CN109439791A - 三七根腐病致病菌轮枝镰刀菌的Real-timePCR检测引物及方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种三七根腐病致病菌轮枝镰刀菌的Real‑time PCR检测引物及方法，检测引物的核苷酸序列为：上游引物Fv‑QF:5’GTCAGCGTTCTTATTACGGATGC3’，下游引物Fv‑QR:5’TGTTGGAGGTAGTTACCCTATGTTCA3’；本发明设计轮枝镰刀菌的特异性引物，建立标准曲线用于轮枝镰刀菌的定性定量分子检测和病害准确诊断；利用本发明能快速准确检测三七种植土壤以及三七病株中轮枝镰刀菌的数量动态变化，因而可以为三七土壤处理、根腐病的早期诊断和动态监测以及三七种子、种苗的带菌分子检测提供技术支持。
Description
技术领域
本发明涉及一种三七根腐病致病菌轮枝镰刀菌的Real-time PCR检测引物及其检测方法，专用于三七根腐病菌的快速分子检测，同时可实现田间三七根腐病菌的早期诊断和病菌的监测鉴定，属于农作物病害的分子生物学检测技术领域。
背景技术
三七[Panax notoginseng (Burk) F.H. Chen)]为五加科(Araliaceae)人参属(Panax)植物，其干燥根及根茎入药，是我国传统名贵中药材；其味甘、微苦、性温，归肝、胃、大肠经，具有化瘀止血、消肿止痛等作用。研究表明其主要成分有三萜类化合物甾醇类、人参炔三醇、黄酮类、糖类、微量元素和氨基酸等(Dawei L, Jiaqing C, Xiuli B, et al.New dammarane-type triterpenoids from the leaves of Panax notoginseng andtheir protein tyrosine phosphatase 1B inhibitory activity . Journal ofGinseng Research , 2014, 38(1): 28-33)。其中，三七总皂苷为其主要的药用活性成分，在三七中含量约为12%（郑丽华, 卢昌均, 周志昆. HPLC测定三七总皂苷中5种皂苷的含量及稳定性考察. 中医药临床杂志, 2012, 24(1): 73-75)。三七皂苷是治疗心血管疾病的活性成分，也是目前研究较为系统的化学物质，三七皂苷具有扩张冠状动脉、增加冠状血流量、降低血小板表面活性、抗动脉粥样硬化、抑制血小板活化、降低血黏度、黏附和聚集、抗血栓形成等作用(赵铁夫, 王盛宇, 陈宏. 不停跳冠状动脉旁路移植术术前应用三七三醇皂苷抗血小板的疗效研究. 中国医药, 2015, 10 (3): 309-311)。至今为止，已有70余种三萜类皂苷分别从三七的根茎、根块及花等组织中分离鉴定出来，它们均属于达玛烷型四环三萜类。它们具有非常广阔的应用和开发前景。三七独特的药效使得它在民间具有不可替代的地位，也是复方丹参滴丸、云南白药、血塞通、片仔癀等药品的主要原料，是我国少有的高附加值药用经济植物。
随着近年来三七产业的快速发展，三七种植面积的逐年增加，三七在大规模生产中面临的问题也随之而来，当前制约三七可持续发展的原因有两个方面：一是连作障碍问题严重，在三七的实际生产中适合种植三七的土地日益紧张，需要间隔10-15年以上才能复种，连作障碍大大增加了三七的种植成本。二是没有优良的新品种，三七种质资源严重退化，三七病害种类逐年增大，对三七的大规模生产造成巨大损失(崔秀明, 黄路琦, 等. 中国三七产业现状及发展对策. 中国中药杂志，2014, 39 (4): 553-557)。
三七的主要病害是根腐病，主要症状为根部腐烂，呈湿腐和干腐两型，地上部黄萎或青枯，常年损失5%～20%，严重的达70%，损失占各种三七病害的70%～85%；(蒋妮, 覃柳燕, 叶云峰. 三七病害研究进展. 南方农业学报, 2011, 42 (9): 1070-1074)。而轮枝镰刀菌是根腐病的致病菌之一。轮枝镰刀菌是属于镰刀属的一种真菌，菌丝呈白色长毛状，生长速度较快，2-3天即可生长成熟（兰楠. 轮枝镰刀菌velvet复合物生物学功能及粗糙脉孢菌有性发育分子调控机制的研究, [学位论文] 2013- 中国科学院大学: 微生物学）。
聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)技术，以其具有灵敏、特异等优点在植物病理学研究领域如植物病原菌的鉴定、病原菌分类、病原菌生理小种鉴定、病原菌群体遗传结构分析、抗病基因克隆等多方面得到广泛的应用。而实时荧光定量PCR技术具有定量、特异、灵敏和快速等特点，可以在短时间内处理大量样本获得大量有效数据，在病原菌初始菌源量或潜伏侵染病原菌的定量分析、病原菌抗药性频率监测、寄主抗病性快速测定、病害流行动态监测等研究领域方面具有独特的应用价值(Johnson CE, PremasuthanA, Satkoski Trask J, et al. Species identification of cannabis sativa usingreal-time quantitative PCR (qPCR). Journal of Forensic Sciences , 2013, 58(2): 486-490)；目前在植物病理学领域已经开发了许多病原菌的常规PCR检测方法，可以在此基础上将常规PCR转化为实时荧光定量PCR，更好地直接用于病害的定量研究；另外随着此技术研究的不断深入和改进，成本的降低和更多更好的荧光标记方法的出现，实时荧光定量PCR在植物病害流行学方面将有更广泛的应用前景。
发明内容
针对现有技术中对三七根腐病菌的检测和鉴定主要基于病原形态学特征，程序繁琐、耗时长，对鉴定经验要求高、准确度低，无法进行病原菌的定量分析，难以满足三七根腐病菌的快速准确诊断的现状，本发明提供了一种三七根腐病致病菌轮枝镰刀菌的Real-time PCR检测引物及其检测方法。
为实现上述目的，本发明采取了以下技术方案：
本发明首先提供了一种三七根腐病致病菌轮枝镰刀菌的Real-time PCR检测引物，其核苷酸序列为：
上游引物Fv-QF:5’GTCAGCGTTCTTATTACGGATGC3’
下游引物Fv-QR:5’TGTTGGAGGTAGTTACCCTATGTTCA3’；
所述引物Fv-QF和Fv-QR对三七根腐病菌轮枝镰刀菌特异性扩增出113 bp的产物。
本发明还提供了一种三七根腐病菌的快速检测方法，包括以下步骤：
(1) 提取三七样品或土壤的DNA；
(2) 以提取的三七样品或土壤的DNA为模板进行实时荧光定量PCR扩增；实时荧光定量PCR扩增反应体系为20 μL，其包含2×SYBR Green Mix 10 μL、无核酸酶水7 μL、上游引物Fv-QF (2μmol/L) 1 μL、下游引物Fv-QR (2μmol/L) 1 μL、DNA模板1 μL；在荧光定量PCR仪上扩增，扩增谱为95℃ 2 min，然后进行45个循环反应，每个循环反应为95℃ 1 min，62℃30 s，72℃ 1 min，于72℃ 时测定荧光值，每个循环结束后自动收集并记录荧光信号；
（3）实时荧光定量PCR标准曲线的建立
制备浓度为40 ng/μL的重组质粒pGEM-T-FvBlh作为标准品，进行10倍的浓度梯度稀释，共设置5个梯度，浓度在0.004ng/μL～40ng/μL范围内，稀释介质为无核酸酶水；对5个梯度的标准品进行实时荧光定量PCR反应，每个梯度设置3次重复。荧光定量PCR反应体系及扩增程序同步骤（2），于72℃时测定荧光值，每个循环反应结束后收集并记录荧光信号，以各梯度浓度对应的质粒质量对数值作为纵坐标，Ct值为横坐标，得到线性回归方程，并建立标准曲线；
(4) 若有荧光信号则可判定所检测样品中存在根腐病致病菌轮枝镰刀菌，将上步所得的Ct值带入本发明构建的标准曲线中，计算得到检测样品中轮枝镰刀菌的数量。
本发明的优点在于：
