CN103834681B

CN103834681B - 一种农杆菌介导遗传转化稻曲菌的方法

Info

Publication number: CN103834681B
Application number: CN201310614030.7A
Authority: CN
Inventors: 邹克琴; 汪德凯; 胡东维; 李素芳; 朱诚
Original assignee: China Jiliang University
Current assignee: China Jiliang University
Priority date: 2013-11-26
Filing date: 2013-11-26
Publication date: 2016-01-13
Anticipated expiration: 2033-11-26
Also published as: CN103834681A

Abstract

本发明公开了一种农杆菌介导遗传转化稻曲菌的方法，所述方法为：将含有潮霉素B基因和标记基因的农杆菌预诱导培养，然后将稻曲菌孢子液与预诱导后的农杆菌菌液以体积比1：1混合制成混合菌液，将混合菌液均匀涂布于表面铺有滤纸、PVDF膜或硝酸纤维素膜的含乙酰丁香酮的改良AIM固体培养基平板上，黑暗条件下于20～24℃共培养36～48h，然后将共培养后的膜剪成小片并铺在改良的选择培养基CM上26℃培养4～5d，获得含有潮霉素B基因的稻曲菌；本发明方法转化子时间缩短为4～5d，转化效率高达91.3%；稻曲菌转基因后代稳定，基因丢失率低，转化子稳定性达95%。

Description

一种农杆菌介导遗传转化稻曲菌的方法

（一）技术领域

本发明涉及一种农杆菌介导的真菌遗传转化方法，尤其涉及一种基于根癌农杆菌介导遗传转化稻曲菌的改良方法。

（二）背景技术

稻曲菌(Ustilaginoideavirens(Cooke)Tak)属子囊目、麦角科、拟黑粉属。水稻稻曲病是由稻曲菌引起的水稻真菌病害。稻曲病在历史上对水稻的危害损失并不严重，但是随着全球气候变化和我国高产优质杂交稻大面积推广以及水稻水肥水平的提高，稻曲病危害逐年加重。稻曲病菌不但侵染水稻，还可以侵染玉米和田间一些杂草如马唐属和水社黍以及野生稻。水稻发生稻曲病后，不仅降低稻谷产量及质量，而且病粒含有毒素，这种毒素能引起人畜慢性中毒，极大的影响了我国粮食高产稳产和粮食食品安全。对稻曲菌的研究也逐渐引起世界各国的重视。

近年来，随着分子生物学向真菌学的渗透和发展，真菌的遗传转化也越来越受到重视。真菌基因工程是进行真菌遗传研究的重要途径。真菌有坚韧的细胞壁结构，迄今所建立的真菌遗传转化技术均有利弊。例如电转化虽然实验过程简单，但需要昂贵的仪器设备，而PEG介导的原生质转化法虽然不需要仪器，但是需要制备原生质体，制备过程大多程序繁多，最终因原生质的破裂而转化率极低。目前，农杆菌介导转化技术在植物上应用较为广泛，但在真菌中的应用还不是很多，根癌农杆菌介导的转化法近几年在一些真菌中出现有报道，例如利用根癌农杆菌转化了黑曲霉(Aspergillusniger)、里氏木霉(Trichodermareesei)、链孢霉(Neurosporacrassa)、立枯丝核菌（Rhizoctoniasolani）、稻瘟菌（Magnaporthegrisea）、大丽轮枝菌（Verticilliumdahliae）、红曲霉(MonascuspurpureusWent)等多种真菌。根癌农杆菌介导的转化法因而成为真菌遗传转化和基因克隆的强有力工具。但是不同的真菌物种有不同的生理特性，目前真菌利用农杆菌介导的方法转化率有待提高，转化子的稳定性也需要提高。稻曲病是水稻上的重要病害之一，农杆菌介导稻曲菌转化的相关研究国内外还很少见报导，2006年张震进行了根癌农杆菌介导遗传转化稻曲病菌的初步研究（中国水稻科学,2006,20(4):440-442），但是转化率偏低，而且无法确定转化子的稳定性和拷贝数。因此，有必要建立一套农杆菌介导的高转化率的稻曲菌的遗传转化技术，为稻曲病菌的致病机制研究、致病相关基因克隆以及为寻求控制该病害的有效途径奠定基础。本发明的技术效果能够克服上述缺陷，提供一种根癌农杆菌介导的稻曲菌高效转基因方法，以弥补现行真菌转基因技术转化率普遍偏低、外源基因不稳定的缺陷。

