CN105779315A - 一种农杆菌介导的芦笋茎枯病菌遗传转化子的制备方法 - Google Patents

一种农杆菌介导的芦笋茎枯病菌遗传转化子的制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种农杆菌介导的芦笋茎枯病菌遗传转化子的制备方法。该方法以芦笋茎枯病菌的分生孢子为受体，以根癌农杆菌为介体，将芦笋茎枯病菌的分生孢子悬浮液与含有双元载体的根癌农杆菌混合后放置在改良的诱导共培养基上共培养，用抗生素筛选，制备芦笋茎枯病菌遗传转化子。该方法操作简单、重复性好，遗传转化效率高，约1.2×103个分生孢子可以获得1个遗传转化子，且转基因遗传转化子后代遗传稳定，目标基因丢失率低，可应用于芦笋茎枯病菌突变体库的大规模构建，为该病原菌致病丧失突变体筛选及关键致病功能基因的鉴定提供了重要基础。

Description

一种农杆菌介导的芦笋茎枯病菌遗传转化子的制备方法
技术领域
本发明属于植物基因工程技术领域，具体地，涉及一种芦笋茎枯病菌遗传转化子的制备方法以及基于该方法制备得到的具有GFP标记的芦笋茎枯病菌。
背景技术
芦笋(AsparagusofficinalisL.)为天门冬科天门冬属多年生草本植物，以嫩茎供食，具有极高的营养和保健价值，富含天冬酰胺、皂苷、黄酮、硒和植物多糖等多种活性成分，能抗肿瘤、抗氧化和降血脂，被誉为“蔬菜之王”、“世界十大名菜”之一(Jaiswaletal.，2014；Nishimuraetal.，2013)。同时，芦笋加工产业链长，可生产出芦笋抗癌药、芦笋茶、酒和饮料等高附加值产品，在食品、医药等领域应用开发前景广阔。目前，我国芦笋种植及加工发展迅速，已成为世界第一大生产和出口国，种植面积超过95，000公顷，约占全球的43％。病害是芦笋生产的重要制约因子，主要包括芦笋茎枯病、褐斑病和根腐病等，其中茎枯病危害最为严重，极易造成毁灭性影响。该病害在全球芦笋产区广泛存在；美国、希腊和澳大利亚等国均有报道，中国、日本和泰国等亚洲主产区因湿热气候和舶来品种生态适应性差导致其发生十分严重；近年来，我国平均发病率居高不下，一般导致减产30％以上，严重时甚至引起成片绝收。
目前，生产上缺乏高抗茎枯病的芦笋栽培品种，主要依赖于化学农药或温室设施避雨栽培技术防控，不仅提高了生产成本，同时极易造成产品和环境的污染，加剧土壤质量严重退化。茎枯病危害已成为制约我国芦笋生产可持续发展的突出问题。然而迄今为止，国内外对其病原分子生物学研究较少，尤其缺乏病菌分子遗传转化技术体系报道，这与其在芦笋生产中所具有的严重危害性极不相称。为此，深入开展芦笋茎枯病菌分子致病机理研究具有重要的现实意义。
天门冬拟茎点霉(Phmopsisasparagi)是引起芦笋茎枯病的病原真菌。目前，有关其致病接种方法、病害分级指标和病情评价体系相对成熟。前期研究表明，天门冬拟茎点霉为半活体营养寄生型(Hemibiotrophs)丝状病原真菌，病菌无性分生孢子呈α(5.0-12.5×1.8-3.8μm)、β(17.5-26.0×1.0-2.0μm)和中间型(12.0-17.0×2.5-4.5μm)，α型占绝对优势且通常内含1-2个油球，主要危害嫩茎，也可侵染枝梗和拟叶，分生孢子接种后5-7d可获得明显病斑，病斑初呈水渍条状、后渐变成暗黑色梭条形，中部赤褐色凹陷，其上散生大量小黑点，为分生孢子器，随后病株枯死并迅速传染相邻植株，病菌以分生孢子(器)或菌丝体越冬，适宜条件下进行初侵染和再侵染。。
