CN105838629A - Peg介导芦笋茎枯病菌原生质体的遗传转化方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供PEG介导芦笋茎枯病菌原生质体的遗传转化方法，包括芦笋茎枯病菌原生质体的制备、原生质体的遗传转化以及遗传转化子的筛选等步骤。本发明成功实现了PEG介导芦笋茎枯病菌原生质体的遗传转化，首次构建了一套针对该病原菌的高效遗传转化体系，获得大量能够多代稳定遗传的遗传转化子。该方法操作简单、转化周期短、可重复性强、转化效率高、稳定性好。本发明提供的方法是推动芦笋茎枯病病害分子生物学研究的重要技术创新，为该病害致病机制及抗病研究提供了一种重要手段。

Description

PEG介导芦笋茎枯病菌原生质体的遗传转化方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体地说，涉及一种PEG介导芦笋茎枯病菌原生质体的遗传转化方法。
背景技术
芦笋(Asparagus officinalis L.)为天门冬科天门冬属多年生草本植物，以嫩茎供食，具有极高的营养和保健价值，富含天冬酰胺、皂苷、黄酮、硒和植物多糖等多种活性成分，能抗肿瘤、抗氧化和降血脂，被誉为“蔬菜之王”、“世界十大名菜”之一(Jaiswal et al.，2014；Nishimura et al.，2013)。同时，芦笋加工产业链长，可生产出芦笋抗癌药、芦笋茶、酒和饮料等高附加值产品，在食品、医药等领域应用开发前景广阔。目前，我国芦笋种植及加工发展迅速，已成为世界第一大生产和出口国，种植面积超过95000公顷，约占全球的43％。病害是芦笋生产的重要制约因子，主要包括芦笋茎枯病、褐斑病和根腐病等，其中茎枯病危害最为严重，极易造成毁灭性影响。该病害在全球芦笋产区广泛存在；美国、希腊和澳大利亚等国均有报道，中国、日本和泰国等亚洲主产区因湿热气候和舶来品种生态适应性差导致病害发生十分严重；近年来，我国平均发病率居高不下，一般导致减产30％以上，严重时甚至引起成片绝收(陈光宇，2013；陈光宇，2010；Lu et al.，2008)。目前，生产上缺乏高抗茎枯病的芦笋栽培品种，主要依赖于化学农药或温室设施避雨栽培技术防控，不仅提高了生产成本，同时极易造成产品和环境的污染，加剧土壤质量严重退化。因此，茎枯病危害已成为制约我国芦笋生产可持续发展的突出问题。迄今为止，国内外对其病原分子生物学研究较少，尤其缺乏病菌分子遗传转化技术体系的相关报道。为此，深入开展芦笋茎枯病菌分子致病机理研究具有重要的现实意义。
天门冬拟茎点霉(Phmopsis asparagi)是引起芦笋茎枯病的病原真菌。目前，有关其致病接种方法、病害分级指标和病情评价体系已相对成熟(Takahiro，1997)。前期研究表明，天门冬拟茎点霉为半活体营养寄生型(Hemibiotrophs)丝状病原真菌，病菌无性分生孢子呈α(5.0-12.5×1.8-3.8μm)、β(17.5-26.0×1.0-2.0μm)和中间型(12.0-17.0×2.5-4.5μm)，α型占绝对优势，通常内含1-2个油球，主要危害嫩茎，也可侵染枝梗和拟叶，分生孢子接种后5-7d可获得明显病斑，病斑初呈水渍条状、后渐变成暗黑色梭条形，中部赤褐色凹陷，其上散生大量小黑点，为分生孢子器，随后病株枯死并迅速传染相邻植株，病菌以分生孢子(器)或菌丝体越冬，适宜条件下进行初侵染和再侵染(Zhang et al.，2012；张岳平等，2012；Udayanga et al.，2011；陈光宇，2010；陈光宇，2005)。此外，芦笋茎枯病菌所属的天门冬拟茎点霉属(Phomopsis)真菌，该属是腔孢纲球壳孢科真菌中的一个大属，含有100多个不同的种，可寄生于70多种不同科的植物。该属病原菌地域分布广泛，引起植物的叶枯、枝枯、烂茎、溃疡及果腐等严重病害，造成重大经济损失。