CN107557446A - 用于同时检测蓝莓四种病害病原菌的核酸、试剂盒及方法 - Google Patents
用于同时检测蓝莓四种病害病原菌的核酸、试剂盒及方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及用于同时检测蓝莓四种病害病原菌的核酸、试剂盒及方法，核酸包括用于检测枝枯病病原菌的上、下游引物，检测溃疡病病原菌的上、下游引物，检测叶斑病病原菌的上、下游引物和检测根癌病病原菌的上、下游引物。试剂盒中包括对应各病原菌的特异性引物和探针。本发明提供的试剂盒使用方便，所用的试剂少，检测的特异性强，灵敏度高。还提供了对导致蓝莓枝枯病、溃疡病、叶斑病和根癌病四种病原菌的检测方法，该方法实现了对同一个样本，可进行4种病原菌的检测，大大简化了操作过程，减少了重复操作的过程，节省时间，减轻重复操作消耗的劳动力，并有效节约成本，实现快速筛查。
Description
技术领域
本发明属于生物技术检测领域，具体涉及一种用于同时检测蓝莓四种病害病原菌的试剂盒及方法。
背景技术
蓝莓(Vaccinium spp.)，是一类属于杜鹃花科(Ericaceae)越橘属(Vaccinium)的多年生小浆果类果树，广泛地应用于医药、保健、化妆品和环境保护等各方面，联合国粮农组织将其果实列为人类世界五大健康食品之一，也是我国南方酸性土丘陵地区值得发展的经济作物。全国已超过10个省份开始大面积的蓝莓商业化栽培，预计未来10年将超过10万hm2。但是，随着生产面积的不断扩大，蓝莓病害也日趋严重，严重影响和制约蓝莓产业的发展。
蓝莓病害有蓝莓枝枯病即枝条枯萎病，表现枝枯和茎枯病症状主要为害嫩枝、枝条和主干，发病初期，感病枝条上产生红褐色圆或椭圆形坏死斑，随后逐渐扩大，造成枝条干枯死亡，并可扩展造成主干枯萎。调查发现，该病发病率通常在10％～20％，重者可达25％以上，可引起蓝莓整株枯萎死亡。
蓝莓溃疡病在发病早期，部分枝条任呈现健康症状，但是发病枝条的韧皮部或木质部的横切面显示病变，颜色呈现淡褐色或灰黑色，典型症状表现为枝条或茎秆的枯萎死亡。
蓝莓叶斑病是一种普遍性病害，在蓝莓的一生中均可发生，主要危害叶片，感染初期在叶片上出现斑点，斑点逐渐扩大形成病斑，影响叶片的光合作用，从而阻碍果树的生长、发育及坐果情况。
蓝莓根癌病的病害症状，早期表现为根部出现小的隆起，表面粗糙的白色或肉色瘤状物，之后颜色慢慢变深、增大，最后变成棕色或黑色。直接影响植株根部吸收，造成植株营养不良，发育受阻。有研究通过对病害植株根系的分离获得了19株致病菌，并确定是由根癌土壤杆菌侵染导致蓝莓根癌病的发生。但是目前对根癌土壤杆菌未见有报道。
近年来，蓝莓枝枯病、溃疡病、叶斑病和根癌病在我国蓝莓产区的发病率不断上升，四者复合侵染的情况越来越多，每年给我国蓝莓产业造成逾百亿元的经济损失。目前尚缺乏蓝莓枝枯病、溃疡病、叶斑病和根癌病的高效杀菌剂和抗病品种，一旦发现有感染这四种病害，需要及时清除病树，防止病害蔓延此外，还要加强非疫区的管理，防止这几种病害的侵入，因此，针对导致蓝莓枝枯病、溃疡病、叶斑病和根癌病和叶斑病的病原菌，建立早期快速检测方法就显得尤为重要。
发明内容
(一)要解决的技术问题
为了解决现有技术的上述问题，本发明提供一组用于同时检测导致蓝莓枝枯病、溃疡病、叶斑病和根癌病的四种病原菌的核酸。本发明还提供一组用于荧光定量PCR同时检测导致蓝莓枝枯病、溃疡病、叶斑病和根癌病的四种病原菌的试剂盒及其检测方法。
(二)技术方案
为了达到上述目的，本发明采用的主要技术方案包括：
一组用于多重PCR同时检测导致蓝莓枝枯病、溃疡病、叶斑病和根癌病四种病原菌的核酸，包括检测枝枯病病原菌的上、下游引物，检测溃疡病病原菌的上、下游引物，检测叶斑病病原菌的上、下游引物和检测根癌病病原菌的上、下游引物；
其中，所述枝枯病病原菌的上游引物序列如SEQ ID No.1所示，下游引物序列如SEQ ID No.2所示；
所述溃疡病病原菌的上游引物序列如SEQ ID No.4所示，下游引物序列如SEQ IDNo.5所示；
所述叶斑病病原菌的上游引物序列如SEQ ID No.7所示，下游引物序列如SEQ IDNo.8所示；
所述根癌病病原菌的上游引物序列如SEQ ID No.10所示，下游引物序列如SEQ IDNo.11所示。
一组用于荧光定量PCR同时检测导致蓝莓枝枯病、溃疡病、叶斑病和根癌病四种病原菌的核酸，包括枝枯病病原菌的上、下游引物和探针、溃疡病病原菌的上、下游引物和探针、叶斑病病原菌的上、下游引物和探针、及根癌病病原菌的上、下游引物和探针；
所述枝枯病病原菌的上游引物序列如SEQ ID No.1所示，下游引物序列如SEQ IDNo.2所示，探针序列如SEQ ID No.3所示；
所述溃疡病病原菌的上游引物序列如SEQ ID No.4所示，下游引物序列如SEQ IDNo.5所示，探针序列如SEQ ID No.6所示；
所述叶斑病病原菌的上游引物序列如SEQ ID No.7所示，下游引物序列如SEQ IDNo.8所示，探针序列如SEQ ID No.9所示；
所述根癌病病原菌的上游引物序列如SEQ ID No.10所示，下游引物序列如SEQ IDNo.11所示，探针序列如SEQ ID No.12所示。
如上所述的核酸，优选地，还包括检测枝枯病病原菌、溃疡病病原菌、叶斑病病原菌和根癌病病原菌的阳性扩增产物，其中，
所述检测枝枯病病原菌的阳性扩增产物，含如SEQ ID No.13所示的序列；
