CN107699634A - 一种芦笋茎枯病菌lamp检测引物组及其检测方法 - Google Patents

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CN107699634A CN201711235832.1A CN201711235832A CN107699634A CN 107699634 A CN107699634 A CN 107699634A CN 201711235832 A CN201711235832 A CN 201711235832A CN 107699634 A CN107699634 A CN 107699634A
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杜宜新
阮宏椿
陈福如
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杨秀娟
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Abstract

本发明提供了一种芦笋茎枯病菌LAMP检测引物组及其检测方法，专用于芦笋茎枯病菌的特异性检测，属于农作物病害检测和生物技术领域，包括外引物F3和B3，以及内引物FIP和BIP，序列见SEQ ID NO.1‑4。基于该引物组建立的芦笋茎枯病菌检测方法，经过LAMP恒温扩增后显色反应或琼脂糖凝胶电泳检测，可观察到绿色荧光或出现LAMP特征性的梯形条带。所发明的LAMP检测引物组及其检测方法能在生产实践中实现感染芦笋茎枯病菌植株的快速、灵敏、准确检测，同时可用于田间病害的早期诊断和病菌的监测、鉴定，为芦笋茎枯病的早期预警和防控提供可靠的技术和理论依据。

Description

一种芦笋茎枯病菌LAMP检测引物组及其检测方法
技术领域
本发明涉及一种芦笋茎枯病菌LAMP检测引物组及其检测方法，专用于芦笋茎枯病菌的快速分子检测，同时可实现田间芦笋茎枯病的早期诊断和病菌的监测和鉴定，属于农作物病害检测、鉴定、防治及生物技术领域。
背景技术
芦笋富含皂苷、固醇、黄酮甙、异黄酮、含硫氨基酸、组蛋白、核酸和酶类大分子、维生素C、维生素E、 B 族维生素、芦丁、叶酸、糖类免疫的激活剂以及人类健康必要的锰、锌、铜、铁等微量矿物质，营养价值极高，是一种名贵的保健蔬菜，其嫩茎风味鲜美，细嫩可口，具有很高的食用和药用价值，已成为深受消费者喜爱的营养保健型高档蔬菜，国际上享有“蔬菜之王”的美誉，风靡欧洲、美洲、韩国、日本等国，也成为我国出口创汇的特色蔬菜之一。芦笋是多年生宿根的草本植物，春、秋季抽出的嫩芽即为可食用的“芦笋”。芦笋是一种名贵的中药材，古代《神农本草经》称它为“上品之上”，《本草纲目》称其能“解诸瘤之毒”。据科学研究表明，芦笋富含组织蛋白质，人体所需的17种氨基酸，而以天门冬氨含量高达51.32mg/100ml，维生素中以维生素A含量尤为丰富，多种微量元素以硒的含量较为突出，所有这些特殊物质都能抑制癌细胞的产生。
芦笋茎枯病是芦笋上一种毁灭性病害，由拟茎点霉[Phomopsis asparagi(Sacc.)Bubak]引起，茎枯病的发生需要湿热气候条件，欧美芦笋主产区均为冷凉气候，故在欧美国家基本不发生茎枯病。在我国芦笋种植地区芦笋茎枯病每年均有不同程度的发生，我国南方芦笋种植区，茎枯病发生更严重，一旦发病当年就会造成20%-50%的损失，如果防治不力，次年就可能造成绝收毁园，给芦笋生产造成极大威胁。芦笋茎枯病菌在田间主要通过风雨传播，雨水飞溅是近距离传播的主要因子，而种子带菌、带菌鲜笋调运是远距离传播的主要因子，而病害初发期是病害防治的最佳时期。因此，建立一种简便、快速、灵敏的检测方法用于芦笋茎枯病的早期诊断，为病害的最佳防治时期提供技术支撑，同时防治病害从病区向非病区传播具有重要意义。
