CN108977501A - 人参黑斑菌-单管巢式pcr-核酸传感器的制备及其检测方法 - Google Patents

人参黑斑菌-单管巢式pcr-核酸传感器的制备及其检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了人参黑斑菌‑单管巢式PCR‑核酸传感器的制备方法，包括以下步骤：A、制备人参黑斑菌真菌培养物；B、对培养物破碎并进行DNA提取；C、人参黑斑菌16S rRNA扩增；D、胶体金的制备；E、胶体金颗粒与链酶亲和素的结合；F、核酸传感器的制备与组装。所述的核酸传感器，由底板、硝酸纤维素膜、金标结合垫、样品垫和吸水纸五部分组成。本发明将单管巢式PCR‑核酸传感器相结合，建立了用于人参黑斑病的快速检测的方法。在优化的条件下，该方法对人参黑斑菌基因组DNA最低检出限为0.01pg；较常规PCR检测灵敏度提高了100倍。

Description

人参黑斑菌-单管巢式PCR-核酸传感器的制备及其检测方法
技术领域
本发明涉及人参病害防治技术领域，尤其涉及人参黑斑菌-单管巢式PCR-核酸传感器的制备及其检测方法。
背景技术
人参病害的防治主要包括农业防治、化学药剂防治和生物防治，其中化学药剂防治具有高效、适应性广、使用方便及效益显著等特点而被广泛应用。但是，随着化学农药的大量使用，农药残留、病原菌的抗药性、污染环境、伤害天敌等一系列的问题突显出来。为了改变人参病害化学防治中存在的一系列问题，很多学者进行了多方面的研究，但主要的研究方向大多集中在人参病害病原菌的分离诊断、人参病害的拮抗菌筛选和安全用药检测等方向，并取得了一些成果，但这些成果都是在病害发生后进行的防治措施，对人参病害发病前的诊断方面没有具体的研究。开展植物重要病原物的早期检测研究，能够对病害发生的严重程度及流行趋势进行预测，从而抓住化学防治的最佳时机，对药剂的种类和用量具有针对性的指导作用，在不用药或少量用药的情况下进行病害的有效防控就可以起到事半功倍的作用；开展病原体的检测研究对于科学防治人参黑斑病具有重要的意义。
传统的植物病害检测方法主要根据发病组织的症状，病原菌的特征，调查人员的经验等进行。然而，由于某些病原引起的症状相似，并且在不同发病时期症状有所不同，很难准确判断；分离培养法由于某些专性寄生菌的存在，如常见的霜霉菌、白粉菌、锈菌等，也很难进行；同时，由于腐生菌的存在，使得这些传统方法不仅检测速度慢，而且准确率低。近年来，分子生物学的发展为传统检测方法向分子检测方法的过渡提供了理论基础，出现了如DNA探针技术、DNA芯片技术、基于PCR等的分子检测方法，其中PCR方法由于检测快速，特异性强、灵敏性高等优点，已经被越来越多的用于植物病原菌领域的检测研究。
本发明建立了人参黑斑菌-单管巢式PCR-核酸传感器检测技术，可用于土壤中人参黑斑菌的快速检测。土壤中的微生物种类繁多，且不同的土壤环境中微生物的种类不同，因此，针对复杂的土壤微生物环境，建立的检测方法应具有较高的特异性。
发明内容
基于背景技术存在的技术问题，本发明提出了人参黑斑菌-单管巢式PCR-核酸传感器的制备及其检测方法。
本发明的技术方案如下：
人参黑斑菌-单管巢式PCR-核酸传感器的制备方法，包括以下步骤：
A、制备人参黑斑菌真菌培养物；
B、对培养物破碎并进行DNA提取；
C、人参黑斑菌16S rRNA扩增；
D、胶体金的制备；
E、胶体金颗粒与链酶亲和素的结合；
F、核酸传感器(核酸侧向流生物传感器)的制备与组装。
优选的，所述的步骤B中，所述的DNA提取方法为磁珠法或者CTAB法，优选的，所述的DNA提取方法为磁珠法。
优选的，所述的人参黑斑菌16S rRNA扩增：根据李烨报道的人参黑斑菌特异引物进行人参黑斑菌DNA的扩增，引物序列如下，5’-CCTGCGGAGGGATCATTACACA-3’；5’-ACGCTGACCTTGGCTGGAAGA-3’，扩增目的条带大约为475bp，引物由上海生物工程有限公司合成；PCR反应体系为15μL的PCR Mix，1μL的基因组DNA，各引物均1μL 10μM，加入双蒸馏水定容到系统总体积25μL；PCR的扩增条件为：95℃预变性2min，95℃变性1min55℃退火45s，72℃延伸45s，共35个循环，4℃保存；将5μL PCR产物通过2％琼脂糖凝胶电泳检测。
