CN111172314A

CN111172314A - 一种利用lamp检测三七黑斑病菌的方法

Info

Publication number: CN111172314A
Application number: CN202010106087.6A
Authority: CN
Inventors: 兰成忠; 林雄; 代玉立; 姚凤銮
Original assignee: Institute of Plant Protection of FAAS
Current assignee: Institute of Plant Protection of FAAS
Priority date: 2020-02-21
Filing date: 2020-02-21
Publication date: 2020-05-19
Anticipated expiration: 2040-02-21
Also published as: CN111172314B

Abstract

本发明公开了一种利用LAMP检测三七黑斑病菌的方法。所述引物序列如SEQ ID NO.1‑4所示。三七黑斑病菌LAMP检测步骤如下：首先以三七黑斑病菌RPB2基因为检测靶标，设计LAMP特异性引物；提取待测样品DNA；配制LAMP反应体系；将反应体系于64℃恒温反应40 min；通过自然光下或紫外光下判断结果或是二者结合判断结果。本发明解决了现有技术检测周期长、灵敏度不高、特异性不强、操作复杂、仪器设备要求高等缺陷，提供了一种特异性强、灵敏度高、操作简便、对环境设备要求不高、低成本的LAMP快速准确检测技术，可用于三七黑斑病的检测与鉴定，为三七黑斑病的诊断与防控提供了一种方法。

Description

一种利用LAMP检测三七黑斑病菌的方法

技术领域

本发明属于植物病原物检测技术领域，具体地，涉及一种利用LAMP检测三七黑斑病菌的方法。该方法可用于三七黑斑病菌快速、灵敏和特异的分子检测，同时可用于三七黑斑病的早期诊断和病菌的监测和鉴定。

背景技术

三七【Panax notoginseng (Burk.) F H Chen】又称田七、金不换、南国神草，是一种五加科（Araliaceae）名贵中药材，具有散淤止血、消肿定痛的功效。三七经过数百年的人工驯化种植，形成现广植于云南和广西等省份（区）。由于长期大规模、单一、连片种植，加之三七喜冬暖夏凉、半阴和潮湿的生态环境，不耐严寒与醋热，因其生长环境的特殊性，常导致三七各种病害的发生和流行。研究表明，三七地上部分的主要病害有黑斑病、炭疽病、灰霉病、圆斑病和病毒病等。其中，由人参链格孢（Alternaria panax Whetz）引起的黑斑病是三七种植区的一种重要病害，该病害具发病突然，蔓延迅速的特点，可危害植株的各个部分，受害叶片常形成圆形或不规则水浸状褐色病斑，受害叶柄、茎杆产生黑褐色病斑，常造成落叶、干花、不结实、植株折垂而枯死。三七黑斑病的常年发病率5%-35%之间，部分三七种植园的发病率可高达90%以上，常给三七生产带来巨大损失。

病原菌的准确鉴定与检测是病害防控的前期基础，病原菌传统的鉴定和检测流程通常如下：从发病组织中分离病原菌、采用形态学特征对病原菌进行初步鉴定、再通过柯赫氏法则（将病原菌重新回接到寄主植株上，待发病后再重新分离、鉴定，并与原始菌株进行比较）对病原菌进行最终确定。这种运用形态学方法进行鉴定不仅耗时费力，而且需要交给具有丰富经验的专业技术人员判断，这限制了病害的早期诊断，易延误最佳的防治时机，不能满足病害快速、准确鉴定、诊断的需求。随着分子生物学技术的发展，常规PCR、巢式PCR和实时荧光定量PCR等DNA体外PCR扩增技术成功地应用于植物病原菌的准确鉴定和快速检测中。PCR技术虽然提升了病原菌鉴定的准确性和检测的快速性，但仍存在需要依赖精密的PCR仪、凝胶成像系统等贵重仪器设备、操作繁琐和操作人员需具备一定分子生物学技术等问题，并不是所有农业部门都具有分子生物学专业技术人员，另外，不可能都具备PCR仪等贵重设备，使得该技术在经济欠发达地区和基层农业部门的使用、推广受到很大的限制。因此，在生产实践中很有必要建立一种快速简便、容易普及、易于操作的三七黑斑病菌快速检测方法。

