CN111304272A - 一种利用轮枝镰孢菌转化三七茎叶皂苷制备人参稀有皂苷的方法 - Google Patents
一种利用轮枝镰孢菌转化三七茎叶皂苷制备人参稀有皂苷的方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN111304272A CN111304272A CN201911341704.4A CN201911341704A CN111304272A CN 111304272 A CN111304272 A CN 111304272A CN 201911341704 A CN201911341704 A CN 201911341704A CN 111304272 A CN111304272 A CN 111304272A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- saponins
- panax notoginseng
- ginsenoside
- leaves
- fermentation
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 229930182490 saponin Natural products 0.000 title claims abstract description 57
- 150000007949 saponins Chemical class 0.000 title claims abstract description 57
- 241000180649 Panax notoginseng Species 0.000 title claims abstract description 33
- 235000003143 Panax notoginseng Nutrition 0.000 title claims abstract description 32
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 21
- 235000017709 saponins Nutrition 0.000 title claims description 53
- UHPMCKVQTMMPCG-UHFFFAOYSA-N 5,8-dihydroxy-2-methoxy-6-methyl-7-(2-oxopropyl)naphthalene-1,4-dione Chemical compound CC1=C(CC(C)=O)C(O)=C2C(=O)C(OC)=CC(=O)C2=C1O UHPMCKVQTMMPCG-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims description 21
- 241000208340 Araliaceae Species 0.000 title claims description 21
- 241000223218 Fusarium Species 0.000 title claims description 21
- 241000082085 Verticillium <Phyllachorales> Species 0.000 title claims description 21
- 235000005035 Panax pseudoginseng ssp. pseudoginseng Nutrition 0.000 title claims description 20
- 235000003140 Panax quinquefolius Nutrition 0.000 title claims description 20
- 235000008434 ginseng Nutrition 0.000 title claims description 20
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 title description 3
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 claims abstract description 29
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 claims abstract description 29
- LRHPLDYGYMQRHN-UHFFFAOYSA-N N-Butanol Chemical compound CCCCO LRHPLDYGYMQRHN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 15
- 239000001397 quillaja saponaria molina bark Substances 0.000 claims abstract description 14
- FVIZARNDLVOMSU-IRFFNABBSA-N ginsenoside C-K Chemical compound O([C@@](C)(CCC=C(C)C)[C@@H]1[C@@H]2[C@@]([C@@]3(CC[C@H]4C(C)(C)[C@@H](O)CC[C@]4(C)[C@H]3C[C@H]2O)C)(C)CC1)[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O FVIZARNDLVOMSU-IRFFNABBSA-N 0.000 claims abstract description 13
