CN105779306A - 一种产皂苷酶的盾叶薯蓣内生菌及应用 - Google Patents

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Abstract

一种产皂苷酶的盾叶薯蓣内生菌及应用，所述盾叶薯蓣内生菌为黄曲霉菌(Aspergillus flavus))菌株SYfx213.2，保藏于CGMCC，保藏编号为CGMCC 11517。本发明内生菌菌株能用于盾叶薯蓣皂甙酶的工业化发酵生产，提高皂苷酶的产量，满足市场需求。

Description

一种产皂苷酶的盾叶薯蓣内生菌及应用
技术领域
本发明涉及一种植物内生菌种及应用，具体涉及一种产皂苷酶的盾叶薯蓣内生菌及应用。
背景技术
盾叶薯蓣是一种药用植物，它的根状茎含1.1％～16.15％的薯蓣皂苷元、45％左右的淀粉、40％的纤维素以及一些水溶性甙类、生物碱类、黄酮甙类、强心甙类、生物碱单宁、色素等化学成分。其中，皂甙元是薯蓣的主要活性成分，是一种甾体皂苷元，通常称为皂素，在盾叶薯蓣植物根茎中有皂苷酶，当根茎组织被粉碎成粉或磨成浆时，皂苷酶便释放出来与薯蓣皂苷接触产生酶解作用，薯蓣皂苷发生脱糖基反应后就转变为薯蓣皂甙元。盾叶薯蓣的根茎水解后生成的薯蓣皂甙元是合成多种甾体激素的重要前体，可以合成蛋白同化激素、皮质激素、性激素等三大类数百种甾体激素药物，是国内药品生产中仅次于抗菌素的一个重要领域。
目前，我国生产皂甙元的方法主要是酸水解法，自然发酵法，酶解法等。其中，酸水解法制备薯蓣皂甙元，收率低，只有2％左右。自然发酵过程中多种微生物参与发酵，发酵条件难以控制，杂质增多使薯蓣皂素质量下降，工艺不够理想。酶解法是将薯蓣干料粉碎后加入一定量的纤维素酶、果胶酶、淀粉酶、苦杏仁酶以及葡萄糖苷酶等酶溶液中进行酶解，经抽滤，酸水解，碱中和，水洗抽滤，干燥一系列过程后再提取浓缩得到薯蓣皂甙元，虽然比直接酸水解收率大为提高，提高幅度为28.8％，但是仍然不理想。同时从薯蓣中提取皂甙元的生产工艺会产生大量废水，每生产1吨皂甙元平均排放废水450吨，这些废水有机污染物浓度高、酸度高、色度高，处理难度极大。并且随着医药工业对皂甙元的需求量日益增加，刺激了对野生盾叶薯蓣的高速无节制利用，使野生资源逐渐枯竭；即使采用人工种植的方式，一方面在盾叶薯蓣种植过程中的循环种-挖，对其产区(主要是山区)脆弱的生态环境会造成严重的破坏；另一方面长期人工种植造成薯蓣种质资源退化，其皂素含量不断降低。
植物内生细菌是指能在健康植物组织内栖居，对植物不造成实质性危害，而与植物建立了和谐联合关系的微生物。植物内生菌的研究起始于19世纪中叶，1993年Stierle首次报道了从短叶紫杉(Taxusbrevifolia)的树皮中分离出一株内生真菌能产生紫杉醇，掀起了从植物内生菌中寻找新物质的热潮。植物体内广泛分布着内生细菌，其长期生活在植物体内的特殊环境中并与宿主协同进化。一方面，植物体为其提供生长必需的能量和营养；另一方面，内生菌又可通过自身的代谢产物或借助于信号传导作用对植物体产生影响。而内生菌对宿主植物的生物学作用的物质基础，在于其自身合成的抗生素、激素酶抑制剂、诱导物等多种活性物质或通过诱导物(葡聚糖、糖蛋白、小肽、脱乙酰几丁质、花生四烯酸等不饱和脂肪酸)胁迫宿主植物合成的萜类、生物碱、皂苷、黄酮、酚类和多炔类等次生代谢产物。可见，利用植物内生菌发酵生产与植物相同或相似的次生代谢活性产物是可能的。因此，从特殊环境下的植物和传统的药用植物中分离得内生菌，然后从内生菌次生代谢产物中筛选具有药用价值的活性物质或新型化合物以创制新药，解决自然资源不足，开发紧缺及新型药物，将在很大程度上丰富人类的药物宝库，同时也有助于保护稀缺的植物资源以及避免脆弱的环境受到破坏。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是，提供一种从盾叶薯蓣植株中分离得到能发酵生产盾叶薯蓣皂甙酶的一株内生菌及应用。