本发明涉及的一种农杆菌介导的稻曲菌遗传转化方法，该方法适用于稻曲菌的各种产孢的菌种类型。通过这种方法，可以成功实现在短时间内稻曲菌的遗传转化。

（三）发明内容

本发明目的是提供一种农杆菌介导遗传转化稻曲菌的高效方法，使得在短期内可以获得大量的转化子，可以成功实现在短时间内稻曲真菌的遗传转化，为稻曲菌的致病机制研究建立良好的技术平台。

本发明采用的技术方案是：

本发明提供一种农杆菌介导遗传转化稻曲菌的方法，所述方法按如下步骤进行：（1）质粒转化农杆菌：将构巢曲霉启动子基因和标记基因重组到带有潮霉素B基因的质粒中获得重组质粒，然后用重组质粒转化农杆菌，获得含有潮霉素B基因和标记基因的农杆菌（优选pCAMBIA1300-TrpC-GFP重组质粒，该质粒含有潮霉素B基因和绿色荧光蛋白基因）；（2）预诱导：将含有潮霉素B基因和标记基因的农杆菌（优选含有pCAMBIA1300-TrpC-GFP质粒的农杆菌）接种至含有卡那霉素和利福平的LB液体培养基中，28℃、150rpm、黑暗条件下培养至OD₆₀₀为0.5～0.8，取培养液离心，将沉淀用改良AIM培养液洗涤后再用含有终浓度150～250μmol/L乙酰丁香酮的改良AIM培养液稀释至OD₆₀₀为0.1～0.3，在28℃、150rpm、黑暗条件下诱导培养至OD₆₀₀为0.3～0.5，获得预诱导后的农杆菌菌液；所述改良AIM培养液终浓度组成为：8～12mg/LCaCl₂·2H₂O、0.8～1.2mg/LFeSO₄、400～600mg/LNH₄NO₃、体积浓度0.4～0.6%glycerol（丙三醇）、30～50mmol/LMES（2-吗啉乙磺酸）、0.5～0.7g/LMgSO₄·7H₂O、0.2～0.4g/LNaCl、1.8～2.2g/L葡萄糖、50～150mg/LZnSO₄·7H₂O、50～150mg/LCuSO₄·5H₂O、50～150mg/LH₃BO₃，50～150mg/LNa₂MoO₄·2H₂O和50～150mg/LCoCl₂·6H₂O，溶剂为0.01M磷酸缓冲液，pH4.8；（3）共培养：将稻曲菌接种在PSA液体培养基中，24～28℃，150rpm黑暗培养至OD₆₀₀为0.7～1.0，将培养液用纱布过滤，滤液离心，沉淀加入PSA液体培养基，获得稻曲菌孢子液，然后将稻曲菌孢子液与步骤（2）获得的预诱导后的农杆菌菌液以体积比1：1混合制成混合菌液，将混合菌液均匀涂布于表面铺有滤纸、PVDF膜或硝酸纤维素膜的含乙酰丁香酮的改良AIM固体培养基平板上，黑暗条件下于20～24℃共培养36～48h，然后将共培养后的膜剪成小片（优选2cm×2cm小片）并铺在改良的选择培养基CM上26℃培养4～5d，获得含有潮霉素B基因的稻曲菌（优选获得含有pCAMBIA1300-TrpC-GFP质粒的稻曲菌）；所述含乙酰丁香酮的改良AIM固体培养基终浓度组成为：8～12mg/LCaCl₂·2H₂O、0.8～1.2mg/LFeSO₄、400～600mg/LNH₄NO₃、体积浓度0.4～0.6%glycerol（丙三醇）、30～50mmol/LMES（2-吗啉乙磺酸）、0.5～0.7g/LMgSO₄·7H₂O、0.2～0.4g/LNaCl、1.8～2.2g/L葡萄糖、50～150mg/LZnSO₄·7H₂O、50～150mg/LCuSO₄·5H₂O、50～150mg/LH₃BO₃，50～150mg/LNa₂MoO₄·2H₂O和50～150mg/LCoCl₂·6H₂O、150～250μmol/L乙酰丁香酮和13～18g/L琼脂，溶剂为0.01M磷酸缓冲液，pH7.0；所述选择性固体培养基CM终浓度组成为：马铃薯200g/L、蔗糖20g/L、琼脂20g/L、100μg/mL潮霉素B、400μg/mL头孢霉素、60μg/mL链霉素、100μg/mL卡那霉素，溶剂为水，pH7.0。