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims abstract description 12
- YNBYFOIDLBTOMW-UHFFFAOYSA-N 20-O-beta-D-xylopyranosy (1->6)-beta-D-glucopyranosyl-20(S)-protopanaxadiol Natural products C1CC(C2(CCC3C(C)(C)C(O)CCC3(C)C2CC2O)C)(C)C2C1C(C)(CCC=C(C)C)OC(C(C(O)C1O)O)OC1COC1OCC(O)C(O)C1O YNBYFOIDLBTOMW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 11
- YNBYFOIDLBTOMW-IPTBNLQOSA-N ginsenoside Mx Chemical compound C([C@H]1O[C@H]([C@@H]([C@@H](O)[C@@H]1O)O)O[C@@](C)(CCC=C(C)C)[C@@H]1[C@@H]2[C@@]([C@@]3(CC[C@H]4C(C)(C)[C@@H](O)CC[C@]4(C)[C@H]3C[C@H]2O)C)(C)CC1)O[C@@H]1OC[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O YNBYFOIDLBTOMW-IPTBNLQOSA-N 0.000 claims abstract description 11
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims abstract description 7
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims abstract 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 31
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 24
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- ZTQSADJAYQOCDD-HUGMCNGHSA-N (2r,3s,4s,5r,6r)-2-(hydroxymethyl)-6-[[(3s,5r,8r,9r,10r,12r,13r,14r,17s)-12-hydroxy-4,4,8,10,14-pentamethyl-17-[(2s)-6-methyl-2-[(2s,3r,4s,5s,6r)-3,4,5-trihydroxy-6-[[(2s,3r,4s,5r)-3,4,5-trihydroxyoxan-2-yl]oxymethyl]oxan-2-yl]oxyhept-5-en-2-yl]-2,3,5,6,7 Chemical compound C([C@H]1O[C@H]([C@@H]([C@@H](O)[C@@H]1O)O)O[C@@](C)(CCC=C(C)C)[C@@H]1[C@@H]2[C@@]([C@@]3(CC[C@H]4C(C)(C)[C@@H](O[C@H]5[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O5)O)CC[C@]4(C)[C@H]3C[C@H]2O)C)(C)CC1)O[C@@H]1OC[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O ZTQSADJAYQOCDD-HUGMCNGHSA-N 0.000 claims description 11
- ZTQSADJAYQOCDD-XTHRNRJFSA-N Gypenoside IX Natural products O([C@](CC/C=C(\C)/C)(C)[C@@H]1[C@H]2[C@H](O)C[C@H]3[C@](C)([C@]2(C)CC1)CC[C@H]1C(C)(C)[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)CC[C@]31C)[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO[C@@H]2[C@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO2)O1 ZTQSADJAYQOCDD-XTHRNRJFSA-N 0.000 claims description 11
- 244000061456 Solanum tuberosum Species 0.000 claims description 11
- 235000002595 Solanum tuberosum Nutrition 0.000 claims description 11
