CN102675105A

CN102675105A - 一种烟草中的酚类化合物及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN102675105A
Application number: CN2012101228497A
Authority: CN
Inventors: 杨光宇; 许�永; 张霞; 张涛; 王岚; 陈永宽; 刘巍; 缪明明
Original assignee: Yunnan Academy of Tobacco Science
Current assignee: Yunnan Academy of Tobacco Science
Priority date: 2012-04-24
Filing date: 2012-04-24
Publication date: 2012-09-19

Abstract

一种烟草中的酚类化合物及其制备方法和应用。本发明属于烟草化学研究领域，具体涉及烟草中一种新的酚类化合物的制备方法，以及该化合物在抗癌药物中的应用。本发明是从烟草中分离得到酚类化合物，(5-羟基-4-氧代-戊酸)-(3－羟基-4,5-二甲氧基)－苯乙酯，工艺步骤为：烟草样品粉碎后以70wt%的丙酮反复用超声提取，合并提取液；减压浓缩提取液，静置后滤除沉淀物；滤液用乙酸乙酯萃取，获得乙酸乙酯的萃取后液；将萃取后液浓缩成浸膏，浸膏用硅胶柱层析初分，然后采用半制备高效液相色谱进一步分离，即得到所需的化合物。该化合物对MKN-28细胞具有较好的细胞毒活性，对K562细胞和Bel-7402细胞也有一定活性。

Description

一种烟草中的酚类化合物及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于烟草化学研究领域，更具体地说，本发明涉及烟草中一种新的酚类化合物的制备方法，以及该化合物在抗癌药物中的应用。

背景技术

烟草是人类所认识的各种植物中含化学物质最多的物种之一。经过几十年的研究，人们目前从烟草中鉴定出来的单体化学物质就超过3000多种，而且还有许多成分尚未鉴定出来。烟草除主要用于卷烟生产外，还可从中提取多种有利用价值的化学成分，因此除作为卷烟消费外，加强烟草化学成分研究具有重要意义。酚类化合物是指芳香烃中苯环上的氢原子被羟基取代所生成的化合物，该类化合物广泛存在于植物和动物体内；生物活性多样化，具有抗菌消炎、抗肿瘤、抗病毒、抗氧化、保肝护肝和碱基修复等作用，对于糖尿病及相关疾病，以及对由于身心压力所致的性功能障碍，学习、记忆能力低下等都具有明显的改善作用。

发明内容

本发明的目的在于提供一种新的烟草中的酚类化合物。

本发明的另一个目的是提供一种从烟草中酚类化合物的提取制备方法。

本发明进一步的目的是所述化合物的细胞毒活性及其在抗肿瘤药物中的应用。

本发明的目的通过下述技术方案予以实现。

除非另有说明，本发明中所采用的百分数均为质量百分数。

A.本发明从烟草中分离出一种新的酚类化合物，具有下述结构式：

该化合物的命名为，(5-羟基-4-氧代-戊酸)-(3-羟基-4，5-二甲氧基)-苯乙酯[3-hydroxy-4，5-dimethoxyphenethyl-5-hydroxy-4-oxopentanoate]。

B.本发明所述的烟草中酚类化合物的制备方法采用以下步骤：

(1)烟草样品粉碎后以70wt％的丙酮反复用超声提取，合并提取液；

(2)减压浓缩提取液，静置后滤除沉淀物；

(3)滤液用乙酸乙酯萃取，获得乙酸乙酯的萃取后液；

(4)将萃取后液浓缩成浸膏，浸膏用硅胶柱层析初分，然后采用半制备高效液相色谱进一步分离，即得到所需的化合物。

本发明制备所述烟草中酚类化合物还包括以下具体方案：

①烟草样品取样2～3kg粉碎至20～30目，以70wt％的丙酮，每次4L，用超声提取4次，合并提取液；

②静置滤除沉淀物，滤液减压浓缩到原体积的1/2～1/3，用乙酸乙酯进行3～4次萃取；每次萃取用乙酸乙酯2L，振荡50次，振荡完后静置1h分层，然后分出有机相。

③萃取后的溶液蒸干溶剂，浓缩成浸膏，浸膏用甲醇溶解后，用80～100目的硅胶拌样，硅胶量为样品量的1.5倍，上160～200目硅胶柱层析，采用氯仿-丙酮梯度洗脱，氯仿∶丙酮梯度洗脱依次分别为纯氯仿、20∶1、 9∶1、 8∶2、3∶2、1∶1、 20∶1、纯丙酮，其中氯仿-丙酮的8∶2洗脱部分用安捷仑1100半制备高效液相色谱分离，得到所需的化合物。

C.本发明对所述的新化合物进行了细胞毒活性筛选，该化合物对胃癌细胞株(MKN-28)有较好的活性，对人慢性粒细胞白血病细胞株(K562)细胞和人肝癌细胞(Bel-7402)也有一定活性。

