.
La presencia o ausencia, y la determinación de
la cantidad de una secuencia específica de ácido nucleico da
respuestas de mayor importancia a las cuestiones investigadas por
microbiología, virología, genética e investigación biomédica en
general. La gran evolución de las técnicas de Biología Molecular y
las principales aplicaciones específicas de la Reacción en Cadena
de Polimerasa (PCR) impulsaron el desarrollo de muchas técnicas para
la detección y la determinación de los productos específicos de la
reacción PCR.
Las técnicas que comprenden la electroforesis en
gel de agarosa o poliacrilamida por ejemplo: SSCP, DGGE, RFLP son
muy sensibles pero adolecen de determinados inconvenientes tales
como la demanda de personal entrenado, duración total prolongada
del análisis y la utilización de reactivos dañinos o irritantes.
Se utilizan ampliamente técnicas que presentan
ventajas de hibridación de ADN/ADN, ARN/ARN o ARN/ADN para la
detección de secuencias específicas de ácidos nucleicos. La
sustitución de las sondas radiomarcadas utilizadas en un principio
por sondas no isotópicas para la detección de híbridos ha conducido
a la superación de los inconvenientes anteriores tales como la
utilización de reactivos radiomarcados dañinos con duración
limitada, sin obligación con respecto a la sensibilidad o
especificidad del análisis. Las técnicas del tipo anterior que
comprenden la inmovilización de oligonucleótidos en soportes
sólidos, tales como membranas de nilón o nitrocelulosa (conocidas
como transferencia de manchas y transferencia inversa de manchas)
son sensibles y robustas, pero no son satisfactorias con respecto a
la velocidad y facilidad del análisis. Las técnicas de hibridación
que comprenden la inmovilización directa o indirecta de
oligonucleótidos para placas de microvaloración de ELISA de
poliestireno presentan todas las ventajas mencionadas anteriormente
de sensibilidad, especificidad y robustez, con adición de la
susceptibilidad a la automatización y capacidad de análisis
simultáneo de muchas muestras, pero adolecen del inconveniente de
ser heterogéneas lo que significa realmente que el análisis requiere
múltiples etapas.
La duración total del análisis se compara con la
de la técnica de transferencia de manchas y de transferencia de
manchas inversa.
La utilización de los sistemas analíticos
rápidos de una etapa (ensayos con varilla indicadora o de flujo
lateral) durante la década de los 80 fue revolucionario en el campo
del inmunoanálisis clínico ofreciendo ventajas atractivas tales
como robustez, especificidad, simplicidad y facilidad de análisis,
velocidad y bajo coste. Las aplicaciones de los sistemas anteriores
respecto a los ensayos para el embarazo, enfermedades de
transmisión sexual, ensayos en alimentos, toxinas, infecciones
bacteriológicas; control medioambiental, agentes biológicos,
detección de alergenos, etc. Sin embargo, en algunos casos las
señales de la varilla indicadora existente o de los ensayos rápidos
de flujo lateral no son lo bastante sensibles para proporcionar un
resultado cualitativo o cuantitativo, especialmente cuando la
concentración de la sustancia que ha de detectarse es ya sumamente
baja en la muestra, como por ejemplo en la detección de anticuerpos
VIH en la saliva o la sangre, u otras infecciones víricas o
bacterianas en la orina o la sangre que indican el comienzo de una
determinada enfermedad. En el último caso, la detección de virus o
bacterias a nivel del ADN o ARN presenta muchas ventajas sobre la
determinación de la respuesta inmunológica del sistema inmunitario
del paciente, tal como el diagnóstico en una etapa precoz de una
enfermedad virológica/bacteriana (incluso antes de la respuesta del
sistema inmunitario), la detección del ADN vírico/bacteriano a
bajas concentraciones (límite de detección bajo) con la sensibilidad
y especificidad que caracterizan a las técnicas de Biología
Molecular, la capacidad para controlar la eficacia de una terapia o
tratamiento de los pacientes. Las técnicas de Biología Molecular,
sin embargo, que se utilizan también actualmente en los
laboratorios clínicos en todo el mundo para la detección de
mutaciones, para el diagnóstico molecular de enfermedades
genéticas, así como el diagnóstico molecular del cáncer (cáncer de
mama, cáncer de próstata, etc.), son inferiores a los ensayos con
varilla indicadora y de flujo lateral en cuanto a la velocidad y
facilidad de utilización se refiere.
La presente invención proporciona un sistema
analítico de una etapa (una tira de análisis por inmersión), que
emplea procedimientos y técnicas de Biología Molecular,
específicamente la hibridación de secuencias complementarias de
ácido nucleico, y combina la ventaja del análisis molecular con la
sencillez, velocidad de análisis y bajo coste de los análisis
rápidos.
Según la presente invención, esto se consigue
por medio de un sistema analítico de tira de ensayo por inmersión
con reactivos secados consistentes en las cuatro áreas
diferenciadas: a), b), c) y d) mencionadas anteriormente,
caracterizado porque el área b) lleva partículas de oro coloidal
secas conjugadas con un oligonucleótido, y porque este área c)
lleva la proteína estreptavidina y un oligonucleótido de secuencia
complementaria con el oligo conjugado en las partículas de oro del
área b), que están inmovilizadas en dos zonas diferenciadas (banda
o puntos). La presente invención proporciona un método para la
construcción de dicho sistema de tira de análisis por inmersión,
así como un método analítico para la detección y/o determinación de
secuencias específicas de ácido nucleico mediante el desarrollo de
análisis de hibridación específicos en dicho sistema de tira de
análisis, caracterizado porque se utiliza una sonda de
oligonucleótido, una parte de la cual es complementaria con la
secuencia del ácido nucleico que debe detectarse y otra parte es de
la secuencia complementaria con el oligo conjugado en las
partículas de oro, así como porque se produce una señal visible,
basada en la hibridación de secuencias de ácido complementarias,
indicativas de la presencia o ausencia de dicha secuencia de ácido
nucleico específica y un punto de detección sobre un soporte (área
c) en el que está inmovilizada la proteína estreptavidina, y una
señal visible (basada en la hibridación) indicativa de que la
terminación del análisis (la muestra junto con las partículas de
oro coloidales han alcanzado el punto de detección) se produce en
el punto de control en un soporte (área c) caracterizado porque en
dicho punto se inmoviliza un oligonucleótido.
El sistema analítico de tira de ensayo por
inmersión con reactivos secos de la presente invención presenta
muchas ventajas. El hecho de que la proteína estreptavidina esté
inmovilizada en el punto de detección en el área c), realmente
significa que bien un oligonucleótido biotinilado se utiliza como
sonda para la secuencia específica del ácido nucleico que ha de
detectarse, o bien el ácido nucleico específico que debe detectarse
está biotinilado; depende del protocolo de hibridación determinado
que se desarrolle sobre la tira. De esta manera los autores se
aprovechan del puente de estreptavidina, que es muy estable
(K=10^{15} l/mol), con el resultado de aumento de sensibilidad en
el análisis donde está siendo empleado, comparable con la
sensibilidad de las sondas radiomarcadas. Utilizando esta
tecnología, se caracteriza asimismo el análisis por la especificidad
ya que la detección se basa en la hibridación de secuencias
específicas de ácido nucleico. Además, la duración del análisis se
reduce drásticamente desde dos o tres horas requeridas en las
técnicas de biológica molecular más rápidas actualmente utilizadas
hasta diez o doce minutos, el análisis es muy sencillo, y se evita
la utilización anterior de muchos materiales peligrosos y
reactivos.