- 239000002021 butanolic extract Substances 0.000 claims description 11
- 235000012015 potatoes Nutrition 0.000 claims description 8
- 235000002791 Panax Nutrition 0.000 claims description 7
- 241000208343 Panax Species 0.000 claims description 7
- 238000010828 elution Methods 0.000 claims description 7
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 6
- 238000004809 thin layer chromatography Methods 0.000 claims description 6
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 claims description 5
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 239000008103 glucose Substances 0.000 claims description 5
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 claims description 5
- 239000000741 silica gel Substances 0.000 claims description 5
- 229910002027 silica gel Inorganic materials 0.000 claims description 5
- 239000003480 eluent Substances 0.000 claims description 2
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims 3
- 239000008213 purified water Substances 0.000 claims 2
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 claims 1
- 229930182494 ginsenoside Natural products 0.000 abstract description 6
- 241000233732 Fusarium verticillioides Species 0.000 abstract description 5
- 239000000284 extract Substances 0.000 abstract description 4
- 229940089161 ginsenoside Drugs 0.000 abstract description 2
- 238000009776 industrial production Methods 0.000 abstract description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 abstract 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 abstract 1
- 239000002547 new drug Substances 0.000 abstract 1
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 9
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 4
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 4
- 238000001644 13C nuclear magnetic resonance spectroscopy Methods 0.000 description 3
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 3
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 3
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 3
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 3
- JUJWROOIHBZHMG-RALIUCGRSA-N pyridine-d5 Chemical compound [2H]C1=NC([2H])=C([2H])C([2H])=C1[2H] JUJWROOIHBZHMG-RALIUCGRSA-N 0.000 description 3
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 3
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 3