此外，芦笋茎枯病菌所属的天门冬拟茎点霉属(Phomopsis)真菌，该属是腔孢纲球壳孢科真菌中的一个大属，含有100多个不同的种，可寄生于70多种不同科的植物。该属病原菌地域分布广泛，引起植物的叶枯、枝枯、烂茎、溃疡及果腐等严重病害，造成重大经济损失。目前，一些主要作物的拟茎点霉属真菌病害在发生特点、致病症状及特性、生活周期循环、病害生化防控及病菌生物学特性方面等取得了一定的研究进展。然而，有关该属病原菌与寄主的生物学互作、致病相关基因鉴定及致病机制探讨等方面研究仍比较薄弱，今后应加强从组织细胞学和分子生物学方面明确其致病机制，鉴定该属的致病特异性，并构建抗病分子育种技术体系等为病害安全、高效防控提供基因基础。芦笋茎枯病菌作为拟茎点霉属中重要成员，具备该属病原真菌的重要生物学特性，包括通过分生孢子器产孢、分生孢子内含1-2个油球、菌丝细胞壁成分相对复杂，难以裂解并获得原生质体等。
植物病原菌侵染致病过程的研究，对于病害防控具有重要的实践价值，还可根据抗感病品种不同的侵染过程而筛选抗病品种。对于真菌侵染过程的研究，多采用切片染色结合电子显微镜观察的方法进行，但对于多年生植物的茎干类病害如芦笋茎枯病，由于材料木质化程度较高，采用传统的技术方法很难取得理想的观察效果，这也是该类病害侵染致病过程研究无法取得突破性进展的主要原因之一。
随着生物技术和分子生物学的不断发展，利用分子标记如绿色荧光蛋白(GFP)研究病原菌的侵染过程与致病机理已成为可能(Spelligetal.,1996)。因此，在目前缺乏有效抗茎枯病品种及杀菌剂的前提下，利用GPF标记菌株揭示腐烂病菌的侵染致病过程及其潜伏位点，明确其致病机理及其与寄主的互作机制，将为病害的有效、安全控制提供理论基础和新的思路。绿色荧光蛋白(greenfluorescentprotein,GFP)作为一种重要的报告基因，在病原菌的侵染致病过程、病原菌在寄主组织中的发育和形态观察、致病机理及其病原物-寄主互作研究等诸多方面均显示了良好的应用前景。在植物病原真菌中，GFP标记技术也已得到广泛应用，并取得了前所未有的成果，受到植物病理学家的高度关注。
对于芦笋茎枯病菌而言，由于其功能基因尚未被克隆，因此，要得到其GFP标记菌株，首先必须建立高效、稳定的茎枯病菌遗传转化技术体系。目前广泛采用的真菌转化方法有聚乙二醇(PEG)介导的原生质体转化法、电激法、醋酸锂法、限制性内切酶介导法(REMI)和基因枪转化法等，这些方法大都需以原生质体为受体。然而，原生质体制备相对繁琐，需要借助于高活性的裂解酶，且裂解酶的价格往往较贵，是使用原生质体作为转化受体的主要问题。针对这一问题，许多学者提出了一些改进技术和新方法，其中最有效的是根癌农杆菌介导的真菌遗传转化法(Agrobacteriumtumefaciens-mediatedtransformation,ATMT)，在一些模式丝状真菌的遗传转化中获得成功，例如黑曲霉(Aspergillusniger)、里氏木霉(Trichodermareesei)、链孢霉(Neurosporacrassa)、立枯丝核菌(Rhizoctoniasolani)、稻瘟菌(Magnaportheoryza)、大丽轮枝菌(Verticilliumdahliae)、红曲霉(MonascuspurpureusWent)等。然而，不同的真菌物种在营养生长、菌丝特性、产孢方式等生物学特性上表现出千差万别，就遗传转化体系构建而言，不同的真菌物种更是需要研究者经过长期实验摸索和技术创新才能获得，这也是为什么至今，被报道获得成功的遗传转化体系的植物真菌仅占很少的一部分的原因；此外，目前植物真菌利用农杆菌介导的方法遗传转化效率普遍不高，转化的可重复性、遗传转化子的遗传稳定性等也有待提高。