环介导等温扩增（Loop-mediated Isothermal Amplification，LAMP）技术是日本荣研公司开发的一种简便、快速、准确及廉价的核酸高效扩增技术，该技术可在60℃~65℃恒温条件下，利用高活性的链置换DNA聚合酶 (Bst DNA polymerase) 对目的DNA片段进行特异性扩增，在1小时内即可观察结果。LAMP技术具特异性强、设备要求低、操作简单、灵敏度高、反应时间短等优点被广泛应用于多种病原菌检测中。截至目前为止，尚未见有LAMP技术用于检测三七黑斑病菌的相关技术报道。因此，很有必要研发一种能快速、准确检测三七黑斑病菌的LAMP方法。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是克服现有技术中对三七黑斑病菌检测和鉴定主要基于形态学特征，方法耗时长、程序繁琐、经验性强、准确度低，难以做到对病害发生的及时监测和控制病原菌的传播、流行的问题，以及现有PCR分子检测需要依靠扩增仪等贵重仪器，且检测时间较长等问题，提供一种三七黑斑病菌的LAMP检测引物及快速检测方法，该方法检测三七黑斑病菌具操作简便、实用性好、检测周期短、准确性强、灵敏性高、肉眼可观察检测结果等优势。

本发明的目的是提供一组用于三七黑斑病菌LAMP检测的特异引物。

本发明的另一目的是提供一种利用LAMP检测三七黑斑病菌的方法。

为实现本发明的目的，采用以下技术方案，包括下列步骤：

1. 三七黑斑病菌LAMP检测特异性引物的设计：通过测定三七黑斑病菌莲链格孢（Alternaria panax）和其它病原菌的RNA polymerase II subunit (RPB2)基因序列，对链格属不同种间RPB2基因序列进行比对分析，利用在线LAMP引物设计软件Primer softwareExplorer V5 (https://primerexplorer.jp/lampv5/index.html; Eiken Chemical Co.,Japan)设计三七黑斑病菌特异性LAMP引物组，由F3、B3、FIP和BIP组成，引物序列如下：

F3：5’- TGGAGTCAGGATGAGGTCG -3’；

B3：5’- GATCTGGCAGTGGCTTGAG -3’；

FIP：5’- CCTCCTCTTCGGCGTCTAGGTA-AACAAGCTACTTACGGCTGG -3’；

BIP：5’-TGGAGGAGTGGCGGGAGATG-CACCCTCAGTTGATCGCTC-3’；

2. 三七黑斑病菌LAMP检测方法的建立，包括以下步骤：

（1）提取待测样品基因组DNA。

用于检测病原菌纯培养物时，采用CTAB 法进行提取基因组DNA，具体方法如下：取少量菌丝粉于1.5 mL离心管中（菌丝粉刚盖过半圆形底部为宜），加入900 µL 2%CTAB（十六烷基三甲基溴化铵）提取液（2% CTAB；100 mmol/L Tris-HCl, pH 8.0；20 mmol/L EDTA，pH8.0；1.4 mol/L NaCl）和90 µL SDS（十二烷基苯磺酸钠）【注：CTAB，SDS需60℃预热】，使用振荡器振荡混匀，60℃水浴1h（DNA释放至缓冲液中），12000 r·min^-1离心15 min；取上清液700 µL，加等体积酚、氯仿、异戊醇（25:24:1），轻轻振荡混匀，12000 r·min^-1离心9 min；取上清液500 µL，加入等体积氯仿再抽提一次，12000 r·min^-1离心5 min；取上清液350 µL，加入1/10体积3 mol·L^-1 NaAc和2倍体积无水乙醇，-20℃沉淀30 min，12000 r·min^-1离心5 min；弃去上清液，加入700µL 冰70%乙醇进行洗涤（稍离心；倾掉上清液），在超净工作台上晾干无酒精味，加入30~60 µL TE（10 mmol/L Tris-HCl，0.1 mmol/L EDTA，pH 8.0）溶液进行溶解，得到 DNA 溶液，用紫外分光光度计检测 DNA 浓度并稀释至100 ng/µL待用。