进一步，步骤（1）所述转化方法为：将农杆菌单菌落接种在含有终浓度50μg/ml利福平的LB固体培养基上，27～29℃培养至浅黄色菌落出现，挑取单菌落转接到含有终浓度50μg/ml利福平的LB液体培养基中，在27～29℃、150rpm、黑暗条件下培养至OD₆₀₀为0.8～1.0，取培养液加入新鲜的含有终浓度50μg/ml利福平的LB液体培养基中，27～29℃、150rpm、黑暗条件下振荡培养至OD₆₀₀为0.5～0.8，然后将培养液转移到灭菌的离心管中，冰上放置10～15min后于10000rpm条件下离心30～60s；弃上清液，冰浴条件下，沉淀用灭菌的20mmol/LCaCl₂水溶液悬浮后加入1/10倍体积的0.8～1.0μg/ml含有潮霉素B基因和标记基因的重组质粒（优选含有pCAMBIA1300-TrpC-GFP重组质粒），混匀，置于液氮中冷冻3～5min后于37℃水浴中解冻，再加入5～8倍体积的LB液体培养基，于28℃、150rpm、黑暗条件下振荡培养至OD₆₀₀为0.3～0.5；离心，去除四分之三体积的上清液，剩余上清液与沉淀悬浮混匀制成悬浮液，取悬浮液均匀涂布在含终浓度100μg/mL卡那霉素和终浓度50μg/mL利福平的LB固体培养基上，待菌液被完全吸收后倒置，28℃培养2～4d，获得含有潮霉素B基因和标记基因的农杆菌菌株；所述含有潮霉素B基因和标记基因的重组质粒是将构巢曲霉启动子和标记基因重组到带有潮霉素B基因的质粒中而获得的，所述LB固体培养基终浓度组成为：胰蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、氯化钠10g/L、琼脂1.5g/L，溶剂为水，pH7.0；所述LB液体培养基终浓度组成为：胰蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、氯化钠10g/L、溶剂为水，pH7.0。

进一步，步骤（1）所述农杆菌为农杆菌AGL-1。

进一步，步骤（2）所述LB液体培养基中卡那霉素终浓度100μg/mL，利福平终浓度为50μg/mL。

进一步，步骤（2）所述改良的农杆菌诱导培养液中CoCl₂·6H₂O终浓度为100mg/L。

进一步，步骤（2）所述乙酰丁香酮的终浓度为200μmol/L。

进一步，步骤（2）所述沉淀用改良AIM培养液洗涤2次。

进一步，步骤（3）所述稻曲菌孢子液的浓度为10⁵～10⁷个/mL（优选10⁶个/mL）。

进一步，步骤（3）所述改良AIM固体培养基平板上铺有PVDF膜（聚偏二氟乙烯膜）。

进一步，所述PVDF膜孔径为0.45μm。

进一步，步骤（3）所述稻曲菌为稻曲菌SX02-01（即陕西稻曲菌SX02-01）、稻曲菌ZJ02-02（即浙江稻曲菌ZJ02-02）或稻曲菌SY04（即沈阳稻曲菌SY04）。本发明所述稻曲菌菌系见公开文献：王永强等，中国不同地理来源稻曲病菌rDNA-ITS的分析，植物保护学报，2009,36（5）：475-476；所述3种稻曲菌菌株（即稻曲菌SX02-01、稻曲菌ZJ02-02或稻曲菌SY04）可以从浙江大学生物技术研究所获得，地址为：浙江杭州市余杭塘路866号浙江大学紫金港校区，联系电话：0571-86835772，86971667。