总之，目前国内外缺乏高效、稳定的芦笋茎枯病菌遗传转化技术体系，更没有关于该病菌GFP标记方法和标记菌株的报道，成为其侵染致病过程与机理研究的主要瓶颈。因此，建立全新的芦笋茎枯病菌高效遗传转化体系，筛选获得稳定表达绿色荧光蛋白的标记菌株，对于推动其侵染致病互作进程解析及其分子生物学研究具有重大意义。
发明内容
本发明的目的在于提供一种操作简单、遗传转化率高的芦笋茎枯病菌遗传转化子的制备方法，以解决现有技术遗传转化率效率低等问题。
本发明提供的一种芦笋茎枯病菌遗传转化子的制备方法，是以芦笋茎枯病菌的分生孢子为受体，以农杆菌为介体，将芦笋茎枯病菌的分生孢子悬浮液与含有双元载体的农杆菌混合后共培养，制备芦笋茎枯病菌遗传转化子。
具体地，本发明的芦笋茎枯病菌遗传转化子的制备方法，包括如下步骤：
(1)制备芦笋茎枯病菌的分生孢子：将芦笋茎枯病菌接种于马铃薯葡萄糖琼脂培养基上，活化培养；将活化培养后的芦笋茎枯病菌接种于燕麦琼脂糖培养基上，培养至分生孢子器中乳白色分生孢子溢出；
(2)将已转入双元表达载体的农杆菌单菌落接种固体培养基中培养后，再将农杆菌单菌落接种液体基本培养基MM中培养得到农杆菌悬浮液；
(3)用含有乙酰丁香酮和2-(N-吗啉基)乙磺酸钠的液体诱导培养基IM稀释步骤(2)制得的农杆菌悬浮液至OD600值为0.15-0.20，继续在28℃条件下振荡培养，至OD600值为0.25-0.35备用；
(4)农杆菌与芦笋茎枯病菌分生孢子共培养：
将步骤(1)获得的芦笋茎枯病菌分生孢子用水稀释为浓度为1×106-5×106个分生孢子/mL；
将步骤(3)得到的OD600值为0.25-0.35的农杆菌悬浮液与上述浓度为1×106-5×106个分生孢子/mL分生孢子悬浮液按照体积比1:1混合，混合液均匀涂布于铺有硝酸纤维素膜的改良型共培养诱导培养基中培养；
(5)将步骤(4)中的硝酸纤维素膜放于含有潮霉素B和头孢噻肟的筛选培养基SM中，使有菌丝的一面朝上，恒温培养；
将长出芦笋茎枯病菌的菌落转移至含有潮霉素B的PDA平板培养基中继续培养，将生长的菌落再次接种至含有潮霉素B的PDA平板培养基上，连续培养得到纯净的芦笋茎枯病菌遗传转化子。
上述方法中，所述步骤(1)中，活化培养条件为23-27℃，3-6d；活化培养后的芦笋茎枯病菌接种于燕麦琼脂糖培养基上的培养条件为23-27℃14-21d。
优选地，活化培养条件为25℃培养5d，在燕麦琼脂糖培养基上的培养条件为25℃18d。
其中，步骤(2)所述的双元表达载体为本领域技术人员公知的双元表达载体。在本发明的实施例中，选用的是质粒pBHt2_sGFP。该质粒公开于Mullins,E.D.,Chen,X.,Romaine,P.,Raina,R.,Geiser,D.M.,Kang,S.,2001.Agrobacterium-mediatedtransformationofFusariumoxysporum:anefficienttoolforinsertionalmutagenesisandgenetransfer.Phytopathology91,173-180。该质粒本领域技术人员可通过合法途径获得。
步骤(2)所述的固体培养基为含卡那霉素(50μg/mL)和利福平(100μg/mL)的LB固体培养基；培养条件为28℃培养2-3d；优选28℃培养2d。
步骤(2)所述液体基本培养基MM为含50μg/mL卡那霉素的液体基本培养基MM，培养条件为28℃振荡培养2-3d，振速150-180rpm。优选振速160rpm。
步骤(3)所述的液体诱导培养基IM含150-250μM乙酰丁香酮和35-45mM2-(N-吗啉基)乙磺酸钠。
