CN109796509B - 环烯醚萜类化合物及其制备方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了如式(1)、(2)、(3)或(4)所示的环烯醚萜类化合物及其制备方法，本发明化合物1、2、3、4结构新颖，且具有较好的抗肿瘤活性，其提取分离方法简易，便于对其进行进一步的药理和临床研究，为开发具有较好抗肿瘤活性的药物创造条件；

Description

环烯醚萜类化合物及其制备方法与应用

(一)技术领域

本发明涉及环烯醚萜类化合物及其制备方法，以及在制备抗肿瘤药物中的应用。

(二)背景技术

猴面包树(Adansonia digitata)原产非洲热带。除了非洲，地中海、大西洋和印度洋诸岛，澳洲北部也都可以看到猴面包树。中国福建、广东、云南的热带地区少量栽培。非洲猴面包树的果实钙含量比菠菜高50％以上，含较高的抗氧化成分，维生素C含量是单个橙子的三倍，因此它有时也被称为超级水果。同时其还具有消炎、退热和抗疟作用。

本发明所涉及的环烯醚萜类化合物(从猴面包树干燥果实中分离得到)及其制备方法与应用，迄今在国内外尚未见相关专利或文献报道。

(三)发明内容

本发明目的在于提供环烯醚萜类化合物及其制备方法，以及在制备抗肿瘤药物中的应用。

本发明的技术方案如下：

环烯醚萜类化合物，如式(1)、(2)、(3)或(4)所示：

本发明还提供了所述环烯醚萜类化合物的制备方法，所述方法包括如下步骤：

(1)以猴面包树干燥果实为原料，经醇提、浓缩得到浸膏状乙醇提取物；

具体的，所述醇提、浓缩的操作方法为：将猴面包树干燥果实与体积分数40～70％(优选70％)的乙醇水溶液按料液比1：5～10(优选1：8，kg：L)混合，回流(75～85℃)提取0.5～1h(优选1h)，过滤，滤渣重复提取2～4次，合并滤液，浓缩，得到浸膏状乙醇提取物；

(2)将步骤(1)所得浸膏状乙醇提取物混悬于水中，用正丁醇萃取，收集萃取液，浓缩，得到正丁醇浸膏；

(3)将步骤(2)所得正丁醇浸膏进行中低压制备色谱分离(C18填料)，以体积分数为10％、40％、70％的甲醇水溶液为洗脱剂依次进行梯度洗脱，流速：30mL/min，每种梯度的洗脱剂用量为3～5倍柱体积；

(4)取步骤(3)中体积分数40％甲醇水溶液的洗脱部分，蒸除溶剂后进行开放柱色谱分离(C18填料)，以体积分数10％、30％、60％、95％的甲醇水溶液为洗脱剂依次进行梯度洗脱，流速：30mL/min，每种梯度的洗脱剂用量为3～5倍柱体积，收集体积分数30％甲醇水溶液的洗脱部分，蒸除溶剂后进行半制备高效液相色谱分离，以体积分数20％的乙腈水溶液进行洗脱，分别收集含目标化合物1、3、4的洗脱液，减压蒸除溶剂并干燥，得到化合物1、3、4；

在分别收集含目标化合物1、3、4的洗脱液时，可通过TLC检测，以氯仿：甲醇(体积比2：1)为展开剂，化合物1、3、4的Rf值分别为0.3、0.1、0.15；

(5)取步骤(3)中体积分数10％甲醇水溶液的洗脱部分，蒸除溶剂后进行半制备高效液相色谱分离，以体积分数10％的乙腈水溶液进行洗脱，收集含目标化合物2的洗脱液，减压蒸除溶剂并干燥，得到化合物2；

在收集含目标化合物2的洗脱液时，可通过TLC检测，以氯仿：甲醇(体积比1：1)为展开剂，化合物2的Rf值为0.15。

本发明所述环烯醚萜类化合物可应用于制备抗肿瘤药物。

与现有技术相比，本发明的有益效果在于：所得到的化合物1、2、3、4结构新颖，且具有较好的抗肿瘤活性，其提取分离方法简易，便于对其进行进一步的药理和临床研究，为开发具有较好抗肿瘤活性的药物创造条件。