所述检测溃疡病病原菌的阳性扩增产物，含如SEQ ID No.14所示的序列；
所述检测叶斑病病原菌的阳性扩增产物，含如SEQ ID No.15所示的序列；
所述检测根癌病病原菌的阳性扩增产物，含如SEQ ID No.16所示的序列。
一种用于同时检测导致蓝莓枝枯病、溃疡病、叶斑病和根癌病的病原菌的试剂盒，该试剂盒包括：检测上述枝枯病病原菌、溃疡病病原菌、叶斑病病原菌、根癌病病原菌的上、下游引物和相应的探针，各条探针的5′端和3′端分别对应标记JOE-TAMRA、Texred-MGB、FAM-BHQ1和CY5-BHQ3。
如上所述的试剂盒，优选地，还包括2×Premix EX Taq，和/或枝枯病病原菌、溃疡病病原菌、叶斑病病原菌和根癌病病原菌的阳性扩增产物。
一种用于荧光定量PCR同时检测导致蓝莓枝枯病、溃疡病、叶斑病和根癌病四种病原菌的方法，包括以下步骤：
(1)从样品中提取DNA；
(2)对所述步骤(1)提取的DNA进行荧光定量PCR扩增；其中，荧光定量PCR扩增时，在反应体系中，采用枝枯病病原菌的上、下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.1和SEQ IDNo.2所示，探针的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，其5′端和3′端分别对应标记JOE和TAMRA；溃疡病病原菌的上、下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.4和SEQ ID No.5所示，探针的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示，其5′端和3′端分别对应标记Texred和MGB；叶斑病病原菌上、下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.7和SEQ ID No.8所示，探针的核苷酸序列如SEQ ID No.9所示，其5′端和3′端分别对应标记FAM和BHQ1；根癌病病原菌上、下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.10和SEQ ID No.11所示，探针的核苷酸序列如SEQ ID No.12所示，其5′端和3′端分别对应标记CY5和BHQ3；
(3)收集荧光信号，选择上述荧光基团的荧光检测模式，基线调整取3～15个循环的荧光信号，以阈值线刚好超过正常阴性对照的最高点设定阈值线；
(4)结果判定：待测样品荧光增长曲线超过阈值线，并呈现良好的对数增长，则判断为阳性，如无典型的扩增曲线，判断为阴性。
如上所述的方法，优选地，所述步骤(2)中荧光定量PCR扩增的反应体系具体如下：
1×Premix EX Taq所述枝枯病病原菌的上游引物的终浓度为60nmol/L，下游引物的终浓度为60nmol/L，探针的终浓度为80nmol/L；所述溃疡病病原菌的上游引物的终浓度为200nmol/L，下游引物终浓度为200nmol/L，探针的终浓度为100nmol/L；所述叶斑病病原菌的上游引物终浓度为80nmol/L，下游引物终浓度为80nmol/L，探针的终浓度为100nmol/L；所述根癌病病原菌上游引物终浓度为200nmol/L，下游引物终浓度为200nmol/L，探针的终浓度为80nmol/L；
所述DNA为2μL；
同时设置无核酸酶水为阴性对照。
如上所述的方法，优选地，所述步骤(2)中荧光定量PCR扩增的反应程序为：94℃5min，扩增阶段94℃30s，58℃30s，72℃30s扩增45个循环，72℃7min，4℃保持。
如上所述的方法，优选地，所述方法还设有采用含有如包含如SEQ ID No.13所示的序列、SEQ ID No.14所示的序列、SEQ ID No.15所示的序列的和SEQ ID No.16所示序列的基因作为枯病病原菌、溃疡病病原菌、叶斑病病原菌和根癌病病原菌的阳性对照。
如上所述的方法，优选地，所述步骤(4)结果判定中，所述阈值为35，当Ct值≤35时，有明显扩增曲线为阳性结果；Ct值＞40时，无明显扩增曲线为阴性结果。
(三)有益效果
本发明的有益效果是：
本发明提供了检测枝枯病病原菌、溃疡病病原菌、叶斑病病原菌和根癌病病原菌的核酸组，该组核酸可用于单一病原菌的检测，也可用于上述几种病原菌同步检测的多重扩增使用。用于同步检测这四种病原菌时，其检测灵敏度高，特异性强，经过验证，相互之间不发生交叉反应。
本发明还提供了，一种用于荧光定量PCR同时检测枝枯病病原菌、溃疡病病原菌、叶斑病病原菌和根癌病病原菌的试剂盒，同时建立了一种比较高效、灵敏的，可同时检查四种病原菌，具体为导致蓝莓枝枯病、溃疡病、叶斑病和根癌病四种病原菌的快速检测方法。该方法能有效提高检测的灵敏度，避免假阴性。提供的检测试剂盒使用方便，操作简便，自动化程度高，有效替代传统病原菌分离来获得检测结果，且试剂盒所用的试剂少，大大简化了操作过程，减少了重复操作的过程，也就减少了在操作过程的污染，避免重复操作而消耗过多的劳动力，节省时间，有效节约成本，实现了快速筛查，所用试剂盒的检测效果好，特异性强，灵敏度高。
提供的检测方法采用完全闭管操作，操作简单、方便快捷、通过直接探测PCR过程中荧光信号的变化来获得定量的结果，不需要PCR后处理或电泳检测，克服了常规PCR技术的易污染、出现假阳性，能有效避免非特异性扩增难题，并且适合大批量样本的检测。