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- 238000005481 NMR spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 230000002001 anti-metastasis Effects 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 230000036983 biotransformation Effects 0.000 description 1
- 230000000740 bleeding effect Effects 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 230000017531 blood circulation Effects 0.000 description 1
- 230000005907 cancer growth Effects 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 150000002009 diols Chemical group 0.000 description 1
- 235000013399 edible fruits Nutrition 0.000 description 1
- 238000005265 energy consumption Methods 0.000 description 1
- 238000003912 environmental pollution Methods 0.000 description 1
- 125000002791 glucosyl group Chemical group C1([C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O1)CO)* 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 239000002207 metabolite Substances 0.000 description 1
- 239000012982 microporous membrane Substances 0.000 description 1
- 230000001766 physiological effect Effects 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 238000011426 transformation method Methods 0.000 description 1
- 238000000825 ultraviolet detection Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P33/00—Preparation of steroids
- C12P33/20—Preparation of steroids containing heterocyclic rings
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Organic Chemistry (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Steroid Compounds (AREA)
Abstract
本发明公开一种利用轮枝镰孢菌转化三七茎叶总皂苷制备人参稀有皂苷的方法，以轮枝镰孢菌为发酵菌种，将种子液加入添加有三七茎叶皂苷的培养基中，摇床发酵培养7天，发酵结束后过滤菌液，菌液用等体积的正丁醇提取2次，合并正丁醇提取液，减压浓缩得到富含三七皂苷Fd、人参皂苷Mx及人参皂苷CK的稀有皂苷产物；本发明方法工艺简单、发酵成本低、转化效率高，为其工业化生产及新药制备提供了保证。
Description
技术领域
本发明属生物医药技术领域，具体涉及一种利用轮枝镰孢菌转化三七茎叶皂苷制备人参稀有皂苷的方法。
背景技术
三七Panax notoginseng (Burk) F.H. Chen为五加科人参属植物，为我国著名的传统中药。三七具有化瘀止血，活血定痛的功效。三七最主要的活性成分为皂苷类化合物。目前已从三七不同部位如根、茎叶、花、果等分离鉴定出150余种皂苷。同时，人们在研究皂苷生理活性的同时，发现皂苷中的糖链与其生物活性密不可分，如皂苷糖分子越少，其活性越高。例如，人参皂苷CK含有一个葡萄糖基，为达玛烷型二醇组人参皂苷的生物体内代谢产物，其具有良好的抑制癌细胞生长及抗转移的作用。由于这类低糖链皂苷在三七中的含量极低，限制了其在药物领域的应用。因此，快速高效地制备低糖链稀有皂苷已成为研究热点与难题。
为了有效获得大量的人参稀有皂苷，传统化学方法时间长、耗能高、产率低、选择性差，极易造成环境污染。
发明内容
本发明的目的是提供一种利用轮枝镰孢菌转化三七茎叶皂苷制备人参稀有皂苷的方法，可实现绿色、高效、专一的稀有人参皂苷的转化方法，易于工业化生产。
本发明的目的是通过以下具体技术方案实现的：
一种利用轮枝镰孢菌转化三七茎叶皂苷制备人参稀有皂苷的方法，具体步骤如下：