优选地，步骤(3)所述的液体诱导培养基IM含200μM乙酰丁香酮和40mM2-(N-吗啉基)乙磺酸钠。
步骤(4)的改良型共培养诱导培养基含3-6mM葡萄糖、150-250μM乙酰丁香酮、35-45mM2-(N-吗啉基)乙磺酸钠，培养条件为23-27℃共培养2-4d。
优选地，步骤(4)的改良型共培养诱导培养基含5mM葡萄糖、200μM乙酰丁香酮、40mM2-(N-吗啉基)乙磺酸钠，培养条件为25℃共培养3d。
在本发明的实施例中，改良型共培养诱导培养基Co-IM培养基成分为：每升Co-IM培养基中含2.05gK2HPO4、1.45gKH2PO4、0.15gNaCl、0.5gMgSO4·7H2O、0.5g(NH4)2SO4、0.10gCaCl2·6H2O、0.0025gFeSO4·7H2O、1050％的甘油、5mM葡萄糖、200μM乙酰丁香酮、40mM2-(N-吗啉基)乙磺酸钠。
步骤(5)的筛选培养基SM含40-100μg/mL潮霉素B和150-250μM头孢噻肟。
优选地，步骤(5)的筛选培养基SM含50μg/mL潮霉素B和200μM头孢噻肟。
步骤(5)的PDA平板培养基含40-100μg/mL潮霉素B。
优选地，步骤(5)的PDA平板培养基含50μg/mL潮霉素B。
步骤(5)中将长出芦笋茎枯病菌的菌落转移至含有潮霉素B的PDA平板培养基中连续培养的代数为5代。
上述方法制备得到的芦笋茎枯病菌遗传转化子属于本发明的保护范围。
本发明提供了上述方法在制备芦笋茎枯病菌特异性荧光标记菌株中的应用。
在本发明的实施例中，由于选择的双元表达载体为pBHt2_sGFP，因此本发明得到了GFP标记的芦笋茎枯病菌菌株。
具体为：
(1)制备芦笋茎枯病菌分生孢子：
将芦笋茎枯病菌接种于马铃薯葡萄糖琼脂培养基上，活化培养5d；将活化培养的芦笋茎枯病菌打取菌饼接种于燕麦琼脂糖培养基上，25℃恒温培养14-21d，至分生孢子器中乳白色分生孢子溢出；
(2)培养农杆菌：
将质粒pBHt2_sGFP转入农杆菌株LBA4404中；农杆菌单菌落接种于含有50μg/mL卡那霉素和100μg/mL利福平的LB固体培养基中，28℃培养2d；再将前述LB固体培养基上的农杆菌单菌落接种于含50μg/mL卡那霉素的液体基本培养基MM中，28℃振荡培养2-3d(振速150-180rpm)；
(3)用含150-250μM乙酰丁香酮和35-45mM2-(N-吗啉基)乙磺酸钠的诱导培养基IM稀释农杆菌悬浮液至OD600值为0.15-0.20，继续在28℃条件下振荡培养至OD600值为0.25-0.35备用；
(4)根癌农杆菌与芦笋茎枯病菌分生孢子共培养：
取步骤(1)中的芦笋茎枯病菌分生孢子，用水稀释，调节浓度至1×106-5×106个分生孢子/mL；得到的OD600值为0.25-0.35的农杆菌悬浮液与前述浓度为1×106-5×106个分生孢子/mL的分生孢子悬浮液按照体积比1:1混合，混合液均匀涂布于铺有硝酸纤维素膜的改良型共培养诱导培养基中培养；
所述改良型共培养诱导培养基含5mM葡萄糖、200μM乙酰丁香酮、40mM2-(N-吗啉基)乙磺酸钠；培养条件为25℃共培养2-4d；
(5)转化子的筛选：
将步骤(4)中的硝酸纤维素膜放于含50μg/mL潮霉素B和200μM头孢噻肟的筛选培养基SM中，使有菌丝的一面朝上，置于25℃恒温箱中培养4-6d；将长出的芦笋茎枯病菌菌落转移至含有50μg/mL潮霉素B的PDA平板中继续培养，将生长的菌落再次接种至含有50μg/mL潮霉素B的PDA平板上，连续培养5代得到纯净的芦笋茎枯病菌遗传转化子；