目前，一些主要作物的拟茎点霉属真菌病害在发生特点、致病症状及特性、生活周期循环、病害生化防控及病菌生物学特性方面等取得了一定的研究进展。然而，有关该属病原菌与寄主的生物学互作、致病相关基因鉴定及致病机制探讨等方面研究仍比较薄弱，今后应加强分子生物学方面的研究，以明确其致病机制，鉴定该属的致病特异性，并构建抗病分子育种技术体系等。为病害安全、高效防控提供基因基础(张岳平等,一些重要作物拟茎点霉属病原生物学及致病机制研究概况，中国农学通报，2013，29(33)：327-332)。芦笋茎枯病菌作为拟茎点霉属中重要成员，具备该属病原真菌的重要生物学特性，包括通过分生孢子器产孢、分生孢子内含1-2个油球、菌丝细胞壁成分相对复杂(Zhang Yueping et al.,Stress physiology and virulence characterization of Phomopsis asparagi(Sacc.)Bubák isolated from asparagus in Jiangxi province,China,Agricultural science&technology,2012,13(7):1502-1508)。
至今国内外鲜有对芦笋茎枯病菌的致病机理的报道，这也限制了对芦笋茎枯病菌侵染和致病机制的深入认识。芦笋茎枯病菌的遗传转化是研究其生长发育与致病过程分子机制的基本工具，目前国内外未见遗传转化技术在芦笋茎枯病菌研究中得到应用。ATMT技术(根癌农杆菌介导的遗传转化方法)虽然操作简便，但转化周期相对较长，工作量大，适用于突变体库的构建，对于针对目的基因的敲除等反向遗传学研究具有明显的缺陷；电穿孔转化法转化效率低，目前极少在真菌转化中应用；CaCl2/PEG是目前较为传统的转化方法，其操作步骤简便有效，可用于目的基因敲除和替换，已成为获得转化子的最普遍的转化技术。尤其是在芦笋茎枯病菌全基因组已经测序的基础上，亟需有一个成熟、高效的可应用于通过目标基因敲除开展功能基因组研究的遗传转化方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种高效、稳定的PEG介导芦笋茎枯病菌原生质体的遗传转化方法。
为了实现本发明目的，本发明提供的PEG介导芦笋茎枯病菌原生质体的遗传转化方法，包括芦笋茎枯病菌原生质体的制备、原生质体的遗传转化以及遗传转化子的筛选等步骤。
原生质体的遗传转化方法如下：向离心管中加入0.5μg/μL质粒DNA 10-20μL、0.6M KCl与50mM CaCl2混合缓冲液25-30μL、亚精胺2-3μL，然后加入浓度为107-108个/mL的芦笋茎枯病菌原生质体悬液50-100μL，混匀后置于冰上静置10-15min；然后加入新鲜配制的PTC缓冲液50-100μL，混匀后置于冰上静置20-25min；然后再加入PTC混合溶液250-350μL，混匀后置于冰上静置10-15min；然后加入0.6M KCl与50mM CaCl2混合缓冲液600-800μL终止转化反应，所得转化体系用于后续遗传转化子的筛选。
优选地，原生质体的遗传转化方法如下：向离心管中加入0.5μg/μL质粒pBHt2-sGFP的DNA 20μL、0.6M KCl与50mM CaCl2混合缓冲液27.5μL、亚精胺2.5μL，然后加入浓度为107-108个/mL的芦笋茎枯病菌原生质体悬液50μL，混匀后置于冰上静置10min；然后加入新鲜配制的PTC缓冲液50μL，混匀后置于冰上静置20min；然后再加入PTC混合溶液250μL，混匀后置于冰上静置10min；然后加入0.6M KCl与50mM CaCl2混合缓冲液700μL终止转化反应，所得转化体系用于后续遗传转化子的筛选。