用于检测植物组织中存在三七黑斑病菌时，采用NaOH快速裂解法提取DNA，具体过程如下：向每毫克植物组织中加入10µL 0.5 mol/L NaOH，在研钵中将组织充分磨碎成糊后转入1.5mL离心管中，12,000 rpm离心6 min，取上清液5 µl加入495µL 0.1 mol/L Tris-HCl（pH=8.0）混合均匀，取1.0 µL作为PCR模板进行扩增。

（2）LAMP反应体系的建立：以步骤（1）提取的DNA为模板，利用外侧引物F3/B3和内侧引物FIP/BIP进行LAMP扩增，LAMP检测反应体系为25 μL，包括5 μM引物F3和B3各1.0 μL，40 μM引物FIP和BIP各1.0 μL，LAMP反应混合液【40 mM Tris-HCl，20 mM (NH₄)₂SO₄，20 mMKCl，16 mM MgSO₄，1.6 mol/L甜菜碱(Betaine)，2.0 mM dNTPs，0.2wt.% Trion X-100】12.5μL，8 U Bst聚合酶1.0 μL，DNA模板1.0 μL，用灭菌超纯水补足至25μL；

（3）LAMP反应条件：64 ℃温育40 min；

（4）反应结果的测定：采用荧光染料目测观察法，待LAMP反应结束后，在LAMP反应的扩增产物中加入显色剂SYBR greenⅠ1.0 μL，在正常光照下，显色结果观察到绿色荧光，并且在波长为365nm的紫外光照射下呈白色浑浊沉淀状的判断为阳性，即存在三七黑斑病菌，在正常光照下，显色结果观察到橙色或橘黄色，并且在波长为365nm的紫外光照射下呈无色透明状的判断为阴性，即不存在三七黑斑病菌。

本发明的有益效果：本发明建立了三七黑斑病菌的快速、简便、特异性强、灵敏度高的LAMP检测技术体系，可用于三七黑斑病菌的检测，或用于三七黑斑病的发病前期、初期检测，对于确定病害防治的最佳时期具有十分重要的意义。

与现有技术相比，本发明具有以下的技术优势和积极效果：

1、特异性强：4个特异性引物共识别序列的6个不同区域，6个区域中任何区域与引物不匹配均不能进行核酸扩增，故特异性极高；

2、灵敏度高：本发明对三七黑斑病菌的检测灵敏度在DNA水平上可达到10fg/ μL，具有很高的灵敏性；

3、快速：应用本发明检测方法，可在1～1.5h 得到检测结果，而以往的PCR或巢式PCR检测需4～6h才可得到检测结果，本发明所述方法大大缩短了操作时间，方便快速；

4、成本低、应用性好：本发明操作简单，LMAP扩增反应在一个温度下扩增，不需要昂贵的PCR扩增仪等特殊仪器设备，成本低，只要简单的水浴锅或加热设备即可，便于基层推广使用；

5、检测结果分析简便、直观，肉眼可判断，且准确度高：本发明扩增产物可通过加显色剂进行染色，正常光照下呈绿色，并且在365nm的紫外光照射下呈白色浑浊沉淀状的判断为阳性，即待测样品中含三七黑斑病菌，在正常光照下，显色结果观察到橙色或橘黄色，并且在波长为365nm的紫外光照射下呈无色透明状的判断为阴性，说明待测样品中不含三七黑斑病菌，肉眼可判断检测结果，无需电泳检测及凝胶成像，且通过两种光照条件下检测，提高了检测结果的准确性。

附图说明

图1 为三七黑斑病菌LAMP特异引物在RNA polymerase II subunit (RPB2)基因序列中的位点。

图2 为本发明三七黑斑病菌的LAMP[a1] 。a为正常（自然）光照下的检测结果，1-3呈绿色；b为波长365nm紫外光照射下的检测结果，1-3呈白色浑浊沉淀状。图中1-3为三七黑斑病菌（Alternaria panax），4-7分别为烟草赤星病菌（A.alternata）、番茄早疫病菌（A.solani）、瓜链格孢菌（A.cucumerina）、胡萝卜链格孢菌（A.daucicola），8为阴性对照。