以轮枝镰孢菌(Fusarium verticillioides)为发酵菌种，接种到含有三七茎叶皂苷的液体发酵培养基中，摇床发酵培养7天，发酵结束后过滤菌液，菌液用等体积的正丁醇提取2次，合并正丁醇提取液，减压浓缩得到人参稀有皂苷产物；将人参稀有皂苷产物采用反相硅胶进行纯化，溶剂系统为甲醇/水，依次采用不同浓度的甲醇溶液（按体积比为甲醇:水 =50:50，60:40，70:30，80:20，90:10，100:0）进行梯度流动相洗脱，根据薄层色谱（TLC）结果，合并洗脱液，分别浓缩后，得到三七皂苷Fd、人参皂苷Mx、人参皂苷CK，三七皂苷Fd、人参皂苷Mx、人参皂苷CK其结构式分别如下Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ所示：
所述轮枝镰孢菌的接种量为5-15%，即轮枝镰孢菌占液体发酵培养基总质量的5-15%。
所述液体发酵培养基为马铃薯培养基，其制备方法是：取200g新鲜市售马铃薯，切成边长为1cm的正方形马铃薯块，加纯净水1L煮沸30min，用8层纱布过滤，用纯净水定容至1L，每升加20g葡萄糖混匀，在121℃下灭菌20 min后，放置至室温，调整培养基pH值为5.5。
所述液体发酵培养基中三七茎叶皂苷的浓度为0.5-1g/L。
所述摇床发酵培养的摇床转速为100-180r/min，温度为25-30℃。
本发明的优点是：采用新方法对三七茎叶总皂苷进行生物转化，转化的时间短，过程稳定，转化产物相对单一，且成本低廉。通过该方法可实现定向、专一的生产和分离稀有人参皂苷，易于工业化生产。
附图说明
图 1 轮枝镰孢菌转化三七茎叶皂苷的高效液相色谱图。
具体实施方式
下面通过附图和实施例对本发明方法作进一步详细说明，但本发明保护范围不局限于所述内容。
本发明使用的岛津高效液相色谱仪（包括在线脱气机DGU-20A3R(C)、二元泵LC-20AB、自动进样器SIL-20A、柱温箱CTO-20A、检测器SPD-20A）。
实施例1
一种利用轮枝镰孢菌转化三七茎叶皂苷制备人参稀有皂苷的方法，具体步骤如下：
（1）液体发酵培养基的制备：将200g去皮马铃薯，切成1.0cm左右的马铃薯丁，加入1L纯水煮沸30min，8层纱布过滤并将液体补齐至1L，加入葡萄糖20g，充分混匀，在121℃下灭菌20min后，放置至室温，采用稀盐酸和稀氢氧化钠溶液调节培养基pH值为5.5；
（2）将三七茎叶总皂苷加入到步骤（1）的液体发酵培养基中，三七茎叶总皂苷的浓度为1g/L，按照10%的接种量，将轮枝镰孢菌(Fusarium verticillioides)接种到步骤（1）制备得到的液体发酵培养基中，将培养基置于28℃恒温摇床中150r/min培养7天；
（3）步骤（2）发酵结束后过滤菌液，菌液用等体积的正丁醇提取2次，合并正丁醇提取液，旋转蒸发仪减压浓缩得到正丁醇浸膏（0.64g），即人参稀有皂苷产物；
（4）将步骤（3）得到的正丁醇浸膏（0.64g）经反相硅胶ODS柱色谱分离（溶剂系统按体积比为甲醇:水 = 50:50，60:40，70:30，80:20，90:10，100:0）为流动相进行梯度洗脱，根据TLC结果，合并洗脱液，分别经过旋转蒸发仪减压浓缩后，得到三七皂苷Fd（0.12g），人参皂苷Mx（0.05g），人参皂苷CK（0.19g）。
经NMR鉴定，三七皂苷Fd为式Ⅰ所示化合物，人参皂苷Mx为式Ⅱ所示化合物，人参皂苷CK为式Ⅲ所示化合物：
本实施例提取分离到的三七皂苷Fd、人参皂苷Mx及人参皂苷CK的理化特征及化学结构的定性鉴定如下：
三七皂苷Fd：白色无定形粉末，分子式C47H80O17。
13C-NMR (pyridine-d 5，125 MHz)：δ：131.3(C-25)，126.4(C-24)，107.3(C-1')，106.2(C-1''')，98.5(C-1'')，83.8(C-20)，89.2(C-3)，79.7(C-3'), 79.1(C-3''), 78.7(C-5'), 78.3(C-3'''), 77.3(C-5''), 76.2(C-2'), 75.3(C-2''), 75.2(C-2'''),72.3(C-4''), 72.0(C-4'), 71.5(C-4'''), 70.5(C-6''), 70.4(C-12)，67.4(C-5'''),63.5(C-6'), 56.7(C-5)，51.8(C-17)，52.0 (C-14)，50.6(C-9)，49.9(C-13)，40.4(C-8)，40.0(C-4)，39.6(C-1)，37.3(C-10)，36.5(C-22)，35.5(C-7)，31.2(C-15)，31.1(C-11)，27.0(C-2)，28.5(C-28)，27.1(C-16)，26.2(C-26)，23.5(C-23)，22.7(C-21)，18.8(C-6)，18.3(C-27)，17.8(C-30)，17.2(C-29)，16.6(C-18)，16.4(C-19)。
人参皂苷Mx：白色无定形粉末，分子式C41H70O12。
13C-NMR (pyridine-d 5，125 MHz)：δ：131.4(C-25)，126.4(C-24)，106.2(C-1'')，98.4(C-1')，83.8(C-20)，79.7(C-3'), 78.4(C-3)，78.3(C-3''), 77.3(C-5'), 75.2(C-2'), 75.2(C-2''), 72.0(C-4'), 71.5(C-4''), 70.5(C-12), 70.4(C-6'), 67.3(C-5''), 56.7(C-5)，52.0(C-17)，51.8 (C-14)，50.7(C-9)，49.9(C-13)，40.4(C-8)，39.9(C-4)，39.8(C-1)，37.7(C-10)，36.6(C-22)，35.5(C-7)，31.1(C-15)，31.3(C-11)，29.0(C-2)，28.6(C-28)，27.0(C-16)，26.2(C-26)，23.5(C-23)，22.7(C-21)，19.1(C-6)，18.3(C-27)，17.8(C-30)，16.7(C-29)，16.7(C-18)，16.4(C-19)。