本发明解决其技术问题采用的技术方案是，一种产皂苷酶的盾叶薯蓣内生菌，所述盾叶薯蓣内生菌为黄曲霉菌(Aspergillusflavus))菌株SYfx213.2，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其简称为CGMCC，保藏编号：CGMCC11517，保藏日期：2015年10月19日，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，邮编100101。
进一步，所述黄曲霉菌(Aspergillusflavus))菌株SYfx213.2是由盾叶薯蓣中分离得到的内生菌。
本发明进一步解决其技术问题采用的技术方案是，一种产皂苷酶的盾叶薯蓣内生菌在制备薯蓣皂苷元中的应用。
本发明之产皂苷酶的盾叶薯蓣内生菌能用于盾叶薯蓣皂甙酶的工业化发酵生产，提高皂苷酶的产量，满足市场需求；而且在后续利用皂苷酶获得皂甙元的酶转化法，和微生物转化相比较，还可省掉培养微生物所需的相关设备，解除染菌和生产菌变异等问题。
实验证明，本发明薯蓣皂苷元的收率可达63.27％。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步详细说明。
实施例1
一、产皂苷酶的盾叶薯蓣内生菌的筛选
1、采集：从野外采集盾叶薯蓣植株样本；
2、表面灭菌：选取健壮盾叶薯蓣的地下茎用无菌水冲洗干净，放入超净工作台，剪成5cm×5cm小块，先在75％的酒精中浸泡30s，然后用0.1％HgCl2溶液浸泡3～5min，接着用无菌水冲洗3次；并分别用两种方法检验表面灭菌效果：
(1)冲洗液法：分别移取最后一次无菌水冲洗液于马铃薯葡萄糖琼脂培养基平板上，在27℃恒温培养箱中培养3～5d，每个材料做2个重复，观察是否有菌落产生。
(2)原材料法：取灭过菌的原材料置于马铃薯葡萄糖琼脂培养基平板上，在27℃恒温培养箱中培养3～5d，每个材料做2个重复，观察是否有菌落产生。
若无菌落产生则证明表面灭菌彻底，否则该材料不能使用。
3、内生菌的分离：将表面灭菌后的薯蓣地下茎切成0.5cm左右的小薄片，接种于PDA平板培养基上，每个培养皿接种1～2片，做4个重复；然后置于28℃的恒温培养箱中培养3～5d，接着根据细菌的菌落形状、大小，颜色和分布状况等，用接种环从培养基菌落上挑菌少许到新的PDA培养基上，用划线分离法纯化2～3次，直到分离出纯菌种。
二、产皂苷酶的盾叶薯蓣内生菌的鉴定
1、内生菌的液体发酵：发酵培养基为粗总皂苷2g；NaNO32.0g；K2HPO41.0g；KCl0.5g；MgSO40.5g；FeSO40.01g，用蒸馏水定容至1000mL。取250mL规格的锥形瓶，每瓶分装50mL发酵培养基，121℃高压灭菌30min；然后在超净工作台中选取优质菌落，挑取两环菌株到种子培养基中，在28℃、180rpm/min条件下振荡培养8d后，置于4℃冰箱保藏待用。
2、粗酶液的提取：将发酵液在4℃，8000rpm条件下离心10min，分离菌体，去除上清液(即为粗酶液)；然后用4℃蒸馏水清洗菌体3～5次，并离心收集菌体，称量菌体湿重；接着按1∶3(w/v)的比例将菌体悬浮于0.02moL/LpH5.0的醋酸-醋酸钠缓冲液中，置于4℃冰箱保存。