El coste de producción de dicho sistema
analítico de tira de ensayo por inmersión es notablemente bajo.
Por último, la ventaja igualmente importante del
sistema analítico de tira de ensayo por inmersión es su capacidad
para la utilización universal para la detección de muchas secuencias
de ácido nucleico diferentes, con la flexibilidad también del
desarrollo de protocolos de hibridación alternativos sobre él,
mediante una sola modificación con respecto a la utilización de la
sonda específica apropiada para cada ácido nucleico que ha de
detectarse, que se describe a continuación.
La invención se describe específicamente a
continuación a modo de ejemplo con relación a los dibujos de los
diagramas adjuntos en los que:
La Fig. 1 es un dibujo esquemático de un
dispositivo de ensayo analítico que ilustra la disposición de las
cuatro áreas diferenciadas/perceptibles que constituyen el sistema
de tira de ensayo por inmersión según la presente invención.
La Fig. 2 presenta un dibujo esquemático que
ilustra las configuraciones del análisis de hibridación
desarrolladas en dicho sistema con tira de ensayo que son
responsables de proporcionar una indicación de señal visible de la
presencia o ausencia de una secuencia de ácido nucleico específico
en una muestra, según la presente invención.
Para la conveniencia del lector se utilizan los
mismos números de referencia en los siguientes ejemplos como en los
dibujos.
La Fig. 1 presenta un dibujo esquemático que
ilustra el sistema de tira de ensayo por inmersión con reactivos
secos (10), que está soportado por una película (1) de poliestireno
flexible que se utiliza realmente como base para la construcción
del sistema. El sistema (10) consiste en al menos cuatro áreas
distintas de materiales diferentes y con una función específica: a)
el área o parte de la tira de ensayo que se pone en contacto con la
muestra o con la solución de desarrollo del ensayo sobre la tira
(2), b) el área o parte de la tira de ensayo sobre la que se seca
el reactivo de detección que lleva o es responsable de la señal
óptica (3), c) el área o parte de la tira de ensayo sobre la que se
desarrolla la señal (área de la membrana) (6), d) el área o parte
de la tira de ensayo con la función de retener el exceso de la
muestra líquida o del líquido que contiene el analito (7). El área
o parte a) de la tira de ensayo que se pone en contacto con la
muestra o con la solución de desarrollo del ensayo sobre la tira
(2) constituidas por un elemento poroso, habitualmente fibra de
algodón, y que tiene la propiedad de absorber rápidamente una gran
cantidad de solución de desarrollo del ensayo que permite sin
embargo su transferencia cuantitativa al área b) (3) de la tira. El
área (3) está constituida por fibra de vidrio elaborada de manera
que sea capaz de retener el reactivo de detección secado sobre
ella, pero que permite también su liberación hacia el área de la
membrana cuando se está rehidratando moviendo la solución de
desarrollo del ensayo. El área de la membrana (6) comprende una
membrana de nitrocelulosa o una membrana modificada de manera
adecuada que posee funcionalidad de nitrocelulosa (grupos nitro en
superficie). Las membranas típicas que pueden utilizarse en el
sistema de la presente invención son membranas de nitrocelulosa con
tamaños de poro que varían de 5 \mum a
8 \mum o 12 \mum, dependiendo de la aplicación concreta, (p. ej. Schleicher y Shuell AE 98, AE 99, AE 100), así como la membrana modificada por polietersulfona que tiene funcionalidad de nitrocelulosa: Predator (Pall & Gelman) con tamaño de poro de 0,45 \mum. El área (7) (parte superior del sistema) está constituida por un material muy absorbente que comprende principalmente fibra de algodón.
8 \mum o 12 \mum, dependiendo de la aplicación concreta, (p. ej. Schleicher y Shuell AE 98, AE 99, AE 100), así como la membrana modificada por polietersulfona que tiene funcionalidad de nitrocelulosa: Predator (Pall & Gelman) con tamaño de poro de 0,45 \mum. El área (7) (parte superior del sistema) está constituida por un material muy absorbente que comprende principalmente fibra de algodón.
Según la presente invención, inicialmente la
proteína estreptavidina (8) está inmovilizada sobre la membrana en
una cantidad de al menos 0,5 \mug (8.333 fmoles) diluida en un
tampón fosfato 15 mM pH 7,2 (solución de aplicación de
estreptavidina), así como un oligonucleótido (9) que tiene una
longitud de al menos 60 (sesenta) bases y preferentemente entre 60
y 100 bases como máximo, está también inmovilizada en la membrana de
manera que forma un punto o una banda y en una cantidad de al menos
500 fmoles. La longitud del oligonucleótido que se inmoviliza es de
considerable importancia para el éxito de la inmovilización. La
inmovilización de la proteína estreptavidina sobre la membrana
tiene lugar a una distancia de 1 cm (8) del extremo de la membrana
que se pone en contacto con la parte (3) de la tira, mientras que
el oligonucleótido se inmoviliza a una distancia de 1,5 cm del
mismo extremo de la membrana. La inmovilización se realiza mediante
la aplicación del reactivo al área seleccionada de la membrana
seguido de secado en una estufa de temperatura y humedad
controladas, a 70-80ºC durante un periodo de tiempo
que oscila entre 30 y 120 minutos dependiendo del tipo de la
membrana que se esté utilizando. El conjunto del sistema de la tira
sobre la película de poliestireno flexible sigue a dicha
inmovilización.
Según la presente invención, se aplican
partículas de oro coloidal y se secan en el área (3) del sistema
analítico de la tira y más concretamente en la mitad inferior (5)
del área (3) [hacia la parte de la tira que se pone en contacto con
la solución de desarrollo del ensayo], en donde dichas partículas de
oro coloidal se conjugan con un oligonucleótido de determinada
longitud y concretamente que tiene la longitud de 60 (sesenta) a
100 (cien) bases y de secuencia complementaria con el oligo
previamente inmovilizado (9) sobre la membrana. El oligonucleótido
que debe conjugarse con las partículas de oro coloidal se modifica
para que posea un grupo SH en su extremo 5', y se lleva a cabo la
conjugación por el procedimiento descrito por Mirkin C. A.,
Letsinger R. L., Music R. C. y Storhoff J. J., en Nature
382, 607-609 (1996). Según dicho método de
conjugación el oligonucleótido se añade a una cantidad de
partículas de oro coloidal y se incuba a 4ºC durante 56 horas. La
relación (moles de partículas de oro coloidal)/(moles de
oligonucleótido) mantenida en el procedimiento de conjugación es
por lo menos 1/500 y preferentemente entre 1/500 y 1/1.000. Dichas
partículas de oro coloidal conjugadas se secan sobre el área (3)
secando a 40ºC durante dos horas o preferentemente permitiendo que
la solución de aplicación de las partículas a aire seco en un área
de humedad confinada. El tampón de aplicación de dichas partículas
conjugadas más o menos que va a ser secado en el área (3) de la tira
de ensayo, contiene albúmina de suero bovino (BSA) al 5% p/v,
sacarosa al 5% p/v y Tween 20 en una cantidad entre 0,01% y 0,1%
p/v y preferentemente 0,05% p/v. Las partículas de oro utilizadas en
la presente invención para la conjugación con oligonucleótidos
pueden tener un diámetro de 20 nm, 30 nm o 40 nm.