芦笋茎枯病可为害芦笋茎秆、枝条、小枝和拟叶，为害芦笋茎秆和枝条初期出现水渍状斑点，后逐渐扩大成梭形或椭圆形的病斑。干燥条件下病斑边缘清晰，扩展较慢，高温潮湿时病斑扩展迅速，深入茎秆髓部，造成茎秆枯死。为害拟叶和小枝，先出现褐色小点，而后迅速扩大，形成边缘紫红色，中间灰白色的拟叶病段，使拟叶迅速枯死。芦笋茎枯病为害茎秆，尤其是为害茎秆基部的病害症状与芦笋枯萎病相似，而为害拟叶和小枝的病害症状与芦笋褐斑病相似，给芦笋茎枯病的诊断造成很大难度。以症状为基础的病害常规诊断技术耗时长、效率低、准确性差，难以满足芦笋茎枯病诊断的实际需要，因此迫切需要建立一套方便快捷、结果可靠、灵敏度高的快速诊断技术。
环介导等温扩增（loop-mediated isothermal amplification, LAMP）技术是由日本科学家Notomi等开发的一种简便、快速、准确、高效的核酸恒温扩增方法。该技术在等温条件下短时间内实现大量扩增，30 min -60 min内实现109-1010倍的扩增，具有很高的灵敏性和特异性，且操作简便，检测结果可肉眼判断。相比不同的PCR技术，LAMP技术全程恒温反应，无需PCR仪，且扩增量大灵敏度高。目前LAMP检测已成功应用于人畜病原物、食品安全、环境安全及多种植物病原物检测的报道，但目前有关芦笋茎枯病菌LAMP检测的研究尚未见报道。
发明内容
针对现有技术中对芦笋茎枯病菌的检测和鉴定程序繁琐、耗时长、对鉴定经验要求高、准确度低，PCR检测需要依靠扩增仪等设备的问题，提供了一种芦笋茎枯病菌LAMP检测引物组及简便、快捷、灵敏、特异的可视化检测方法。
为实现上述目的，本发明采取了以下技术方案：
1.芦笋茎枯病菌LAMP检测引物的设计
根据芦笋茎枯病菌核糖体内转录间隔区（rDNA-ITS）序列在真菌种内的高度保守性和科属种间可变性的特点设计对芦笋茎枯病菌具有特异扩增作用的LAMP检测引物组，包括2条外引物（F3和B3）和2条内引物（FIP和BIP），其核苷酸序列分别为：
F3：5’-ACATTGCGCCCTCTGGTAT-3’；
B3：5’-CCTACCTGATCCGAGGTCAA-3’；
FIP: 5’-GAAAGCAGTGCCCCAACACCA-CATGCCTGTTCGAGCGTC-3’；
BIP: 5’GGACCCCGAGCGCAGTAGTTA-AGTTGGGGGTTTAACGGC-3’。
2.建立芦笋茎枯病菌LAMP检测方法，包括以下步骤：
(1)从待检测样品中提取DNA；
用于检测病原菌纯培养物时，采用 CTAB 法提取供试菌株基因组 DNA；用于检测芦笋植株组织是否存在芦笋茎枯病菌时，采用NaOH 快速裂解法提取芦笋植株组织基因组DNA。
(2) 以提取待测样品DNA为模板进行LAMP扩增检测：LAMP反应体系25 μL，反应体系包括0.2 mmol/L的F3和B3，1.6 mmol/L的FIP和BIP，Bst DNA聚合酶为8 U，DNA模板50～100 ng，12.5 uL的LAMP反应混合液（40 mM Tris-HCl，20 mM(NH4)2SO4，20 mM KCl，16 mMMgSO4，1.6 mol/L 甜菜碱，2.0 mM dNTPs，0.2% Trion X-100），用无菌的超纯水补足25uL。LAMP反应条件为63-65℃温育45-60 min，85℃灭活5-10 min。
(3)LAMP反应结果测定：采用荧光染料目测观察法或琼脂糖凝胶电泳法。所述的荧光染料目测观察法：待LAMP反应结束后，在LAMP反应的扩增产物中加入荧光染料显色剂SYBR green I 1.0 uL，显色结果观察到绿色荧光的判断为阳性，橙色或橘黄色判断为阴性。所述的琼脂糖凝胶电泳法：取2.0 uL LAMP扩增产物用2%琼脂糖凝胶电泳检测，如出现梯形条带判断为阳性，没有出现条带则判断为阴性。