优选的，所述的胶体金的制备方法，包括以下步骤：称取100mL双蒸水于平底烧瓶中，在电炉上加热至沸腾；加入1.0mL 1％HAuCl4溶液，继续加热，加入1.25mL 2％的柠檬酸三钠，继续煮沸；溶液将依次由浅黄色变为灰色、黑色、紫色，最后为酒红色，继续搅拌，5min后取出烧杯；待胶体金冷却至室温时，补充至原先的体积；将瓶身用铝箔纸包裹，4℃避光保存即可。
胶体金制备完成后，分别通过目测和紫外可见分光光度计对胶体金的品质进行检测。胶体金的质量通过目测观察进行初步的鉴定，胶体金的颜色主要与金颗粒大小有关，随金颗粒的增大，胶体金颜色从橙红向紫红色渐变；高品质的胶体金对光观察时呈清澈、透亮、无沉淀、无浑浊以及油状的漂浮物等。
利用紫外-可见分光光度计检测胶体金的波长与波峰，在波长500nm-600nm的范围内对胶体金溶液进行扫描，可以对胶体金溶液的最大吸收波长、紫外可见光吸收光谱、缝宽和吸光值进行检测。胶体金溶液应呈现尖而窄的峰波，若峰宽大，标准偏差就大，表明胶体金颗粒不均匀，可能存在多三角形或椭圆形的金颗粒；而峰宽越小，则证明金颗粒均匀，对后续试验结果较好。
优选的，所述的胶体金颗粒与链酶亲和素的结合，包括以下步骤：
a、取10mL胶体金，调pH至7.0，在搅拌状态下，加入SA至最佳标记量，在室温下反应30min；加入100μL 10％BSA，继续搅拌10min；加入200μL 10％(W/V)BSA进行封闭，缓慢颠倒混匀10min；
b、再加入200μL 10％(W/V)PEG进行二次封闭，缓慢颠倒混匀10min；
c、随后，9000rpm 4℃离心30min，弃上清，得到胶体金-SA结合物，用5mL金标稀释液复溶，铺在玻璃纤维上，37℃烘干过夜，密封干燥保存，即可得到胶体金颗粒-链霉亲和素(AuNPs-SA)复合物。
优选的，所述的金标稀释液，由以下成分组成：硼砂,硼酸,0.5％Casein,2.5％蔗糖,0.1％PEG,0.1％TritonX-100和0.05％NaN3。
优选的，所述的核酸传感器的制备与组装，包括以下步骤:将胶体金颗粒-链霉亲和素(AuNPs-SA)复合物铺于金标结合垫；将鼠抗Fam单克隆抗体和BSA-生物素铺于硝酸纤维素滤膜(NC)的T线和C线；取底板作为支撑，底端粘贴样品垫，顶端粘贴吸水垫，中间粘贴NC膜，组装完成，试纸条切刀裁剪成合适尺寸，装入含有干燥剂的铝箔袋中密封保存，标明制备日期、名称，即可。
所述的核酸传感器，由底板、硝酸纤维素膜(NC膜)、金标结合垫、样品垫和吸水纸五部分组成(图1)。
人参黑斑菌-单管巢式PCR-核酸传感器的检测方法，包括以下步骤：
步骤一：通过外引物(F1和R1)对靶DNA进行PCR扩增；随后在同一反应管中内引物(F2和R2，F2在序列的5'端用Fam标记)以一扩的PCR产物为模板进行巢式PCR扩增；
步骤二：PCR扩增结束后，PCR扩增子经高温变性，变性的Fam标记的单链DNA与Biotin修饰的特异性核酸探针在46℃下杂交，形成三明治样夹心复合物(被Fam和Biotin标记)；
步骤三：将5μL杂交物上样于核酸传感器的样品垫；随后，将核酸传感器下部吸水垫浸入95μL的展开液中；在展开液作用下，复合物中的Biotin位点与金标结合垫中链霉亲和素-胶体金复合物结合，形成新复合物，并在展开液作用下自下而上层析，当到达T线时被包被的鼠抗-Fam单克隆抗体捕获，反应过程中由于胶体金颗粒在检测线的大量富集，形生可见的红色条带；过剩的胶体金-链霉亲和素继续层析至C线，被C线的Biotin捕获，C线可形成可见的红色条带，此时，检测结果呈阳性；若仅C线显红色，则结果呈阴性；若T线和C线均无色，表明核酸传感器已经失效(图2)。
本发明的有益之处在于：