图3 为本发明三七黑斑病菌LAMP检测灵敏性。a为正常（自然）光照下的检测结果，1-5呈绿色；b为波长365nm紫外光照射下的检测结果，1-5呈白色浑浊沉淀状。图中1-7模板DNA浓度分别为100 pg、10 pg、1 pg、100 fg、10 fg、1 fg、100ag，8为阴性对照。

图4 为本发明检测方法对发病叶片中三七黑斑病菌的检测。a为正常（自然）光照下的检测结果，1-4呈绿色；b为波长365nm紫外光照射下的检测结果，1-4呈白色浑浊沉淀状。图中1为阳性对照，2-4为三七黑斑病发病叶片，5-7为健康三七叶，8为阴性对照。

具体实施方式

下面结合说明书附图和具体实施例对本发明作进一步地详细阐述，但不用来限制本发明的范围。以下实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均按照常规实验条件，或已发表相关文献中所述的操作技术规程，或按照厂商所建议的实验条件。

实施例 1：三七黑斑病菌环介导等温扩增（LAMP）检测特异性引物的设计及引物特异性验证

1.供试菌株基因组DNA的提取

采用CTAB 法提取供试菌株（表1）基因组 DNA，具体方法如下：取少量菌丝粉于1.5 mL离心管中（菌丝粉刚盖过半圆形底部为宜），加入900 µL 2%CTAB（十六烷基三甲基溴化铵）提取液（2% CTAB；100 mmol/L Tris-HCl, pH 8.0；20 mmol/L EDTA，pH8.0；1.4 mol/LNaCl）和90 µL SDS（十二烷基苯磺酸钠）【注：CTAB，SDS需60℃预热】，使用振荡器振荡混匀，60℃水浴1h（DNA释放至缓冲液中），12000 r·min^-1离心15 min；取上清液700 µL，加等体积酚、氯仿、异戊醇（25:24:1），轻轻振荡混匀，12000 r·min^-1离心9 min；取上清液500 µL，加入等体积氯仿再抽提一次，12000 r·min^-1离心5 min；取上清液350 µL，加入1/10体积3mol·L^-1 NaAc和2倍体积无水乙醇，-20℃沉淀30 min，12000 r·min^-1离心5 min；弃去上清液，加入700µL 冰70%乙醇进行洗涤（稍离心；倾掉上清液），在超净工作台上晾干无酒精味，加入30~60 µL TE（10 mmol/L Tris-HCl，0.1 mmol/L EDTA，pH 8.0）溶液进行溶解，得到 DNA 溶液，用紫外分光光度计检测 DNA 浓度并稀释至100 ng/µL待用。

表1 供试菌株

2. 三七黑斑病菌环介导等温扩增（LAMP）特异引物的设计

通过测定三七黑斑病菌莲链格孢（Alternaria panax）和其它病原菌的RNA polymerase II subunit (RPB2)基因序列，对链格属不同种间RPB2基因序列进行比对分析，利用在线LAMP引物设计软件Primer software Explorer V5 (https://primerexplorer.jp/lampv5/index.html; Eiken Chemical Co., Japan)设计三七黑斑病菌特异性LAMP引物组。引物在RPB2基因序列中的位点和序列见图1、表2。引物FIP由F1c和F2组成，引物BIP由B1c和B2组成。