(6)GFP标记的芦笋茎枯病菌菌株的获得：对得到的阳性转化子，利用荧光显微镜观察各遗传转化子的菌丝体在488nm蓝色激发光源的激发下能否产生绿色荧光，将表达绿色荧光蛋白的转化子接种至含有50μg/mL潮霉素B的PDA平板培养基上，连续培养5代得到稳定表达绿色荧光的芦笋茎枯病菌GFP标记菌株。
上述方法得到的GFP标记的芦笋茎枯病菌菌株也属于本发明的保护范围。
本领域技术人员应当理解，基因本发明的上述芦笋茎枯病菌遗传转化子制备方法以及实施例制得的GFP标记的芦笋茎枯病菌菌株，本领域技术人员可以采用该方法以及该菌株进行芦笋茎枯病相关病理的研究，进而实现对芦笋茎枯病的防控与治疗。因此本发明还提供了上述芦笋茎枯病菌遗传转化子制备方法在芦笋茎枯病高效防控与治疗中的用途。
利用本方法成功转化了不同的芦笋茎枯病菌菌株，而且经多次重复实验具有相似转化效率，这为构建芦笋茎枯菌株T-DNA随机插入突变体库提供了高效的遗传转化技术。在获得大量芦笋茎枯病菌的遗传转化子的同时筛选到了能稳定表达绿色荧光蛋白的标记菌株。相对于该领域目前的技术，本发明具有如下优点：
第一、本发明是国内外首次报道芦笋茎枯病菌的遗传转化方法以及遗传转化子的获得，这为今后大规模构建病原菌T-DNA插入突变体库、病害发生机制的后续深入研究和关键功能基因的鉴定提供了重要方法基础，是推动该病害分子生物学研究的重要技术革新，为该病害致病机制及抗病研究提供了一个重要的创新方法。
第二、本发明方法简单、快捷、节约成本：本发明直接以芦笋茎枯病菌分生孢子为遗传转化受体，相对于芦笋茎枯病菌原生质体制备，所需的用于与农杆菌共培养的分生孢子的生产方法更简单，可以直接在培养皿内通过诱导成熟的分生孢子器而产生，无需其它昂贵的试剂药品及离心等处理，更为简单、快捷和节约成本。
第三、转化效率高、遗传稳定：本发明以含有双元表达载体的根癌农杆菌作为转化介体，按照实验步骤，通过与芦笋茎枯病菌分生孢子的共培养、筛选等过程，通过对共培养诱导培养基的改良等改进技术，使得该方法遗传转化效率高(1.2×103个分生孢子可以获得1个遗传转化子)、转基因后代遗传稳定、目标基因丢失率低(连续培养5代仍可稳定遗传)。
第四、本发明方法周期短、重复性好：本发明获得遗传转化子的周期短，从制备好的分生孢子到转基因遗传转化子的PCR鉴定仅需约15d。采用不同地域的芦笋茎枯病菌菌株，在不同的实验室由不同的研究人员操作均可获得稳定的遗传转化子。
第五、本发明获得的GFP标记菌株为重要创新材料：利用本方法转化芦笋茎枯病菌后，可进一步筛选获得超强表达绿色荧光蛋白(GFP)的标记菌株，这为生产上利用该种荧光标记菌株开展病害发生进程和病原菌与寄主的生物学互作研究提供了重要的材料。
附图说明
图1为实施例1中芦笋茎枯病菌Pa1100在OA培养基上产生的分生孢子器及分生孢子。图中：A图中黑点为成熟的分生孢子器，黑点上乳白色液体为其分泌出的分生孢子液；B图为分生孢子器的纵切面结构分析；C图为α型分生孢子；D图为α型分生孢子的扫描电镜分析。
图2为实施例1中野生型芦笋茎枯病菌菌株Pa1100在OA培养基中对潮霉素B的敏感性检测。图中：A图潮霉素B浓度为0μg/mL；B图潮霉素B浓度为10μg/mL；C图潮霉素B浓度为20μg/mL；D图潮霉素B浓度为50μg/mL；E图潮霉素B浓度为100μg/mL；F图潮霉素B浓度为150μg/mL。
图3为实施例3中芦笋茎枯病菌在筛选培养基(SelectionMedium)上的生长情况。
图4为实施例4中随机挑选芦笋茎枯病菌转化子潮霉素B抗性基因(Hph)的PCR扩增电泳图谱。图中：泳道M：DL2000DNAMaker；泳道P：质粒pBHt2_sGFP；泳道H2O：无菌水对照；泳道WT：Pa1100未转化的野生型菌株；泳道1-7：芦笋茎枯病菌Pa1100菌株的转化子。