本发明为了验证潮霉素B基因和标记基因是否转化到稻曲菌中，采用选择培养、复筛及PCR检测等手段来确定，所述选择培养、复筛及PCR检测方法为：

（1）选择培养

将步骤（3）共培养后的滤纸、硝酸纤维素膜或PVDF膜（孔径0.45μm）剪成2×2cm的小片，在改良的选择培养基CM上26℃培养4～5d，观察菌落生长。选择性固体培养基CM终浓度组成为：马铃薯200g/L、蔗糖20g/L、琼脂20g/L、100μg/mL潮霉素B、400μg/mL头孢霉素、60μg/mL链霉素、100μg/mL卡那霉素，溶剂为水，pH7.0。

（2）复筛

将步骤（1）选择培养过程中膜周围长出的菌落挑取转移到含有潮霉素B（终浓度为100μg/mL）和头孢霉素（终浓度为400μg/mL）的PSA固体培养基平板上，22～26℃培养48～60h进行复筛，获得单菌落。随机挑选经过复筛得到的单菌落接种到不含潮霉素B的PSA固体培养基上，22～26℃培养7d，挑取单菌落接种至不含潮霉素B的PSA固体培养基上，22～26℃培养7d，连续转接8次后，挑取单菌落再转接到含终浓度100μg/mL潮霉素B的PSA固体培养基上，同时接种出发菌株稻曲菌SX0201作为对照，22～26℃培养7d，观察菌落生长。与对照相比，能多次在含有潮霉素B的培养基上生长的稻曲菌为复筛转化子。PSA固体培养基终浓度组成为：马铃薯200g/L、蔗糖20g/L、琼脂20g/L，溶剂为水，pH为7.0。

（3）转化子的PCR检测（目的是检验pCAMBIA1300-TrpC-GFP质粒上携带的潮霉素B基因(hpt)和绿色荧光蛋白基因(gfp)是否转入稻曲菌）

a、潮霉素磷酸转移酶基因（hpt）的PCR检测

随机挑取步骤（2）获得的复筛转化子，用改进的CTAB方法（参见专利ZL201110365304.4）提取野生型稻曲菌SX02-01菌株和转化子菌株（即含pCAMBIA1300-TrpC-GFP质粒的稻曲菌SX02-01）基因组DNA，以重组质粒pCAMBIA1300-TrpC-GFP上的潮霉素磷酸转移酶基因(hpt)为模板分别设计特异引物hpt-F和hpt-R（引物由上海生工生物技术有限公司合成，序列见表1）进行PCR检测。潮霉素磷酸转移酶基因（hpt）的PCR扩增实验步骤为：取0.2ml的离心管，分别加入下列试剂，10×PCRBuffer5μL，dNTPsMixture(100mmol/L)4μL，hpt-FPrimer(20μmol/L)1μL，hpt-RPrimer(20μmol/L)1μl，DNA模板（所提取的稻曲菌基因组DNA分别用双蒸水稀释200倍后作为PCR反应的模板）1μL，TaqDNA聚合酶1μL，补加灭菌的双蒸水到50μL。

PCR扩增反应条件为：94℃预热变性5min，然后进入循环阶段，94℃热变性40s，56℃复性30s，72℃延伸1min，进行30个循环，最后72℃延伸10min。反应结束后，取5μL扩增产物进行1.0%琼脂糖凝胶电泳检测，以验证潮霉素磷酸转移酶基因(hpt)是否转入稻曲菌基因组中。

表1扩增hpt基因的引物序列

b、绿色荧光蛋白基因(gfp)的PCR检测

随机挑取步骤（2）获得的复筛转化子，用改进的CTAB方法提取野生型稻曲菌SX02-01菌株和转化子（即含pCAMBIA1300-TrpC-GFP质粒的稻曲菌SX02-01）菌株基因组DNA，以质粒pCAMBIA1300-TrpC-GFP质粒上的绿色荧光蛋白基因(gfp)为模板分别设计特异引物gfp-F和gfp-R（引物由上海生工生物技术有限公司合成，引物序列见表2）进行PCR检测。绿色荧光蛋白基因（gfp）的PCR扩增实验步骤为：取0.2ml的离心管，分别加入下列试剂：10×PCRBuffer5μL，dNTPsMixture(100mmol/L)4μL，gfp-FPrimer(20μmol/L)1μL，gfp-RPrimer(20μmol/L)1μL，DNA模板（所提取的稻曲菌基因组DNA分别用灭菌的双蒸水稀释200倍后作为PCR反应的模板）1μL，TaqDNA聚合酶1μL，补加灭菌的双蒸水到50μL。