其中，所述PTC缓冲液的配制如下：用水配制含有以下各组分的溶液：20-30％PEG3350、pH7.5 8-12mM Tris-HCl、40-60mM CaCl2，55℃水浴中各组分溶解后，用0.22μm细菌过滤器过滤除菌。优选地，用水配制含有以下各组分的溶液：25％PEG3350、pH7.5 10mMTris-HCl、50mM CaCl2。
本发明中使用的转化质粒pBHt2-sGFP，见Mullins,E.D.,Chen,X.,Romaine,P.,Raina,R.,Geiser,D.M.,Kang,S.,2001.Agrobacterium-mediated transformation of Fusarium oxysporum:anefficient tool for insertional mutagenesis and gene transfer.Phytopathology 91,173-180。
前述的方法，转化反应结束后，向所得转化体系中加入10-15mL改良的Bottom agar固体培养基，混匀后倒入培养皿中，25℃暗培养15-24h；再向培养皿中加入10-15mL改良的Top agar固体培养基，25℃暗培养5-10d，挑出遗传转化子，将单菌落转移至含有50-100μg/mL潮霉素B的PDA平板培养基中，3d后将生长的菌落再次接种至含有50-100μg/mL潮霉素B的PDA平板培养基上，连续培养3-5代得到纯化的芦笋茎枯病菌遗传转化子。
优选地，转化反应结束后，向所得转化体系中加入10mL改良的Bottom agar固体培养基，混匀后倒入培养皿中，25℃暗培养15-24h；再向培养皿中加入15mL改良的Top agar固体培养基，25℃暗培养5-10d，挑出遗传转化子，将单菌落转移至含有50μg/mL潮霉素B的PDA平板培养基中，3d后将生长的菌落再次接种至含有50μg/mL潮霉素B的PDA平板培养基上，连续培养3-5代(优选5代)得到纯化的芦笋茎枯病菌遗传转化子。
筛选出性状稳定，即菌丝和分生孢子发出较强的绿色荧光，且生长发育没有发生变化，作为候选的经PEG介导原生质体遗传转化的芦笋茎枯病菌遗传转化子。将得到的遗传转化子保存在含有潮霉素B的PDA平板培养基上，置于4℃低温保存，用于阳性鉴定。
所述改良的Bottom agar固体培养基的配制如下：用水配制含有以下各组分的溶液：0.6M蔗糖、5mM HEPES、1mM(NH4)2HPO4、0.2mM生物素、1mM维生素B1，pH5.3，琼脂粉0.6％；121℃高压蒸汽灭菌30min，冷却后加入潮霉素B使其终浓度为50μg/ml。
所述改良的Top agar固体培养基的配制如下：用水配制含有以下各组分的溶液：0.6M蔗糖、5mM HEPES、1mM(NH4)2HPO4、0.2mM生物素、1mM维生素B1，pH5.3，琼脂粉1％；121℃高压蒸汽灭菌30min，冷却后加入潮霉素B使其终浓度为100μg/ml。
可参照张岳平等,芦笋茎枯病菌原生质体的制备及再生.植物保护学报,2014,41(2):182-186中公开的方法制备纯化的芦笋茎枯病菌原生质体。
具体地，本发明芦笋茎枯病菌原生质体的制备方法如下：
(1)芦笋茎枯病菌新鲜菌丝的获得
a1)将芦笋茎枯病菌接种于马铃薯葡萄糖琼脂(Potato DextroseAgar，PDA)培养基上，活化培养5d；
a2)将活化培养的芦笋茎枯病菌打取菌饼接种于燕麦琼脂糖(Oatmeal Agar，OA)培养基上，25℃培养14d，至分生孢子器中乳白色分生孢子溢出，用于制备分生孢子悬浮液；
a3)挑取适量分生孢子器中分泌出的乳白色分生孢子，溶于无菌水中，使分生孢子浓度达1.0×108个/mL；将制备好的分生孢子悬液接种于液体完全培养基中，25℃150rpm摇床培养72h，漏斗过滤，获得新鲜菌丝体。
(2)芦笋茎枯病菌新鲜菌丝的酶解与原生质体的获得
b1)酶解菌丝细胞壁：取1.0g新鲜菌丝体，加入10mL裂解酶、崩溃酶和蜗牛酶的混合酶液，33℃水浴酶解4.5h，使原生质体数量达107-108个/mL；