蓝莓被病原菌感染，一般很难发现和控制，而本发明提供的试剂盒具有较高的检测灵敏度，且对1个样本的检测可实现对四种病原菌的排查，且主要是检测待测样本中是否含有导致蓝莓枝枯病、溃疡病、叶斑病和根癌病四种病原菌的核酸，有助于提前发现病原菌，为能及时有效控制枝枯病病原菌、溃疡病病原菌、叶斑病病原菌和根癌病病原菌的传播与扩散，提供有效的技术支持。
附图说明
图1为同时检测三种病原菌的PCR电泳结果。
图2为本发明荧光定量PCR同时检测四种病原菌时，检测枝枯病病原菌的灵敏度测试结果图；
图3为本发明荧光定量PCR同时检测四种病原菌时，检测溃疡病病原菌的灵敏度测试结果图；
图4为本发明荧光定量PCR同时检测四种病原菌时，检测叶斑病病原菌的灵敏度测试结果图；
图5为本发明荧光定量PCR同时检测四种病原菌时，检测根癌病病原菌的灵敏度测试结果图。
具体实施方式
为了更好的解释本发明，以便于理解，下面结合附图，通过具体实施方式，对本发明作详细描述。
实施例1引物、探针的设计
首先分别筛选四种病原菌的特异目标基因，根据检测目的，对导致每种病害的病原菌从GenBank下载多条基因序列，进行比对分析，选取保守区，采用Array Designer4.0software软件辅助设计扩增引物及适合荧光定量PCR反应体系的杂交探针。
由于本发明是多重荧光定量，首先探针标记的选择比较关键，其次软件设计出来的探针要经过筛选，四个基因的探针信号不能相互干扰，这就需要在设计探针时考虑四对引物和四条探针之间都不能相互干扰。
荧光定量PCR检测是在普通PCR检测的基础上，进一步通过特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5'－3'外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。所以荧光定量PCR检测的前提是要进行PCR扩增反应，扩增反应之间的引物及产物需尽量避免交叉反应，再进一步保证特异性探针与各个扩增产物、引物均不应有交叉反应。又由于本发明是多重荧光定量，所以探针标记的选择也比较关键，不仅要对软件设计出来的探针要经过筛选，四个基因的探针信号还不能相互干扰。
分别设计出枝枯病病原菌、溃疡病病原菌、叶斑病病原菌和根癌病病原菌基因多条引物序列和杂交探针序列，采用NCBI Blast在线分析软件(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast)对拟选用的探针和引物组合进行序列同源性和适配性分析评估，并通过检测试验最终选定这四种病原菌特异且适合多重荧光定量反应体系的引物与探针组合。
对于每种病原菌设计的扩增引物首先要进行但病原菌的扩增检测，确认单个病原菌扩增检测没有非特异性扩增后，再进行多重病原菌的扩增，设计引物就需要尽量避免发生交叉反应，还要考虑扩增条件要尽量一致，最终通过杂交反应排除交叉反应；根据上述设计、生物信息学分析和发明人的经验设计及大量实验检测试验筛选结果确定以下序列：
枝枯病病原菌特异的扩增引物对(1-F、1-R)和杂交探针(1-P)：如SEQ ID No.1、SEQ ID No.2所示的特异扩增引物对，以及如SEQ ID No.3所示的杂交探针序列，具体如下：
1-F(SEQ IDNo.1)：5′-CGGGCGGATCAGCGAAAC-3′；
1-R(SEQ IDNo.2)：5′-TCTTATCAAGTCTGGCTTTCTCAAC-3′；
1-P(SEQ IDNo.3)：5′-CGTCATTTCCAAGCCATTCTGCCGC-3′。
溃疡病病原菌特异的扩增引物对(2-F、2-R)和杂交探针(2-P)：如SEQ ID No.4、SEQ ID No.5所示的特异扩增引物对，以及如SEQ ID No.6所示的特异探针序列，具体如下：
2-F(SEQ IDNo.4)：5′-CCACACGAATTGCTTGATTCATTG-3′
2-R(SEQ IDNo.5)：5′-TGACCAACTTCACCAGGTAACTG-3′
2-P(SEQ IDNo.6)：5′-CGAACTGCCGACCTCACCCTTATCA-3′。
叶斑病病原菌特异的扩增引物对(3-F、3-R)和杂交探针(3-P)：如SEQ ID No.7、SEQ ID No.8所示的特异扩增上下游引物，以及如SEQ ID No.9所示的杂交探针序列，具体如下：
3-F(SEQ IDNo.7)：5′-GTCGTAACAAGGTCTCCGTAGG-3′；
3-R(SEQ IDNo.8)：5′-ACAAGGGTGAATAATTCAGCAAGG-3′；
3-P(SEQ IDNo.9)：5′-CCCGAGAGGTTCCAGCCCGCC-3′。
根癌病病原菌特异的扩增引物对(4-F、4-R)和杂交探针(4-P)：如SEQ ID No.10、SEQ ID No.11所示的特异扩增引物对，以及如SEQ ID No.12所示的特异探针序列，具体如下：
4-F(SEQ IDNo.10)：5′-CAACTCTGGAACTGCCTTTGATAC-3′，
4-R(SEQ IDNo.11)：5′-GCACCTCAGCGTCAGTAATGG-3′，
4-P(SEQ IDNo.12)：5′-CGCCTTCGCCACTGGTGTTCCTCC-3′。