En la mitad superior (4) del área (3) de la tira
de ensayo por inmersión de la presente invención, se aplica la
muestra que se sospecha que contiene el analito (ADN), dicho ADN se
desnaturaliza previamente calentando a 95ºC durante 5 min. y se
hibrida previamente durante al menos 15 a 20 min. con una o dos
sondas de oligonucleótidos a una temperatura que depende de la Tm
de las sondas y en condiciones adecuadas de fuerza iónica, pH y el
tampón apropiado (J. Mol. Biol. 98, 503 (1975),
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76, 3683 (1979)). Dicha
prehibridación está muy recomendada porque aumenta la sensibilidad
del ensayo de hibridación en la tira y por consiguiente la
sensibilidad de la detección con la utilización de la presente
invención. Para cada ensayo de hibridación para la detección de un
ácido nucleico específico con la tira de ensayo por inmersión de la
presente invención, es necesario utilizar al menos 5 \mul del
producto de PCR.
La Fig. 2 presenta un dibujo esquemático que
ilustra las configuraciones del ensayo de hibridación relacionadas
con los protocolos de hibridación apropiados desarrollados en dicho
sistema de tira de ensayo que son responsables de proporcionar una
señal visible indicadora de la presencia o ausencia de una secuencia
de ácido nucleico específica en una muestra, según la presente
invención.
Según el protocolo de hibridación (11) de la
presente invención, 500 fmoles de un oligonucleótido (12) que tiene
una longitud de 60 a 100 bases de timina (T), se inmovilizan en el
área (9) de la membrana, así como 0,5 \mug a menos de la proteína
estreptavidina (SA) (13) en un tampón fosfato 15 mM pH 7,2 se
inmovilizan también en el área (8) de la membrana. El
oligonucleótido, que se inmoviliza sobre la membrana, puede
consistir alternativamente en una secuencia aleatoria de al menos
20 bases nucleotídicas, seguido de una secuencia de 40 a 80 bases
de timinas (T) que está a la cola del extremo 3' del oligo de
secuencia aleatoria con utilización de la enzima: terminal
transferasa. Un oligo de 80 a 100 adeninas (A) (15) está conjugado
sobre la superficie de las partículas de oro coloidal (14). El ADN
diana (16) es el producto de una reacción de PCR en la que uno de
los cebadores está biotinilado, de modo que una cadena del producto
PCR está biotinilado en su extremo 5'. Se necesita también una
sonda de oligo (17) consistente en 20 a 24 bases de secuencia
complementaria con una zona específica del producto de PCR
biotinilado, en la que dicha sonda lleva además 80 a 100 bases de
timina (T) en su extremo 5' o 3'. La sonda (17) puede llevar dicho
número (80-100) de timinas (T) habiéndolas
sintetizado de esta manera, o el polímero de 20 a 24 elementos puede
situarse en cola en su extremo 3' mediante la utilización de la
enzima: terminal transferasa. Calentando a 95ºC durante 5 minutos se
desnaturaliza la muestra que contiene el producto de PCR que ha de
detectarse, que se hibrida previamente a continuación con la sonda
de ácido nucleico específica (17) durante al menos 15 a 20 min. a
una temperatura que depende de la Tm (punto de fusión) de la sonda
y en condiciones adecuadas de fuerza iónica, pH y tampón (J. Mol.
Biol. 98, 503 (1975), Proc. Natl. Acad. Sci. USA
76, 3683 (1979)). Al menos 1.500 a 2.000 fmoles y
preferentemente 1.500 a 5.000 fmoles de la sonda (17), se utilizan
para la hibridación con 5 \mul (100-200
fmoles/\mul) de producto biotinilado de PCR.
Según el protocolo II de hibridación de la
presente invención, 500 fmoles de un oligonucleótido (12) que tiene
una longitud de 60 a 100 bases de timina (T), se inmovilizan en el
área (9) de la membrana, así como 0,5 \mug al menos de la
proteína estreptavidina (SA) (13) en un tampón fosfato 15 mM pH 7,2
se inmovilizan también en el área (8) de la membrana. El
oligonucleótido, que se inmoviliza en la membrana puede consistir
alternativamente en una secuencia aleatoria de al menos 20 bases
nucleotídicas, seguido de una secuencia de 40 a 80 bases de timinas
(T) que se coloca en la cola del extremo 3' del oligo de la
secuencia aleatoria con la utilización de la enzima: terminal
transferasa. Un oligo de 80 a 100 adeninas (A) (15) se conjuga sobre
la superficie de las partículas de oro coloidal (14). El ADN diana
(19) es el producto de una reacción de PCR en la que los cebadores
específicos utilizados no están marcados, de modo que la reacción
rinde un producto de PCR que no está marcado.
Se necesitan también dos sondas de
oligonucleótidos consistentes en 20 a 24 bases de secuencia
complementaria a dos áreas perceptibles de la misma cadena del
producto de PCR. Una de dichas oligo-sondas se marca
con biotina (20) en su extremo 3' o 5', mientras que la otra
oligo-sonda (21) lleva además 80 a 100 bases de
timina (T) en su extremo 5' o 3'. El marcado de la sonda (20) con
biotina puede ser en su extremo 5' o en su extremo 3', dicha sonda
marcada puede sintetizarse de esta manera particular o el marcado
puede tener lugar en su extremo 3' del polímero de 20 a 24
elementos mediante la utilización de la enzima: terminal transferasa
y un nucleótido marcado con biotina tal como
biotin-14-dATP. El ADN diana (19)
bicatenario se desnaturaliza calentando a 95ºC durante 5 min. y a
continuación se hibrida previamente con las sondas de ácido nucleico
específicas (20, 21) durante al menos 15 a 20 min. a una
temperatura que depende del punto de fusión (Tm) de las dos sondas
y en condiciones adecuadas de fuerza iónica, pH y tampón (J. Mol.
Biol. 98, 503 (1975), Proc. Natl. Acad. Sci. USA
76, 3638 (1979)). Para la hibridación de 5 \mul de producto
de PCR (100 a 200 fmoles/\mul), se utilizan al menos 1.500 a
2.000 fmoles de cada una de las dos sondas (20, 21) y
preferentemente de 1.500 a 5.000 fmoles de la mayor parte de cada
una de las sondas.