本发明的有益效果在于：
（1）特异性强、准确性高：本发明是根据真菌核糖体转录间隔区（rDNA-ITS）序列在真菌种内的高度保守性和科属种间可变性的特点，选取了6个特定区域设计了对芦笋茎枯病菌具有特异扩增作用的4条LAMP引物。已经对不同地理来源的芦笋茎枯病菌、芦笋褐斑病菌、芦笋枯萎病菌、携带芦笋茎枯病菌的植物组织和健康的芦笋组织进行了检测验证，只有芦笋茎枯病菌和携带该病菌的组织呈现阳性，说明本发明所设计的引物组及检测方法用于检测芦笋茎枯病菌准确可靠，能有效区分发生在芦笋上症状特征相似的病害；
（2）灵敏度高：LAMP对芦笋茎枯病菌的检测灵敏度在DNA水平上可达10 fg，灵敏度高；
（3）适用性广、实用性好：本发明的芦笋茎枯病菌的检测方法，不仅能对病菌菌丝体进行检测，也能对感病的芦笋组织进行检测，可实现芦笋茎枯病菌的早期检测，即在病害显症前进行检测，防止病害的爆发流行。
（4）操作简便快速：LAMP是在等温条件下进行，只需一个水浴锅即可，结果可视化，一般整个检测过程可在1.5小时内完成，操作简便快捷。
附图说明
图1为本发明LAMP检测方法对芦笋茎枯病菌的特异性检测结果：上图为琼脂糖凝胶电泳检测结果，下图为可视化显色结果，其中泳道M为5000bp DNA Marker，泳道2为阳性对照、泳道3-5为芦笋茎枯病菌，泳道6-10分别为：芦笋褐斑病菌、芦笋枯萎病菌、大豆炭疽病菌、番茄灰霉病菌、阴性对照；其中可视化显色结果中2-5显示绿色荧光，其他不显示。
图2为本发明LAMP检测方法对芦笋茎枯病菌的灵敏性检测结果：上图为琼脂糖凝胶电泳检测结果，下图为可视化显色结果，其中泳道M为5000bp DNA Marker，泳道2-11的模板DNA浓度分别为：100ng、10ng、1ng、100pg、10pg、1pg、100fg、10fg、阴性对照、阳性对照；其中可视化显色结果中2-8、11显示绿色荧光，其他不显示。
图3为本发明LAMP检测方法对芦笋发病组织实用性检测结果，上图为琼脂糖凝胶电泳检测结果，下图为可视化显色结果，其中泳道M为5000bp DNA Marker，泳道2-7分别为芦笋茎枯病菌、自然发病的芦笋组织、人工接种发病的芦笋组织、健康芦笋组织、阳性对照、阴性对照；其中可视化显色结果中2-4、6显示绿色荧光，其他不显示。
具体实施方式
为了使本发明所述的内容更加便于理解，下面结合具体实施方式对本发明所述的技术方案做进一步的说明。
下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的试验材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
实施例1 芦笋茎枯病菌LAMP引物组设计
根据芦笋茎枯病菌核糖体内转录间隔区（rDNA-ITS）序列在真菌种内的高度保守性和科属种间可变性的特点设计对芦笋茎枯病菌具有特异扩增作用的LAMP检测引物组，包括2条外引物（F3和B3）和2条内引物（FIP和BIP），其核苷酸序列分别为：
F3：5’-ACATTGCGCCCTCTGGTAT-3’；
B3：5’-CCTACCTGATCCGAGGTCAA-3’；
FIP: 5’-GAAAGCAGTGCCCCAACACCA-CATGCCTGTTCGAGCGTC-3’；
BIP: 5’GGACCCCGAGCGCAGTAGTTA-AGTTGGGGGTTTAACGGC-3’。
实施例2 芦笋茎枯病菌LAMP检测方法的建立
1.待测样品DNA的提取：
①用于检测病原菌纯培养物时，采用 CTAB 法提取供试菌株基因组 DNA，具体步骤如下：