本发明建立了人参黑斑菌-单管巢式PCR-核酸传感器检测技术，可用于土壤中人参黑斑菌的快速检测。土壤中的微生物种类繁多，且不同的土壤环境中微生物的种类不同，因此，针对复杂的土壤微生物环境，建立的检测方法应具有较高的特异性。巢式PCR是具有较高特异性的核酸扩增技术。其工作原理是，在外引物的作用下开始第一轮的PCR扩增，然后内引物以一轮的PCR产物为模板进行第二轮的PCR扩增，经过两轮的PCR反应，检测的特异性大大增强。本发明建立了人参黑斑菌特异的单管巢式PCR检测方法；该方法与常规巢式PCR技术明显不同，常规巢式PCR是先进行第一轮PCR，再用该PCR产物做模板进行第二次扩增。在两步扩增的中间阶段，需取出第一次扩增的产物，人为加入有关试剂后才能进行第二次扩增检测，这无疑增加了污染的几率，使操作更加繁琐，不利于技术的产品化。本发明通过对巢式PCR内、外引物退火温度、浓度的系统优化，建立了可在同一反应管中进行PCR扩增的单管巢式PCR技术，并成功用于人参黑斑菌的检测，该技术保留了常规两步巢式PCR的特异性和灵敏度，同时简化了检测程序，降低了交叉污染的风险和劳动力消耗。
目前，已有将核酸传感器用于PCR产物检测的报道；但大多数的研究是在核酸扩增中将上下游引物的两端进行标记，这大大降低了检测的特异性；同时，PCR过程中容易产生引物二聚体，造成检测结果的假阳性。本发明是在特异基因检测过程中引入一条3’端标记的特异性探针，将探针与PCR产物杂交后通过核酸传感器检测，这大大提高了检测结果的特异性，也消除了引物二聚体带来的假阳性。另外，本发明将一次性核酸传感器用于核酸扩增物的检测，整个检测时间仅2-3分钟，与常规的电泳法相比，缩短了检测所用时间、降低了电泳仪和凝胶成像系统等设备投入，同时避免了EB等核酸燃料的使用对操作环境和实验人员带来的危害；因此，非常适合在条件有限的基层实验室开展基因检测。
本发明将单管巢式PCR-核酸传感器相结合，建立了用于人参黑斑病的快速检测的方法。在优化的条件下，该方法对人参黑斑菌基因组DNA最低检出限为0.01pg；较常规PCR检测灵敏度提高了100倍，这项结果表明，通过对单管巢式PCR过程中引物退火温度、内外引物比例及浓度的系统优化，确实提高了检测的灵敏度。值得注意的是，PCR反应灵敏度极高，PCR检测结果容易受到核酸气溶胶的污染导致检测结果的假阳性。为避免交叉污染的风险，在PCR技术应用中，需要在各自独立的实验空间，即核酸制备、扩增和产物检测分别在独立的实验室开展研究，这无疑限制了分子诊断技术的推广和应用，下一步，我们将开发一种一次性的密闭核酸扩增物检测装置，将核酸扩增物的检测固定在一个密闭的装置中进行，在最大程度上避免核酸气溶胶对后续实验的影响。
在实际样本检测中，该方法能检测出土壤样本中的人参黑斑菌，而对照样本的检测呈阴性。目前，市场上尚没有同类的黑斑菌基因检测试剂产品，因此，在分子检测试剂效果评价的过程中我们无法采用同类方法进行对比研究，我们对检测结果呈阳性的PCR产物进行了基因测序，测序结果表明，这些阳性的PCR产物确实是人参黑斑菌的DNA序列，这进一步验证了检测结果的可靠性。下一步，我们将以吉林省人参主产区土壤样本及人参叶片为材料进行大量的田间检测，将检测结果与人参生产及人参黑斑病的发病规律结合进行研究，为人参黑斑病早期预警和疾病防控提供新思路。
附图说明
图1：核酸侧向流生物传感器的结构组成图；
图2：单管巢式PCR-LFBT原理图；
图3：CTAB法提取DNA的PCR结果图；
图4：磁珠法提取DNA的PCR结果图；
图5：30nm胶体金紫外光谱扫描图；
图6：内、外引物的PCR验证图；
图7：基因特异探针的位置图；
图8：STNPCR-LFBT的特异性检测结果图；
图9：STNPCR-LFBT的灵敏性检测结果图；
图10：实际样品的检测结果图；
图11：PCR产物的测序结果图。
具体实施方式
实施例：
人参黑斑菌-单管巢式PCR-核酸传感器的制备方法，包括以下步骤：
A、制备人参黑斑菌真菌培养物；
将保存的供试菌株接种于PDA平板培养基中，共25皿，培养8天，备用。用无菌枪头刮取培养基上的菌落，定量取量50mg培养物，转移至2.0mL无菌离心管中，获得真菌培养物50份，用于DNA提取；-80℃冰箱冻存，备用。
B、对培养物破碎并进行DNA提取；
取装有真菌培养物的无菌离心管，在震荡仪上29次/秒振幅震荡破碎2min，随后进行DNA提取。
以下分别采用磁珠法和CTAB法进行DNA提取，并进行对比测试。
磁珠法：加入600μL提取液，100μL 5M盐酸胍，30μL蛋白酶K，震荡混匀。65℃水浴15min，期间颠倒混匀2-3次；12000r离心5min。取600μL上清液并转移至另一干净的离心管中。随后加入600μL结合液，30μL磁珠，混匀，静置1min，放于磁力架；去上清，加入70％乙醇，磁分离，弃上清，晾干。加入30min TE Buffer，65℃水浴5min，取出离心管，置磁力架上，上清至一新离心管，获得DNA样本。