Los protocolos I y II pueden desarrollarse
también en el sistema analítico de la tira de la presente invención
por intercambio mutuo de los oligonucleótidos que se inmovilizan
sobre la membrana y la superficie de las partículas de oro coloidal
respectivamente. Específicamente un oligonucleótido de 60 a 100
adeninas (A) puede inmovilizarse en la membrana, mientras que un
oligonucleótido con secuencia complementaria de 800 a 100 timinas
(T) se conjuga con la superficie de las partículas de oro coloidal.
En este caso las sondas de oligonucleótidos de 20 a 24 elementos
utilizadas en los ensayos de hibridación de ambos protocolos I y II
deben llevar además 80 a 100 bases de adenina (A) en lugar de
timina (T) en su extremo 5' o 3'.
Tras la aplicación de la muestra que se sospecha
que contiene la secuencia de ácido nucleico específico en la mitad
superior (4) del área (3) de la tira de ensayo por inmersión de la
presente invención, se sumerge la tira en un tubo o recipiente que
contiene la solución de hibridación que se desplaza a lo largo del
trazado de la tira por fuerzas capilares y encuentra las partículas
de oro coloidal secas que rehidrata e induce al área de la membrana
en primer lugar, y a continuación a la parte superior de la tira de
ensayo que tiene la función de retener el exceso de la muestra
líquida. La constitución de la solución de hibridación es tal que
permite la hibridación de las secuencias de ácido nucleico
complementarias así como la formación del enlace
biotina-estreptavidina. Específicamente, la solución
de hibridación contiene un tampón de pH 7,5-7,6,
albúmina de suero bovino (BSA) al menos 5% p/v y preferentemente 5%
a 7% p/v, NaCl 150 mM, glicerol al menos 15% v/v y preferiblemente
15% a 30% v/v y un tensioactivo o detergente no iónico en una
cantidad al menos de 0,1% v/v y preferiblemente 0,1% a 5% v/v. Un
tampón adecuado es PBS pH 7,5 o tampón de ácido maleico pH 7,6 y un
tensioactivo no iónico es Tween 20 o Triton X-100 o
cualquier otro detergente no iónico de la misma categoría. El
glicerol en la solución de hibridación tiene una doble función:
aumenta la viscosidad de la solución que se mueve a continuación a
lo largo de la tira de ensayo conducida por fuerzas capilares más
lentamente permitiendo que la hibridación tenga lugar de manera más
eficaz, afectando de este modo al éxito del ensayo, y en segundo
lugar tiene capacidad de activar la eficacia de la hibridación.
Otras sustancias que favorecen la eficacia de la hibridación y
pueden utilizarse en lugar de glicerol o además del glicerol en la
solución de hibridación son los polímeros tales como PVP
(polivinilpirrolidona), Ficoll, sulfato de dextrano, etc. (Wahl
et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 76,
3683-3687, EUA, 1979). El sistema analítico de tira
de ensayo se deposita en un recipiente que contiene la solución de
hibridación o la solución de revelado del ensayo a temperatura
ambiente y después de 15 a 20 min. como máximo se genera una señal
visible y se lee en el área de la membrana. El desarrollo de dos
bandas o puntos rojos o rojo púrpura [posiciones (8) y (9) sobre la
tira] indica un análisis de detección positiva del ADN diana en la
muestra y la terminación del análisis con éxito en la tira, mientras
que el desarrollo de únicamente una banda o punto [posición (9) en
la tira]
indica un análisis de detección negativo del ADN diana y la terminación del análisis con éxito en la tira de ensayo.
indica un análisis de detección negativo del ADN diana y la terminación del análisis con éxito en la tira de ensayo.
El sistema analítico de tira de ensayo por
inmersión de la presente invención puede convertirse en un sistema
analítico de flujo lateral con una ligera modificación de la forma y
el material absorbente del área (2) de la tira, que se pone en
contacto con la muestra o con la solución de desarrollo del análisis
en la tira.
Con el sistema analítico de la tira de ensayo
por inmersión de la presente invención y los protocolos del ensayo
de hibridación desarrollados sobre la tira de la presente invención,
es posible detectar una secuencia de ácido nucleico específica de
al menos 50 pares de bases.
La utilización del sistema analítico de tira de
la presente invención puede tener lugar con un volumen de al menos
5 \mul de producto de PCR y preferentemente entre 5 \mul y 15
\mul.
Los Ejemplos siguientes se proporcionan
solamente a modo de ilustración.
Ejemplo
1
El desarrollo del ensayo de hibridación en la
tira de ensayo por inmersión según el protocolo I, para la detección
de los productos específicos de la reacción ARMS PCR que se utiliza
para el diagnóstico genético de la mutación puntual
IVS-n110 en el gen de b-globina que
produce la beta-talasemia, dicha PCR se realiza
utilizando el ADN genómico como plantilla. El método ARMS (sistema
de mutación resistente a la ampliación) es una variación de la
reacción PCR que permite la ampliación específica de un segmento de
un alelo procedente de un ADN genómico del individuo. El método
ARMS se basa en el atributo del cebador de PCR según el cual cuando
los cebadores del oligonucleótido tienen una incompatibilidad en su
extremo 3', no pueden hibridarse con la plantilla de modo que el
fragmento de ADN seleccionado puede ampliarse para proporcionar un
producto de PCR. Los cebadores están diseñados para hibridarse con
la secuencia de ADN normal y la mutada. Se preparan dos reacciones
de ampliación para cada muestra. En cada reacción se utiliza un
cebador común marcado con biotina en su extremo 5', y otro cebador
complementario con la zona que se sospecha que lleva la mutación. El
segundo cebador se diferencia en cuanto se refiere al extremo 3',
en cada reacción respecto a la misma muestra: en la primera se
hibrida a la secuencia normal, mientras que en la segunda a la
mutada. Con objeto de que la hibridación de los dos últimos
cebadores sea más específica que su secuencia complementaria en la
plantilla de ADN, tanto el cebador normal como el mutado tienen una
incompatibilidad de la base adicional 3 ó 4 nucleótidos de su
extremo 3'. Cuando un individuo es homozigótico con respecto a la
mutación, la reacción de PCR con los cebadores específicos para la
ampliación de la secuencia normal no producirán un producto de PCR.
Por el contrario, la reacción PCR con los cebadores específicos
para la ampliación de la secuencia mutada proporcionará un producto
de PCR. Para la detección de los productos de las dos reacciones de
PCR realizadas para cada muestra, se necesitan dos tiras de ensayo
por inmersión. Cuando el resultado del ensayo de hibridación en
ambas tiras para la misma muestra es positivo, entonces el
individuo es heterozigótico para la mutación. Cuando el resultado
del ensayo de hibridación es positivo solamente en una de las dos
tiras para la misma muestra, y particularmente cuando la detección
es positiva solamente para el producto de la reacción de PCR que
amplía la secuencia normal, entonces el individuo no lleva la
mutación. Por último, cuando el ensayo de detección es positivo
solamente en una tira de ensayo para la misma muestra y
específicamente la tira utilizada para el producto de la reacción
de PCR que amplía la secuencia mutada, entonces el individuo es
heterozigótico para dicha mutación.