本发明的有益效果是：本发明化合物结构简单，人工合成容易实现，产业化前景好，该化合物对MKN-28细胞具有较好的细胞毒活性，对K562细胞和Bel-7402细胞也有一定活性，可作为抗肿瘤药物开发的先导性化合物。

附图说明

图1为本发明化合物的核磁共振氢谱(¹HNMR)；

图2为本发明化合物的核磁共振炭谱(¹³CNMR)；

图3为本发明化合物主要HBMC相关。

具体实施方式

通过下面给出的具体实施例和典型应用实施例，可以进一步清楚地了解本发明。但它们并不是对本发明保护范围的限定。

实施例1

化合物的制备。

烟草样品采于云南玉溪，品种为K326。将烟草样品取样2.5kg粉碎到20～30目，以70％的丙酮，每次4L，用超声提取4次，提取液合并，过滤，减压浓缩提取液至原体积的1/2～1/3，静置后滤除沉淀物，用乙酸乙酯进行3～4次萃取，振荡50次，振荡完后静置1h分层，然后分出有机相，将萃取后的溶液浓缩成浸膏，得浸膏96.5g。浸膏用适量甲醇溶解后用80g粗硅胶(80～100目)拌样，1.5kg的160～200目硅胶装柱进行硅胶柱层析，氯仿-丙酮(1∶0→0∶1)梯度洗脱，TLC监测合并相同的部分，得到8个部分(纯氯仿、氯仿-丙酮20∶1、氯仿-丙酮9∶1、氯仿-丙酮8∶2、氯仿-丙酮3∶2、氯仿-丙酮1∶1、氯仿-丙酮20∶1、纯丙酮)，其中氯仿-丙酮(8∶2)洗脱部分8.29g用安捷仑1100半制备高效液相色谱分离，以48％的甲醇为流动相，Zorbax SB-C₁₈column(9.4×250mm，5μm)半制备柱为固定相，紫外检测器检测波长为254nm，每次进样200μL，收集18.6min的色谱峰，多次累加后蒸干，再次用纯甲醇溶解，再以甲醇为流动相，用Sephadex LH-20凝胶柱层析分离，可得该新化合物。

实施例2

化合物的鉴定。

所述的化合物为白色无定形粉末；紫外光谱(溶剂为甲醇)，λ_max(log ε)350(2.46)，279(3.54)，210(3.95)nm；红外光谱(溴化钾压片)v_max3460，3446，2918，2882，1655，1620，1582，1470，1368，1125，1039，867cm^-1；HRESIMS显示其准分子离子峰m/z 335.1116[M+Na]⁺(calcd335.1107)，结合NMR谱确定其分子式为C₁₅H₂₀O₇，不饱和度为6。¹H和¹³CNMR谱(附图-1和附图-2，数据归属见表-1)显示分子中有1个苯环(苯环上有2个次甲基双键炭)，2个甲氧基，1个酯羰基，1个酮羰基，3个亚甲基，2个氧化亚甲基；1个酚羟基。通过主要HMBC相关(附图-3)可证实该化合物为(5-羟基-4-氧代-戊酸)-(3-羟基-4，5-二甲氧基)-苯乙酯。化合物的结构最终得到确认。通过SCIFINDER数据库检索和文献查询证实该化合物为新化合物。

表-1化合物的¹H和¹³CNMR数据

No.		Compound 9
			1	133.8
2	103.9	6.82(s)
			3	152.8

4	136.6
			5	148.5
6	106.8	7.05(s)
			7	34.6	2.79(t)，J＝6.1
8	65.8	4.32(t)，J＝6.1
			9
1’	172.2
			2’	27.8	2.68(t)，J＝6.3
3’	33.0	2.82(t)，J＝6.3
			4’	210.3
5’	68.5	4.49(s)
			OMe-4	61.0	3.98(s)
OMe-5	55.8	3.78(s)
			Ar-OH	55.8	11.11(s)

实施例3

细胞毒活性检测。

细胞株：MKN-28(胃癌细胞株)，K562(人慢性粒细胞白血病细胞株)，A549(人非小细胞肺癌细胞)，Bel-7402(人肝癌细胞)均由中国科学院上海药物研究所提供。

实验设计：以上细胞与不同浓度化合物温育72小时，每株细胞的实验均重复一次，用两次实验的结果进行数据处理，采用改良MTT法及SRB法评价化合物对细胞增殖的抑制程度，计算抑制率，根据抑制率采用Logit方法计算IC₅₀，比较化合物的体外抗肿瘤活性。