PCR扩增反应条件为：94℃预热变性5min，然后进入循环阶段，94℃热变性30s，54℃复性30s，72℃延伸1min，进行30个循环，最后72℃延伸10min。反应结束后，取5μL产物进行1.0%琼脂糖凝胶电泳检测，以验证绿色荧光蛋白基因（gfp）是否转入稻曲菌基因组中。

表2扩增gfp基因的引物序列

与现有技术相比，本发明的有益效果主要体现在：1、采用本发明提供的方法进行农杆菌介导遗传转化稻曲菌，改良共培养培养基和选择培养基后，获得转化子时间缩短为4～5d，转化效率高达91.3%；2、本发明方法转化周期短，从农杆菌的预培养到转化子的PCR检测需要20天。3、改进了农杆菌的诱导转化剂，添加了钴离子激活剂后，分生孢子转化率大大提高了14%。4、用PVDF膜代替硝酸纤维素膜和普通滤纸进行转化，转化率大大提高。稻曲菌转基因后代稳定，基因丢失率低，转化子稳定性达95%；本方法适用于不同的稻曲菌菌株，都能获得较高的遗传转化效率。

（四）附图说明

图1为实施例2中野生型稻曲菌SX02-01在PSA培养基中对潮霉素B的生长抗性表现照片，潮霉素B浓度50μg/mL。

图2为实施例2中稻曲菌SX02-01转化子在PSA培养基上生长状况的照片，潮霉素B浓度100μg/mL。

图3为实施例1中稻曲菌SX02-01转化子转移6代后的PCR检测绿色荧光蛋白基因gfp（700bp）的电泳结果：M:15KDNAMarker（从上到下DNA大小依次为：15000bp，10000bp，7500bp，5000bp，2500bp，2000bp，1000bp，500bp）；泳道1为空的未转化质粒的农杆菌基因组做模板扩增gfp基因（阴性对照）；泳道2为质粒做模板扩增gfp基因（阳性对照），泳道3-6为稻曲菌转化子基因组DNA做模板扩增gfp基因。

图4为实施例1中稻曲菌SX02-01转化子转移6代后的PCR检测潮霉素基因hpt（1000bp）电泳结果：泳道M为15KDNAMarker（从上到下DNA大小依次为：15000bp，10000bp，7500bp，5000bp，2500bp，2000bp，1000bp，500bp）；泳道1为空的未转化质粒的农杆菌基因组做模板扩增hpt基因（阴性对照）；泳道2为质粒做模板扩增hpt基因（阳性对照）；泳道3-6为稻曲菌转化子基因组DNA做模板扩增hpt基因。

（五）具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

实施例1：农杆菌介导遗传转化稻曲菌的方法

（1）将构巢曲霉启动子和绿色荧光蛋白基因gfp重组到含有潮霉素B基因的pCAMBIA1300质粒中，获得pCAMBIA1300-TrpC-GFP重组质粒（经测序验证，该重组质粒含有构巢曲霉启动子、潮霉素B基因hpt和绿色荧光蛋白基因gfp），用重组质粒转化农杆菌。

将农杆菌AGL-1（浙江大学生物技术研究所提供）单菌落接种在含有终浓度50μg/ml利福平的LB固体培养基平板上，28℃培养40h，挑取单菌落转接到25ml含有终浓度50μg/ml利福平的LB液体培养基中，在28℃、150rpm、黑暗条件下振荡培养至OD₆₀₀为0.8，取0.1ml培养液加入到5ml新鲜的含有终浓度50μg/ml利福平的LB液体培养基中，28℃振荡培养至OD₆₀₀为0.6，然后将培养液转移到灭菌的10ml的离心管中，冰上放置10min，10000rpm，离心40s；弃上清液，沉淀用0.3ml的20mmol/LCaCl₂水溶液悬浮并放在冰上，再加入1/10倍体积的浓度为0.9μg/ml的pCAMBIA1300-TrpC-GFP重组质粒溶液（pH为8.0），混匀，置于液氮中冷冻4min后于37℃水浴中解冻，加入0.8mlLB液体培养基，于28℃、150rpm、黑暗条件下振荡培养3h至OD₆₀₀为0.6；离心，去除四分之三体积的上清液，剩余上清液与沉淀悬浮混匀制成悬浮液，取150μl的悬浮液均匀涂布在含终浓度100μg/mL卡那霉素和终浓度50μg/mL利福平的LB固体培养基上，待菌液被完全吸收后倒置，28℃培养2d，获得单菌落，即获得转化有pCAMBIA1300-TrpC-GFP质粒的农杆菌菌株AGL-1（经酶切和测序，验证含有潮霉素B基因转化质粒pCAMBIA1300-TrpC-GFP已经转化入农杆菌菌株AGL-1）；所述LB固体培养基终浓度组成为：胰蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、氯化钠10g/L、琼脂1.5g/L，溶剂为水，pH7.0；所述LB液体培养基终浓度组成为：胰蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、氯化钠10g/L、溶剂为水，pH7.0。