b2)制备原生质体悬液：过滤酶解溶液，滤去未被酶解的菌丝残片，滤液于4℃5000rpm离心5min；弃上清液，用1-2mL浓度1.0mol/L的山梨醇溶液洗2-3次，收集原生质体重悬于1mL浓度1.0mol/L预冷的山梨醇溶液中，即得原生质体悬液。
所述混合酶液的配制如下：向1.0mol/L MgSO4溶液(作为渗透压稳定剂)中加入裂解酶、崩溃酶和蜗牛酶，使其终浓度为裂解酶15g/L、崩溃酶10g/L、蜗牛酶15g/L；配好后用直径为0.45μm的超微微孔滤膜过滤除菌。其中，1.0mol/L MgSO4溶液是以10mmol/L pH6.98的PBS为溶剂配制。
前述的方法，还包括对芦笋茎枯病菌遗传转化子进行PCR检测的步骤。根据转入到芦笋茎枯病菌基因组中的外源质粒中的潮霉素抗性基因序列设计引物验证阳性遗传转化子，以CTAB法快速提取转化子DNA作为模板进行PCR扩增，再用2％琼脂糖凝胶电泳检测扩增片段的大小。荧光显微镜观察：取经PCR检测验证过的阳性遗传转化子的菌丝和分生孢子分别制成临时玻片，用莱卡DM2000荧光显微镜观察，筛选强表达绿色荧光的遗传转化子。
其中，PCR检测使用的引物序列如下：
Hph/F1:5’-CTATTCCTTTGCCCTCGGAC-3’
Hph/R1:5’-AAGCCTGAACTCACCGCGAC-3’
PCR反应体系为：10×反应缓冲液(含Mg2+)5μL，2.5U/μL dNTPs1μL，50μM引物Hph/F1、Hph/R1各2.5μL，DNA模板1μL，5U/μL TaqDNA聚合酶1μL，ddH2O 37μL。
PCR反应程序为：95℃预变性3min；94℃变性30s、55℃退火30s、72℃复性1min，35个循环；72℃延伸10min，16℃保温30min。
本发明进一步提供用于PEG介导的芦笋茎枯病菌原生质体遗传转化的试剂，所述试剂的组成如下：20-30％PEG3350、pH7.5 8-12mMTris-HCl、40-60mM CaCl2，以水配制。优选地，所述试剂的组成如下：25％PEG3350、pH7.5 10mM Tris-HCl、50mM CaCl2，以水配制。
利用本方法成功转化了不同地域来源的芦笋茎枯病菌菌株，而且经多次重复实验具有相似的转化效率，为基于已全基因组测序的芦笋茎枯病菌的功能基因组学研究提供了高效、稳定的遗传转化技术。针对于该领域目前的技术，本发明具有以下优点：
(一)本发明首次提供PEG介导芦笋茎枯病菌原生质体的遗传转化方法，为今后病害发生机制的后续深入研究和关键功能基因的鉴定提供了重要方法基础，是推动该病害分子生物学研究的重要技术革新，为该病害致病机制及抗病研究提供了重要的技术手段。
(二)本发明提供的遗传转化操作简便，条件温和，转化效率高(可达40-50个遗传转化子/μg DNA)，遗传稳定(连续培养5代仍可稳定遗传)。
(三)转化周期短、重复性好：采用本发明描述的方法获得芦笋茎枯病菌遗传转化子的周期短，从制备好的分生孢子到转基因遗传转化子的PCR鉴定仅需约10d。采用不同地域的芦笋茎枯病菌菌株均可获得稳定的遗传转化子。
附图说明
图1为本发明实施例1中野生型芦笋茎枯病菌菌株在OA培养基中对潮霉素B的敏感性检测。其中：A图潮霉素B浓度为0μg/mL；B图潮霉素B浓度为10μg/mL；C图潮霉素B浓度为20μg/mL；D图潮霉素B浓度为50μg/mL；E图潮霉素B浓度为100μg/mL；F图潮霉素B浓度为150μg/mL。
图2为本发明实施例2中芦笋茎枯病菌在OA培养基上产生的分生孢子器及分生孢子。其中：A图中黑点为成熟的分生孢子器，黑点上乳白色液体为其分泌出的分生孢子液；B图为分生孢子器的纵切面结构分析；C图为α型分生孢子；D图为α型分生孢子的扫描电镜分析。
图3为本发明实施例2中新鲜的芦笋茎枯病菌菌丝。
图4为本发明实施例3中芦笋茎枯病菌原生质显微镜下效果图。