CTAB法：菌丝体打碎后，加入600μL经65℃预热的CTAB抽提液，颠倒混匀，65℃水浴1h；冷却至室温，12 000r/min离心10min，将上清液转移至另一离心管中；加入Tris饱和酚和氯仿：异戊醇(24∶1)各300μL，颠倒混匀，静置至分层；12 000r/min离心10min，将上清液转移至另一离心管中，加入等体积氯仿：异戊醇(24∶1)，颠倒混匀；12000r/min离心10min，将上清液转移至另一离心管中，加入等体积异丙醇，轻轻颠倒混匀，-20℃沉淀1h；1200r/min离心10min，弃上清液，500μL 70％乙醇悬浮沉淀；12000r/min离心5min，弃上清，室温干燥；加100μL无菌水溶解沉淀，-20℃保存，备用。
李烨等报道了CTAB法对人参黑斑菌DNA进行提取，并建立了基于PCR-电泳技术的人参黑斑菌的检测方法。本发明通过磁珠法和经典CTAB法对待测样本进行DNA提取，采用分光光度计测定不同DNA提取方法得到样本浓度和质量情况，探讨磁珠法对人参黑斑菌检测中的可行性；结果表明，CTAB法效果较为稳定，获得了相对满意的DNA得率；磁珠法提取的DNA，OD260/OD280在1.9，且DNA的浓度远高于传统的CTAB法，结果见表1。
表1：磁珠法、CTAB法对核酸提取效果
C、人参黑斑菌16S rRNA扩增；
将磁珠法和CTAB法获得的DNA样本分别设定呈1ng,100pg,10pg,1pg,100fg,10fg,1fg/μL七个浓度梯度，并分别取上述DNA进行PCR扩增(NTC:阴性对照)，通过琼脂糖凝胶电泳。结果表明，以两种方法提取的黑斑菌基因组DNA进行PCR扩增，均产生预期的目的条带。以CTAB法提取的DNA模板,通过PCR可检测到1ng的黑斑菌DNA；当待检DNA浓度在100pg及其以下的浓度范围，未获得阳性结果(图3)。
以磁珠法获得的DNA为模板,在相同的PCR反应程序下，成功检测的100pg的黑斑菌DNA(图4)；因此，用磁珠法提取的DNA较CTAB法提取的DNA更有利于PCR扩增反应，推测出现而这种差异主要是不同提取方法获得的DNA质量存在差异，进而对检测结果造成了影响。
在供试两种DNA提取方法的比较见表2。提取DNA需时最少的方法为磁珠法，时间小于0.5h，另外，该方法所需人力成本也较少。CTAB法用时长，达4-5h，人力成本相对较高；另外，CTAB法需要多种有机试剂，这增加了对操作人员危害、实验环境污染的风险。因此，本发明建立的基于磁珠法的人参黑斑菌DNA纯化方法，不仅操作简单，也省去了有机试剂及多步离心操作步骤，适合在基层实验室中进行病原菌DNA的提取。
表2：两种提取方法的比较
D、胶体金的制备；
采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金，称取100mL双蒸水于平底烧瓶中，在电炉上加热至沸腾，加入1.0mL 1％HAuCl4溶液，继续加热，加入1.25mL 2％的柠檬酸三钠，继续煮沸。溶液将依次由浅黄色变为灰色、黑色、紫色，最后为酒红色，继续搅拌。5min后取出烧杯，待胶体金冷却至室温时，补充至原先的体积。将瓶身用铝箔纸包裹，4℃避光保存。
胶体金制备完成后，分别通过目测和紫外可见分光光度计对胶体金的品质进行检测。首先对制备的胶体金溶液进行肉眼观察，胶体金为酒红色，清澈透明，本次实验胶体金质量较好，可用于后续实验。
胶体金溶液的紫外可见分光光度计鉴定结果见图5。波长在510-550nm内，胶体金溶液有单一波峰；在小于525nm与大于525nm的范围中的大颗粒较少，表明此次制备的胶体金的颗粒均一性比较好，可用于后续研究。
E、胶体金颗粒与链酶亲和素的结合；
取10mL胶体金，调pH至7.0，在搅拌状态下，加入SA至最佳标记量，在室温下反应30min，加入100μL 10％BSA，继续搅拌10min。加入200μL 10％(W/V)BSA进行封闭，缓慢颠倒混匀10min；再加入200μL 10％(W/V)PEG进行二次封闭，缓慢颠倒混匀10min；随后，9000rpm4℃离心30min，弃上清，得到胶体金-SA结合物，用5mL金标稀释液(硼砂,硼酸,0.5％Casein,2.5％蔗糖,0.1％PEG,0.1％TritonX-100,0.05％NaN3)复溶，铺在玻璃纤维上，37℃烘干过夜，密封干燥保存，备用。