经大量实验验证，采用上述引物、探针时，可单独用于检测各对应的病原菌的检测，其探针的5′端和3′端分别可选用标记JOE-TAMRA、Texred-MGB、FAM-BHQ1和CY5-BHQ3。但进行同时检测四病原菌时，各探针标记则应对应标记这四种组合关系也就是说采用JOE-TAMRA、Texred-MGB、FAM-BHQ1和CY5-BHQ3分别标记枝枯病病原菌的探针，溃疡病病原菌的探针，叶斑病病原菌的探针，根癌病病原菌的探针，各探针5′端和3′端标记是不重合的，但是可随意进行组合，检测结果不受影响，当然单独一个病毒进行检测时，探针也可选用其它荧光基团如VIC、NED等作为发光基团，使用如BHQ和BHQ2等作为非荧光淬灭基团。
实施例2普通PCR检测四种病原菌
本发明用于检测枝枯病病原菌的引物对，其扩增产物的阳性序列如S EQ IDNo.13所示，大小为99bp，SEQ ID No.13：CGGGCGGATCAGCGAAACAGGGACGGGACCGTCATTTCCAAGCCATTCTGCCGCTGCGCGGTAAGATTCTGAACGTTGAGAAAGCCAGACTTGATAAGA。
用于检测溃疡病病原菌的引物对，其扩增产物的阳性序列如SEQ I DNo.14所示，大小为166bp，SEQ IDNo.14：CCACACGAATTGCTTGATTCATTGAAGAAGACGATGAGAAGCAGCTTTTGCTTTGCACACCCGATTTTGGGTCTGTAGCTCAGTTGGTTAGAGCGCACCCCTGATAAGGGTGAGGTCGGCAGTTCGAATCTGCCCAGACCCACCAGTTACCTGGTGAAGTTGGTCA。
用于检测叶斑病病原菌的引物对，其扩增产物的阳性序列如SEQ I DNo.15所示，大小为108bp，SEQ IDNo.15：GTCGTAACAAGGTCTCCGTAGGTGAACCTGCGGAGGGATCATTACACAAATATGAAGGCGGGCTGGAACCTCTCGGGGTTACAGCCTTGCTGAATTATTCACCCTTGT。
用于检测根癌病病原菌的引物对，其扩增产物的阳性序列如SEQ I DNo.16所示，大小为145bp，SEQ IDNo.16：CAACTCTGGAACTGCCTTTGATACTGGGTATCTTGAGTATGGAAGAGGTAAGTGGAATTCCGAGTGTAGAGGTGAAATTCGTAGATATTCGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTTACTGGTCCATTACTGACGCTGAGGTGC。
对实施例1中的引物及上述扩增产物的阳性序列进行合成，获得引物对及携带含有如序列SEQ ID No.13、SEQ ID No.14、SEQ ID No.15、SEQ ID No.16所示序列的阳性质粒DNA。
利用引物和阳性质粒DNA并进行普通PCR扩增，采用宝生物工程(大连)有限公司公司的Premix EX Taq×2，25μL反应体系：各上下游引物(10μM)0.5μL；Premix EX Taq×212.5μL；各阳性质粒DNA模板1μL，其余用无核酸酶水补足。
PCR扩增反应条件优选为：
反应条件：预变性阶段95℃，4min；扩增阶段94℃，25sec；58℃，30sec；72℃，30s，30个循环；72℃，7min；4℃保温。
对扩增产物进行电泳，如图1所示，图中，1为阴性对照、2为枝枯病病原菌、3为溃疡病病原菌、4为叶斑病病原菌、5为根癌病病原菌的扩增结果，6为DNA Marker。结果显示，所设计的引物可有效扩增出对应的枝枯病病原菌、溃疡病病原菌、叶斑病病原菌和根癌病病原菌的阳性条带。
实施例3荧光定量PCR检测试剂盒
用于检测枝枯病病原菌、溃疡病病原菌、叶斑病病原菌和根癌病病原菌的荧光定量PCR检测试剂盒包括以下成分：
Premix EX Taq×2；
用于检测枝枯病病原菌的上游引物序列如SEQ ID No.1所示，下游引物序列如SEQID No.2所示，探针序列如SEQ ID No.3所示，探针SEQ IDNo.3的5′标记JOE，3′标记TAMRA；
用于检测溃疡病病原菌的上游引物序列如SEQ ID No.4所示，下游引物序列如SEQID No.5所示，探针序列如SEQ ID No.6所示其中，探针SEQ IDNo.6的5′标记Texred，3′标记MGB；
用于检测叶斑病病原菌的上游引物序列如SEQ ID No.7所示，下游引物序列如SEQID No.8所示，探针序列如SEQ ID No.9所示，其中，探针SEQ IDNo.9的5′标记FAM，3′标记BHQ1；
用于检测根癌病病原菌的上游引物序列如SEQ ID No.10所示，下游引物序列如SEQ ID No.11所示，探针序列如SEQ ID No.12所示，其中，探针SEQ IDNo.12的5′标记CY5，3′标记BHQ3。
进一步的，还包括有阴性对照、阳性对照。
其中阴性对照采用无核酸酶水；阳性对照采用携带有扩增产物的质粒DNA，所述扩增产物的核苷酸序列分别如SEQ ID No.13、SEQ ID No.14、SEQ ID No.15、SEQ ID No.16所示。
阴性对照的设计能有效验证所用试剂是否受到污染，避免假阳性发生，阳性对照的设计能有效验证受用试剂的有效性，避免假阴性的发生。
其中，所述Premix EX Taq×2、无核酸酶水可购自宝生物工程(大连)有限公司；引物、探针、质粒可委托英潍捷基(上海)贸易有限公司合成。