Se utiliza una sonda de oligonucleótido (17) de
20 elementos de secuencia complementaria a una zona de la cadena
biotinilada del producto de PCR específico. Dicha sonda lleva además
80 a 100 timinas (T) en su extremo 3' o 5'.
Para la construcción del sistema analítico de
tira de ensayo por inmersión es necesario el procedimiento
siguiente:
Se inmovilizan 0,5 \mug de la proteína
estreptavidina (8) en un tampón fosfato 15 mM pH 7,2 sobre una
membrana Predator Laminated (Pall & Gelman, EUA), así como 500
fmoles de un oligonucleótido (9) consistente en al menos 80 timinas
(T), teniendo ambos la forma de un punto, a una distancia de 1 cm y
1,5 cm del borde superior de la membrana respectivamente. La
inmovilización tiene lugar por aplicación de cada reactivo en una
zona seleccionada de la membrana, seguido de secado a 70ºC durante
30 minutos en una estufa de temperatura estable con humedad
limitada. Después de esto, se monta el sistema de la tira de
inmersión en una película de poliestireno flexible. Un
oligonucleótido consistente en 100 adeninas (A) modificado con un
grupo SH- en su extremo 5', se conjuga sobre la superficie de las
partículas de oro coloidal de 40 nm de diámetro añadiéndolo a una
cantidad de las partículas en una proporción de: (moles de
partículas de oro)/(moles de oligonucleótido) = 1/500, seguido de
incubación a 4ºC durante 56 horas. En consecuencia, la solución de
partículas de oro coloidal conjugada se concentra diez veces y las
partículas se llevan a una solución que contiene albúmina de suero
bovino (BSA) al 5% p/v, sacarosa al 5% p/v, 0,05% v/v de Tween 20 y
se dejan secar al aire después de ser depositadas sobre el área (5)
del sistema de tira de ensayo. Aproximadamente
9\times10^{9}-1,1\times10^{10} partículas
de oro conjugadas se secan sobre cada sistema de tira de ensayo por
inmersión.
El calentamiento a 95ºC durante 5 minutos
desnaturaliza el producto de PCR biotinilado de la reacción ARMS
específica (435 bp), que se prehibrida a continuación con la sonda
de oligonucleótido (17) de la secuencia complementaria por
incubación durante al menos 15 a 20 min. a una temperatura que
depende del punto de fusión (Tm) de la sonda que estaba a 42ºC para
este caso concreto y en un tampón de ácido maleico que contiene sal
100 mM, pH 7,5. Para la prehibridación de 5 \mul de producto de
PCR (100-200 fmoles/\mul), se utilizan 2.000
fmoles de la sonda y el volumen de la solución de prehibridación es
15 \mul (preferentemente 15-20 \mul). Después
de esto el producto prehibridado se deposita en el área (4) de la
tira de ensayo por inmersión que está sumergida en 300 \mul de la
solución de hibridación (o solución de desarrollo del ensayo) que
contiene tampón PBS pH 7,5-7,6, albúmina de suero
bovino (BSA) al 5%, NaCl 150 mM, glicerol al 20% y Tween 20 al 0,5%.
El sistema analítico de tira de ensayo se deposita en un recipiente
que contiene la solución de hibridación o la solución de revelado
del ensayo a temperatura ambiente y después de 15 a 20 min. como
máximo se genera una señal visible y se lee en el área de la
membrana. El desarrollo de dos bandas o puntos rojos o rojo púrpura
[posiciones (8) y (9) en la tira] indica un análisis de detección
positiva del ADN diana en la muestra y la terminación del análisis
con éxito en la tira, mientras que el desarrollo de únicamente una
banda o punto [posición (9) en la tira] indica un análisis de
detección negativo del ADN diana y la terminación del análisis con
éxito en la tira de ensayo.
Ejemplo
2
El desarrollo del ensayo de hibridación en la
tira de ensayo por inmersión según el protocolo II para la detección
de los productos específicos de la reacción PCR anidada, que se
utiliza para la ampliación de la secuencia de ADN específica del
citomegalovirus (CMV) de un ADN genómico del individuo. La reacción
de PCR anidada se utiliza a fin de aumentar significativamente la
sensibilidad y especificidad de la PCR, particularmente cuando la
ampliación de una secuencia rara se desea (plantilla de ácido
nucleico de bajo número de copias) y si se utiliza un gran número
de ciclos existe un riesgo aumentado de ampliación de productos no
específicos. Dos reacciones de ampliación consecutivas tienen lugar
con un par cebador diferente utilizado en cada reacción. La primera
PCR contiene un par externo de cebadores utilizados para ampliar un
fragmento de aproximadamente 300 bp. La segunda PCR contiene un par
interno de cebadores, que hidroliza al fragmento ampliado de 300 bp
por el primer conjunto de cebadores (cebadores externos), y se
utiliza para ampliar un fragmento de 163 bp. Se seleccionan dos
sondas de oligonucleótidos consistentes en 20 a 24 bases de la
secuencia complementaria a dos áreas perceptibles de la misma
cadena del producto de PCR de 163 bp. Una de dichas
oligo-sondas se marca con biotina (20) en su
extremo 3' utilizando la enzima: terminal transferasa, mientras que
la otra oligo-sonda (21) se coloca en cola con 80 a
100 timinas (T) adicionales en su extremo 3' utilizando dicha
enzima. El procedimiento de colocación en cola se describe a
continuación: a) Marcado con biotina: En un eppendorf se prepara una
mezcla que contiene 4 \mul de tampón 5\timesTdT (tampón de
marcado que contiene: 200 mmoles/l de cacodilato potásico, 50
mmoles/l de Tris-HCl, 0,4 mg/ml de albúmina de suero
bovino, pH 7,2), 1 \mul de CoCl_{2} 25 mmoles/l, 1 \mul de
sonda (19) (100 pmoles/\mul), 1 \mul de mezcla de dNTP (sin
dATP) 10 mM, 2,5 \mul de
biotina-14-dATP 0,4 mM, 1,2 \mul
de terminal transferasa (30 unidades) y agua destilada hasta un
volumen final de 20 \mul. La mezcla se incuba a 37ºC durante una
hora. La reacción se termina mediante la adición de 2,5 \mul de
EDTA 0,4 M, y la oligo-sonda de cola se purifica en
el exceso de reactivos utilizados con la utilización de una columna
Sephadex G-25 (CPG, EUA). b) Acabado con numerosas
timinas (T): En un eppendorf se prepara una mezcla que contiene 4
\mul de tampón 5\timesTdT (tampón de marcado que contiene: 200
mmoles/l de cacodilato potásico, 50 mmoles/l de
Tris-HCl, 0,4 mg/ml de albúmina de suero bovino, pH
7,2), 1 \mul de CoCl_{2} 25 mmoles/l, 1 \mul de sonda (20)
(100 pmoles/\mul), 1 \mul de dATP 10 mM, 1,2 \mul de terminal
transferasa (30 unidades) y agua destilada hasta un volumen final
de 20 \mul. La mezcla se incuba a 37ºC durante una hora. La
reacción se termina mediante la adición de 2,5 \mul de EDTA 0,4
M.
