CN103805670B - 利用黄姜提取黄姜皂素和鼠李糖的方法 - Google Patents

Abstract

针对目前黄姜资源不足和产生大量废弃物，严重影响了黄姜长期利用发展前景，而采用目前提取方法都会对环境造成大量的废弃物，本发明提供了一种利用萃取、结晶与重结晶方法从黄姜根茎中规模化生产黄姜皂素和鼠李糖，又能提高黄姜中黄姜皂素和鼠李糖的收率。

Description

利用黄姜提取黄姜皂素和鼠李糖的方法

技术领域

本发明属于天然产物加工领域，涉及了利用黄姜提取黄姜皂素的综合利用方法，更具体地说是涉及了利用黄姜在不酸解条件下提取出黄姜皂素(薯蓣皂苷元)，同时又对提取皂素后的废弃物进行综合利用的方法。

背景技术

黄姜又名盾叶薯蓣，是薯蓣科薯蓣属（Dioscrea.L）多年生草本植物，是世界上薯蓣皂苷元含量最高的种。被《中华人民共和国药典》(2000版)收载，其根茎中薯蓣皂苷元（disogenin）（俗称皂素）的含量为1.1﹪～16.15﹪，是合成甾体激素类（steroidhormone）药物和甾体避孕药（steroidprophylactic）的重要医药化工原料。草质藤本。根茎横生。茎纤细，无毛，有纵皱纹或浅槽，有时在分枝或叶柄的基部两侧微凸出，或具短刺。叶互生，盾形；叶片三角状卵形或长卵形，长5～11厘米，宽4～9厘米，边缘浅波状，基部心形或近于截形，通常3裂，中央裂片先端渐尖，两侧裂片圆耳状；叶柄短于叶片。花单性，雌雄异株；雄花序穗状，腋生，有时分枝；花无柄，常2～3朵簇生，仅1～2朵完全发育；苞片膜质，卵形或三角状卵形；花被片6，卵形，紫红色，雄蕊6；雌花序有花6～8朵，花有短柄，花被6裂，雄蕊退化；子房长圆柱形。蒴果干燥后蓝黑色，表面附有白色粉状物，翅近半月形，长约2.5厘米，宽约1.5厘米，顶端微凹，或近于截形，基部狭圆形、种子扁卵圆形，周围呈薄膜状的翅。花期5～8月，果期9～10月。

中国是盾叶薯蓣的原产地，两千多年前的《山海经》中就有“景山、北望少泽，其草多薯蓣”的记载。盾叶薯蓣是薯蓣科薯蓣属（Dioscrea.L）多年生草本植物，是世界上薯蓣皂苷元含量最高的种。被《中华人民共和国药典》(2000版)收载，其根茎中薯蓣皂苷元（disogenin）(俗称皂素)的含量为1.1﹪～16.15﹪，是合成甾体激素类（steroidhormone）药物和甾体避孕药（steroidprophylactic）的重要医药化工原料。以根状茎入药，中医学认为其性味甘﹑苦﹑凉，具有清肺止咳，利湿通淋，通络止痛，解毒消肿的功能，可治肺热咳嗽，湿热淋痛，风湿腰痛，痈肿恶疮，跌打扭伤，蜂蜇虫咬，同时具有治疗皮肤急性化脓性感染、软组织损伤、降血脂等功效，也有降低胆固醇、抗炎、抗肿瘤等药理作用。

盾叶薯蓣的根状茎含1.1﹪～16.15﹪的薯蓣皂苷元、45﹪左右的淀粉、40﹪的纤维素以及一些水溶性苷类、生物碱类、黄酮苷类、强心苷类、生物碱、单宁、色素等化学成分。刘建本等进行了盾叶薯蓣根茎中色素的提取和性质研究，结果表明薯蓣色素具有对紫外线有较强的吸收作用，耐热、耐光性能良好，Fe3+、Cu2+、Hg2+3种金属离子对色素均具有一定的增色作用，酸碱对色素的影响较大等性质，为综合利用提供了一条新途。