（2）农杆菌的预诱导

用灭菌的牙签挑取步骤（1）转化含有pCAMBIA1300-TrpC-GFP质粒的农杆菌菌株AGL-1，置于20×200mm的试管中，再加入5ml的含有终浓度100μg/mL卡那霉素和终浓度50μg/mL利福平的LB培养液，28℃、150rpm、黑暗条件下振荡培养至OD₆₀₀为0.8，取培养液4000r/min离心，收集菌体沉淀，菌体沉淀用改良AIM培养液洗2次，再用含有终浓度200μmol/L乙酰丁香酮的改良AIM培养液稀释至OD₆₀₀值为0.2。在恒温摇床上28℃下进行农杆菌的黑暗预诱导培养3h，转速150rpm，培养至培养液OD₆₀₀值为0.5时，获得预诱导培养后的农杆菌AGL-1菌液，菌体浓度为10⁷个/mL，即可用于农杆菌和稻曲菌的共培养转化。改良AIM培养液终浓度组成为：10mg/LCaCl₂·2H₂O、1.0mg/LFeSO₄、500mg/LNH₄NO₃、体积浓度0.5%glycerol（丙三醇）、40mmol/LMES（2-吗啉乙磺酸）、0.6g/LMgSO₄·7H₂O、0.3g/LNaCl、2.0g/L葡萄糖、100mg/LZnSO₄·7H₂O、100mg/LCuSO₄·5H₂O、100mg/LH₃BO₃，100mg/LNa₂MoO₄·2H₂O和100mg/LCoCl₂·6H₂O，溶剂为0.01M磷酸缓冲液，pH4.8。

（3）含有pCAMBIA1300-TrpC-GFP质粒的农杆菌和稻曲菌共培养转化

将稻曲菌SX02-01菌株（浙江大学生物技术研究所提供）接种在PSA培养液中，26℃培养4d后，培养液用三层灭菌纱布过滤，滤液在10000rpm下离心，收集沉淀即为孢子沉淀，将孢子沉淀用PSA培养液稀释成10⁶个/mL浓度的稻曲菌SX02-01孢子液进行转化实验。取上述100μL稀释的稻曲菌SX02-01孢子液与100μL步骤（2）获得的预诱导后的农杆菌AGL-1菌液以体积比1：1混合制成混合菌液，将混合菌液分别均匀涂布于表面铺有PVDF膜（孔径0.45μm）的改良AIM固体培养基平板上，黑暗条件下于22℃共培养40h，然后将共培养后的膜剪成2×2cm的小片，铺在改良的选择培养基CM上26℃培养4d，挑取小片膜周围长出的单菌落，即获得含有pCAMBIA1300-TrpC-GFP质粒的稻曲菌；改良AIM固体培养基终浓度组成为：10mg/LCaCl₂·2H₂O、1.0mg/LFeSO₄、500mg/LNH₄NO₃、体积浓度0.5%glycerol（丙三醇）、40mmol/LMES（2-吗啉乙磺酸）、0.6g/LMgSO₄·7H₂O、0.3g/LNaCl、2.0g/L葡萄糖、100mg/LZnSO₄·7H₂O、100mg/LCuSO₄·5H₂O、100mg/LH₃BO₃，100mg/LNa₂MoO₄·2H₂O和100mg/LCoCl₂·6H₂O，乙酰丁香酮200μmol/L和15g/L琼脂，溶剂为0.01M磷酸缓冲液，pH7.0。选择性固体培养基CM终浓度组成为：马铃薯200g/L、蔗糖20g/L、琼脂20g/L、100μg/mL潮霉素B、400μg/mL头孢霉素、60μg/mL链霉素、100μg/mL卡那霉素，溶剂为水，pH7.0。