每一反应孔中分别加入200μL的胶体金溶液；用0.2mol/L的K2CO3溶液调节溶液的pH值，然后在每种不同pH值的胶体金中分别加入过量的SA；每孔再加入10％NaCl溶液20μL，放置于室温下1h，肉眼观察其颜色变化。结果表明，pH7.0时，胶体金仍保持红色，其它pH条件下的胶体金溶液有不同程度的颜色变浅、变灰现象。因此，本实验选择pH7.0作为最佳标记pH值。
取200μL胶体金溶液，用0.1mol/L K2CO3溶液将胶体金溶液调节到pH7.0值，混合后室温放置10min。分别向每个反应孔的胶体金溶液中加入不同浓度的SA，通过10％NaCl滴定。结果表明，当SA的用量为6μg/mL时胶体金溶液保持红色；实际应用中本发明确定6.6μgSA为稳定1mL胶体金的所需的蛋白量。
F、核酸传感器的制备与组装。
将6.5mg/mL SA与30nm胶体金颗粒(AuNP)偶联，制备胶体金颗粒-链霉亲和素(AuNPs-SA)复合物；将其铺于金标结合垫；将鼠抗Fam单克隆抗体和BSA-生物素铺于硝酸纤维素滤膜(NC)的T线和C线，鼠抗-Fam单克隆抗体和BSA-生物素的浓度均为1.0mg/mL。取底板作为支撑，底端粘贴样品垫，顶端粘贴吸水垫，中间粘贴NC膜，组装完成，试纸条切刀裁剪成长×宽为0.4cm×6cm，装入含有干燥剂的铝箔袋中密封保存，标明制备日期、名称，即可。
所述的核酸传感器由底板、硝酸纤维素膜(NC膜)、金标结合垫、样品垫和吸水纸五部分组成。
将C线包被生物素的浓度分别设置为0.2mg/mL、0.5mg/mL、1mg/mL、2mg/mL；结果表明：C线处的生物素浓度为1mg/mL时，核酸传感器的C线的辨识度已经满足检测要求，综合考虑，我们选取1mg/mL作为用于C线包被的最适浓度。为确定鼠-抗Fam单克隆抗体在T线包被的适宜浓度。分别将0.2mg/mL、0.5mg/mL、1mg/mL、2mg/mL的待测抗体包被于试纸的T线；以PBS缓冲液做为对照。结果表明：T线处的蛋白浓度为1mg/mL时，T线条带清晰可见，当抗体浓度为2mg/mL对结果影响不大。本发明选取抗体浓度1mg/mL为核酸传感器T线制备的工作浓度。
一、单管巢式PCR反应条件的确定
1、引物及探针的设计
在GenBank中检索人参黑斑病菌的基因序列(登录号为：FJ607183)。用DNAStar软件设计引物及探针。该引物及探针序列的特异性通过GeneBank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)的Blast工具软件分析，证明其与核酸数据库中其它序列不存在交叉反应，初步证明其特异性。
表3 引物和探针
以纯化的人参黑斑菌基因组DNA为模板，对人参黑斑菌18S rRNA序列进行PCR扩增。其中外引物(F1/R1)对目的片段进行PCR扩增，得到475bp的目的片段(图6A)；内引物(F2/R2)对靶基因进行扩增，获得240bp的目的片段(图6B)；以上目的条带大小与理论相符，同时测序结果表明，上述PCR扩增产物均为人参黑斑菌18S rRNA特异序列；因此，本发明用中设计的用于巢式PCR扩增的外、内引物对可以用于人参黑斑菌18S rRNA基因的扩增。
2、外引物退火温度的筛选
利用引物设计软件DNAStar预测外引物的退火温度为66℃。为确定外引物最佳退火温度，本发明分别设置外引物的退火温度，分别为60℃，62℃，64℃，66℃，68℃，70℃，72℃。以纯化的的人参黑斑菌DNA为模板，分别按照上述退火温度进行PCR扩增。具体PCR反应体系及反应条件为如下：
PCR反应体系为为15μL的PCR Mix，1μL的基因组DNA，各引物均1μL10μM，加入双蒸馏水定容到系统总体积25μL。PCR的扩增条件为：95℃预变性5min，95℃变性30s，60℃(60℃，62℃，64℃，66℃，68℃，70℃，72℃。)退火45s，72℃延伸45s，共40个循环，4℃保存。将5μL PCR产物通过2％琼脂糖凝胶电泳检测，根据不同退火温度下目的条带亮度，确定外引物的最佳退火温度。