薯蓣皂苷包括糖和苷元两部分。为了对皂苷进行定位，郭永兵等将盾叶薯蓣根茎分为5个区段，对其薯蓣皂苷元的分布进行研究发现，嫩茎顶端的薯蓣皂苷元含量最高，抽茎区段次之，接着是嫩茎区段，其后为老茎区段和底层区段，须根及地上茎基部段的含量很低。薯蓣皂苷元又名皂素。它是目前世界上合成300多种甾体激素和避孕药的原料。

刘承来，陈延庸等用薄层层析法(不同展开剂)、纸层析法对盾叶薯蓣进行了分离提取，结果在根状茎中分离出两种水不溶性三糖皂苷和两种水溶性四糖皂苷，用乙酰化、酸水解、酶解、克分子旋光差计算以及红外光谱、质谱、氢谱、碳谱等方法进行分析鉴定，分别为①表-拔葜皂苷元、②延龄草次苷,结构为3-O-(β-D-葡萄吡喃糖)-薯蓣皂苷元、③薯蓣皂苷元-双葡萄糖苷,结构为3-0-*β-D-葡萄吡喃糖(1→4)-β-D-葡萄吡喃糖]-薯蓣皂苷元、④纤细皂苷，结构为3-O-,β-D-葡萄吡喃糖(1→3)-[a-L-鼠李吡喃糖(1→2)+-β-D-葡萄吡喃糖}-薯蓣皂苷元4个甾体化合物，据其化学结构推测为次级皂甙。

盾叶薯蓣标本为了研究盾叶薯蓣的原始皂甙，探索其活性，1985年他们又对鲜根茎的甲醇提取物经干柱法分离得到⑤薯蓣皂苷元棕榈酸酯、⑥β-谷甾醇、纤细皂苷、⑦原纤细皂苷和⑧原盾叶皂苷5种甾体类物质，其中原盾叶皂苷为一新发现的化合物，鉴定2种原皂苷的结构分别为⑦3-O-,β-D-葡萄吡喃糖(1→3)-[a-L-鼠李吡喃糖(1→2)+-β-D-葡萄吡喃糖}-26-O-,β-D-葡萄吡喃糖}-薯蓣皂苷元与⑧3-O-{a-L-鼠李吡喃糖(1→3)-*β-D-葡萄吡喃糖(1→2)+-β-D-葡萄吡喃糖}-26-O-,β-D-葡萄吡喃糖}-薯蓣皂苷元。

唐世蓉，吴余芬等从盾叶薯蓣根中分得两种水不溶性三糖皂苷（A和B）以及两种水溶性四糖皂苷（C和D）。⑨A为新皂苷，暂定名盾叶皂苷A，结构为薯蓣皂苷元-3-O-*β-D-葡萄吡喃糖(1→2)+-O-[a-L-鼠李吡喃糖(1→3)+-O-β-D-葡萄吡喃糖苷、⑩B为纤细皂苷异构物、⑾C为原盾叶皂苷A、⑿D为原盾叶皂苷B。唐世蓉，姜志东用盾叶薯蓣地上部分经提取、脱色、硅胶柱层析及反向柱层析分离得到盾叶皂苷A1、A2、A3和叉蕊皂苷IV4种主要含雅姆皂苷元的皂苷，前三种为新化合物，分别为⒀雅姆皂苷元-3-O-[a-L-鼠李吡喃糖(1→2)+-β-D-葡萄吡喃糖苷、⒁羟基雅姆皂苷元-3-O-[a-L-鼠李吡喃糖(1→2)+-β-D-葡萄吡喃糖苷、⒂雅姆皂苷元-3-O-{a-L-鼠李吡喃糖(1→2)-*β-D-葡萄吡喃糖(1→4)+--β-D-葡萄吡喃糖苷，其中盾叶皂苷A2的苷元为一新甾体皂苷元，命名为盾叶皂苷元。第四种为⒃雅姆皂苷元-3-O-{a-L-鼠李吡喃糖(1→2)-*β-D-葡萄吡喃糖(1→3)+--β-D-葡萄吡喃糖苷。这与地下部分主要含有薯蓣皂苷元的皂苷情况不同。