3、薯蓣皂苷酶的电泳分离：取一定质量的菌体，按1∶5(w/v)比例加入pH5.0的缓冲液，进行冰浴研磨，每0.5h按1∶0.1(w/w)比例加一次石英砂，共研磨1.5h。取一定体积的粗酶液于离心管中，按1∶4(v/v)比例缓慢加入-20℃预冷的丙酮，摇匀后于-20℃冰箱沉淀1h，12000rpm、4℃离心10min，去除上清液。待丙酮挥发干后，加入上样缓冲液使蛋白溶解，按上样缓冲液∶甘油∶溴酚蓝(3∶1∶0.14)体积比加入甘油和溴酚蓝3000rpm离心3min；点样量为30μl。凝胶制备：分离胶浓度为10％，浓缩胶浓度为5％。首先灌注分离胶至玻璃板上沿约2.0cm处，再缓慢加入ddH2O。待分离胶聚合后，将水倒出并用滤纸条吸干。然后灌注浓缩胶，并插入梳子，浓缩胶聚合后拔出梳子即可。电泳：将电泳仪线路连接好，浓缩胶部分电压是100V，分离胶部分电压是200V。当溴酚蓝指示剂下行到距玻璃板下沿0.5～1厘米处时停止电泳。
4、薯蓣皂苷酶的检测：取出凝胶玻璃板，将胶剥离，去除浓缩胶部分，将分离胶保留。固定、染色、脱色：将分离胶放在大培养皿中加入固定液固定30min后，回收固定液倒入染色液，放在摇床中染色60min。然后，回收染色液加入脱色液，进行脱色，每小时换一次脱色液直至条带清晰。切下较清晰的两条条带，浸泡于6mg/ml的皂苷粉底物溶液中，半小时观察一次显色情况，观察条带分布情况，初步鉴定酶蛋白为薯蓣皂苷酶。
通过本发明获得一株能产生产皂苷酶的盾叶薯蓣内生菌株，经鉴定为黄曲霉(Aspergillusflavus)SYfx213.2，该菌株能用于发酵生产盾叶薯蓣皂苷酶。
实施例2：产皂苷酶的盾叶薯蓣内生菌的应用
1、薯蓣皂苷底物的制备：将盾叶薯蓣根茎切片或粉末用4倍质量体积的75％乙醇浸提3次，每次在室温条件下浸提48小时。3次浸提液分别过滤，合并滤液，滤液于减压真空条件下，浓缩除去乙醇。浓缩液采用石油謎萃取3遍，进行脱脂，脱脂后的下层水相用3倍乙酸乙酯除去小极性物质，下层水相再用水饱和正丁醇除去大极性物质，最后水相浓缩蒸干，获得薯蓣皂苷粗品即皂苷酶粗酶液底物。
2、皂素产量的测定：发酵收集菌体制备皂苷酶粗酶液，然后将等体积粗酶液与等体积4mg/mL盾叶薯蓣皂苷底物溶液，置于30℃下反应24h，饱和正丁醇终止反应，加等体积石油醚萃取3次过夜，收集萃取液浓缩至干，获得酶反应产物粗品，酶解总产物经硅胶柱层析分离，可得到单组分的单体皂苷，测其中薯蓣皂素的含量。
3、薯蓣皂苷底物完全转化生成皂素的量的测定：向50mL不接菌的液体发酵培养基中加10mL的浓盐酸，沸水浴4h，中和后滤纸过滤，烘干滤纸，索氏提取4h，将石油醚提取液浓缩至干后测其中薯蓣皂素的含量。
4、薯蓣皂苷元的收率用皂素生成率表示，皂素生成率(％)＝皂素的产量(mg)/薯蓣皂苷底物完全转化生成皂素的量(mg)。
经粗酶液与等体积薯蓣皂苷底物溶液反应，测得皂素生成率为63.27％。

Claims (3)

1.一种产皂苷酶的盾叶薯蓣内生菌，其特征在于，所述盾叶薯蓣内生菌为黄曲霉菌(Aspergillusflavus))菌株SYfx213.2，保藏于CGMCC，保藏编号为CGMCC11517。
2.根据权利要求1所述的产皂苷酶的盾叶薯蓣内生菌，其特征在于，所述黄曲霉菌(Aspergillusflavus))菌株SYfx213.2是由盾叶薯蓣中分离得到的内生菌。
3.根据权利要求1或2所述的产皂苷酶的盾叶薯蓣内生菌在制备薯蓣皂苷元中的应用。
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