细胞的增殖抑制率＝(空白对照OD值-加药孔的OD值)/空白对照OD值×100％。

(a)改良MTT法

取处于对数生长期的悬浮细胞：K562、CEM细胞，将细胞浓度调整为4×10⁴/ml，加入96孔培养板，90μL/孔。阳性对照为顺铂，用生理盐水溶解。每孔分别加入10μl不同浓度的样品(1号试液-5号试液)。加样组及对照组均设4个复孔，加样组、阳性对照组的高浓度组还设培养基的加药平行孔，每块板均设有4个空白对照孔(仅加培养基)。样品的终浓度分别为10^-2、10^-1、1、10及10²μg/mL，相应DMSO的终浓度分别为0.1％、0.01％、0.001％、0.0001％、0.00001％。样品在终浓度10²μg/mL时，用0.1％DMSO作为溶剂对照，其余浓度均用生理盐水作阴性对照。阳性对照药顺铂的终浓度为10^-1、1、10μg/mL。细胞在37℃，5％CO₂培养箱中分别孵育48h后，加入MTT(5mg/ml，Sigma)，10μL/孔。继续培养4h后，加入三联液[10％SDS-5％异丁醇-0.012mol/L HCL(w/v/v)]，100μL/孔，放置过夜后用酶标仪在570nm、630nm双波长下测定各孔的OD值。

(b)SRB法

取处于对数生长期的贴壁细胞株：HCT、MKN-28、CNE、CA、Tca8113、T-24、SCaBER，用25％胰酶常规消化后，再用15％小牛血清完全RPMI-1640培养基将细胞浓度调整为5×10⁴/mL，加入96孔培养板，90μL/孔。细胞在37℃，5％CO₂培养箱中分别孵育24h后加入阳性对照、阴性对照以及受试样品的各受试浓度同上MTT法(10μL/孔)，样品的终浓度分别为10^-2、10^-1、1、10、10²μg/mL，相应DMSO的终浓度分别为0.1％、0.01％、0.001％、0.0001％、0.00001％。对瘤株CNE、SCaBER、T-24的测定，样品在终浓度10²、10μg/mL时用0.1％、0.01％DMSO作为溶剂对照，其余浓度均用生理盐水作阴性对照；对其它瘤株的测定，样品在终浓度10²μg/mL时用0.1％DMSO作为溶剂对照，其余浓度均用生理盐水作阴性对照。阳性对照药顺铂的终浓度为10^-1、1、10μg/mL，阴性对照为等体积的生理盐水。加样组及对照组均设4复孔，加样组、阳性对照组的高浓度组还设培养基的加药平行孔，每块板均设有4个空白对照孔(仅加培养基)。将96孔培养板置于37℃，5％CO₂培养箱中孵育(细胞与样品作用)48h后，加入4℃、50％的TCA(三氯乙酸)50μL/孔。加完TCA后，将96孔培养板置于4℃孵育1小时，取出培养板，轻轻倾去板内液体。用自来水轻轻冲洗5遍(将自来水由烧杯中轻轻倒入板中，轻晃后再将水倒去)，置于空气中风干至不见水痕。然后加入配制好的0.4％SRB(用1％乙酸稀释)，50μL/孔，于室温下静置染色30分钟后倾去SRB溶液，用1％乙酸冲洗4遍，以除去未与蛋白质结合的染料。置于空气中风干至无水痕后，加入10mM未缓冲Tris(缓血氨酸)溶液150μL/孔(PH10，用三蒸水配制)，将染料溶解后，于振荡器上振荡5分钟，用酶标仪在570nm波长下读取各孔OD值。

(c)实验结果

实验结果表明：进行5次测试取平均值，本发明化合物对MKN-28的IC50值为0.26μM、对K562细胞的IC50值为2.28μM，对Bel-7402细胞的IC50值为3.52μM、对A-549细胞的IC50值为11.6μM。化合物对MKN-28细胞具有较好的细胞毒活性，对K562细胞和Bel-7402细胞也有一定活性。

Claims

1.一种烟草中的酚类化合物，从烟草中分离得到，其特征是结构式为：

该化合物的命名为：(5-羟基-4-氧代-戊酸)-(3-羟基-4，5-二甲氧基)-苯乙酯。

2.一种权利要求1所述的烟草中的酚类化合物的制备方法，其特征是工艺步骤如下：

(2)减压浓缩提取液，静置后滤除沉淀物；

(3)滤液用乙酸乙酯萃取，获得乙酸乙酯的萃取后液；

3.按权利要求2所述的烟草中的酚类化合物的制备方法，其特征是具体工艺步骤为：

③萃取后的溶液蒸干溶剂，浓缩成浸膏，浸膏用甲醇溶解后，用80～100目的硅胶拌样，硅胶量为样品量的1.5倍，上160～200目硅胶柱层析，采用氯仿-丙酮梯度洗脱，氯仿-丙酮梯度洗脱依次分别为纯氯仿、20∶1、9∶1、8∶2、3∶2、1∶1、20∶1、纯丙酮，其中氯仿-丙酮的8∶2洗脱部分用安捷仑1100半制备高效液相色谱分离，得到所需的化合物。

4.一种权利要求1所述的烟草中的酚类化合物在抗胃癌、人慢性粒细胞白血病和人肝癌药物中的应用。