蒋朝晖等对盾叶薯蓣生育期皂苷元含量变化规律研究认为，皂苷在根茎中积累高峰期是现蕾及盛花期，结实期后明显下降；在根茎生长明显的8～9月，含量有一定提高，至枯萎期的10月和11月时含量又出现下降；2年生皂苷元含量明显高于1年生；适宜的采收期应为第2年的枯萎期或第3年的现蕾开花期。丁志遵等研究认为，盾叶薯蓣一般在萌芽期至开花盛期皂苷含量较高，从结实期至始萎期，皂苷含量则逐渐下降；老根茎皂苷含量高于新根茎；水分含量高的根茎皂苷含量亦高。

目前从黄姜中获取薯蓣皂苷元有三种方法。直接酸水解法：酸水解是使苷键断裂生成苷元和糖。预发酵法：一般认为预发酵法可提高薯蓣皂苷元的收率。预发酵法有自然发酵法、酶解法、微生物发酵法。分离法加工薯蓣植物：从盾叶薯蓣中首先分离出植物纤维和淀粉，剩余部分再经自然发酵提取薯蓣皂苷元。

我国自上世纪50年代开始建立薯蓣皂素生产工厂，采用Rothrod发明的直接酸水解法生产薯蓣皂素的工艺，即原料浸泡、粉碎后，加酸加热水解，再用有机溶剂提取。该工艺的缺点是：由于薯蓣根茎质地坚硬和大量淀粉的存在，不易水解彻底，皂素收率低；由于在浓酸和高温等强烈条件下进行水解，薯蓣中其它成分如淀粉等遭到破坏，不利于资源的综合利用。

后来，国内外都报道了在植物材料酸水解前进行预发酵（又称自然发酵）。目前我国大多数薯蓣皂素厂都采用此生产工艺，即将薯蓣原料粉碎浸泡后任其自然发酵数天，植物体疏松后，加入强酸加热水解、水洗至中性，滤渣烘干后瑞溶剂汽油提取皂素。该方法使皂素收率提高，但杂质增加，熔点降低。此外，该工艺同最早的皂素生产工艺一样，公利用了黄姜中含量仅占2%的皂素，而占98%的淀粉等干物质成分不仅完全没有被有效利用，而且产生大量的含BOD、COD和酸性极高的有机废水，为后续的水处理造成极大困难。按此工艺，每加工一吨鲜姜产生2.5吨以上的废水。

如果单纯从治污的角度进行清洁生产工艺设计，不仅治污成本高，而且就目前的废水治理技术而言也难以实现。因此黄姜提取皂素清洁生产技术的关键在于其中占近80%的淀粉和纤维素的有效利用和高浓度皂素废水的处理与利用。由于淀粉经强酸水解后有近一半的葡萄糖被破坏，无论是用于提取葡萄糖或酒精发酵，其利用效率将大大降低。因此对黄姜淀粉的利用要在酸水解之前进行，不仅可以最大限度地利用淀粉资源，还将大大降低水解所需的酸用量。

现有黄姜淀粉可食用或造酒的报道。西北植物研究所提出了“分离法制取薯蓣皂素新工艺”：其主要步骤为先从黄姜中分离出淀粉浆，再进行稀酸水解使淀粉糖化，分离后得到糖液和糖渣，糖渣用于提取皂素，糖液用于发酵生产肌苷。但据文献报道，该工艺在淀粉水洗分离中的消失会影响皂素得率，而且水处理量大，目前仍未得到大量推广。