人参皂苷CK：白色无定形粉末，分子式C36H62O8。
13C-NMR (pyridine-d 5，125 MHz)：δ：130.9(C-25)，125.9(C-24)，83.3(C-20)，78.4(C-3)，70.4(C-12)，56.4(C-5)，51.8(C-17)，51.6(C-14)，50.3(C-9)，49.6(C-13)，40.2(C-8)，39.6(C-4)，39.4(C-1)，37.6(C-10)，36.3(C-22)，35.2(C-7)，31.2(C-15)，30.8(C-11)，28.4(C-2)，28.7(C-28)，26.7(C-16)，25.8(C-26)，23.2(C-23)，22.6(C-21)，18.9(C-6)，17.9(C-27)，17.4(C-30)，16.6(C-29)，16.3(C-18)，16.1(C-19)。
取步骤（3）的人参稀有皂苷产物5mg，用甲醇溶解定容至1mL，用0.45μm微孔滤膜过滤后，采用高效液相色谱法进行检测。
高效液相色谱法测定条件：色谱柱：YMC-Triart C18色谱柱（5µm，250mm×4.6mm），流速为1.0mL/min，洗脱条件见表1，柱温为25℃，紫外检测波长为203nm，进样量为20.0µL。
检测结果：从图1可以看出，经过轮枝镰孢菌转化后，三七茎叶总皂苷的成分发生了变化，三七茎叶总皂苷的原有皂苷含量大幅度下降，而新生成皂苷三七皂苷Fd、人参皂苷Mx及人参皂苷CK含量显著增加；经检测，三七皂苷Fd、人参皂苷Mx及人参皂苷CK重量之和在人参稀有皂苷产物中的含量为65.8%。
表1 洗脱条件
实施例2
一种利用轮枝镰孢菌转化三七茎叶皂苷制备人参稀有皂苷的方法，具体步骤如下：
（1）液体发酵培养基的制备：将200g去皮马铃薯，切成1.0cm左右的马铃薯丁，加入1L纯水煮沸30min，8层纱布过滤并将液体补齐至1L，加入葡萄糖20g，充分混匀，在121℃下灭菌20min后，放置至室温，采用稀盐酸和稀氢氧化钠溶液调节培养基pH值为5.5；
（2）将三七茎叶总皂苷加入到步骤（1）的液体发酵培养基中，三七茎叶总皂苷的浓度为0.8g/L，按照5%的接种量，将轮枝镰孢菌(Fusarium verticillioides)接种到步骤（1）制备得到的液体发酵培养基中，将培养基置于30℃恒温摇床中180r/min培养7天；
（3）步骤（2）发酵结束后过滤菌液，菌液用等体积的正丁醇提取2次，合并正丁醇提取液，旋转蒸发仪减压浓缩得到正丁醇浸膏，即人参稀有皂苷产物；
（4）将步骤（3）得到的正丁醇浸膏经反相硅胶ODS柱色谱分离（溶剂系统按体积比为甲醇:水 = 50:50，60:40，70:30，80:20，90:10，100:0）为流动相进行梯度洗脱，根据TLC结果，合并洗脱液，分别经过旋转蒸发仪减压浓缩后，得到三七皂苷Fd，人参皂苷Mx，人参皂苷CK。
实施例3
一种利用轮枝镰孢菌转化三七茎叶皂苷制备人参稀有皂苷的方法，具体步骤如下：
（1）液体发酵培养基的制备：将200g去皮马铃薯，切成1.0cm左右的马铃薯丁，加入1L纯水煮沸30min，8层纱布过滤并将液体补齐至1L，加入葡萄糖20g，充分混匀，在121℃下灭菌20min后，放置至室温，采用稀盐酸和稀氢氧化钠溶液调节培养基pH值为5.5；
（2）将三七茎叶总皂苷加入到步骤（1）的液体发酵培养基中，三七茎叶总皂苷的浓度为0.5g/L，按照15%的接种量，将轮枝镰孢菌(Fusarium verticillioides)接种到步骤（1）制备得到的液体发酵培养基中，将培养基置于25℃恒温摇床中100r/min培养7天；
（3）步骤（2）发酵结束后过滤菌液，菌液用等体积的正丁醇提取2次，合并正丁醇提取液，旋转蒸发仪减压浓缩得到正丁醇浸膏，即人参稀有皂苷产物；
（4）将步骤（3）得到的正丁醇浸膏经反相硅胶ODS柱色谱分离（溶剂系统按体积比为甲醇:水 = 50:50，60:40，70:30，80:20，90:10，100:0）为流动相进行梯度洗脱，根据TLC结果，合并洗脱液，分别经过旋转蒸发仪减压浓缩后，得到三七皂苷Fd，人参皂苷Mx，人参皂苷CK。
Claims (5)
1.一种利用轮枝镰孢菌转化三七茎叶总皂苷制备人参稀有皂苷的方法，其特征在于，以轮枝镰孢菌为发酵菌种，接种到含有三七茎叶皂苷的液体发酵培养基中，摇床发酵培养7天，发酵结束后过滤菌液，菌液用等体积的正丁醇提取2次，合并正丁醇提取液，减压浓缩得到人参稀有皂苷产物；将人参稀有皂苷产物采用反相硅胶进行纯化，采用不同浓度的甲醇水溶液进行梯度流动相洗脱，根据薄层色谱结果，合并洗脱液，分别浓缩后，得到三七皂苷Fd、人参皂苷Mx、人参皂苷CK。
2.根据权利要求1所述利用轮枝镰孢菌转化三七茎叶总皂苷制备人参稀有皂苷的方法，其特征在于，轮枝镰孢菌的接种量为5-15%。