图5为本发明实施例4中芦笋茎枯病菌原生质体经PEG介导的遗传转化后在Top agar培养基上的生长情况。
图6为本发明实施例5中芦笋茎枯病菌经PEG介导的遗传转化后部分遗传转化子菌落形态(PDA培养基，25℃培养5d)。其中：W为未转化的野生型菌株，其余均为遗传转化子；其中，野生型菌株生长在不含潮霉素B的PDA平板培养基上，遗传转化子生在含潮霉素B50μg/mL的PDA平板培养基上。
图7为本发明实施例6中随机挑选芦笋茎枯病菌转化子潮霉素B磷酸转移酶基因(hph)的PCR扩增电泳图谱。其中：泳道M：DL2000DNA Maker；泳道P：质粒pBHt2-sGFP；泳道H2O：无菌水对照；泳道W：未转化的野生型菌株；泳道1-6：芦笋茎枯病菌的遗传转化子。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW,Molecular Cloning:a LaboratoryManual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。
以下实施例中涉及菌株和载体的来源：芦笋茎枯病菌野生型菌株采自江西省农业科学院芦笋试验场芦笋病茎，采用单孢分离的方法，经真菌通用引物ITS5(5’-GGAAGGTAAAAGTCAAGG-3’)和ITS4(5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’)进行PCR鉴定后保存，作为实验用野生型菌株。pBHt2-sGFP载体(含TrpC启动子，潮霉素B抗性)由中国科学院微生物研究所向春梅老师惠赠。
实施例1芦笋茎枯病菌野生型菌株对潮霉素B敏感性检测
1、配制含不同浓度潮霉素B的OA培养基，设置成为6种不同浓度，分别为0μg/mL、10μg/mL、20μg/mL、50μg/mL、100μg/mL和150μg/mL。
2、均匀打取野生型芦笋茎枯病菌菌株菌饼，分别接种于不同潮霉素B浓度的OA培养基中，生长7d后拍照，用于分析其对潮霉素B的敏感性(图1)。
实施例2芦笋茎枯病菌新鲜菌丝的获得
1、将芦笋茎枯病菌接种于马铃薯葡萄糖琼脂(Potato DextroseAgar，PDA)培养基上，活化培养5d。
2、将活化培养的芦笋茎枯病菌打取菌饼接种于燕麦琼脂糖(Oatmeal Agar，OA)培养基上，25℃恒温培养14d，至分生孢子器中乳白色分生孢子溢出(图2)，用于制备分生孢子悬浮液。
3、用牙签提取适量分生孢子器中分泌出的乳白色分生孢子，溶于无菌纯水中，调节分生孢子浓度达1.0×108个/mL；将制备好的分生孢子悬液接种于液体完全培养基中，25℃150rpm摇床培养72h，漏斗过滤，获得新鲜菌丝体(图3)。
实施例3芦笋茎枯病菌新鲜菌丝的酶解与原生质体的获得
1、酶解菌丝细胞壁：取1.0g新鲜菌丝体，加入10mL裂解酶、崩溃酶和蜗牛酶的混合酶液，33℃水浴酶解4.5h，使原生质体数量达2.8×107个/mL；所述混合酶液由下列重量配比的物质组成：裂解酶15g/L、崩溃酶10g/L、蜗牛酶15g/L、溶剂为1.0mol/L MgSO4溶液(10mmol/L pH6.98的PBS配制，体积比为MgSO4︰PBS＝3︰1)，配好后用直径为0.45μm的超微微孔滤膜过滤除菌。
所述混合酶液的配制如下：向1.0mol/L MgSO4溶液中加入裂解酶、崩溃酶和蜗牛酶，使其终浓度为裂解酶15g/L、崩溃酶10g/L、蜗牛酶15g/L；配好后用直径为0.45μm的超微微孔滤膜过滤除菌。其中，1.0mol/L MgSO4溶液是以10mmol/L pH6.98的PBS为溶剂配制。
2、制备原生质体悬液：过滤酶解溶液，滤去未被酶解的菌丝残片，滤液于4℃、转速5000rpm离心分离5min；弃上清液，用1-2mL浓度1.0mol/L的山梨醇溶液洗涤2-3次，收集原生质体重悬于1mL浓度1.0mol/L预冷的山梨醇溶液中保存，得到原生质体悬液(图4)。