(四)附图说明

图1：式(1)化合物的高分辨ESI质谱；

图2：式(1)化合物的氢谱；

图3：式(1)化合物的碳谱；

图4：式(1)化合物的HSQC谱；

图5：式(1)化合物的HMBC谱；

图6：式(1)化合物的ROESY谱；

图7：式(2)化合物的高分辨ESI质谱；

图8：式(2)化合物的氢谱；

图9：式(2)化合物的碳谱；

图10：式(2)化合物的HSQC谱；

图11：式(2)化合物的HMBC谱；

图12：式(2)化合物的ROESY谱；

图13：式(3)化合物的高分辨ESI质谱；

图14：式(3)化合物的氢谱；

图15：式(3)化合物的碳谱；

图16：式(3)化合物的HSQC谱；

图17：式(3)化合物的HMBC谱；

图18：式(3)化合物的ROESY谱；

图19：式(4)化合物的高分辨ESI质谱；

图20：式(4)化合物的氢谱；

图21：式(4)化合物的碳谱；

图22：式(4)化合物的HSQC谱；

图23：式(4)化合物的HMBC谱；

图24：式(4)化合物的ROESY谱。

(五)具体实施方式：

下面通过具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明的保护范围并不仅限于此。

实施例1：

以猴面包树干燥果实0.8kg为原料，按照1:8(kg/L)的料液比经70％乙醇回流提取三次，每次一个小时，浓缩得浸膏状乙醇提取物75g，将浓缩得乙醇提取物混悬于水中，以正丁醇(3次，750ml/次)萃取后，将正丁醇萃取部分浸膏经中低压制备色谱分离(C18填料，粒径50um，柱长50cm，直径8cm)，使用甲醇-水(甲醇体积含量为10％、40％、70％)依次梯度洗脱，流速：30mL/min，每种梯度的洗脱剂用量为5倍柱体积，取其中40％甲醇的洗脱部分经C18填料开放柱色谱(C18填料，粒径150um，柱长120cm，直径10cm)分离，使用甲醇-水(甲醇体积含量为10％、30％、60％、95％)依次梯度洗脱，流速：30mL/min，每种梯度的洗脱剂用量为4倍柱体积，取其中30％甲醇的洗脱部分再经半制备高效液相色谱(Agilent XDB-C18reversed-phase column-5μm,250×10mm)分离，以乙腈-水(体积配比为20:80)进行洗脱，得到式1化合物(13mg)、式3化合物(20mg)、式4化合物(10mg)。

所得化合物经过系统结构鉴定，结果如下：

主要利用包括高分辨质谱、核磁共振谱(¹H NMR、¹³C NMR、2D NMR)。

化合物1为浅黄色油状物，HRESIMS(图1)给出准分子离子峰m/z：559.1228[M-H]^-，确定化合物分子式为C₂₄H₂₈O₁₃Cl。

¹H NMR(CD₃OD，600MHz)谱(图2)给出2个反式烯氢质子信号δ_H 6.31(1H,d,J＝15.6Hz)、δ_H 7.58(1H,d,J＝15.6Hz)，一组苯环上的ABX偶和系统质子信号δ_H 6.79(1H,d,J＝7.8Hz)、δ_H 6.97(1H,dd,J＝1.8,7.8Hz)、δ_H 7.06(1H,d,J＝1.8Hz)，3个半缩醛质子信号δ_H 5.67(1H,d,J＝1.8)、δ_H 5.32(1H,d,J＝2.4)、δ_H 4.70(1H,d,J＝7.8)。(表1)

¹³C NMR(CD₃OD，150MHz)谱结合HSQC谱(图3、4)给出24个碳信号，包括1个羰基碳信号，3个sp2杂化季碳信号，5个sp2杂化次甲基信号，1个sp3杂化季碳信号，3个sp3杂化亚甲基碳信号，11个sp3杂化次甲基碳信号。(表1)