3.根据权利要求1所述利用轮枝镰孢菌转化三七茎叶总皂苷制备人参稀有皂苷的方法，其特征在于，液体发酵培养基的制备方法是：取200g新鲜市售马铃薯，切成边长为1cm的正方形马铃薯块，加纯净水1L煮沸30min，用8层纱布过滤，用纯净水定容至1L，每升加20g葡萄糖混匀，在121℃下灭菌20 min后，放置至室温，调整培养基pH值为5.5。
4.根据权利要求1所述利用轮枝镰孢菌转化三七茎叶总皂苷制备人参稀有皂苷的方法，其特征在于，液体发酵培养基中三七茎叶皂苷的浓度为0.5-1g/L。
5.根据权利要求1所述利用轮枝镰孢菌转化三七茎叶总皂苷制备人参稀有皂苷的方法，其特征在于，摇床发酵培养的摇床转速为100-180r/min，温度为25-30℃。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201911341704.4A CN111304272B (zh) | 2019-12-24 | 2019-12-24 | 一种利用轮枝镰孢菌转化三七茎叶皂苷制备人参稀有皂苷的方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201911341704.4A CN111304272B (zh) | 2019-12-24 | 2019-12-24 | 一种利用轮枝镰孢菌转化三七茎叶皂苷制备人参稀有皂苷的方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN111304272A true CN111304272A (zh) | 2020-06-19 |
| CN111304272B CN111304272B (zh) | 2023-05-26 |
Family
ID=71159752
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201911341704.4A Active CN111304272B (zh) | 2019-12-24 | 2019-12-24 | 一种利用轮枝镰孢菌转化三七茎叶皂苷制备人参稀有皂苷的方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN111304272B (zh) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN113138235A (zh) * | 2021-03-11 | 2021-07-20 | 云南与诺生物工程有限责任公司 | 一种人参皂苷ck软胶囊中人参皂苷ck的含量测定方法 |
| CN116098285A (zh) * | 2023-01-31 | 2023-05-12 | 宝健（北京）生物技术有限公司 | 一种利用复合微生物转化三七茎叶制备含稀有皂苷的发酵提取物的方法 |
Citations (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103805581A (zh) * | 2012-11-15 | 2014-05-21 | 中国科学院微生物研究所 | β-糖苷酶突变体及其编码基因与其在生产人参皂苷CK中的应用 |
| CN104140931A (zh) * | 2013-12-06 | 2014-11-12 | 天津市尖峰天然产物研究开发有限公司 | 一种阿达青霉发酵原人参二醇制备稀有人参皂苷ck的方法 |
| CN105087739A (zh) * | 2014-05-12 | 2015-11-25 | 中国科学院上海生命科学研究院 | 一种新的制备稀有人参皂苷的催化体系及其应用 |
| CN105838770A (zh) * | 2016-05-24 | 2016-08-10 | 西北大学 | 一种氧化微杆菌发酵二醇组人参皂苷制备稀有人参皂苷ck的方法 |
| KR20180000757A (ko) * | 2016-06-23 | 2018-01-04 | 중부대학교 산학협력단 | 생물전환 기술을 이용한 발효 삼 조성물 및 이의 제조방법 |
| KR20180042695A (ko) * | 2016-10-18 | 2018-04-26 | 건국대학교 산학협력단 | 베타-글라이코시다아제에 고활성 알파-엘-아라비노퓨라노시다아제 효소의 첨가에 의한 고수율 진세노사이드 컴파운드 k의 제조방법 |
| CN109439791A (zh) * | 2018-12-12 | 2019-03-08 | 昆明理工大学 | 三七根腐病致病菌轮枝镰刀菌的Real-timePCR检测引物及方法 |
-
2019
- 2019-12-24 CN CN201911341704.4A patent/CN111304272B/zh active Active
Patent Citations (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103805581A (zh) * | 2012-11-15 | 2014-05-21 | 中国科学院微生物研究所 | β-糖苷酶突变体及其编码基因与其在生产人参皂苷CK中的应用 |
| CN104140931A (zh) * | 2013-12-06 | 2014-11-12 | 天津市尖峰天然产物研究开发有限公司 | 一种阿达青霉发酵原人参二醇制备稀有人参皂苷ck的方法 |
| CN105087739A (zh) * | 2014-05-12 | 2015-11-25 | 中国科学院上海生命科学研究院 | 一种新的制备稀有人参皂苷的催化体系及其应用 |