实施例4PEG介导的芦笋茎枯病菌原生质体的遗传转化
1、取一支15mL的灭菌的离心管，分别加入20μL质粒DNA(含质粒10μg)、27.5μL 0.6M KCl与50mM CaCl2混合缓冲液、2.5μL亚精胺。
2、加入50μL实施例3制备的芦笋茎枯病菌原生质体悬液，轻柔混匀后置于冰上静置10min；然后加入新鲜配制的50μL PTC缓冲液，轻柔混匀后置于冰上静置20min；然后再次加入250μL PTC缓冲液，轻柔混匀后置于冰上静置10min。
其中，所述PTC缓冲液的配制如下：用水配制含有以下各组分的溶液：25％PEG3350、pH7.5 10mM Tris-HCl、50mM CaCl2，55℃水浴中各组分溶解后，用0.22μm细菌过滤器过滤除菌。
3、加入700μL 0.6M KCl与50mM CaCl2混合缓冲液用于终止转化反应。
4、向上述转化体系中倒入10mL改良的Bottom agar固体培养基，混匀后倒入培养皿中，25℃暗培养15-24h。
5、向培养皿中倒入15mL改良的Top agar固体培养基，25℃暗培养5-10d，挑出遗传转化子(图5)。
其中，改良的Bottom agar固体培养基的配制如下：用水配制含有以下各组分的溶液：0.6M蔗糖、5mM HEPES、1mM(NH4)2HPO4、0.2mM生物素、1mM维生素B1，pH5.3，琼脂粉0.6％；121℃高压蒸汽灭菌30min，冷却后加入潮霉素B使其终浓度为50μg/ml。
改良的Top agar固体培养基的配制如下：用水配制含有以下各组分的溶液：0.6M蔗糖、5mM HEPES、1mM(NH4)2HPO4、0.2mM生物素、1mM维生素B1，pH5.3，琼脂粉1％；121℃高压蒸汽灭菌30min，冷却后加入潮霉素B使其终浓度为100μg/ml。
实施例5遗传转化子的筛选与保存
1、遗传转化子的筛选：将长出的芦笋茎枯病菌单个菌落用牙签挑取转移至含有50μg/mL潮霉素B的PDA平板培养基中，3d后将生长的菌落再次接种至含有50μg/mL潮霉素B的PDA平板培养基上，连续培养5代得到纯净的芦笋茎枯病菌遗传转化子。
2、遗传转化子的保存：分别将挑取获得的各个不同的遗传转化子保存在含有50μg/mL潮霉素B的PDA平板培养基上(图6)，于4℃低温保存，用于阳性鉴定。
实施例6遗传转化子的PCR鉴定和荧光观测
1、芦笋茎枯病菌遗传转化子的基因组DNA提取
①取100mg新鲜菌丝，加600μL 2×CTAB提取缓冲液及少许灭菌石英砂，在研钵中将菌丝充分研磨；
②将研磨后的溶液转入1.5mL无菌Eppendorf管中，于65℃水浴保温30min，加等体积的氯仿和异戊醇混合液，氯仿和异戊醇的体积比为24:1，充分摇匀，4℃10000rpm离心5min；
③移取上清液至另一新的Eppendorf管中，加入3mol/L的NaAc溶液和冰冻乙醇，NaAc溶液的体积是上清液体积的10％，其pH为6.0，冰冻乙醇的体积是上清液体积的2.5倍，于-20℃沉淀30min；
④4℃12000rpm离心5min，弃上清液，用70％无水乙醇清洗沉淀2次，通风干燥沉淀20min，加TE缓冲液充分溶解，即为遗传转化子基因组DNA溶液，-20℃保存备用。
2、芦笋茎枯病菌遗传转化子的PCR扩增检测
为确定所获得的抗潮霉素B的芦笋茎枯病菌株是否为阳性遗传转化子，含有目标外源质粒目标基因片段，采用PCR扩增方法进行分子鉴定。根据外源质粒序列中的潮霉素B抗性基因Hph设计引物用于扩增，引物序列为：
Hph/F1:5’-CTATTCCTTTGCCCTCGGAC-3’
Hph/R1:5’-AAGCCTGAACTCACCGCGAC-3’