表2 用于Alternaria panax LAMP检测的引物

1.三七黑斑病菌LAMP检测方法的建立及引物特异性验证

以表1供试菌株的DNA为模板，利用F3、B3、FIP和BIP进行LAMP扩增，LAMP检测反应体系为25 μL，包括5 μM引物F3和B3各1.0 μL，40 μM引物FIP和BIP各1.0 μL，LAMP反应混合液【40 mM Tris-HCl，20 mM (NH₄)₂SO₄，20 mM KCl，16 mM MgSO₄，1.6 mol/L甜菜碱(Betaine)，2.0 mM dNTPs，0.2% Trion X-100】12.5μL，8 U Bst聚合酶1.0 μL，DNA模板1.0μL，用灭菌超纯水补足至25μL；LAMP反应条件：64℃温育40 min；反应结果的测定：采用荧光染料目测观察法进行测定。待LAMP反应结束后，在LAMP反应的扩增产物中加入显色剂SYBRgreenⅠ1.0 μL，在正常光照下，显色结果观察到绿色荧光，并且在波长为365nm的紫外光照射下呈白色浑浊沉淀状的判断为阳性，即存在三七黑斑病菌，在正常光照下，显色结果观察到橙色或橘黄色，并且在波长为365nm的紫外光照射下呈无色透明状的判断为阴性，即不存在三七黑斑病菌。

4.引物特异性验证结果

LAMP扩增结果表明，供试的菌株中只有三七黑斑病菌显色结果可观察到绿色荧光和白色浑浊沉淀状，其余供试菌株显色结果为橙色和透明状（部分菌株检测结果如图2），说明所设计的三七黑斑病菌引物F3/B3和引物FIP/BIP可以将三七黑斑病菌与其它病原菌区分开来，具有种的特异性，可用于三七黑斑病菌快速可靠的检测和鉴定。

实施例2：三七黑斑病菌环介导等温扩增（LAMP）检测灵敏度测定

1.不同浓度基因组DNA的制备

用无菌超纯水对三七黑斑病菌基因组DNA进行稀释，配制成10倍数量级的系列浓度备用；

2. LAMP检测方法灵敏度测定及结果观察

以不同浓度的三七黑斑病菌基因组DNA为模板，利用引物F3/B3和引物FIP/BIP进行LAMP扩增，LAMP检测反应体系为25 μL，包括5 μM引物F3和B3各1.0 μL，40 μM引物FIP和BIP各1.0 μL，LAMP反应混合液【40 mM Tris-HCl，20 mM (NH₄)₂SO₄，20 mM KCl，16 mM MgSO₄，1.6 mol/L甜菜碱(Betaine)，2.0 mM dNTPs，0.2% Trion X-100】12.5μL，8 U Bst聚合酶1.0 μL，不同浓度DNA模板1.0 μL，用灭菌超纯水补足至25μL；LAMP反应条件：64℃温育40min；反应结果的测定：采用荧光染料目测观察法进行测定，待LAMP反应结束后，在LAMP反应的扩增产物中加入显色剂SYBR greenⅠ1.0 μL，在正常光照下，显色结果观察到绿色荧光，并且在波长为365nm的紫外光照射下呈白色浑浊沉淀状的判断为阳性，在正常光照下，显色结果观察到橙色或橘黄色，并且在波长为365nm的紫外光照射下呈无色透明状的判断为阴性。

3. LAMP扩增灵敏度检测结果

LAMP扩增灵敏度检测结果表明，100pg、10 pg、1 pg、100 fg、10 fg/μL浓度的三七黑斑病菌基因组DNA显色结果可观察到绿色荧光和白色浑浊状沉淀，其余浓度及阴性对照显色结果为橙色和无色透明状，说明所设计的三七黑斑病菌引物F3、B3、FIP和BIP通过LAMP扩增，对三七黑斑病菌的检测灵敏度可达10 fg/μL（图3）。

实施例3：发病叶片中三七黑斑病菌的LAMP检测

样品采集：从福建霞浦、福鼎、柘荣采集三七黑斑病发病症状典型的叶片及健康叶片带回实验室备用；

植物组织DNA的提取：采用NaOH快速裂解法提取DNA，具体过程如下：向每毫克植物组织中加入10µL 0.5 mol/L NaOH，在研钵中将组织充分磨碎成糊后转入1.5mL离心管中，12,000 rpm离心6 min，取上清液5 µl加入495µL 0.1 mol/L Tris-HCl（pH=8.0）混合均匀，取1.0 µL作为PCR模板进行扩增。