（1）准确性高：本发明是根据基因序列在真菌种内的高度保守性和属种间可变性的特点设计对三七根腐病致病菌轮枝镰刀菌具有特异扩增作用的Real-time PCR引物。已经对不同种植基地的三七根腐病样品进行了检测分析，只在根腐病病株的腐烂根部能特异性地扩增出一条113 bp的条带，说明本发明所设计的引物用于检测三七根腐病菌轮枝镰刀菌准确可靠；
（2）特异性强：本发明所设计的引物对三七根腐病致病菌轮枝镰刀菌具有很强的特异性，能够用于区别三七根腐病、三七黑斑病等三七上常见病害的病原菌；
（3）灵敏度高：本发明将设计的特异引物进行实时荧光定量PCR分析，对三七根腐病致病菌轮枝镰刀菌的检测灵敏度在DNA水平上可达到0.4 pg/μL；
（4）适用性广、实用性好：本发明的三七根腐病致病菌轮枝镰刀菌的实时荧光定量PCR检测方法，不仅能对病菌菌丝体进行检测，也能对感病的三七根部、叶片、种子、种苗以及土壤样品进行检测，可实现三七根腐病的早期检测，即在病害显症前进行检测，防治病害的爆发流行。
传统病原菌的分类、鉴定的方法不仅主观、繁杂，而且难以可靠地分析和鉴别近似种间和种内生理小种或致病型间存在的差异；本发明利用实时荧光定量PCR技术检测轮枝镰刀菌，从而快速鉴定三七病原菌的类型，可为三七病害的分类提供依据。此外，传统防治三七病害的方法是喷洒大量农药，不仅针对性不强，还可能带来了重金属农残等问题。利用本发明的检测技术，一方面通过阻断致病菌种子种苗的传播途径，可以有效降低三七病害特别是根系病害的发病频次，另一方面，基于三七病原菌的准确诊断，研发针对性、专一性、低毒高效的农药制剂，能从根本上减少农药的使用量，降低土壤农药残留，在生态保护方面有较大优势。
附图说明
图1为验证轮枝镰刀菌博来霉素水解酶（XM_018888941.1）基因特异性的扩增电泳图，其中泳道Marker为2000 bp DNA Marker，泳道1为尖孢镰刀菌，泳道2为茄腐镰刀菌，泳道3为核盘菌，泳道4为人参链格孢，泳道5为禾谷镰刀菌，泳道6为烟草赤星病菌，泳道7为轮枝镰刀菌，泳道8为阴性对照（无模板）；
图2为本发明引物对八种病原真菌进行实时荧光定量PCR的扩增曲线图（a）以及熔解曲线图（b），其中八种病原真菌分别为人参链格孢、烟草赤星病菌、核盘菌、茄腐镰刀菌、尖孢镰刀菌、轮枝镰刀菌、禾谷镰刀菌、葡萄座腔菌；
图3为本发明利用轮枝镰刀菌博来霉素水解酶基因片段构建质粒的实时荧光定量PCR的扩增曲线图，其中1至5号分别为浓度为40 ng/μL、4 ng/μL、0.4ng/μL、0.04 ng/μL、0.004ng/μL重组质粒pGEM-T-FvBlh标准品的实时荧光定量扩增曲线；
图4为以Ct值为横坐标，以质粒标准品质量对数值为纵坐标建立的标准曲线图；
图5为用本发明引物以及检测方法对12个三七样品以及三七种植土壤DNA进行实时荧光定量PCR的扩增曲线图，其中产生Ct值的6个检测样品分别是三七根腐病病株的根部样品3号、4号、5号、6号以及根腐病病株的土壤样品10号和11号。
具体实施方式
下面通过附图和实施例对本发明进一步说明，但本发明保护范围不局限于所述内容，本实施例中方法如无特殊说明的均按常规方法操作，所用试剂如无特殊说明的采用常规试剂或按常规方法配置的试剂。
实施例1：轮枝镰刀菌博来霉素水解酶基因特异性分析
根据前期研究结果选择轮枝镰刀菌博来霉素水解酶（XM_018888941.1）基因作为设计特异PCR引物的基因位点；
上下游引物序列分别为上游引物(Fv-F) 5’ACCCTACTGGGCGACATCGTTTC3和下游引物(Fv-R) 5’GCCGAGGATCATCCACAAGTGAGA3’；引物序列委托昆明硕擎生物科技有限公司合成。