图5为实施例5中部分转化子的菌丝生长速率。图中：W：野生型菌株Pa1100；不同数字表示编码不同的遗传转化子。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。
若未特别指明，实施例中所用的化学试剂均为常规市售试剂，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例1芦笋茎枯病菌菌株分生孢子的制备与对潮霉素B敏感性检测
(1)将芦笋茎枯病菌接种于马铃薯葡萄糖琼脂(PotatoDextroseAgar，PDA)培养基上，活化培养5d；
将活化培养的芦笋茎枯病菌打取菌饼接种于燕麦琼脂糖(OatmealAgar，OA)培养基上，25℃恒温培养14d，至分生孢子器中乳白色分生孢子溢出(图1)；
(2)芦笋茎枯病菌对潮霉素B的敏感性检测：
1)配制好含不同浓度潮霉素B的OA培养基，设置成为6种不同浓度，分别为：0μg/mL、10μg/mL、20μg/mL、50μg/mL、100μg/mL和150μg/mL；
2)均匀打取野生型芦笋茎枯病菌菌株Pa1100菌饼，分别接种于不同潮霉素B浓度的OA培养基中，生长7d后拍照，用于分析其对潮霉素B的敏感性(图2)。图2结果说明，芦笋茎枯病菌对于潮霉素B比较敏感，在潮霉素B浓度达到10μg/mL时，相比于未添加潮霉素B对照，其生长即表现出受到一定程度的抑制；当潮霉素B浓度达到20μg/mL时，其生长速率表现出十分显著地减缓；当潮霉素B浓度至50μg/mL时，其生长几乎受到完全抑制；当继续增加潮霉素B至100μg/mL和150μg/mL时，其生长状态与50μg/mL时基本一致。从抑制效果和节约成本等角度综合考虑，选择40-100μg/mL的潮霉素B即可作为筛选转基因遗传转化子的筛选浓度，其中50μg/mL可作为最佳浓度。
实施例2培养农杆菌
(1)将质粒pBHt2_sGFP转入农杆菌株LBA4404中；
(2)取步骤(1)中的农杆菌单菌落接种于含有含有50μg/mL卡那霉素和100μg/mL利福平的LB固体培养基中，28℃培养2d；
(3)取步骤(2)中的农杆菌单菌落接种于含50μg/mL卡那霉素的基本培养基(MinimalMedium，MM)中，28℃振荡培养2d(振速160rpm)；
(4)用含200μM乙酰丁香酮和40mM2-(N-吗啉基)乙磺酸钠的诱导培养基(InductionMedium，IM)稀释步骤(3)中的农杆菌悬浮液至OD600值为0.15，继续在28℃条件下振荡(振速160rpm)培养6h，至OD600值为0.30，备用。
实施例3芦笋茎枯病菌遗传转化子的制备
(1)取实施例1制得的芦笋茎枯病菌分生孢子，用水稀释浓度至2×106个分生孢子/mL；
(2)将实施例2制得的OD600值为0.30的农杆菌悬浮液以1:1的体积比混合，按200μL/皿的量均匀涂布于铺有硝酸纤维素膜的含有乙酰丁香酮和2-(N-吗啉基)乙磺酸钠的Co-IM培养基上，置于25℃共培养2d；
Co-IM培养基成分为：每升Co-IM培养基中含2.05gK2HPO4、1.45gKH2PO4、0.15gNaCl、0.5gMgSO4·7H2O、0.5g(NH4)2SO4、0.10gCaCl2·6H2O、0.0025gFeSO4·7H2O、1050％的甘油、5mM葡萄糖、200μM乙酰丁香酮、40mM2-(N-吗啉基)乙磺酸钠。
(3)转化子的筛选及保存：