通过以上分析，并结合HRESIMS数据结构中还具有一个Cl原子。通过HMBC谱对化合物取代基的位置及相关结构进行了确认，并通过ROESY谱对化合物的相对构型进行了确认。

通过上述解析，最终确定化合物结构式如式1所示。

化合物3为浅黄色油状物，HRESIMS(图13)给出准分子离子峰m/z：685.1984[M-H]^-，确定化合物分子式为C₃₀H₃₇O₁₈。

¹H NMR(CD₃OD，600MHz)谱(图14)给出2个反式烯氢质子信号δ_H 6.32(1H,d,J＝15.6Hz)、δ_H 7.61(1H,d,J＝15.6Hz)，一组苯环上的ABX偶和系统质子信号δ_H 6.79(1H,d,J＝7.8Hz)、δ_H 6.97(1H,dd,J＝1.8,7.8Hz)、δ_H 7.07(1H,d,J＝1.8Hz)，3个半缩醛质子信号δ_H 5.06(1H,d,J＝9.0)、δ_H 4.80(1H,d,J＝7.8)、δ_H 4.89(1H,d,J＝3.6)。(表2)

¹³C NMR(CD₃OD，150MHz)谱结合HSQC谱(图15、16)给出30个碳信号，包括1个羰基碳信号，3个sp2杂化季碳信号，7个sp2杂化次甲基信号，1个sp3杂化季碳信号，3个sp3杂化亚甲基碳信号，15个sp3杂化次甲基碳信号。(表2)

通过以上分析，并与梓醇6-咖啡酸酯的数据对照发现多出了一组半乳糖信号。通过HMBC谱确定了半乳糖分子的在结构中的连接位点，并确定了其结构。通过ROESY谱对化合物的相对构型进行了确认。

通过上述解析，最终确定化合物结构式如式3所示。

化合物4为浅黄色油状物，HRESIMS(图19)给出准分子离子峰m/z：685.1984[M-H]^-，确定化合物分子式为C₃₀H₃₇O₁₈。

将化合物4的¹H NMR、¹³C NMR数据(表2)与化合物3的数据比较发现，C-10、C-5’、C-6’位的碳谱化学位移发生了较大的变化，结合HRESIMS数据和苷化位移规律，推测半乳糖分子连接位置发生了改变。通过HMBC谱对半乳糖的取代位置及相关结构进行了确认，并通过ROESY谱对化合物的相对构型进行了确认。

通过上述解析，最终确定化合物结构式如式4所示。

实施例2：

以猴面包树干燥果实0.8kg为原料，按照1:8(kg/L)的料液比经70％乙醇回流提取三次，每次一个小时，浓缩得浸膏状乙醇提取物75g，将浓缩得乙醇提取物混悬于水中，以正丁醇(3次，750ml/次)萃取后，将正丁醇萃取部分浸膏经中低压制备色谱分离(C18填料，粒径50um，柱长50cm，直径8cm)，使用甲醇-水(甲醇体积含量为10％、40％、70％)依次梯度洗脱，流速：40mL/min，每种梯度的洗脱剂用量为4倍柱体积，取其中10％甲醇的洗脱部分经半制备高效液相色谱(Agilent XDB-C18reversed-phase column-5μm,250×10mm)分离，以乙腈-水(体积配比为10:90)进行洗脱，得到式2化合物(20mg)。

所得化合物经过系统结构鉴定，结果如下：

主要利用包括高分辨质谱、核磁共振谱(¹H NMR、¹³C NMR、2D NMR)。

化合物2为浅黄色油状物，HRESIMS(图7)给出准分子离子峰m/z：541.1558[M-H]^-，确定化合物分子式为C₂₄H₂₉O₁₄。

将化合物2的¹H NMR、¹³C NMR数据(表1)与化合物1的数据比较发现，C-7位的碳谱化学位移发生了较大的变化，结合HRESIMS数据可知该位置为羟基取代。通过HMBC谱对化合物取代基的位置及相关结构进行了确认，并通过ROESY谱对化合物的相对构型进行了确认。