常规PCR反应：加入适量菌的DNA作为PCR模板，然后按表1依次加入PCR反应试剂，置于PCR仪中进行反应。反应条件为：95℃预变性3min；94℃变性30s、55℃退火30s、72℃复性1min，35个循环；72℃延伸10min，16℃保温30min。根据Tm值对退火温度加以调整。扩增后样品用2％琼脂糖凝胶电泳检测，扩增产物大小为1020bp(图7)。
表1 PCR反应体系
3、芦笋茎枯病菌遗传转化子的荧光观测
挑取经PCR鉴定的阳性遗传转化子，利用莱卡DM2000荧光显微镜观察阳性遗传转化子的菌丝体在488nm蓝色激发光源的激发下能否产生绿色荧光，筛选能够强表达绿色荧光蛋白的遗传转化子接种至含有50μg/mL潮霉素B的PDA平板培养基上，连续培养5代获得稳定表达GFP且生长发育形态未发生变化的芦笋茎枯病菌遗传转化子，转化效率高达40-50个遗传转化子/μg DNA。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
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Claims (10)

1.PEG介导芦笋茎枯病菌原生质体的遗传转化方法，其特征在于，包括芦笋茎枯病菌原生质体的制备、原生质体的遗传转化以及遗传转化子的筛选步骤；
原生质体的遗传转化方法如下：向离心管中加入0.5μg/μL质粒DNA 10-20μL、0.6M KCl与50mM CaCl2混合缓冲液25-30μL、亚精胺2-3μL，然后加入浓度为107-108个/mL的芦笋茎枯病菌原生质体悬液50-100μL，混匀后置于冰上静置10-15min；然后加入新鲜配制的PTC缓冲液50-100μL，混匀后置于冰上静置20-25min；然后再加入PTC混合溶液250-350μL，混匀后置于冰上静置10-15min；然后加入0.6M KCl与50mM CaCl2混合缓冲液600-800μL终止转化反应，所得转化体系用于后续遗传转化子的筛选；
其中，所述PTC缓冲液的配制如下：用水配制含有以下各组分的溶液：20-30％PEG3350、pH7.5 8-12mM Tris-HCl、40-60mM CaCl2，55℃水浴中各组分溶解后，用0.22μm细菌过滤器过滤除菌。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，原生质体的遗传转化方法如下：向离心管中加入0.5μg/μL质粒pBHt2-sGFP的DNA 20μL、0.6M KCl与50mM CaCl2混合缓冲液27.5μL、亚精胺2.5μL，然后加入浓度为107-108个/mL的芦笋茎枯病菌原生质体悬液50μL，混匀后置于冰上静置10min；然后加入新鲜配制的PTC缓冲液50μL，混匀后置于冰上静置20min；然后再加入PTC混合溶液250μL，混匀后置于冰上静置10min；然后加入0.6M KCl与50mM CaCl2混合缓冲液700μL终止转化反应，所得转化体系用于后续遗传转化子的筛选；
其中，所述PTC缓冲液的配制如下：用水配制含有以下各组分的溶液：25％PEG3350、pH7.5 10mM Tris-HCl、50mM CaCl2，55℃水浴中各组分溶解后，用0.22μm细菌过滤器过滤除菌。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，转化反应结束后，向所得转化体系中加入10-15mL改良的Bottom agar固体培养基，混匀后倒入培养皿中，25℃暗培养15-24h；再向培养皿中加入10-15mL改良的Top agar固体培养基，25℃暗培养5-10d，挑出遗传转化子，将单菌落转移至含有50-100μg/mL潮霉素B的PDA平板培养基中，3d后将生长的菌落再次接种至含有50-100μg/mL潮霉素B的PDA平板培养基上，连续培养3-5代得到纯化的芦笋茎枯病菌遗传转化子。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述改良的Bottomagar固体培养基的配制如下：用水配制含有以下各组分的溶液：0.6M蔗糖、5mM HEPES、1mM(NH4)2HPO4、0.2mM生物素、1mM维生素B1，pH5.3，琼脂粉0.6％；121℃高压蒸汽灭菌30min，冷却后加入潮霉素B使其终浓度为50μg/ml；