将步骤(2)中的硝酸纤维素膜放于含50μg/mL潮霉素B和200μM头孢噻肟的筛选培养基中，使有菌丝的一面朝上，置于25℃恒温箱中培养4d(图3)；
将长出的芦笋茎枯病菌单个菌落用牙签挑取转移至含有50μg/mL潮霉素B的PDA平板培养基中，3d后将生长的菌落再次接种至含有50μg/mL潮霉素B的PDA平板培养基上，连续培养5代得到纯净的芦笋茎枯病菌遗传转化子。通过筛选获得的遗传转化子数目与所用分生孢子数目进行比较，分析获得该方法的遗传转化效率约1.2×103个分生孢子可获得1个遗传转化子；
分别将挑取获得的各个不同的遗传转化子保存在含有50μg/mL潮霉素B的PDA平板培养基上，置于4℃低温保存，用于阳性鉴定，从而构建芦笋茎枯病菌T-DNA随机插入突变体库，为后续功能基因鉴定提供材料基础。
实施例4芦笋茎枯病菌遗传转化子的PCR鉴定
(1)遗传转化子基因组DNA的提取
采用改良型CTAB法提取转化子基因组DNA，步骤如下：取100mg新鲜菌丝，加600μL2xCTAB提取缓冲液和少许灭菌石英砂，在研钵中将菌丝充分研磨；将研磨后的溶液转入1.5mL无菌Eppendorf管中，于65℃水浴保温30min，加等体积的氯仿和异戊醇混合液，氯仿和异戊醇的体积比为24:1，充分摇匀，4℃下10000rpm离心5min；移取上清液至另一新的Eppendorf管中，加入3mol/L的NaAc溶液和冰冻乙醇，NaAc溶液的体积是上清液体积的10％，其pH为6.0，冰冻乙醇的体积是上清液体积的2.5倍，在-20℃沉淀30min；4℃12000rpm离心5min，弃上清液，用70％的无水乙醇清洗沉淀2次，通风干燥沉淀20min，加TE缓冲液充分溶解，即为遗传转化子基因组DNA溶液，-20℃保存备用。
(2)PCR扩增检测
为确定所获得的抗潮霉素B的芦笋茎枯病菌株是否为阳性遗传转化子，含有目标T-DNA插入片段，采用PCR扩增方法进行分子鉴定。根据T-DNA序列中的潮霉素B抗性基因Hph设计引物用于扩增，引物序列分别为：
Hph/F1:5’-CTATTCCTTTgCCCTCggAC-3’
Hph/R1:5’-AAgCCTgAACTCACCgCgAC-3’；扩增长度为1020bp；
常规PCR反应：加入适量菌的DNA作为PCR模板，然后按表1依次加入PCR反应试剂，置于PCR仪中进行反应。反应条件为95℃预变性3min，94℃变性30s、55℃退火30s、72℃复性1min(35个循环)，72℃延伸10min，16℃保温30min。根据Tm值对退火温度加以调整。扩增后样品用2％琼脂糖凝胶电泳检验(图4)。PCR扩增结果说明随机挑取的遗传转化子的基因组中成功扩增出了目标潮霉素B抗性基因Hph的片段，所挑取的遗传转化子为阳性转化子。
表1PCR反应体系
实施例5芦笋茎枯病菌菌株Pa1100GFP标记菌株的获得
参照实施例3记载的方法，在含潮霉素B的PDA平板培养基上筛选获得芦笋茎枯病菌遗传转化子；
利用莱卡DM2000荧光显微镜观察各遗传转化子的菌丝体在488nm蓝色激发光源的激发下能否产生绿色荧光，筛选强表达绿色荧光蛋白的遗传转化子接种至含有50μg/mL潮霉素B的PDA平板培养基上，连续培养5代获得稳定表达GFP的芦笋茎枯病菌遗传转化子，并分析了其生长速率(图5)。结果表明，不同的可稳定表达GFP的芦笋茎枯病菌遗传转化子在营养生长速率上具有一定的差异，在应用这些表达GFP荧光的遗传转化子在显微镜下分析观测致病互作进程时，可选择那些生长速率和形态与野生型差异不大的菌株，这样便可作为标记菌株应用于该病原菌的致病进程分析。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (10)