实施例4荧光定量PCR检测同时检测四种病原菌的方法
采用荧光定量PCR同时检测枝枯病病原菌、溃疡病病原菌、叶斑病病原菌和根癌病病原菌的方法包括以下步骤：
(1)DNA提取
将植物样品材料剪成1cm左右碎片，放入预冷的瓷研钵中；加入液氮速冷，研磨成细粉(越细越好)；在5ml离心管中加入抽提缓冲液2.5mL，60℃保温1小时；15 000rpm，离心10分钟；上清转入另一个新的离心管中；加入等体积氯仿：异戊醇(24:1)，混匀抽提至水乳胶融状；15 000rpm，离心10分钟；上清转入另一个新的离心管中；加入2/3倍体积预冷异丙醇，-20℃保温30min，缓缓混匀DNA成絮状折出；15 000rpm，离心10分钟，弃上清；DNA沉淀用70％乙醇洗2次；加入400μL TE buffer溶解DNA。其中，CTAB抽提缓冲液：2％CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)，1％β-巯基乙醇1.4mol/L NaCl，20mmol/L EDTA，100mmol/L Tris-HClpH8.0，3M NaAC，50mM Tris-HCl pH8.0，20mM EDTA。
(2)荧光定量PCR扩增
采用实施例3制备的试剂盒配置反应体系，其组分及其体积优选采用25μL反应体系，具体如下，其各组分是指终浓度：
1×Premix EX Taq，枝枯病病原菌的上游引物的终浓度为60nmol/L，下游引物的终浓度为60nmol/L，探针的终浓度为80nmol/L；溃疡病病原菌的上游引物的终浓度为200nmol/L，下游引物终浓度为200nmol/L，探针的终浓度为100nmol/L；叶斑病病原菌的上游引物终浓度为80nmol/L，下游引物终浓度为80nmol/L，探针的终浓度为100nmol/L；根癌病病原菌上游引物终浓度为200nmol/L，下游引物终浓度为200nmol/L，探针的终浓度为80nmol/L；DNA为2μL；加水至25μL。
同时设置阳性对照，采用导致蓝莓枝枯病、溃疡病、叶斑病和根癌病的病原菌的质粒DNA如实施例2中所述。
扩增条件：优选以下扩增条件：94℃5min，扩增阶段94℃30s，58℃30s，72℃30s扩增45个循环，72℃7min，4℃保持。
(3)收集荧光信号信号，分别选择JOE、Texred、FAM、CY5的荧光检测模式，基线调整取3～15个循环的荧光信号，以阈值线刚好超过正常阴性对照的最高点设定阈值线；
(4)结果判定：待测样品荧光增长曲线超过阈值线，并呈现良好的对数增长，待测样品荧光增长曲线超过阈值线，并呈现良好的对数增长，则判断为阳性，如无典型的扩增曲线，判断为阴性。
进一步地，本实施例中，阈值为35，当Ct值≤35，有明显扩增曲线为阳性结果，Ct值＞40，明显扩增曲线为阴性结果。
上述荧光定量PCR反应可使用的仪器包括BioRad实时PCR检测系统、ABI实时PCR系统(例如7000，7300，7500，7900等)、Stratagene定量多聚酶链反应仪(例如MX4000，MX3000，MX3005)。
具体在本发明中，以ABI7500荧光定量PCR仪为例，第一到第四条检检测通过分别以JOE、Texred、FAM和Cy5标记。第一条检测通道检测枝枯病病原菌,其荧光染料JOE的检测波长约为550nm；第二条检测通道检测溃疡病病原菌，其荧光染料Texred的检测波长约为580nm；第三条检测通道检测叶斑病病原菌，其荧光染料FAM的检测波长约为520nm；第四条检测通道根癌病病原菌，其荧光染料CY5的检测波长约为650nm。以下实施例采用最优选的实施例来说明本发明。
实施例5本发明试剂盒灵敏度的检测
将实施例2中的枝枯病、溃疡病、叶斑病和根癌病的病原菌的阳性质粒DNA，经测定，其浓度分别为0.145ng/μL、0.187ng/μL、0.216ng/μL、0.204ng/μL，按10倍比进行稀释后，即获得的枝枯病枝枯病阳性质粒DNA的浓度分别为1.45×10-2ng/μL、1.45×10-3ng/μL、1.45×10-4ng/μL、1.45×10-5ng/μL、1.45×10-6ng/μL；溃疡病病原菌阳性质粒DNA的浓度分别为1.87×10-2ng/μL、1.87×10-3ng/μL、1.87×10-4ng/μL、1.87×10-5ng/μL、1.87×10- 6ng/μL，叶斑病病原菌阳性质粒DNA的浓度分别为2.16×10-2ng/μL、2.16×10-3ng/μL、2.16×10-4ng/μL、2.16×10-5ng/μL、2.16×10-6ng/μL，根癌病病原菌阳性质粒DNA的浓度分别为2.04×10-2ng/μL、2.04×10-3ng/μl、2.04×10-4ng/μL、2.04×10-5ng/μL、2.04×10-6ng/μL。
利用实施例3制备的试剂盒分别对上述不同浓度的DNA模板进行枝枯病、溃疡病、叶斑病和根癌病的病原菌这四种病原菌的检测，其中，1)NTC：无核酸酶水；
反应体系采用25μL反应体系，每个反应体系由12.5μL Premix EX Taq×2，枝枯病病原菌的上下游引物(20μM)均为0.075μL、枝枯病病原菌的探针(20μM)为0.1μL，溃疡病病原菌的上下游引物(20μM)均为0.25μL，溃疡病病原菌的探针(20μM)为0.125μL，叶斑病病原菌的上下游引物(20μM)均为0.1μL；叶斑病病原菌的探针(20μM)为0.125μL，根癌病病原菌的上下游引物(20μM)均为0.25μL；根癌病病原菌的探针(20μM)为0.1μL，样品DNA的量1μL。样本DNA采用上述稀释后的阳性模板进行检测，优选扩增条件：94℃5min，扩增阶段94℃30s，58℃30s，72℃30s扩增45个循环，72℃7min，4℃保持。每个梯度做三个平行样。