通过上述解析，最终确定化合物结构式如式2所示。

表1化合物1、2的¹H、¹³C NMR数据^a,b

^aδ为化学位移，其单位为ppm，偶合常数的单位为Hz。

^b该测试是在600MHZ核磁共振波谱仪上进行，氘代试剂为CD₃OD。

表2化合物3、4的¹H、¹³C NMR数据^a,b

^aδ为化学位移，其单位为ppm，偶合常数的单位为Hz。

^b该测试是在600MHZ核磁共振波谱仪上进行，氘代试剂为CD₃OD。

实施例3：

式1、2、3、4化合物在体外对人乳腺癌MDA-MB-231细胞的生长抑制实验：MDA-MB-231细胞单层接种在含质量浓度2％谷氨酰胺、1.5％碳酸氢钠、10％胎牛血清的RPMI-1640培养液中。并加入了100单位/毫升的青霉素和100微克/毫升的链霉素。在温度为37℃，CO₂浓度为5％的细胞培养箱中培养。将对数生长期的细胞配制成1×10⁴cell/mL的浓度接种于96孔板上，每孔0.1mL然后在孔中加入含有不同浓度的培养基，每个浓度有3组平行，对照组加等量溶剂，置于37℃二氧化碳培养箱中培养72h，然后离心(1000rpm,20min)，弃去上清液，每孔加0.20mg/mL的MTT无血清培养基，37℃下继续培养3h，离心，除去上清液后，加入0.20mL DMSO溶解MTT沉淀，用微型超声震荡5min混匀，在酶标仪上测定570nm处的光密度值，并按下列计算公式计算肿瘤细胞生长抑制率IC₅₀：

肿瘤细胞生长抑制率＝(1-实验孔测定值/对照孔测定值)×100％

通过MTT法测定并计算出各化合物的IC₅₀值，结果如表所示：

体外实验结果表明式1、2、3、4化合物在体外对人乳腺癌MDA-MB-231细胞有生长抑制作用，有望开发其在制备人乳腺癌细胞株MDA-MB-231抑制剂中的用途。

Claims (4)

1.环烯醚萜类化合物，如式(1)、(2)、(3)或(4)所示：

2.如权利要求1所述的环烯醚萜类化合物的制备方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

(1)以猴面包树干燥果实为原料，经醇提、浓缩得到浸膏状乙醇提取物；

(2)将步骤(1)所得浸膏状乙醇提取物混悬于水中，用正丁醇萃取，收集萃取液，浓缩，得到正丁醇浸膏；

(3)将步骤(2)所得正丁醇浸膏进行中低压制备色谱分离，以体积分数为10％、40％、70％的甲醇水溶液为洗脱剂依次进行梯度洗脱，流速：30mL/min，每种梯度的洗脱剂用量为3～5倍柱体积；

(4)取步骤(3)中体积分数40％甲醇水溶液的洗脱部分，蒸除溶剂后进行开放柱色谱分离，以体积分数10％、30％、60％、95％的甲醇水溶液为洗脱剂依次进行梯度洗脱，流速：30mL/min，每种梯度的洗脱剂用量为3～5倍柱体积，收集体积分数30％甲醇水溶液的洗脱部分，蒸除溶剂后进行半制备高效液相色谱分离，以体积分数20％的乙腈水溶液进行洗脱，分别收集含目标化合物1、3、4的洗脱液，减压蒸除溶剂并干燥，得到化合物1、3、4；

(5)取步骤(3)中体积分数10％甲醇水溶液的洗脱部分，蒸除溶剂后进行半制备高效液相色谱分离，以体积分数10％的乙腈水溶液进行洗脱，收集含目标化合物2的洗脱液，减压蒸除溶剂并干燥，得到化合物2。

3.如权利要求2所述的环烯醚萜类化合物的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述醇提、浓缩的操作方法为：将猴面包树干燥果实与体积分数40～70％的乙醇水溶液按料液比1：5～10混合，回流提取0.5～1h，过滤，滤渣重复提取2～4次，合并滤液，浓缩，得到浸膏状乙醇提取物。

4.如权利要求1所述的环烯醚萜类化合物在制备人乳腺癌细胞株MDA-MB-231抑制剂中的应用。

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