从4℃冰箱取出几种冷藏保存的病原真菌，它们分别是人参链格孢（Alternaria panax）、烟草赤星病菌(Alternaria alternata)、核盘菌（Sclerotinia sclerotiorum）、尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）、轮枝镰刀菌（Fusarium verticillioides）、禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)、葡萄座腔菌（Botryosphaeria dothidea）；接种适量菌丝于新鲜的PDA培养基中，然后置于28℃培养箱中培养；五天后刮下菌丝，并采用CTAB法提取几种真菌的基因组DNA，采用紫外分光光度计检测DNA提取的纯度和质量浓度。
以上述几种病原真菌的基因组DNA为模板进行PCR，以检测引物的特异性，PCR反应体系（20 μL）如下：2×Rapid Taq Master Mix 10μL、无菌双蒸水7μL、上游引物Fv-F (2 μM) 1μL、下游引物Fv-R (2 μM) 1μL、DNA模板 1μL。PCR扩增条件为：95℃ 3min； 94℃ 30s，57℃ 30s， 72℃ 40s，28个循环；72℃ 5min；PCR产物通过1.2%琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图1所示，这对引物只在以轮枝镰刀菌DNA为模板的PCR扩增中产生了500 bp左右的扩增产物，并且与预期扩增产物长度451 bp相符；可初步认定本实验设计的引物具有种间特异性，利用本引物只在轮枝镰刀菌中产生特异的条带，而在其他镰刀属真菌中不引起有效扩增，因而能特异地将轮枝镰刀菌与其他镰刀属病原菌区分开来。
将PCR产物进行T-A克隆，选择pGEM ® -T easy Vector System (Promega，USA)作为克隆载体，与本发明PCR扩增产物进行连接，将连接产物转入大肠杆菌DH5α感受态细胞中，随后挑选阳性克隆测序，并对测序结果进行生物信息学分析。利用BLAST (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)在线分析工具对测序得到的序列与GenBank中的基因序列进行同源性分析，分析结果显示扩增序列与轮枝镰刀菌博来霉素水解酶（XM_018888941.1）基因有99%的相似性。可见本发明设计的引物能特异性扩增轮枝镰刀菌的博来霉素水解酶基因。
实施例2：实时荧光定量PCR引物设计以及特异性分析
根据上述实施例中的基因序列，设计实时荧光定量PCR的特异性引物，设计的上下游引物的核苷酸序列分别为5’GTCAGCGTTCTTATTACGGATGC33’（Fv-QF）和5’TGTTGGAGGTAGTTACCCTATGTTCA3’（Fv-QR），并委托昆明硕擎生物科技有限公司合成上述引物。
以实施例1中几种病原真菌的基因组DNA为模板进行Real-time PCR，按照如下的体系进行荧光定量PCR以检测本发明中引物的特异性；荧光定量PCR反应体系（20 μL）包含无核酸酶水7 μL、2×SYBR Green Mix 10 μL、上游引物Fv-QF (2 μM) 1 μL、下游引物Fv-QR (2 μM) 1 μL、DNA模板1 μL；在荧光定量PCR仪上扩增，扩增谱为95℃ 预处理2 min，然后进行45个循环反应，每个循环反应包括95℃ 1 min，62℃ 30 s，72℃ 1 min于72℃ 时测定荧光值；并在每个循环结束后自动收集并记录荧光信号。
每个真菌DNA模板设置3次重复，并设置阴性对照（不加模板DNA，以无核酸酶水代替），用于检验是否存在模板污染和生成引物二聚体。特异性扩增曲线如图2a所示，只在以轮枝镰刀菌DNA为模板的real-time PCR反应中产生了有效的扩增，三个重复得到三条重合的扩增曲线，其Ct值分别为26.23、26.51、26.71，可见本发明的Real-time PCR引物特异性很好，在其他病原真菌和阴性对照中均无扩增。此外，熔解曲线图(2b)也表明本发明的引物特异性好，没有产生引物二聚体，也没有形成错配的PCR产物。
实施例3：实时荧光定量PCR标准曲线的建立