(1)取0.1 g菌丝粉于1.5 mL 离心管中，加入900 μL 2wt.%CTAB提取液，使用振荡器振荡混匀，60℃水浴60 min，室温条件下，12000r/min离心15 min；
(2)取上清液700 μL，加等体积酚、氯仿、异戊醇混合液（各体积比为25:24:1），温和摇动，室温条件下，8000 r/min离心10 min ；
(3)取上清液500 μL，加入等体积氯仿再抽提一次，室温条件下，8000 r/min离心10min；
(4)取上清液350 μL，加入1/10 体积3 mol/L NaAc 和2倍体积无水乙醇，-20℃沉淀60min，4℃条件下，8000 r/min离心5 min ；
(5)弃去上清液，加入700 μL 体积浓度为70%冰乙醇，轻摇10 sec，4℃条件下，8000 r/min离心10 sec，晾干，加入50 μL TE缓冲液，-20℃保存备用。
②用于检测芦笋植株组织是否存在芦笋茎枯病菌时，采用NaOH 快速裂解法提取芦笋植株组织基因组DNA，具体步骤如下：
a.称取待检测的植物组织0.1 g，加入0.5 mol/L NaOH 30 μL，将组织充分磨碎成糊；
b.将糊状组织转入1.5 mL 离心管中，12000r/min 离心6 min，取上清液5 μl；
c.上清液中加入495 μL 0.1 mol/L Tris-HCl（pH=8.0），混合均匀，取1.0 μL 作为PCR模板进行扩增；
2.以提取待测样品DNA为模板进行LAMP扩增：LAMP反应体系25μL，反应体系包括0.2mmol/L的F3和B3，1.6 mmol/L的FIP和BIP，Bst DNA聚合酶为8 U，DNA模板50～100 ng，12.5uL的LAMP反应混合液（40 mM Tris-HCl，20 mM(NH4)2SO4，20 mM KCl，16 mM MgSO4，1.6mol/L 甜菜碱，2.0 mM dNTPs，0.2% Trion X-100），用无菌的超纯水补足25 uL。LAMP反应条件为63-65℃温育45-60 min，85℃灭活5-10 min。
3.LAMP反应结果测定：采用荧光染料目测观察法或琼脂糖凝胶电泳法。所述的荧光染料目测观察法：待LAMP反应结束后，在LAMP反应的扩增产物中加入荧光染料显色剂SYBR green I 1.0 uL，显色结果观察到绿色荧光的判断为阳性，存在芦笋茎枯病菌；橙色或橘黄色判断为阴性，不存在芦笋茎枯病菌。所述的琼脂糖凝胶电泳法：取2.0 uL LAMP扩增产物用2%琼脂糖凝胶电泳检测，如出现梯形条带判断为阳性，存在芦笋茎枯病菌；没有出现条带则判断为阴性，不存在芦笋茎枯病菌。
实施例3芦笋茎枯病菌LAMP检测特异性测定
1.采用CTAB 法提取3株芦笋茎枯病菌、芦笋褐斑病菌、芦笋枯萎病菌、大豆炭疽病菌、番茄灰霉病菌的基因组DNA。
2.以提取供试菌的DNA为模板进行LAMP扩增：LAMP反应体系25 μL，反应体系包括0.2 mmol/L的F3和B3，1.6 mmol/L的FIP和BIP，Bst DNA聚合酶为8 U，DNA模板50～100 ng，12.5 uL的LAMP反应混合液（40 mM Tris-HCl，20 mM(NH4)2SO4，20 mM KCl，16 mM MgSO4，1.6 mol/L 甜菜碱，2.0 mM dNTPs，0.2% Trion X-100），用无菌的超纯水补足25 uL。LAMP反应条件为63-65℃温育45-60 min，85℃灭活5-10 min。
3.LAMP反应结果测定：采用荧光染料目测观察法或琼脂糖凝胶电泳法。所述的荧光染料目测观察法：待LAMP反应结束后，在LAMP反应的扩增产物中加入荧光染料显色剂SYBR green I 1.0 uL，显色结果观察到绿色荧光的判断为阳性，存在芦笋茎枯病菌；橙色或橘黄色判断为阴性，不存在芦笋茎枯病菌。所述的琼脂糖凝胶电泳法：取2.0 uL LAMP扩增产物用2%琼脂糖凝胶电泳检测，如出现梯形条带判断为阳性，存在芦笋茎枯病菌；没有出现梯形条带则判断为阴性，不存在芦笋茎枯病菌。