结果判定：Ct值≤35有明显扩增曲线为阳性结果，Ct值＞40无明显扩增曲线为阴性结果。
检测结果的荧光值图，其中，枝枯病病原菌的灵敏度测试结果如图2所示，图中曲线由左到右所示的模板浓度分别为1.45×10-2ng/μL、1.45×10-3ng/μL、1.45×10-4ng/μL、1.45×10-5ng/μL、1.45×10-6ng/μL的枝枯病病原菌DNA，从结果可看出，本发明所建立的方法对浓度为1.45×10-6ng/μL的枝枯病病原菌DNA都可以检出。溃疡病病原菌的灵敏度测试结果如图3所示，图中曲线由左到右所示的模板浓度分别为1.87×10-2ng/μL、1.87×10- 3ng/μL、1.87×10-4ng/μL、1.87×10-5ng/μL、1.87×10-6ng/μL的溃疡病病原菌DNA，从结果可看出，本发明所建立的方法对浓度为1.87×10-6ng/μL的溃疡病病原菌DNA都可以检出。叶斑病病原菌的灵敏度测试结果如图4所示。图中曲线由左到右所示的模板浓度分别为2.16×10-2ng/μL、2.16×10-3ng/μL、2.16×10-4ng/μL、2.16×10-5ng/μL、2.16×10-6ng/μL的叶斑病病原菌DNA，从结果可看出，本发明所建立的方法对浓度为2.16×10-6ng/μL的叶斑病病原菌DNA都可以检出。根癌病病原菌的灵敏度测试结果如图5所示。图中曲线由左到右所示的模板浓度分别为2.04×10-2ng/μL、2.04×10-3ng/μL、2.04×10-4ng/μL、2.04×10-5ng/μL、2.04×10-6ng/μL的根癌病病原菌DNA，从结果可看出，本发明所建立的方法对浓度为2.04×10-6ng/μL的根癌病病原菌DNA都可以检出。
可见本发明方法检测枝枯病病原菌、溃疡病病原菌、叶斑病病原菌、根癌病病原菌的灵敏度分别为1.45×10-6ng/μL、1.87×10-6ng/μL、2.16×10-6ng/μL、2.04×10-6ng/μL。
实施例6本发明试剂盒的特异性检测
选择导致蓝莓枝枯病、溃疡病、叶斑病和根癌病病原菌的阳性质粒DNA作为阳性对照；
阴性对照：无核酸酶水；
模板：选择黄曲霉(cfcc 84919)、尖孢镰刀菌(cfcc 89008)、盘长孢状刺盘孢(cfcc 82273)，枯草芽胞杆菌(cfcc 14476)、黄曲霉(CICC2090)、蜡状芽孢杆菌(cfcc2692)、绿木霉(CICC2535)、白假丝酵母(cfcc 3529)，将上述菌株培养后，提取DNA。上述菌种可通过商购获得。
将提取后的DNA进行反应体系配置，按照实施例4中反应体系进行配制，之后进行荧光定量PCR扩增。
结果表明，所建立的四种病原菌的荧光定量PCR方法及其试剂盒，对于导致蓝莓的枝枯病、溃疡病、叶斑病和根癌病的病原菌有明显扩增曲线，为阳性，对于除导致蓝莓的枝枯病、溃疡病、叶斑病和根癌病的病原菌外的其他病原菌为阴性，没有特异性的扩增，表明设计的引物及探针特异性强。
实施例7利用本发明试剂盒对样品进行检测
采集表现为蓝莓典型枝枯病症状、溃疡病症状、叶斑病症状、根癌病症状和健康蓝莓样品，均采自山东青岛地区，其中枝枯病症状有9个样品，溃疡病症状有24个样品，溃疡病症状21个样品、典型丛枝症状的有17个。
对上述样品进行提取DNA，可采用如实施例4提取DNA的方法进行，并采用本发明的试剂盒对提取的DNA进行检测。用实施例4所述的荧光定量方法进行检测，结果显示，枝枯病、溃疡病、叶斑病和根癌病症状的样品都有明显示扩增曲线，结果都呈阳性，说明本发明的检测方法对样品的检测具有很好的适用性，该检测在ABI7500荧光定量PCR仪进行，检测准确率达100％。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非是对本发明做其它形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更或改型为等同变化的等效实施例。但是凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与改型，仍属于本发明技术方案的保护范围。
序列表
<110> 青岛农业大学
<120> 用于同时检测蓝莓四种病害病原菌的核酸、试剂盒及方法
<160> 16
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
cgggcggatc agcgaaac 18
<210> 2
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
tcttatcaag tctggctttc tcaac 25
<210> 3
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
cgtcatttcc aagccattct gccgc 25
<210> 4
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ccacacgaat tgcttgattc attg 24