黄姜皂素废水中的含糖量较高，有文献报道从高浓度皂素废水中提取葡萄糖或利用其中的糖类进行酒精发酵，但这些方法仅回收利用了废水中的还原糖。缪礼鸿等采用皂素废渣直接吸收高浓度皂素废水经堆肥发酵生产有机肥料，作为皂素废渣和废水的一种治理方法。但该技术只解决了皂素废渣和高浓度皂素废水的治理问题，未涉及黄姜淀粉的利用和中、低浓度皂素废水的处理问题。

发明内容

本发明的目的在于针对目前黄姜资源不足和产生大量废弃物，严重影响了黄姜长期利用发展前景，而采用目前提取方法都会对环境造成大量的废弃物，本发明提供了一种利用萃取、酶解、萃取、结晶与重结晶方法从黄姜根茎中规模化生产黄姜皂素，又能提高黄姜中黄姜皂素和鼠李糖的收率。

本发明采用的微生物菌种，黑曲霉（Aspergillusniger）来源于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，编号分别为CGMCCNo.3.4309。

黑曲霉发酵液制备：以淀粉为基质，按黑曲霉CGMCCNo.3.4309培养方法进行培养3-4天即为黑曲霉发酵液。

因此，本发明提供利用黄姜提取黄姜皂素和鼠李糖的方法，其具体步骤如下：

(1)将黄姜进行洗净、干燥后粉碎过20目筛>90%；

(2)加入80-90%甲醇或乙醇溶液，提取三次，每次90min；

(3)将3次黄姜提取液浓缩回收甲醇或乙醇至无醇味；

(4)向浓缩液中加入黑曲霉发酵液CGMCCNo.3.4309，在30℃下进行搅拌培养36-60小时；

(5)将第(4)步获得培养液加入石油醚进行萃取，取石油醚层，再次用石油醚进行结晶与重结晶，静置8-12小时，然后过滤，重结晶，直至结晶颜色洁白为止，将结晶物真空干燥得黄姜皂素成品；

(6)再将水层进行陶瓷膜过滤一次，将滤液在50℃下减压浓缩至原有体积的1/4-1/6，直接加入α-L-鼠李糖的种晶，在4℃下结晶和重结晶方法进行制备高纯度的鼠李糖。

在一个实施方案中，步骤(2)中所述甲醇或乙醇的用量，其体积(L)/黄姜重量(kg)/比=1:4-8。

在一个实施方案中，步骤(4)中所述黑曲霉发酵液的用量，其体积(L)(kg)/浓缩液体积(L)比=1:1-15。

在一个实施方案中，步骤(5)中所述石油醚的用量，其体积(L)/培养液体积(L)/比为1:1-5。

在一个实施方案中，步骤(6)中所述鼠李糖种晶的加入量，其重量(g)/滤液体积(L)比=1:20-25。

技术效果

1、本发明方法操作简单，仅使用萃取、酶解技术、结晶再结晶技术，也不需要精密仪器或自动化设备，极大地降低了黄姜皂素的生产成本，简化了生产过程，确保规模化生产黄姜皂素。

2、本发明不需要酸解过程，降低了环境污染风险，并且只增加一个步骤就能得到大量的鼠李糖，有利于降低黄姜皂素的生产成本。

3、充分利用黑曲霉发酵特点，黑曲霉在生长过程中产生大量的糖苷水解酶，通过与黄姜皂甙进行培养，能水解黄姜皂甙中糖苷键，释放出黄姜皂素，同时黑曲霉又能利用水解得到的葡萄糖，但不利用鼠李糖的特点，通过一段时间培养将水解溶液中葡萄糖分子消耗掉，去除黑曲霉菌体和蛋白质，浓缩液中主要以鼠李糖为主，通过加入种晶的方法，加速使溶液中鼠李糖快速结晶。