4.特异性验证结果
如图1所示，3株芦笋茎枯病菌显色结果可观察到绿色荧光，琼脂糖凝胶电泳出现LAMP特征性梯形条带，而供试其它作物病原菌和阴性对照显色结果为橙色，琼脂糖凝胶电泳未出现LAMP特征性梯形条带，表明本发明的LAMP引物组可以将芦笋茎枯病菌与其他病原菌区分开来，具有很强的特异性，本发明的检测方法可用于芦笋茎枯病菌的特异性检测和鉴定。
实施例4芦笋茎枯病菌LAMP检测灵敏性测定
1.采用CTAB 法提取芦笋茎枯病菌的基因组DNA；
2.将提取的芦笋茎枯病菌的基因组DNA，经分光光度计测定浓度后，用无菌超纯水稀释，配制成系列浓度，备用；
3.以配制的成系列浓度DNA为模板进行常规LAMP扩增：LAMP反应体系25 μL，反应体系包括0.2 mmol/L的F3和B3，1.6 mmol/L的FIP和BIP，Bst DNA聚合酶为8 U，DNA模板50～100ng，12.5 uL的LAMP反应混合液（40 mM Tris-HCl，20 mM(NH4)2SO4，20 mM KCl，16 mMMgSO4，1.6 mol/L 甜菜碱，2.0 mM dNTPs，0.2% Trion X-100），用无菌的超纯水补足25uL。LAMP反应条件为63-65℃温育45-60 min，85℃灭活5-10 min。
4.LAMP反应结果测定：采用荧光染料目测观察法或琼脂糖凝胶电泳法。所述的荧光染料目测观察法：待LAMP反应结束后，在LAMP反应的扩增产物中加入荧光染料显色剂SYBR green I 1.0 uL，显色结果观察到绿色荧光的判断为阳性，存在芦笋茎枯病菌；橙色或橘黄色判断为阴性，不存在芦笋茎枯病菌。所述的琼脂糖凝胶电泳法：取2.0 uL LAMP扩增产物用2%琼脂糖凝胶电泳检测，如出现梯形条带判断为阳性，存在芦笋茎枯病菌；没有出现条带则判断为阴性，不存在芦笋茎枯病菌。
5.检测结果
如图2所示，显色结果可观察到绿色荧光，琼脂糖凝胶电泳出现LAMP特征性的梯形带，检测灵敏度可达10 fg。
实施例5发病芦笋植株中芦笋茎枯病菌的LAMP检测
1.采用CTAB 法提取芦笋茎枯病菌基因组DNA；采用NaOH 快速裂解法提取芦笋植株组织基因组DNA。
2.以提取供试样品的DNA为模板进行LAMP扩增：LAMP反应体系25μL，反应体系包括0.2 mmol/L的F3和B3，1.6 mmol/L的FIP和BIP，Bst DNA聚合酶为8 U，DNA模板50～100ng，12.5 uL的LAMP反应混合液（40 mM Tris-HCl，20 mM(NH4)2SO4，20 mM KCl，16 mM MgSO4，1.6 mol/L 甜菜碱，2.0 mM dNTPs，0.2% Trion X-100），用无菌的超纯水补足25 uL。LAMP反应条件为63-65℃温育45-60 min，85℃灭活5-10 min。
3.LAMP反应结果测定：采用荧光染料目测观察法或琼脂糖凝胶电泳法。所述的荧光染料目测观察法：待LAMP反应结束后，在LAMP反应的扩增产物中加入荧光染料显色剂SYBR green I 1.0 uL，显色结果观察到绿色荧光的判断为阳性，存在芦笋茎枯病菌；橙色或橘黄色判断为阴性，不存在芦笋茎枯病菌。所述的琼脂糖凝胶电泳法：取2.0 uL LAMP扩增产物用2%琼脂糖凝胶电泳检测，如出现梯形条带判断为阳性，存在芦笋茎枯病菌；没有出现条带则判断为阴性，不存在芦笋茎枯病菌。
4.检测结果