<210> 5
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
tgaccaactt caccaggtaa ctg 23
<210> 6
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
cgaactgccg acctcaccct tatca 25
<210> 7
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
gtcgtaacaa ggtctccgta gg 22
<210> 8
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
acaagggtga ataattcagc aagg 24
<210> 9
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
cccgagaggt tccagcccgc c 21
<210> 10
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
caactctgga actgcctttg atac 24
<210> 11
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
gcacctcagc gtcagtaatg g 21
<210> 12
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
cgccttcgcc actggtgttc ctcc 24
<210> 13
<211> 99
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
cgggcggatc agcgaaacag ggacgggacc gtcatttcca agccattctg ccgctgcgcg 60
gtaagattct gaacgttgag aaagccagac ttgataaga 99
<210> 14
<211> 166
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
ccacacgaat tgcttgattc attgaagaag acgatgagaa gcagcttttg ctttgcacac 60
ccgattttgg gtctgtagct cagttggtta gagcgcaccc ctgataaggg tgaggtcggc 120
agttcgaatc tgcccagacc caccagttac ctggtgaagt tggtca 166
<210> 15
<211> 108
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
gtcgtaacaa ggtctccgta ggtgaacctg cggagggatc attacacaaa tatgaaggcg 60
ggctggaacc tctcggggtt acagccttgc tgaattattc acccttgt 108
<210> 16
<211> 145
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
caactctgga actgcctttg atactgggta tcttgagtat ggaagaggta agtggaattc 60
cgagtgtaga ggtgaaattc gtagatattc ggaggaacac cagtggcgaa ggcggcttac 120
tggtccatta ctgacgctga ggtgc 145
Claims (10)
1.一组用于多重PCR同时检测导致蓝莓枝枯病、溃疡病、叶斑病和根癌病四种病原菌的核酸，其特征在于，其包括检测枝枯病病原菌的上、下游引物，检测溃疡病病原菌的上、下游引物，检测叶斑病病原菌的上、下游引物和检测根癌病病原菌的上、下游引物；
其中，所述枝枯病病原菌的上游引物序列如SEQ ID No.1所示，下游引物序列如SEQ IDNo.2所示；
所述溃疡病病原菌的上游引物序列如SEQ ID No.4所示，下游引物序列如SEQ ID No.5所示；
所述叶斑病病原菌的上游引物序列如SEQ ID No.7所示，下游引物序列如SEQ ID No.8所示；
所述根癌病病原菌的上游引物序列如SEQ ID No.10所示，下游引物序列如SEQ IDNo.11所示。
2.一组用于荧光定量PCR同时检测导致蓝莓枝枯病、溃疡病、叶斑病和根癌病四种病原菌的核酸，其特征在于，其包括枝枯病病原菌的上、下游引物和探针、溃疡病病原菌的上、下游引物和探针、叶斑病病原菌的上、下游引物和探针、及根癌病病原菌的上、下游引物和探针；
所述枝枯病病原菌的上游引物序列如SEQ ID No.1所示，下游引物序列如SEQ ID No.2所示，探针序列如SEQ ID No.3所示；
所述溃疡病病原菌的上游引物序列如SEQ ID No.4所示，下游引物序列如SEQ ID No.5所示，探针序列如SEQ ID No.6所示；
所述叶斑病病原菌的上游引物序列如SEQ ID No.7所示，下游引物序列如SEQ ID No.8所示，探针序列如SEQ ID No.9所示；