| CN105838770A (zh) * | 2016-05-24 | 2016-08-10 | 西北大学 | 一种氧化微杆菌发酵二醇组人参皂苷制备稀有人参皂苷ck的方法 |
| KR20180000757A (ko) * | 2016-06-23 | 2018-01-04 | 중부대학교 산학협력단 | 생물전환 기술을 이용한 발효 삼 조성물 및 이의 제조방법 |
| KR20180042695A (ko) * | 2016-10-18 | 2018-04-26 | 건국대학교 산학협력단 | 베타-글라이코시다아제에 고활성 알파-엘-아라비노퓨라노시다아제 효소의 첨가에 의한 고수율 진세노사이드 컴파운드 k의 제조방법 |
| CN109439791A (zh) * | 2018-12-12 | 2019-03-08 | 昆明理工大学 | 三七根腐病致病菌轮枝镰刀菌的Real-timePCR检测引物及方法 |
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| JIAO X等: "Effects of Fusarium solani and F. oxysporum Infection on the Metabolism of Ginsenosides in American Ginseng Roots" * |
| 姜彬慧等: "酶转化三七叶总皂苷制备人参皂苷 CK 的工艺优化" * |
| 胡玉飘等: "失效模式分析和星点设计-效应面法优化熟三七皂苷类成分纯化工艺" * |
| 赵方允等: "微生物转化人参皂苷研究进展" * |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN113138235A (zh) * | 2021-03-11 | 2021-07-20 | 云南与诺生物工程有限责任公司 | 一种人参皂苷ck软胶囊中人参皂苷ck的含量测定方法 |
| CN116098285A (zh) * | 2023-01-31 | 2023-05-12 | 宝健（北京）生物技术有限公司 | 一种利用复合微生物转化三七茎叶制备含稀有皂苷的发酵提取物的方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN111304272B (zh) | 2023-05-26 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN101797447B (zh) | 一种分离和提纯天然产物中有效成分的方法 | |
| CN105255984A (zh) | 一种利用植物复合酶转化人参皂苷的方法 | |
| CN108299453B (zh) | 一种从补骨脂中分离补骨脂素、异补骨脂素和补骨脂酚的方法 | |
| CN110521894A (zh) | 一种罗汉果甜香风味脱色浓缩汁及其制备方法 | |
| CN102675398B (zh) | 一种从罗汉果中提取罗汉果苷v和法尼醇的方法 | |
| CN111304272B (zh) | 一种利用轮枝镰孢菌转化三七茎叶皂苷制备人参稀有皂苷的方法 | |
| CN101229335A (zh) | 酶法制备黑刺菝葜总皂苷提取物的方法 | |
| CN103113433B (zh) | 一种从巧玲花中提取橄榄苦苷的方法 | |
| CN105902584A (zh) | 具有抗补体和降血糖活性的辣木叶黄酮及其制备方法与应用 | |
| CN101884655B (zh) | 一种三七花提取物的制备方法 | |
| CN103130851B (zh) | 一种从萝卜皮中分离制备四种天竺葵素衍生物的方法 | |
| CN108129532A (zh) | 一种以化橘红为基础制备柚皮苷的方法 | |
| CN108840892B (zh) | 一种从矮地茶中提取槲皮甙和岩白菜素的方法 | |
| CN103805670B (zh) | 利用黄姜提取黄姜皂素和鼠李糖的方法 | |
| CN107880084B (zh) | 从凌霄属植物花中提取制备高纯度毛蕊花糖苷的方法 | |
| CN109797177A (zh) | 一种从连翘叶中制备连翘脂素的方法 | |
| CN113354697B (zh) | 一种分离纯化柳穿鱼叶苷和蒙花苷的方法 | |
| CN102295677B (zh) | 北美盐角草中一种降三萜皂苷及其制备方法和用途 | |
| CN102690359B (zh) | 一种从罗汉果块根中提取淀粉和葫芦素的方法 | |
| CN113440547B (zh) | 采用大孔树脂串联动态轴向压缩柱分离纯化大蓟总苷的方法 | |
| CN107988280A (zh) | 从十字花科蔬菜种子中提制异硫氰酸酯高纯品的方法 | |
| KR102611611B1 (ko) | 도라지에서 추출된 도라지 사포닌 농축물을 함유하는 약학적 조성물의 제조방법 | |
| JPH043364B2 (zh) | ||
| CN104557824B (zh) | 荸荠皮提取金鱼草素的方法 | |
| CN115057770B (zh) | 黑老虎果皮中三萜酸化合物的制备方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |