CN104557824B - 荸荠皮提取金鱼草素的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明的荸荠皮提取金鱼草素的方法，属于天然有机化学领域，其特征在于，以甲醇水溶液、乙醇水溶液或丙酮水溶液中的任意一种为溶剂，提取荸荠皮中金鱼草素，提取物经乙酸乙酯萃取后用大孔吸附树脂分离，所得粗品用凝胶色谱柱纯化，得到含量在95％以上的金鱼草素产品。本发明利用大量被废弃的荸荠皮资源为原料制备金鱼草素，开辟了从天然植物中提取分离金鱼草素的新途径，分离效果好，产品纯度高，使荸荠皮变废为宝，所选用的大孔树脂和凝胶均可反复使用，原料易得，资源丰富，生产成本低，可进行规模化生产，满足医药工业需要。
Description
技术领域
本发明属于天然有机化学领域，涉及一种金鱼草素的提取分离方法，特别是涉及一种荸荠皮中提取分离金鱼草素的方法。
背景技术
金鱼草素(Aureusidin)，化学名为4,6,3′,4′-四羟基橙酮，是最著名的橙酮类化合物，具有抗氧化、抗菌、抗肿瘤等多种生物活性。金鱼草素结构特别，在自然界植物中分布较少，且在植物体内的含量低，难以较大规模获得。为了便于研究其药理活性，学者通常使用合成的方法获取金鱼草素。常州大学胡昆就报道了金鱼草素的全合成方法，该法以2,4,6-三羟基苯乙酮与3,4-二羟基苯甲醛为原料，经五步反应合成金鱼草素，其缺点是，合成过程容易带入构型相反的金鱼草素异构体。与合成金鱼草素相比，天然金鱼草素避免了合成过程中带来的异构体，被认为更具安全性。人们在实际应用中更偏向于使用天然的金鱼草素。
天然金鱼草素存在于菊科、玄参科、莎草科、地钱科植物之中，主要从莎草科植物和地钱科地钱属植物中分离得到，目前市场上的天然金鱼草素来自地钱的提取物。公开号为CN103030615 A的中国专利介绍了应用超高压技术和大孔树脂富集纯化地钱中金鱼草素的方法。该方法具有提取速度快，大孔树脂吸附选择性好，吸附容量大，分离效果明显等特点。但该发明使用的超高压技术对设备的要求高，柱层析纯化过程所用的硅胶不能重复利用，都导致生产的成本过高，且原料地钱，不容易获得，阻碍了金鱼草素生产规模的扩大。
荸荠(Eleocharis tuberosa)，又称马蹄，属莎草科多年生浅水草本植物荸荠的地下球茎，我国大部分地区都有栽培。其中，广西荸荠产量占全国70％，贺州荸荠产量占广西70％。据文献报道，荸荠有抗菌、抗肿瘤、防治呼吸道疾病、利肠通便和利尿排淋等作用；临床上可用于治疗咽喉疼痛、痰热咳嗽、热病烦渴、小便不利、痢疾等症。研究表明，荸荠的活性物质主要富集在果皮和果肉之间。在荸荠加工过程中，被丢弃的荸荠皮质量约占新鲜荸荠质量的25％，资源非常丰富。我们在研究中发现，荸荠皮中含有丰富的金鱼草素，但目前未见从荸荠皮中提取分离该化合物的文献报道。
发明内容
本发明的目的在于：提出一种荸荠皮提取金鱼草素的方法。
本发明的荸荠皮提取金鱼草素的方法，常规提取法和大孔树脂及凝胶色谱技术从荸荠皮中提取分离金鱼草素，具体步骤如下：
(1)将新鲜的荸荠皮风干，粉碎；以重量计，取荸荠皮粉末1份，入提取罐中，每次加入提取溶剂8-20份，在温度为50-70℃下提取1-3h，共提取2-3次，过滤，合并滤液，减压浓缩至膏状，获得提取物。
(2)以重量计，将提取物1份分散在5-8份水中制成浑浊液，用1-2倍水体积的乙酸乙酯萃取3次，合并萃取液，减压浓缩至干，获得萃取物。
(3)以重量计，将萃取物1份溶于2-3份甲醇中，加入甲醇体积10-15倍的水制成悬浊液，经大孔树脂吸附后，用25％体积百分比的甲醇水溶液或乙醇水溶液洗脱，薄层色谱法检测，收集合并含有金鱼草素的洗脱液，减压浓缩，获得金鱼草素含量粗品。
(4)以重量计，将粗品1份溶于4-8份甲醇中，加入等体积的水制成悬浊液，用Sephadex LH-20凝胶柱色谱进行分离，用甲醇或70％体积百分比的甲醇水溶液洗脱，薄层色谱法检测，收集合并含有金鱼草素的洗脱液，减压浓缩，真空干燥，得到金鱼草素含量在95％以上的产品。
所述步骤(1)中提取溶剂为50-75％体积百分比的甲醇水溶液、乙醇水溶液或者丙酮水溶液其中的任意一种，提取溶剂体积与荸荠皮粉末质量之比为8-20L/g。
所述步骤(3)中所用的大孔吸附树脂为X-5、NKA-II、D101、AB-8H、NKA-9、S-8、D3520、D4020和H103型树脂中的任意一种；该步骤的洗脱方式为：先用水洗去杂质，再用25％体积百分比的甲醇水溶液或乙醇水溶液洗去极性大的苷类杂质，最后用43-50％体积百分比的甲醇水溶液或乙醇水溶液。
本发明与现有技术相比其有益效果是：设计科学合理，与地钱相比，本发明利用大量被废弃的荸荠皮作为原料，原料易得，资源丰富，生产成本低，开辟了从天然植物中提取分离金鱼草素的新途径，且分离效果好，产品纯度高，使荸荠皮变废为宝，所选用的大孔树脂和凝胶均可反复使用，可进行规模化生产，满足医药工业需要。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步说明，但本发明的实施方式不限于此。
本发明的荸荠皮提取金鱼草素的方法用常规提取法和大孔树脂及凝胶色谱技术从荸荠皮中提取分离金鱼草素，具体步骤如下：
(1)将新鲜的荸荠皮风干，粉碎，备用。称取一定质量(g)的荸荠皮粉末加入提取罐中，再加入8-20倍体积(mL)的50-75％体积百分比的甲醇水溶液、乙醇水溶液或丙酮水溶液中的任意一种，在50-70℃下提取1-3h，共提取2-3次，过滤，合并滤液，减压浓缩至膏状，获得提取物。
(2)将提取物(g)分散在5-8倍体积(mL)的水中制成浑浊液，用1-2倍水体积的乙酸乙酯萃取3次，合并萃取液，减压浓缩至干，获得萃取物。
(3)将萃取物(g)溶于2-3倍体积(mL)的甲醇，再加入甲醇体积10-15倍的水制成悬浊液，用大孔树脂吸附，所用大孔吸附树脂为天津南开大学所生产的NKA-9、X-5、AB-8H、S-8、D3520、NKA-II、D101、D4020和H103型树脂中的任意一种，静态吸附后，先用水洗去杂质，再用25％体积百分比的甲醇水溶液或乙醇水溶液洗去极性大的苷类杂质，最后用43-50％体积百分比的甲醇水溶液或乙醇水溶液洗脱，薄层色谱法检测，收集合并含有金鱼草素的洗脱液，减压浓缩，获得粗品。
(4)将粗品(g)溶于4-8倍体积(mL)的甲醇，加入等甲醇体积的水制成悬浊液，用Sephadex LH-20凝胶色谱柱进行纯化，用甲醇或甲醇溶液洗脱，薄层色谱法检测，收集合并含有金鱼草素的洗脱液，减压浓缩，真空干燥，得到含量在95％以上的金鱼草素产品。
实施例1
在提取罐中，加入800g新鲜荸荠皮粉末和6.4L 50％体积百分比的丙酮水溶液，在50℃下提取2h，共提取3次，过滤，合并滤液，减压浓缩成膏状，获得提取物120g。
往提取物中加入900mL水制成浑浊液，加入1.8L乙酸乙酯萃取3次，合并萃取液，减压浓缩，获得萃取物10.5g。
将萃取物溶于25mL甲醇，再加入250mL水制成悬浊液，转入1kg D101大孔树脂层析柱进行吸附，静态吸附后，先用水洗至流出液无色，再用25％体积百分比的甲醇水溶液800mL洗去极性大的苷类杂质，最后用体积百分比为50％的甲醇水溶液洗脱，薄层色谱法检测，收集合并含有金鱼草素的洗脱液，减压浓缩，获得金鱼草素粗品0.60g。
将粗品溶于3.0mL甲醇，加入3.0mL水制成浑浊液，用Sephadex LH-20凝胶色谱纯化，用甲醇洗脱，薄层色谱法检测，收集合并含有金鱼草素的洗脱液，减压浓缩，真空干燥，获得含量为95.6％的金鱼草素产品41mg。
实施例2
在提取罐中，加入800g新鲜荠皮粉末和1.6L 75％体积百分比的甲醇水溶液，在70℃下提取2.5h，过滤，共提取3次，合并滤液，减压浓缩膏状，获得提取物150g。
往提取物中加入750mL水制成浑浊液，然后加入1.5L乙酸乙酯萃取3次，合并萃取液，减压浓缩，获得萃取物12.0g。
将萃取物溶于24mL甲醇溶解，再加入240mL水制成悬浊液，转入1kg S-8大孔树脂层析柱进行吸附，静态吸附后，先用水洗至流出液无色，再用25％体积百分比的甲醇水溶液800mL洗去极性大的苷类杂质，最后用体积百分比为50％的甲醇水溶液洗脱，薄层色谱法检测，收集金鱼草素组分，减压浓缩，获得金鱼草素粗品0.53g。
将粗品溶于2.5mL甲醇，加入2.5mL水制成悬浊液，用Sephadex LH-20凝胶色谱纯化，用甲醇洗脱，薄层色谱法检测，收集合并含有金鱼草素的洗脱液，减压浓缩，真空干燥，获得含量为95.1％的金鱼草素产品62mg。
实施例3
在提取罐中，加入800g新鲜荸荠皮粉末和8.0L 70％体积百分比的乙醇水溶液，在65℃下提取1.5h，共提取2次，过滤，合并滤液，减压浓缩成膏状，获得提取物100g。
往提取物中加入800mL水制成浑浊液，加入1.6L乙酸乙酯萃取3次，合并萃取液，减压浓缩，获得萃取物9.5g。
将萃取物溶于19mL甲醇，加入190mL水制成悬浊液，转入1kg D101大孔树脂的层析柱进行吸附，静态吸附后，先用水洗至流出液无色，再用25％体积百分比的乙醇水溶液800mL洗去极性大的苷类杂质，最后用体积百分比为45％的乙醇水溶液洗脱，薄层色谱法检测，收集合并含有金鱼草素的洗脱液，减压浓缩，获得金鱼草素粗品0.41g。
将粗品溶于3.0mL甲醇，加入3.0mL水制成浑浊液，用Sephadex LH-20凝胶色谱分离，用甲醇洗脱，薄层色谱法检测，收集合并含有金鱼草素的洗脱液，减压浓缩，真空干燥，获得含量为96.0％的金鱼草素产品27mg。
实施例4
在提取罐中，加入800g新鲜荸荠皮粉末和8.0L 60％体积百分比的甲醇水溶液，在60℃下提取2h，共提取2次，过滤，合并滤液，减压浓缩膏状，获得提取物125g。
往提取物中加入800mL水制成浑浊液，然后加入1.6L乙酸乙酯萃取3次，合并酯层，减压浓缩，获得萃取物9.2g。
将萃取物溶于17mL甲醇，加入170mL水制成悬浊液，转入1kg D101大孔树脂的层析柱中进行吸附，静态吸附后，先用水洗至流出液无色，再用20％体积百分比的乙醇水溶液800mL洗去极性大的苷类杂质，最后用体积百分比为50％的乙醇水溶液梯度洗脱，收集合并含有金鱼草素的洗脱液，减压浓缩，获得金鱼草素粗品0.65g。
将粗品溶于3.0mL甲醇，加入3.0mL水制成悬浊液，用Sephadex LH-20凝胶色谱纯化，用70％体积百分比的甲醇水溶液洗脱，薄层色谱法检测，收集合并含有金鱼草素的洗脱液，减压浓缩，真空干燥，获得含量为95.7％的金鱼草素44mg。
所得产品经1H-NMR、13C-NMR和ESIMS确认结构。波谱数据证实，所提取纯化得到的是金鱼草素，其化学结构式如下：
金鱼草素，橙黄色粉末。1H NMR(400MHz,methanol-d4)δ:6.01(s,H-5),6.19(s,H-7),6.55(s,H-10),7.46(d,J＝1.5Hz，H-2′),6.81(d,J＝8.2Hz,H-5′),7.16(dd,J＝8.2,1.5Hz,H-6′)；13C NMR(125MHz,methanol-d4)δ:148.9(s,C-2),182.9(s,C-3),159.9(s C-4),98.5(d,C-5),169.6(s,C-6),91.6(d,C-7),169.4(s,C-8),104.7(s,C-9),112.9(d,C-10),125.7(s,C-1′),116.6(d,C-2′),146.6(s,C-3′),147.9(s,C-4′),118.6(d,C-5′),126.0(d,C-6′)；ESIMS(negative-ion mode)m/z 285[M–H]–。
Claims (3)
1.一种荸荠皮提取金鱼草素的方法，其具体步骤如下：
(1)将新鲜的荸荠皮风干，粉碎；以重量计，取荸荠皮粉末1份，入提取罐中，每次加入提取溶剂8-20份，在温度为50-70℃下提取1-3h，共提取2-3次，过滤，合并滤液，减压浓缩至膏状，获得提取物；
(2)以重量计，将提取物1份分散在5-8份水中制成浑浊液，用1-2倍水体积的乙酸乙酯萃取3次，合并萃取液，减压浓缩至干，获得萃取物；
(3)以重量计，将萃取物1份溶于2-3份甲醇中，加入甲醇体积10-15倍的水制成悬浊液，经大孔树脂吸附后，先用水洗去杂质，再用25％体积百分比的甲醇水溶液或乙醇水溶液洗去极性大的苷类杂质，最后用43-50％体积百分比的甲醇水溶液或乙醇水溶液洗脱，薄层色谱法检测，收集合并含有金鱼草素的洗脱液，减压浓缩，获得金鱼草素粗品；
(4)以重量计，将粗品1份溶于4-8份甲醇中，加入等体积的水制成悬浊液，用SephadexLH-20凝胶柱色谱进行分离，用甲醇或70％体积百分比的甲醇水溶液洗脱，薄层色谱法检测，收集合并含有金鱼草素的洗脱液，减压浓缩，真空干燥，得到金鱼草素含量在95％以上的产品。
2.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，所述步骤(1)中提取溶剂为50-75％体积百分比的甲醇水溶液、乙醇水溶液或者丙酮水溶液其中的任意一种。
3.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，所述步骤(3)中所用的大孔吸附树脂为X-5、NKA-II、D101、AB-8H、NKA-9、S-8、D3520、D4020和H103型树脂中的任意一种。
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