如图3所示，芦笋茎枯病菌、自然发病的芦笋组织、人工接种发病的芦笋组织、阳性对照显色结果可观察到绿色荧光，琼脂糖凝胶电泳出现LAMP特征性的梯形带，而健康芦笋组织、阴性对照显色结果为橙色，琼脂糖凝胶电泳未出现LAMP特征性的梯形带，表明本发明LAMP引物组和检测方法还可用于田间芦笋茎枯病发病植株的检测。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 福建省农业科学院植物保护研究所
<120> 一种芦笋茎枯病菌LAMP检测引物组及其检测方法
<130> 4
<160> 4
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
acattgcgcc ctctggtat 19
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
cctacctgat ccgaggtcaa 20
<210> 3
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
gaaagcagtg ccccaacacc acatgcctgt tcgagcgtc 39
<210> 4
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
ggaccccgag cgcagtagtt aagttggggg tttaacggc 39

Claims (5)

1.一种芦笋茎枯病菌LAMP检测引物组，其特征在于：所述的芦笋茎枯病菌LAMP检测引物组由正向外引物F3、反向外引物B3、正向内引物FIP和反向内引物BIP组成，各引物的核苷酸序列为：
F3：5’-ACATTGCGCCCTCTGGTAT-3’；
B3：5’-CCTACCTGATCCGAGGTCAA-3’；
FIP: 5’-GAAAGCAGTGCCCCAACACCA-CATGCCTGTTCGAGCGTC-3’；
BIP: 5’-GGACCCCGAGCGCAGTAGTTA-AGTTGGGGGTTTAACGGC-3’。
2.一种芦笋茎枯病菌LAMP检测方法，其特征在于：利用权利要求1所述的芦笋茎枯病菌LAMP引物组进行LAMP反应，LAMP反应体系为25 uL，反应体系包括0.2 mmol/L的F3和B3，1.6mmol/L的FIP和BIP，Bst DNA聚合酶为8 U，DNA模板50～100 ng，12.5 uL的LAMP反应混合液，用无菌的超纯水补足25 uL；LAMP反应条件为63-65℃温育45-60 min，85℃灭活5-10min；所述LAMP反应混合液含40 mM Tris-HCl，20 mM(NH4)2SO4，20 mM KCl，16 mM MgSO4，1.6 mol/L 甜菜碱，2.0 mM dNTPs，0.2% Trion X-100。
3.根据权利要求2所述的一种芦笋茎枯病菌的LAMP检测方法，其特征在于：待LAMP反应结束后，在LAMP反应的扩增产物中加入显色剂SYBR green I 1.0 uL，显色结果观察到绿色荧光的判断为阳性，橙色或橘黄色判断为阴性，或采用琼脂糖凝胶电泳法判断检测结果，取2.0 uL LAMP扩增产物用2%琼脂糖凝胶电泳检测，出现梯形条带判断为阳性，没有出现梯形条带则判断为阴性。
4.如权利要求1所述的芦笋茎枯病菌LAMP检测引物组在芦笋茎枯病的早期诊断和病菌监测和鉴定中的应用。
5.如权利要求2所述的芦笋茎枯病菌LAMP检测方法在芦笋茎枯病的早期诊断和病菌监测和鉴定中的应用。
CN201711235832.1A 2017-11-30 2017-11-30 一种芦笋茎枯病菌lamp检测引物组及其检测方法 Pending CN107699634A (zh)

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