El procedimiento para el montaje del sistema
analítico de tira de ensayo por inmersión es el mismo que el
descrito en el Ejemplo 1.
El calentamiento a 95ºC durante 5 minutos
desnaturaliza el producto de PCR de 163 bp de la reacción PCR
específica, que se hibrida previamente entonces con las dos sondas
de oligonucleótido (20,21) de la secuencia complementaria por
incubación durante al menos 15 a 20 min. a una temperatura que
depende del punto de fusión (Tm) de la sonda que estaba a 37ºC para
este caso concreto y en un tampón de PCR que contiene sal 50 mM, pH
7,5. Para la prehibridación de 5 \mul de producto de PCR
(100-200 fmoles/\mul), se utilizan 2.000 fmoles de
la sonda y el volumen de la solución de prehibridación es 15 \mul
(preferentemente 15-20 \mul). Después de esto el
producto prehibridado se deposita en el área (4) de la tira de
ensayo por inmersión que está sumergida en 300 \mul de la
solución de hibridación (o solución de desarrollo del ensayo) que
contiene tampón PBS pH 7,5-7,6, albúmina de suero
bovino (BSA) al 5%, NaCl 150 mM, glicerol al 20% y Tween 20 al 0,5%.
El sistema analítico de tira de ensayo se deposita en un recipiente
que contiene la solución de hibridación o la solución de revelado
del ensayo a temperatura ambiente y después de 15 a 20 min. como
máximo se genera una señal visible y se lee en el área de la
membrana. El revelado de dos bandas o puntos rojos o rojo púrpura
[posiciones (8) y (9) en la tira] indica un análisis de detección
positiva del ADN diana en la muestra y la terminación del análisis
con éxito en la tira, mientras que el desarrollo de únicamente una
banda o punto [posición (9) en la tira] indica un análisis de
detección negativo del ADN diana y la terminación del análisis con
éxito en la tira de ensayo.
Claims (16)
-
\global\parskip0.950000\baselineskip
1. Un sistema analítico de tira de ensayo por inmersión para la determinación cualitativa y/o cuantitativa en una etapa de una secuencia de ácido nucleico específico (16, 19) en una muestra líquida, que comprende:- A)
- una tira de ensayo (1), teniendo dicha tira de ensayo (1) cuatro áreas distintas:
- a)
- una primera área (2), que pone en contacto dicha muestra o solución de revelado de ensayo;
- b)
- una segunda área (3) sobre la que se seca la sustancia que produce la señal visible;
- c)
- una tercera área (6) para el desarrollo de la señal y seguimiento de la terminación del ensayo, que comprende una primera zona (8) que contiene estreptavidina inmovilizada y una segunda zona (9) que contiene un oligonucleótido inmovilizado; y
- d)
- una cuarta área (7) para retener el exceso de dicha muestra líquida;
- \quad
- caracterizado porque
- dicha sustancia que produce la señal visible consiste en partículas de oro coloidal (14) conjugadas con un oligonucleótido (15) de una determinada longitud y que tiene una secuencia nucleotídica definida y puede ser solubilizado por la muestra líquida o la disolución de desarrollo del ensayo; dicho oligonucleótido (12) inmovilizado en la segunda zona (9) de dicho tercer área (6) de la tira de ensayo (1) tiene una secuencia nucleotídica complementaria con la secuencia nucleotídica de dicho oligonucleótido (15) conjugado con dichas partículas de oro coloidal (14);
- \quad
- y en el que
- \quad
- dicho sistema analítico de tira de ensayo por inmersión comprende además:
- B)
- un reactivo distinto (17; 20, 21) consistente en uno o más oligonucleótidos que se hibridan de manera específica con dicho ácido nucleico y que proporciona a dicho ácido nucleico hibridado la capacidad para hibidarse simultáneamente con dicho oligonucleótido (15) que se conjuga con dichas partículas de oro coloidal (14) y para unirse a dicha estreptavidina inmovilizada de la primera zona (8) de dicha tercer área (6).
- 2. Un sistema analítico de tira de ensayo por inmersión según la reivindicación 1, caracterizado además porque dicha sustancia que produce la señal visible se seca en la mitad inferior (5) de dicha segunda área (3) de dicha tira de ensayo (1).
- 3. Un sistema analítico de tira de ensayo por inmersión según la reivindicación 1, caracterizado porque dicho ácido nucleico que ha de analizarse está biotinilado y dicho reactivo (17; 20, 21) consiste en un oligonucleótido (17) que comprende una primera parte que tiene una secuencia complementaria con una zona de la secuencia nucleotídica de dicho ácido nucleico biotinilado (16) una segunda parte que tiene una secuencia complementaria con la secuencia nucleotídica definida de dicho oligonucleótido (15) conjugado con dichas partículas de oro coloidal (14).
- 4. Un sistema analítico de tira de ensayo por inmersión según la reivindicación 1, caracterizado porque dicho ácido nucleico que ha de analizarse no está biotinilado y dicho reactivo (17; 20, 21) comprende:
- un primer oligonucleótido (20) que tiene una secuencia complementaria con una zona de la secuencia nucleotídica de dicho ácido nucleico (19) y está unido a uno de sus extremos por un molécula de biotina; y
- un segundo oligonucleótido (21) que que comprende una primera parte que tiene una secuencia complementaria con una zona de la secuencia nucleotídica de dicho ácido nucleico (19) y una segunda parte que tiene una complementaria con la secuencia nucleotídica definida de dicho oligonucleótido (15) conjugado con dichas partículas de oro coloidal (14).
- 5. Un sistema analítico de tira de ensayo por inmersión según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque dicha secuencia nucleotídica definida que está conjugada con dichas partículas de oro coloidal (14) tiene una longitud de entre 60 y 100 bases.
- 6. Un sistema analítico de tira de ensayo por inmersión según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque dicha secuencia nucleotídica definida que está conjugada con dichas partículas de oro coloidal (14) consiste en 20 nucleótidos al azar seguidos de 40 a 100 bases de timina.
- 7. Un sistema analítico de tira de ensayo por inmersión según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado porque dicha secuencia nucleotídica definida que está conjugada con dichas partículas de oro coloidal (14) consiste en 20 nucleótidos al azar seguidos de 40 a 100 bases de adenina.
\global\parskip1.000000\baselineskip
- 8. Un sistema analítico de tira de ensayo por inmersión según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque dicha sustancia (14, 15) que produce la señal visible se seca en dicha segunda área (3) de dicha tira de ensayo (1) (i) modificando el extremo (5') de dicho oligonucleótido (15) con una secuencia nucleotídica definida en un grupo SH, (ii) añadiendo dicho oligonucleótido en una disolución de conjugación que contiene dichas partículas de oro coloidal en una relación molar (partículas de oro coloidal)/(oligonucleótido) de por lo menos 1/500 e incubando durante un tiempo suficiente para que tenga lugar la conjugación entre dicho oligonucleótido y dichas partículas de oro, (iii) dispersando dichas partículas coloidales en una disolución y aplicando dicha disolución a dicha tira de ensayo en dicha segunda área (3), y (iv) secando dicha disolución aplicada de partículas conjugadas en dicha segunda área (3) de dicha tira de ensayo (1) mediante secado en estufa o secado con aire.