经DNAStar软件预测，外引物的退火温度为66℃。为确定外引物最佳工作的退火温度，本发明将外引物退火温度分别设置为60℃，62℃，64℃，66℃，68℃，70℃，72℃，以纯化的人参黑斑菌基因组DNA为模板，分别在上述退火温度下进行PCR扩增；结果表明，不用退火温度下引物均获得有效扩增，温度对PCR结果影响不大。考虑到单管巢式PCR内、外引物的退火温度差应在10℃以上，本发明外引物尽可能选用较高的退火温度；故将72℃作为外引物的退火温度。
3、内引物退火温度的筛选
DNAStar软件预测的内引物退火温度为56℃，为确定内引物最佳退火温度，本发明分别设置内引物的退火温度，分别为52℃，53℃，54℃，55℃，56℃，57℃，58℃，59℃。以纯化的的人参黑斑菌DNA为模板，分别按照上述退火温度进行PCR扩增。具体PCR反应体系及反应条件为如下：
PCR反应体系如下：15μL的PCR Mix，1μL的基因组DNA，各引物均1μL10μM加入双蒸馏水，系统总体积为25μL。PCR的扩增条件为：95℃预变性5min，95℃变性30s，50℃(52℃，53℃，54℃，55℃，56℃，57℃，58℃，59℃)退火45s，72℃延伸45s，共40个循环，4℃保存。取5μLPCR产物通过2％琼脂糖凝胶电泳检测，根据不同退火温度下目的条带亮度，确定内引物的最佳退火温度。
经DNAStar软件预测，内引物的退火温度为56℃。为确定内引物最佳工作的退火温度，本发明将内引物退火温度分别置定在52℃，53℃，54℃，55℃，56℃，57℃，58℃，59℃，以纯化的人参黑斑菌基因组DNA为模板，分别在上述退火温度下进行PCR扩增；结果表明，不用退火温度下引物均获得有效扩增，但温度在56℃电泳条带亮度最强。因此，本发明将56℃作为内引物的退火温度。
4、单管巢式PCR反应体系及条件
PCR反应体系如下：15μL的PCR Mix，1μL的基因组DNA，各引物均为1μL 10μM，加入双蒸馏水，系统总体积为25μL。单管巢式PCR的扩增条件为：95℃预变性2min，之后95℃变性30s,72℃退火30s，共15个循环；95℃变性30s，56℃退火30s和72℃延伸30s，共40个循环；最后95℃变性2min，PCR产物于冰上保存，备用。
5、单管巢式PCR内外引物浓度优化
以1ng纯化的人参黑斑菌基因组DNA为模板，对单管巢式PCR的内、外引物的浓度进行系统优化。将外引物与内引物的浓度比例分别设定在1：4，1：10，1：20，1：40，1：60和1：80，在上述浓度比例下分别进行单管巢式PCR扩增；实验重复一次以充分保证结果的可靠性。通过扩增PCR产物电泳条带的强度，分别验证内外引物的比例及浓度。
以1ng纯化的人参黑斑菌基因组DNA为模板，对单管巢式PCR的内、外引物的浓度进行系统优化。将外引物与内引物的浓度比例分别设定在1：4，1：10，1：20，1：40，1：60和1：80，在上述浓度比例下分别进行单管巢式PCR扩增；结果表明，外引物与内引物浓度比例在1:60获得最强的目标条带。因此，本发明的单管巢式PCR的外引物浓度为0.003μM，内引物的浓度为0.2μM。
本发明是采用特异性探针与单链PCR扩增产物进行杂交，通过核酸传感器进行检测的。因此，探针与PCR产物的有效杂交至关重要。本发明设计了特异探针P，该探针与扩增子的反义链杂交，探针的具体位置如图7所示。
二、PCR产物的琼脂糖凝胶电泳检测
取上述PCR产物各5μL，通过2％琼脂糖凝胶电泳检测，以DNA Marker 500为对照，电泳结束后，凝胶成像仪记录实验结果。
三、核酸杂交各条件的筛选
杂交温度设置31、36、41、46、51℃5个不同的杂交温度，杂交后通过核酸传感器进行检测，通过检测线与质控线的比值，即T/C的比值的高低来判断杂交结果，在最适的杂交条件下，杂交信号最强，即T/C最高。在确定了最佳杂交温度后，对杂交的探针浓度0.1μM，0.5μM,5μM,10μM和15μM进行优化；确定上述条件后，将杂交时间分别控制在1分钟,5分钟,10分钟和20分钟进行杂交以确定最佳杂交时间；最后对杂交液的组成包括四种杂交液浓度(2×，4×，6×和8×)和杂交液中BSA(2％，4％，6％和8％)的添加量进行了系统研究。