所述改良的Top agar固体培养基的配制如下：用水配制含有以下各组分的溶液：0.6M蔗糖、5mM HEPES、1mM(NH4)2HPO4、0.2mM生物素、1mM维生素B1，pH5.3，琼脂粉1％；121℃高压蒸汽灭菌30min，冷却后加入潮霉素B使其终浓度为100μg/ml。
5.根据权利要求1-4任一项所述的方法，其特征在于，芦笋茎枯病菌原生质体的制备方法如下：
(1)芦笋茎枯病菌新鲜菌丝的获得
a1)将芦笋茎枯病菌接种于PDA培养基上，活化培养5d；
a2)将活化培养的芦笋茎枯病菌打取菌饼接种于OA培养基上，25℃培养14d，至分生孢子器中乳白色分生孢子溢出，用于制备分生孢子悬浮液；
a3)挑取适量分生孢子器中分泌出的乳白色分生孢子，溶于无菌水中，使分生孢子浓度达1.0×108个/mL；将制备好的分生孢子悬液接种于液体完全培养基中，25℃150rpm摇床培养72h，漏斗过滤，获得新鲜菌丝体；
(2)芦笋茎枯病菌新鲜菌丝的酶解与原生质体的获得
b1)酶解菌丝细胞壁：取1.0g新鲜菌丝体，加入10mL裂解酶、崩溃酶和蜗牛酶的混合酶液，33℃水浴酶解4.5h，使原生质体数量达107-108个/mL；
b2)制备原生质体悬液：过滤酶解溶液，滤去未被酶解的菌丝残片，滤液于4℃5000rpm离心5min；弃上清液，用1-2mL浓度1.0mol/L的山梨醇溶液洗2-3次，收集原生质体重悬于1mL浓度1.0mol/L预冷的山梨醇溶液中，即得原生质体悬液。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述混合酶液的配制如下：向1.0mol/L MgSO4溶液中加入裂解酶、崩溃酶和蜗牛酶，使其终浓度为裂解酶15g/L、崩溃酶10g/L、蜗牛酶15g/L；配好后用直径为0.45μm的超微微孔滤膜过滤除菌；
其中，1.0mol/L MgSO4溶液是以10mmol/L pH6.98的PBS为溶剂配制。
7.根据权利要求2-6任一项所述的方法，其特征在于，还包括对芦笋茎枯病菌遗传转化子进行PCR检测的步骤；其中，PCR检测使用的引物序列如下：
Hph/F1:5’-CTATTCCTTTGCCCTCGGAC-3’
Hph/R1:5’-AAGCCTGAACTCACCGCGAC-3’。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，PCR反应体系为：含Mg2+的10×反应缓冲液5μL，2.5U/μL dNTPs 1μL，50μM引物Hph/F1、Hph/R1各2.5μL，DNA模板1μL，5U/μL Taq DNA聚合酶1μL，ddH2O 37μL。
9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，PCR反应程序为：95℃预变性3min；94℃变性30s、55℃退火30s、72℃复性1min，35个循环；72℃延伸10min，16℃保温30min。
10.用于PEG介导的芦笋茎枯病菌原生质体遗传转化的试剂，其特征在于，所述试剂的组成如下：20-30％PEG3350、pH7.5 8-12mMTris-HCl、40-60mM CaCl2，以水配制；优选地，所述试剂的组成如下：25％PEG3350、pH7.5 10mM Tris-HCl、50mM CaCl2，以水配制。
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