- 9. Un sistema analítico de tira de ensayo por inmersión según la reivindicación 8, caracterizado porque dicha disolución aplicada a dicha tira de ensayo en dicha segunda área (3) en la etapa (iii) contiene albúmina de suero bovino (BSA) al 5% p/v, sacarosa al 5% y 0,001% y 0,1% v/v de un tensioactivo o detergente no iónico tal como Tween 20.
- 10. Método para la determinación cualitativa y/o cuantitativa en una etapa de una secuencia (16, 19) de ácido nucleico específica en una muestra de líquido que utiliza un sistema analítico de tira de ensayo por inmersión según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que dicho método comprende:
- diluir dicha muestra líquida en una disolución de prehibridación que tiene disuelto en ésta dicho reactivo distinto (17; 20, 21);
- calentar dicha disolución de prehibridación y dejar que tenga lugar la prehibridación;
- aplicar dicha disolución de prehibridación en dicha tira de ensayo (1);
- sumergir dicha primera área (2) de dicha tira de ensayo (1) en una disolución de hibridación o en una disolución de desarrollo de ensayo, y
- dejar suficiente tiempo para que la segunda zona (9) de dicha tercer área (6) de la tira de ensayo se coloree, en cuyo tiempo la presencia y/o la intensidad o la ausencia de color en dicha primera zona (8) de dicha tercer área (6) de la tira de ensayo indica la presencia y/o la cantidad o la ausencia de dicha secuencia de ácido nucleico (16, 19) en la muestra líquida.
- 11. Método según la reivindicación 10 y que utiliza un sistema analítico de tira de ensayo por inmersión según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque dicha disolución de prehibridación se aplica en la mitad superior (4) de dicha segunda área (3) de dicha tira de ensayo (1).
- 12. Método según cualquiera de las reivindicaciones 10, 11 y que utiliza un sistema analítico de tira de ensayo por inmersión según la reivindicación 3, caracterizado porque dicho ácido nucleico (16) que debe analizarse se ha biotinilado previamente.
- 13. Método según cualquiera de las reivindicaciones 10 a 12 caracterizado además porque dicha hibridación o solución de desarrollo del ensayo contiene tampón PBS pH 7,5-7,6, albúmina de suero bovino (BSA) al 5%, NaCl al menos 150 mM, glicerol al menos al 15% y al menos 0,1% de un tensioactivo o detergente no iónico tal como Tween 20.
- 14. Utilización del sistema analítico de tira de ensayo por inmersión según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 o del método de cualquiera de las reivindicaciones 10 a 13 para la detección y/o determinación de secuencias de ácido nucleico específicas en una muestra, que son indicativas de una enfermedad.
- 15. Utilización según la reivindicación 14, caracterizada porque dichas secuencias específicas de ácido nucleico son de ADN vírico o bacteriano y su detección es indicativa de una enfermedad infecciosa.
- 16. Utilización según la reivindicación 14, caracterizada porque dichas secuencias específicas de ácido nucleico son secuencias mutadas de ADN y su detección es indicativa de una enfermedad transmitida genéticamente.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| GR20010100478 | 2001-10-16 | ||
| GR010100478 | 2001-10-16 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2286276T3 true ES2286276T3 (es) | 2007-12-01 |
Family
ID=37616771
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES02765125T Expired - Lifetime ES2286276T3 (es) | 2001-10-16 | 2002-10-03 | Sistema analitico de tira de ensayo y metodo para la deteccion de secuencias de acido nucleico especificas. |
Country Status (15)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US20050202427A1 (es) |
| EP (1) | EP1436420B1 (es) |
| AT (1) | ATE360708T1 (es) |
| AU (1) | AU2002329496B2 (es) |
| BR (1) | BR0206145A (es) |
| CA (1) | CA2468802A1 (es) |
| CY (1) | CY1106724T1 (es) |
| DE (1) | DE60219813T2 (es) |
| DK (1) | DK1436420T3 (es) |
| ES (1) | ES2286276T3 (es) |
| GR (1) | GR1003966B (es) |
| NO (1) | NO20032697L (es) |
| PT (1) | PT1436420E (es) |
| WO (1) | WO2003033735A2 (es) |
| YU (1) | YU48903A (es) |
Families Citing this family (19)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GR1004393B (el) | 2002-11-07 | 2003-11-28 | ΑΥΤΟΜΑΤΟΙ ΑΝΑΛΥΤΕΣ ΚΑΙ ΔΙΑΓΝΩΣΤΙΚΑ ΑΝΤΙΔΡΑΣΤΗΡΙΑ MEDICON HELLAS ΑΝΩΝΥΜΗ ΕΤΑΙΡΕΙΑ δ.τ. MEDICON HELLAS S.A. | Μεθοδος ανιχνευσης ειδικων αλληλουχιων νουκλεικων οξεων σε ταινια ξηρων αντιδραστηριων |
| DE602004032125D1 (de) | 2003-05-07 | 2011-05-19 | Coris Bioconcept Sprl | Einstufige oligochromatographische vorrichtung und verfahren zu ihrer verwendung |
| EP1657550A1 (en) * | 2004-11-10 | 2006-05-17 | Coris Bioconcept SPRL | Double-sided device for multiplex dipstick immunodiagnostic |
| DE602005026578D1 (de) * | 2004-12-29 | 2011-04-07 | Suzhou Yangze Delta Academy Of Bio X Science Ltd | Optimales verfahren zur amplifikation nach polymerasekettenreaktion |
| GB0503986D0 (en) * | 2005-02-26 | 2005-04-06 | Secr Defence | Reaction apparatus |
| US8980561B1 (en) * | 2006-08-22 | 2015-03-17 | Los Alamos National Security, Llc. | Nucleic acid detection system and method for detecting influenza |
| EP1933145B1 (en) * | 2006-12-11 | 2011-09-28 | AraGen Biotechnology Co. Ltd. | Rapid immunochromatographic detection by amplification of the colloidal gold signal |
| WO2009005552A2 (en) * | 2007-03-29 | 2009-01-08 | Epitype Corporation | Methods and compositions for multivalent binding and methods for manufacture of rapid diagnostic tests |
| GB0806041D0 (en) * | 2008-04-03 | 2008-05-14 | Genomica S A | Method for detection of herpesvirus in test sample |
| CN102128832A (zh) * | 2010-12-27 | 2011-07-20 | 江南大学 | 一种西瓜果斑病毒金标核酸试纸条及其制备和应用 |