1.一种农杆菌介导的芦笋茎枯病菌遗传转化子的制备方法，其特征在于，以芦笋茎枯病菌的分生孢子为受体，以农杆菌为介体，将芦笋茎枯病菌的分生孢子悬浮液与含有双元载体的农杆菌混合后共培养，制备芦笋茎枯病菌遗传转化子。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)制备芦笋茎枯病菌的分生孢子：将芦笋茎枯病菌接种于马铃薯葡萄糖琼脂培养基上，活化培养；将活化培养后的芦笋茎枯病菌接种于燕麦琼脂糖培养基上，培养至分生孢子器中乳白色分生孢子溢出；
(2)将已转入双元表达载体的农杆菌单菌落接种于LB固体培养基中培养后，再将农杆菌单菌落接种液体基本培养基MM中培养得到农杆菌悬浮液；
(3)用含有乙酰丁香酮和2-(N-吗啉基)乙磺酸钠的液体诱导培养基IM稀释步骤(2)制得的农杆菌悬浮液至OD600值为0.15-0.20，继续在28℃条件下振荡培养，至OD600值为0.25-0.35备用；
(4)农杆菌与芦笋茎枯病菌分生孢子共培养：
将步骤(1)获得的芦笋茎枯病菌分生孢子用水稀释为浓度为1×106-5×106个分生孢子/mL；
将步骤(3)得到的OD600值为0.25-0.35的农杆菌悬浮液与上述浓度为1×106-5×106个分生孢子/mL分生孢子悬浮液按照体积比1:1混合，混合液均匀涂布于铺有硝酸纤维素膜的改良型共培养诱导培养基中培养；
(5)将步骤(4)中的硝酸纤维素膜放于含有潮霉素B和头孢噻肟的筛选培养基SM中，使有菌丝的一面朝上，恒温培养；
将长出芦笋茎枯病菌的菌落转移至含有潮霉素B的PDA平板培养基中继续培养，将生长的菌落再次接种至含有潮霉素B的PDA平板培养基上，连续培养得到纯净的芦笋茎枯病菌遗传转化子。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中，活化培养条件为23-27℃3-6d；活化培养后的芦笋茎枯病菌接种于燕麦琼脂糖培养基上的培养条件为23-27℃，14-21d。
4.如权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(2)所述的固体培养基为含卡那霉素和利福平的LB固体培养基；培养条件为28℃培养2-3d；
步骤(2)所述液体基本培养基MM含50μg/mL卡那霉素，培养条件为28℃振荡培养2-3d，振速150-180rpm。
5.如权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(3)所述的液体诱导培养基IM含150-250μM乙酰丁香酮和35-45mM2-(N-吗啉基)乙磺酸钠。
6.如权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(4)的改良型共培养诱导培养基含3-6mM葡萄糖、150-250μM乙酰丁香酮、35-45mM2-(N-吗啉基)乙磺酸钠，培养条件为23-27℃共培养2-4d。
7.如权利要求2-6任一所述的方法，其特征在于，步骤(5)的筛选培养基SM含40-100μg/mL潮霉素B和150-250μM头孢噻肟。
8.如权利要求2-6任一所述的方法，其特征在于，步骤(5)的PDA平板培养基含40-100μg/mL潮霉素B。
9.权利要求1-8任一所述的方法制备得到的芦笋茎枯病菌遗传转化子。
10.权利要求1-8任一所述的方法在制备芦笋茎枯病菌特异性荧光标记菌株中的应用。
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