所述根癌病病原菌的上游引物序列如SEQ ID No.10所示，下游引物序列如SEQ IDNo.11所示，探针序列如SEQ ID No.12所示。
3.如权利要求1或2所述的核酸，其特征在于，其还包括检测枝枯病病原菌、溃疡病病原菌、叶斑病病原菌和根癌病病原菌的阳性扩增产物，其中，
所述检测枝枯病病原菌的阳性扩增产物，含如SEQ ID No.13所示的序列；
所述检测溃疡病病原菌的阳性扩增产物，含如SEQ ID No.14所示的序列；
所述检测叶斑病病原菌的阳性扩增产物，含如SEQ ID No.15所示的序列；
所述检测根癌病病原菌的阳性扩增产物，含如SEQ ID No.16所示的序列。
4.一种用于同时检测导致蓝莓枝枯病、溃疡病、叶斑病和根癌病的病原菌的试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括：检测上述枝枯病病原菌、溃疡病病原菌、叶斑病病原菌、根癌病病原菌的上、下游引物和相应的探针，各条探针的5′端和3′端分别对应标记JOE-TAMRA、Texred-MGB、FAM-BHQ1和CY5-BHQ3。
5.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，还包括2×Premix EX Taq，和/或枝枯病病原菌、溃疡病病原菌、叶斑病病原菌和根癌病病原菌的阳性扩增产物。
6.一种用于荧光定量PCR同时检测导致蓝莓枝枯病、溃疡病、叶斑病和根癌病四种病原菌的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)从样品中提取DNA；
(2)对所述步骤(1)提取的DNA进行荧光定量PCR扩增；其中，荧光定量PCR扩增时，在反应体系中，采用枝枯病病原菌的上、下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示，探针的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，其5′端和3′端分别对应标记JOE和TAMRA；溃疡病病原菌的上、下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.4和SEQ ID No.5所示，探针的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示，其5′端和3′端分别对应标记Texred和MGB；叶斑病病原菌上、下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.7和SEQ ID No.8所示，探针的核苷酸序列如SEQ IDNo.9所示，其5′端和3′端分别对应标记FAM和BHQ1；根癌病病原菌上、下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.10和SEQ ID No.11所示，探针的核苷酸序列如SEQ ID No.12所示，其5′端和3′端分别对应标记CY5和BHQ3；
(3)收集荧光信号，选择上述荧光基团的荧光检测模式，基线调整取3～15个循环的荧光信号，以阈值线刚好超过正常阴性对照的最高点设定阈值线；
(4)结果判定：待测样品荧光增长曲线超过阈值线，并呈现良好的对数增长，则判断为阳性，如无典型的扩增曲线，判断为阴性。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中荧光定量PCR扩增的反应体系具体如下：
1×Premix EX Taq所述枝枯病病原菌的上游引物的终浓度为60nmol/L，下游引物的终浓度为60nmol/L，探针的终浓度为80nmol/L；所述溃疡病病原菌的上游引物的终浓度为200nmol/L，下游引物终浓度为200nmol/L，探针的终浓度为100nmol/L；所述叶斑病病原菌的上游引物终浓度为80nmol/L，下游引物终浓度为80nmol/L，探针的终浓度为100nmol/L；所述根癌病病原菌上游引物终浓度为200nmol/L，下游引物终浓度为200nmol/L，探针的终浓度为80nmol/L；
所述DNA为2μL；
同时设置无核酸酶水为阴性对照。
8.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中荧光定量PCR扩增的反应程序为：94℃5min，扩增阶段94℃30s，58℃30s，72℃30s扩增45个循环，72℃7min，4℃保持。
9.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述方法还设有采用含有如包含如SEQ IDNo.13所示的序列、SEQ ID No.14所示的序列、SEQ ID No.15所示的序列的和SEQ ID No.16所示序列的基因作为枯病病原菌、溃疡病病原菌、叶斑病病原菌和根癌病病原菌的阳性对照。
10.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述步骤(4)结果判定中，所述阈值为35，当Ct值≤35时，有明显扩增曲线为阳性结果；Ct值＞40时，无明显扩增曲线为阴性结果。
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