将携带实施例1中轮枝镰刀菌博来霉素水解酶基因片段的重组质粒（pGEM-T-FvBlh）的大肠杆菌涂布在固体LB平板培养基上，37℃倒置过夜生长12 h；然后用高压灭菌的牙签从LB平板上挑取一个单菌落接入添加氨苄青霉素的液体LB培养基中，37℃ 200rpm/min 振荡培养12h，然后采用SanPrep柱式质粒DNA小量抽提试剂盒(上海生工)提取质粒，并用紫外分光光度计测定质粒的浓度，将抽提的质粒置于-80℃备用；
将测定好浓度的质粒作为标准品，进行10倍的浓度梯度稀释，共设置5个梯度，分别为40 ng/μL、 4 ng/μL、0. 4 ng/μL、0.04 ng/μL、0.004 ng/μL，稀释介质为无核酸酶水。对5个梯度的标准品进行实时荧光定量PCR反应，每个梯度设置3次重复。荧光定量PCR反应体系（20 μL），包含无核酸酶水7 μL，2×SYBR Green Mix 10 μL，上游引物Fv-QF (2 μM) 1 μL，下游引物Fv-QR (2 μM) 1 μL，DNA模板1 μL，其中模板为5个质量浓度梯度的质粒标准品。在荧光定量PCR仪上扩增，扩增谱为95℃ 2 min，然后进行45个循环反应，每个循环反应为95℃ 1 min，62℃ 30 s，72℃ 1 min，于72℃时测定荧光值，并在每个循环结束后自动收集并记录荧光信号。
质粒标准品的Real-time PCR扩增曲线见图3，每个标准品得到的Real-time PCRCt值见表1；同时以各梯度浓度对应的质粒质量对数值作为纵坐标，Ct值为横坐标，在Excel软件中生成标准曲线，得到线性回归方程为y=-0.3189x +4.2756，R2=0.997，建立的标准曲线见图4；该曲线斜率为-0.3189（处于-1~0之间），相关系数（R2）为0.997。
表1 轮枝镰刀菌质粒标准品的Ct值
此外，进一步实验结果显示当模板浓度低于0.4 pg/μL时，Ct值与模板浓度(log值)不再具有线性关系，表明本发明建立的轮枝镰刀菌实时荧光定量PCR检测的最低模板浓度为0.4 pg/μL；可见本发明建立的实时荧光定量PCR检测方法灵敏度很高。
实施例4：三七根腐病菌轮枝镰刀菌Real-time PCR检测方法的应用
三七种植基地的三七病害主要以根腐病和黑斑病为主，本发明在文山州三七主产区采集具有根腐病、黑斑病典型症状的三七病株以及三七种植土壤，运用本发明设计的轮枝镰刀菌特异Real-time PCR引物及其检测方法对这些样品进行分析。
将采集到的样本先进行编号，1-2号为正常三七的根部样品，3-6号为根腐病样品，7号为健康叶片样品，8-9号为黑斑病病叶样品，10-11号为根腐病病株的土壤样品，12号为健康三七根部土壤样品，13号为无模板阴性对照。取0.1g样品，并用CTAB法提取各样品的总DNA，DNA编号与样本编号相同；接着用样本的DNA进行荧光定量PCR反应，扩增反应体系为20μL，包含无核酸酶水7 μL、2×SYBR Green Mix 10 μL、上游引物Fx-QF (2 μM) 1 μL、下游引物Fv-QR (2 μM) 1 μL、DNA模板1 μL；在荧光定量PCR仪上扩增，扩增谱为95℃ 2 min，然后进行45个循环反应，每个循环反应为95℃ 1 min，62℃ 30 s，72℃ 1 min，于72℃时测定荧光值，并在每个循环结束后自动收集并记录荧光信号；
得到的扩增曲线见图5，各样品三次重复的Ct值平均值见表2；从图5中可以看出3-6号样品有扩增曲线，10和11号样本也产生了扩增曲线，其余样品均无扩增曲线。从表2中可以看出3-6号样品的Ct值平均值分别为30.57、30.71、30.26、30.73，轮枝镰刀菌的含量约为9-10 pg/g样品，说明在三七根腐样品中能检测到轮枝镰刀菌；10-11号样品的Ct值平均值分别为36.08、35.97，轮枝镰刀菌的含量在0.18 pg/g样品左右，说明在三七根腐病病株的土壤中也能检测到极微量的轮枝镰刀菌；1-2号样品、7-9号样品、12号样品均无Ct值，说明在健康的三七根部、叶片及黑斑病病叶以及正常土壤样品中未检测到轮枝镰刀菌。
上述实验结果显示，使用本发明引物及实时荧光定量PCR检测方法，能准确诊断三七的根腐病样品，可检测的最低模板浓度为0.4 pg/μL，可见本发明设计的引物以及建立的实时荧光定量PCR方法特异性好，灵敏、可靠，可以达到特异性检测三七根腐病致病菌轮枝镰刀菌的目的；
表2 12个三七和土壤样品的实时荧光定量PCR检测结果
。
序列表
<110> 昆明理工大学
<120> 三七根腐病致病菌轮枝镰刀菌的Real-time PCR检测引物及方法
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 1
accctactgg gcgacatcgt ttc 23
<210> 2
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 2
gccgaggatc atccacaagt gaga 24
<210> 3
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 3
gtcagcgttc ttattacgga tgc 23
<210> 4
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 4
tgttggaggt agttacccta tgttca 26
Claims (4)
1.一种三七根腐病致病菌轮枝镰刀菌的Real-time PCR检测引物，其特征在于，引物的核苷酸序列为：
上游引物Fv-QF:5’GTCAGCGTTCTTATTACGGATGC3’
下游引物Fv-QR:5’TGTTGGAGGTAGTTACCCTATGTTCA3’。
2.利用权利要求1所述检测引物的三七根腐病致病菌轮枝镰刀菌的检测方法，其特征在于包括以下步骤：
（1）提取三七样品或土壤的DNA；
（2）以提取DNA为模板进行实时荧光定量PCR扩增，扩增程序为95℃ 2 min，然后进行45个循环反应，每个循环反应为95℃ 1 min，62℃ 30 s，72℃ 1 min，于72℃ 时测定荧光值，每个循环结束后收集并记录荧光信号；
（3）实时荧光定量PCR标准曲线的建立
制备浓度在0.004ng/μL～40ng/μL范围内的重组质粒pGEM-T-FvBlh溶液，对不同浓度的溶液进行实时荧光定量PCR反应，扩增程序同步骤（2），于72℃时测定荧光值，每个循环反应结束后收集并记录荧光信号，以各梯度浓度对应的质粒质量对数值作为纵坐标，Ct值为横坐标，得到线性回归方程，并建立标准曲线；
（4）若出现荧光信号则可判定所检测样品中存在根腐病致病菌轮枝镰刀菌，并将获得的Ct值带入构建的标准曲线中，计算得到检测样品中轮枝镰刀菌的数量。
3.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于：实时荧光定量PCR的反应体系为20μL，其包含2×SYBR Green Mix 10μL、无核酸酶水7μL、上游引物Fv-QF 1 μL，下游引物Fv-QR 1μL、DNA模板1μL。
4.根据权利要求3所述的检测方法，其特征在于：上游引物Fv-QF和下游引物Fv-QR的浓度均为2μmol/L。
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| CN111172314A (zh) * | 2020-02-21 | 2020-05-19 | 福建省农业科学院植物保护研究所 | 一种利用lamp检测三七黑斑病菌的方法 |
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| CN109439791B (zh) | 2021-11-23 |
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