为确定探针与扩增子杂交的最适反应温度，分别在31、36、41、46、51℃5个不同的杂交温度下进行反应，结果表明，杂交温度为46℃时，检测线与质控线的比值，即T/C的比值最高，杂交信号最强，超过46℃后杂交信号明显减弱。因此，本发明中46℃为最适杂交温度。当探针浓度为10μM可获得理想的杂交信号，随着探针浓度的增加，T/C比没有明显的变化。因此，本发明中最适探针的浓度为10μM。杂交时间分别控制在1,5,10和20min，结果表明，以上杂交时间对检测结果未见显著影响；为缩短检测时间，本发明选取1min为杂交反应时间。同时，本发明确定杂交缓冲液浓度为4×和2％BSA。在最佳杂交条件下，PCR后5分钟即可完成检测。
四、核酸侧向流传感器(核酸传感器)对PCR产物的检测
取上述变性的PCR产物10μL和1μL寡核苷酸探针于50μL杂交缓冲液中，混匀；46℃温育1分钟。取10μL杂交混合物上样于传感器的样品垫，随后将样品垫的下端浸入90μL展开液(0.01M PBS，pH 7.4)中，5分钟内肉眼读取结果。
五、巢式PCR-LFBA系统性能分析
1、特异性实验
根据人参黑斑病菌16S rRNA基因序列设计引物，分别对人参黑斑病菌及其它5种常见病菌A.panax whetz、P.cactorum、S.schinseng、B.cinerea Pers、C.destructan和E.coli的基因组DNA样本进行单管巢式PCR扩增，结果通过核酸传感器进行检测，验证特异性。
本发明根据人参黑斑病菌16S rRNA基因序列设计引物，分别对A.panax whetz,C.destructans:B.cinerea Pers,S.schinseng,P.cactorum Schroet 和E.coli的基因组DNA样本进行单管巢式PCR扩增，结果通过核酸传感器进行检测。结果表明，仅人参黑斑病菌DNA呈阳性，其它常见人参病原菌、大肠杆菌及空白对照均呈阴性，如图8。因此，该方法具有较高的特异性。
2、灵敏性实验
将纯化的人参黑斑病菌基因DNA进行10倍梯度稀释，分别以各稀释度的基因组DNA作为模板进行单管巢式PCR扩增，结果通过核酸传感器检测，验证灵敏性。
将纯化的人参黑斑病菌基因DNA进行10倍梯度稀释，分别以上述稀释度的基因组DNA作为模板进行单管巢式PCR扩增，结果通过核酸传感器检测。结果表明，该方法的最低检出限为0.01pg(图9A)；同时采用内引物进行常规PCR扩增，通过核酸传感器检测，其最低检出限仅为1pg(图9B)；因此，本发明的单管巢式PCR的灵敏度较常规PCR提高了100倍。
3、实际样品的检测
人参黑斑菌单管巢式PCR-核酸传感器技术分别用于三种土壤中特异病原菌的检测。1至6号土样是首次种植人参的参地，种植时间6个月；7至12号土样是首次种植人参的参地，种植时间仅2个月；13-18号土样为种植玉米的土壤样本，这片土地尚未种植过人参。
STNPCR-LFBA分别用于三种土壤中的检测，土样1-6是首次种植人参的参地，种植时间6个月，期间发现人参黑斑病呈流行趋势。土样7-12是首次种植人参2个月的参地，这片参地中肉眼观察到1株人参发生黑斑病，土样13-18是种植玉米的土壤样本，这片土地没有种植过人参。STNPCR-LFBT检测结果表明，在人参黑斑病呈流行趋势的1-6号土样中4份检测出黑斑菌；在7-12号土样中仅1份检出黑斑菌；在种植玉米的土样中未检测出人参黑斑菌(图10)。
对PCR阳性样本对应的PCR产物测序，结果均为人参黑斑菌特异基因序列。部分测序结果见表4，测序质量图见图11。
表4 PCR产物的测序
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.人参黑斑菌-单管巢式PCR-核酸传感器的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
A、制备人参黑斑菌真菌培养物；
B、对培养物破碎并进行DNA提取；
C、人参黑斑菌16S rRNA扩增；
D、胶体金的制备；
E、胶体金颗粒与链酶亲和素的结合；
F、核酸传感器的制备与组装。
2.如权利要求1所述的人参黑斑菌-单管巢式PCR-核酸传感器的制备方法，其特征在于，所述的步骤B中，所述的DNA提取方法为磁珠法或者CTAB法；优选的，所述的DNA提取方法为磁珠法。