具体实施方式

下面用本发明的实施实例来进一步说明本发明的实质性内容，但并不以此限制本发明。

实施例1

称取100kg干燥黄姜后粉碎过20目筛>95%，加入510kg的82%乙醇，提取三次，每次1.5小时，将3次黄姜提取液合并浓缩回收乙醇至80L，向浓缩液中加入30L黑曲霉发酵液，在30℃下进行搅拌培养48小时；培养结束后加入300L石油醚进行萃取，取石油醚层，再次用石油醚进行结晶与重结晶，静置12小时，然后过滤，重结晶，直至结晶颜色洁白为止，将结晶物真空干燥得黄姜皂素成品3.75kg，经HPLC法进行黄姜皂素含量检测达到99.54%；再将水层进行陶瓷膜过滤一次，将滤液在50℃下减压浓缩至25L，直接加入α-L-鼠李糖的种晶1g，在4℃下结晶和重结晶方法进行制备高纯度的鼠李糖0.71kg，经HPLC法进行鼠李糖含量检测达到98.56%。

实施例2

称取200kg干燥黄姜后粉碎过20目筛>95%，加入950kg的82%乙醇，提取三次，每次1.5小时，将3次黄姜提取液合并浓缩回收乙醇至140L，向浓缩液中加入70L黑曲霉发酵液，在30℃下进行搅拌培养56小时；培养结束后加入450L石油醚进行萃取，取石油醚层，再次用石油醚进行结晶与重结晶，静置10小时，然后过滤，重结晶，直至结晶颜色洁白为止，将结晶物真空干燥得黄姜皂素成品7.88kg，经HPLC法进行黄姜皂素含量检测达到99.76%；再将水层进行陶瓷膜过滤一次，将滤液在50℃下减压浓缩至45L，直接加入α-L-鼠李糖的种晶2g，在4℃下结晶和重结晶方法进行制备高纯度的鼠李糖1.43kg，经HPLC法进行鼠李糖含量检测达到98.72%。

实施例3

称取400kg干燥黄姜后粉碎过20目筛>95%，加入1850kg的81%乙醇，提取三次，每次1.5小时，将3次黄姜提取液合并浓缩回收乙醇至250L，向浓缩液中加入130L黑曲霉发酵液，在30℃下进行搅拌培养60小时；培养结束后加入500L石油醚进行萃取，取石油醚层，再次用石油醚进行结晶与重结晶，静置12小时，然后过滤，重结晶，直至结晶颜色洁白为止，将结晶物真空干燥得黄姜皂素成品13.76kg，经HPLC法进行黄姜皂素含量检测达到99.55%；再将水层进行陶瓷膜过滤一次，将滤液在50℃下减压浓缩至70L，直接加入α-L-鼠李糖的种晶2g，在4℃下结晶和重结晶方法进行制备高纯度的鼠李糖2.93kg，经HPLC法进行鼠李糖含量检测达到98.68%。

Claims (2)

1.一种利用黄姜提取黄姜皂素和鼠李糖的方法，其具体步骤如下：

(1)将黄姜进行洗净、干燥后粉碎过20目筛>90%；

(2)加入80-90%甲醇或乙醇溶液，提取三次，每次90min；

(3)将3次黄姜提取液浓缩回收甲醇或乙醇至无醇味；

(4)向浓缩液中加入黑曲霉发酵液CGMCCNo.3.4309，在30℃下进行搅拌培养36-60小时；

(5)将第(4)步获得培养液加入石油醚进行萃取，取石油醚层，再次用石油醚进行结晶，静置8-12小时，然后过滤，重结晶，直至结晶颜色洁白为止，将结晶物真空干燥得黄姜皂素成品；

(6)再将水层进行陶瓷膜过滤一次，将滤液在50℃下减压浓缩至原有体积的1/4-1/6，直接

加入α-L-鼠李糖的种晶，在4℃下结晶和重结晶方法进行制备高纯度的鼠李糖。

2.根据权利要求1的方法，步骤(6)中所述鼠李糖种晶的加入量，其重量/滤液体积比

=1:20-25,其中重量以g为单位、滤液体积以L为单位。