扩增检测及观察：以上述提取的DNA为模板，利用引物F3、B3、FIP和BIP进行LAMP扩增，LAMP检测反应体系为25 μL，包括5 μM引物F3和B3各1.0 μL，40 μM引物FIP和BIP各1.0μL，LAMP反应混合液【40 mM Tris-HCl，20 mM (NH₄)₂SO₄，20 mM KCl，16 mM MgSO₄，1.6mol/L甜菜碱(Betaine)，2.0 mM dNTPs，0.2% Trion X-100】 12.5μL，8 U Bst聚合酶1.0 μL，DNA模板1.0 μL，用灭菌超纯水补足至25μL；LAMP反应条件：64℃温育40 min；反应结果的测定：采用荧光染料目测观察法进行测定，待LAMP反应结束后，在LAMP反应的扩增产物中加入显色剂SYBR greenⅠ1.0 μL，在正常光照下，显色结果观察到绿色荧光，并且在波长为365nm的紫外光照射下呈白色浑浊沉淀状的判断为阳性，即存在三七黑斑病菌，在正常光照下，显色结果观察到橙色或橘黄色，并且在波长为365nm的紫外光照射下呈无色透明状的判断为阴性，即不存在三七黑斑病菌。

检测结果：检测结果（图4）表明，三七黑斑病发病的叶片通过LAMP扩增，显色结果可观察到绿色荧光和白色浑浊沉淀，说明存在三七黑斑病菌，而健康叶片及阴性对照显色结果为橙色和无色透明状，说明不存在三七黑斑病菌，该套技术能用于植物组织中三七黑斑病菌的快速分子检测。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 福建省农业科学院植物保护研究所

<120> 一种利用LAMP检测三七黑斑病菌的方法

<130> 4

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

TGGAGTCAGG ATGAGGTCG

19

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

GATCTGGCAG TGGCTTGAG

19

<210> 3

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

CCTCCTCTTC GGCGTCTAGG TAAACAAGCT ACTTACGGCT GG

42

<210> 4

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

TGGAGGAGTG GCGGGAGATG CACCCTCAGT TGATCGCTC

39

Claims

1.一种三七黑斑病菌的LAMP检测引物，其特征在于，所述引物包括如下：

F3：5’- TGGAGTCAGGATGAGGTCG -3’；

B3：5’- GATCTGGCAGTGGCTTGAG -3’；

FIP：5’- CCTCCTCTTCGGCGTCTAGGTA-AACAAGCTACTTACGGCTGG -3’；

BIP：5’-TGGAGGAGTGGCGGGAGATG-CACCCTCAGTTGATCGCTC-3’ 。

2.权利要求1所述引物在三七黑斑病检测中的应用。

3.一种利用权利要求1所述引物进行三七黑斑病菌的LAMP检测方法，其特征在于，包括如下步骤：

（1）待测样品DNA的提取：按照CTAB法或采用商品化试剂盒提取待测样品基因组DNA；

（2）LAMP扩增反应：以步骤（1）提取的待测样品DNA为模板，利用权利要求1所述的引物进行LAMP反应，LAMP检测反应体系为25 μL，包括5 μM引物F3和B3各1.0 μL，40 μM引物FIP和BIP各1.0 μL，LAMP反应混合液12.5μL，8 U Bst聚合酶1.0 μL，DNA模板1.0 μL，用灭菌超纯水补足至25μL；LAMP反应条件：64 ℃温育40 min；

（3）反应结果的测定：采用荧光染料目测观察法进行测定，待LAMP反应结束后，在LAMP反应的扩增产物中加入显色剂SYBR greenⅠ 1.0 μL，在正常光照下，显色结果观察到绿色荧光，并且在波长为365nm的紫外光照射下呈白色浑浊沉淀状的判断为阳性，即存在三七黑斑病菌，在正常光照下，显色结果观察到橙色或橘黄色，并且在波长为365nm的紫外光照射下呈无色透明状的判断为阴性，即不存在三七黑斑病菌。

4.根据权利要求3所述的一种三七黑斑病菌的LAMP检测方法，其特征在于，LAMP反应混合液由以下组分组成：40 mM Tris-HCl，20 mM (NH₄)₂SO₄，20 mM KCl，16 mM MgSO₄，1.6mol/L甜菜碱，2.0 mM dNTPs，0.2wt.% Trion X-100。