3.如权利要求1所述的人参黑斑菌-单管巢式PCR-核酸传感器的制备方法，其特征在于，所述的人参黑斑菌16S rRNA扩增：根据李烨报道的人参黑斑菌特异引物进行人参黑斑菌DNA的扩增，引物序列如下，5’-CCTGCGGAGGGATCATTACACA-3’；5’-ACGCTGACCTTGGCTGGAAGA-3’，扩增目的条带大约为475bp，引物由上海生物工程有限公司合成；PCR反应体系为15μL的PCR Mix，1μL的基因组DNA，各引物均1μL 10μM，加入双蒸馏水定容到系统总体积25μL；PCR的扩增条件为：95℃预变性2min，95℃变性1min55℃退火45s，72℃延伸45s，共35个循环，4℃保存；将5μL PCR产物通过2％琼脂糖凝胶电泳检测。
4.如权利要求1所述的人参黑斑菌-单管巢式PCR-核酸传感器的制备方法，其特征在于，所述的胶体金的制备方法，包括以下步骤：称取100mL双蒸水于平底烧瓶中，在电炉上加热至沸腾；加入1.0mL 1％HAuCl4溶液，继续加热，加入1.25mL 2％的柠檬酸三钠，继续煮沸；溶液将依次由浅黄色变为灰色、黑色、紫色，最后为酒红色，继续搅拌，5min后取出烧杯；待胶体金冷却至室温时，补充至原先的体积；将瓶身用铝箔纸包裹，4℃避光保存即可。
5.如权利要求1所述的人参黑斑菌-单管巢式PCR-核酸传感器的制备方法，其特征在于，所述的胶体金颗粒与链酶亲和素的结合，包括以下步骤：
a、取10mL胶体金，调pH至7.0，在搅拌状态下，加入SA至最佳标记量，在室温下反应30min；加入100μL 10％BSA，继续搅拌10min；加入200μL 10％(W/V)BSA进行封闭，缓慢颠倒混匀10min；
b、再加入200μL 10％(W/V)PEG进行二次封闭，缓慢颠倒混匀10min；
c、随后，9000rpm 4℃离心30min，弃上清，得到胶体金-SA结合物，用5mL金标稀释液复溶，铺在玻璃纤维上，37℃烘干过夜，密封干燥保存，即可得到胶体金颗粒-链霉亲和素复合物。
6.如权利要求5所述的人参黑斑菌-单管巢式PCR-核酸传感器的制备方法，其特征在于，所述的金标稀释液，由以下成分组成：硼砂,硼酸,0.5％Casein,2.5％蔗糖,0.1％PEG,0.1％TritonX-100和0.05％NaN3。
7.如权利要求1所述的人参黑斑菌-单管巢式PCR-核酸传感器的制备方法，其特征在于，所述的核酸传感器的制备与组装，包括以下步骤:将胶体金颗粒-链霉亲和素复合物铺于金标结合垫；将鼠抗Fam单克隆抗体和BSA-生物素铺于硝酸纤维素滤膜的T线和C线；取底板作为支撑，底端粘贴样品垫，顶端粘贴吸水垫，中间粘贴硝酸纤维素滤膜，组装完成，试纸条切刀裁剪成合适尺寸，装入含有干燥剂的铝箔袋中密封保存，标明制备日期、名称，即可。
8.如权利要求7所述的人参黑斑菌-单管巢式PCR-核酸传感器的制备方法，其特征在于，所述的核酸传感器，由底板、硝酸纤维素膜、金标结合垫、样品垫和吸水纸五部分组成。
9.人参黑斑菌-单管巢式PCR-核酸传感器的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一：通过外引物F1和R1对靶DNA进行PCR扩增；随后在同一反应管中内引物F2和R2以一扩的PCR产物为模板进行巢式PCR扩增；其中，F2在序列的5'端用Fam标记；
步骤二：PCR扩增结束后，PCR扩增子经高温变性，变性的Fam标记的单链DNA与Biotin修饰的特异性核酸探针在46℃下杂交，形成被Fam和Biotin标记的三明治样夹心复合物；
步骤三：将5μL杂交物上样于核酸传感器的样品垫；随后，将核酸传感器下部吸水垫浸入95μL的展开液中；在展开液作用下，复合物中的Biotin位点与金标结合垫中链霉亲和素-胶体金复合物结合，形成新复合物，并在展开液作用下自下而上层析，当到达T线时被包被的鼠抗-Fam单克隆抗体捕获，反应过程中由于胶体金颗粒在检测线的大量富集，形生可见的红色条带；过剩的胶体金-链霉亲和素继续层析至C线，被C线的Biotin捕获，C线可形成可见的红色条带，此时，检测结果呈阳性；若仅C线显红色，则结果呈阴性；若T线和C线均无色，表明核酸传感器已经失效。
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