| CN102183633B (zh) * | 2011-02-24 | 2013-05-15 | 南京基蛋生物科技有限公司 | 一种胶体金标记方法 |
| US9651549B2 (en) * | 2012-07-13 | 2017-05-16 | Genisphere, Llc | Lateral flow assays using DNA dendrimers |
| FR3012982B1 (fr) * | 2013-11-08 | 2015-12-25 | Espci Innov | Procede de stockage et de concentration d'un compose volatil |
| AU2015346216B2 (en) | 2014-11-13 | 2020-07-02 | The Alfred E. Mann Foundation For Scientific Research | Percutaneous lead interface |
| US9464969B2 (en) | 2014-11-20 | 2016-10-11 | Monolythix, Inc. | Monoliths |
| EP3265561B1 (en) * | 2015-03-03 | 2021-04-28 | University of Miami | Kits and methods for pathogen detection |
| US20170051274A1 (en) | 2015-08-18 | 2017-02-23 | Monolythix, Inc. | Sample concentration devices |
| CN108977501A (zh) * | 2018-08-13 | 2018-12-11 | 吉林农业科技学院 | 人参黑斑菌-单管巢式pcr-核酸传感器的制备及其检测方法 |
| ES2932995A1 (es) * | 2021-07-22 | 2023-01-30 | Ocupharm Diagnostics Sl | Sistema de detección de parásitos oculares |
Family Cites Families (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4751177A (en) * | 1985-06-13 | 1988-06-14 | Amgen | Methods and kits for performing nucleic acid hybridization assays |
| WO1990001564A1 (en) * | 1988-08-09 | 1990-02-22 | Microprobe Corporation | Methods for multiple target analyses through nucleic acid hybridization |
| EP0554355B1 (en) * | 1990-10-19 | 1998-01-07 | Microprobe Corporation | Mehods and pharmaceutical kits useful for detecting microorganisms associated with vaginal infections |
| US6582921B2 (en) * | 1996-07-29 | 2003-06-24 | Nanosphere, Inc. | Nanoparticles having oligonucleotides attached thereto and uses thereof |
| US20010026944A1 (en) * | 1999-04-21 | 2001-10-04 | Roy Chung | Immunoassay system |
| JP2003503699A (ja) * | 1999-06-25 | 2003-01-28 | ナノスフェアー インコーポレイテッド | オリゴヌクレオチドが付着しているナノ粒子およびその利用法 |
| US7101683B2 (en) * | 2001-06-26 | 2006-09-05 | Abbott Laboratories | Methods for the simultaneous detection of HCV antigens and HCV antibodies |
-
2001
- 2001-10-16 GR GR20010100478A patent/GR1003966B/el unknown
-
2002
- 2002-10-03 US US10/496,735 patent/US20050202427A1/en not_active Abandoned
- 2002-10-03 YU YU48903A patent/YU48903A/sh unknown
- 2002-10-03 BR BR0206145-7A patent/BR0206145A/pt not_active IP Right Cessation
- 2002-10-03 AU AU2002329496A patent/AU2002329496B2/en not_active Ceased
- 2002-10-03 ES ES02765125T patent/ES2286276T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2002-10-03 DK DK02765125T patent/DK1436420T3/da active
- 2002-10-03 PT PT02765125T patent/PT1436420E/pt unknown
- 2002-10-03 DE DE60219813T patent/DE60219813T2/de not_active Expired - Lifetime
- 2002-10-03 EP EP02765125A patent/EP1436420B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2002-10-03 CA CA002468802A patent/CA2468802A1/en not_active Abandoned
- 2002-10-03 AT AT02765125T patent/ATE360708T1/de active
- 2002-10-03 WO PCT/GR2002/000052 patent/WO2003033735A2/en active IP Right Grant
-
2003
- 2003-06-13 NO NO20032697A patent/NO20032697L/no not_active Application Discontinuation
-
2007
- 2007-07-13 CY CY20071100930T patent/CY1106724T1/el unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| ATE360708T1 (de) | 2007-05-15 |
| NO20032697D0 (no) | 2003-06-13 |
| EP1436420B1 (en) | 2007-04-25 |
| YU48903A (sh) | 2006-08-17 |
| DK1436420T3 (da) | 2007-09-10 |
| EP1436420A2 (en) | 2004-07-14 |
| DE60219813D1 (de) | 2007-06-06 |
| BR0206145A (pt) | 2004-01-13 |
| PT1436420E (pt) | 2007-09-12 |
| WO2003033735A3 (en) | 2003-09-12 |
| CY1106724T1 (el) | 2012-05-23 |
| WO2003033735A2 (en) | 2003-04-24 |
| CA2468802A1 (en) | 2003-04-24 |
| GR1003966B (el) | 2002-08-06 |
| US20050202427A1 (en) | 2005-09-15 |
| NO20032697L (no) | 2003-07-15 |
| AU2002329496B2 (en) | 2009-10-22 |
| DE60219813T2 (de) | 2008-01-31 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| ES2286276T3 (es) | Sistema analitico de tira de ensayo y metodo para la deteccion de secuencias de acido nucleico especificas. | |
| JP6513892B1 (ja) | 増幅核酸検出方法及び検出デバイス | |
| ES2136059T5 (es) | Deteccion de una secuencia de acidos nucleicos o de un cambio en la misma. | |
| ES2275292T3 (es) | Sondas y equipos para la deteccion de chlamidia trachomatis. | |
| AU601021B2 (en) | Assay for necleic acid sequences in a sample | |
| US5348855A (en) | Assay for nucleic acid sequences in an unpurified sample | |
| US6090592A (en) | Method for performing amplification of nucleic acid on supports | |
| ES2424269T3 (es) | Inmuno-PCR sándwich por desplazamiento | |
| AU2002329496A1 (en) | Test strip assay system and method for the detection of specific nucleic acid sequences | |
| JPH10505492A (ja) | 担体上で核酸の増幅を行う方法および装置 | |
| WO2011001496A1 (ja) | 検体解析方法およびそれに用いるアッセイキット | |
| ES2344873T3 (es) | Procedimiento de hibridacion in situ para detectar un acido nucleico diana. | |
| ATE80666T1 (de) | Hybridisierungstest fuer nukleinsaeure. | |
| JP2007506404A (ja) | 核酸分子を検出するための迅速な方法 | |
| KR20170078456A (ko) | 루프-매개 등온증폭반응 산물을 이용한 미생물 검출 방법, 및 미생물 검출 키트 | |
| JPWO2018003550A1 (ja) | ２以上の標的核酸を検出するためのプライマーセット、キット及び方法 | |
| EP0622464A2 (en) | Nucleic acid assay procedure | |
| CN101240338A (zh) | 检测基因突变的方法 | |
| ES2280793T3 (es) | Deteccion de algas toxicas. | |
| US6306657B1 (en) | Polynucleotide probe and kit for amplifying signal detection in hybridization assays | |
| KR20170078463A (ko) | 중합효소연쇄반응 증폭 산물을 이용한 미생물 검출 방법, 및 미생물 검출 키트 | |
| US20050019772A1 (en) | Method for detecting bacteria associated with parodontitis and tooth decay | |
| ES2229440T3 (es) | Deteccion de un carcinoma de vejiga urinaria en una muestra de orina. | |
| JPH06165681A (ja) | メチシリン耐性ブドウ球菌検出用オリゴヌクレオチド、メチシリン耐性ブドウ球菌の検出法および検出用試薬キット | |
| KR20180049085A (ko) | Snp 유전형분석 방법 및 장치 |