（4）复筛

将步骤（3）中小片膜周围长出的单菌落转移到含有潮霉素B（终浓度为100μg/mL）和头孢霉素（终浓度为400μg/mL）的PSA固体培养基平板（表面没有膜)上，26℃培养36h进行复筛，在平板上长出单菌落（即转化子）。随机挑选经过复筛得到的单菌落接种到不含潮霉素B的PSA固体培养基上26℃培养7d，挑取单菌落再转接到不含潮霉素B的PSA固体培养基上26℃培养7d，连续转接8次后，再将单菌落转接到含终浓度100g/mL潮霉素B的PSA固体培养基(没有膜)上，同时接种出发菌株稻曲菌SX02-01作为对照，26℃培养7d，观察菌落生长。与对照相比，在膜周围有单菌落生长的为复筛转化子。PSA固体培养基终浓度组成为：马铃薯200g/L、蔗糖20g/L、琼脂20g/L，溶剂为水，pH为7.0。

（5）转化子的PCR检测

a、潮霉素磷酸转移酶基因（hpt）的PCR检测

随机挑取15个步骤（5）获得的复筛转化子，用改进的CTAB方法（参见专利ZL201110365304.4）提取野生型稻曲菌SX02-01菌株和转化子菌株（即含潮霉素B基因的稻曲菌SX02-01）基因组DNA，以重组质粒pCAMBIA1300-TrpC-GFP上的潮霉素磷酸转移酶基因(hpt)为模板分别设计特异引物hpt-F和hpt-R（引物由上海生工生物技术有限公司合成，序列见表1）进行PCR检测。潮霉素磷酸转移酶基因（hpt）的PCR扩增实验步骤为：取0.2ml的离心管，分别加入下列试剂，10×PCRBuffer5μL，dNTPsMixture(100mmol/L)4μL，hpt-FPrimer(20μmol/L)1μL，hpt-RPrimer(20μmol/L)1μl，DNA模板（所提取的稻曲菌基因组DNA分别用灭菌的双蒸水稀释200倍后作为PCR反应的模板）1μL，TaqDNA聚合酶1μL，补加灭菌的双蒸水到50μL。

PCR扩增反应条件为：94℃预热变性5min，然后进入循环阶段，94℃热变性40s，56℃复性30s，72℃延伸1min，进行30个循环，最后72℃延伸10min。反应结束后，取5μL产物进行1.0%琼脂糖凝胶电泳检测。结果见图4，所提取的稻曲菌转化子基因组DNA，利用引物hpt-F和hpt-R扩增得到的PCR产物条带清晰，大小均在1000bp左右，符合预期的片段大小。通过凝胶电泳及测序分析，表明潮霉素磷酸转移酶基因(hpt)已经转入稻曲菌基因组中。

表1扩增hpt基因的引物序列

b、绿色荧光蛋白基因(gfp)的PCR检测

随机挑取步骤（5）获得的15个复筛转化子，用改进的CTAB方法提取野生型稻曲菌SX02-01菌株和转化子（即含有质粒pCAMBIA1300-TrpC-GFP的稻曲菌SX02-01）菌株基因组DNA，以重组质粒pCAMBIA1300-TrpC-GFP上的绿色荧光蛋白基因(gfp)为模板分别设计特异引物gfp-F和gfp-R（引物由上海生工生物技术有限公司合成，引物序列见表2）进行PCR检测。绿色荧光蛋白基因（gfp）的PCR扩增实验步骤为：取0.2ml的离心管，分别加入下列试剂：10×PCRBuffer5μL，dNTPsMixture(100mmol/L)4μL，gfp-FPrimer(20μmol/L)1μL，gfp-RPrimer(20μmol/L)1μL，DNA模板（所提取的稻曲菌基因组DNA分别用灭菌的双蒸水稀释200倍后作为PCR反应的模板）1μL，TaqDNA聚合酶1μL，补加灭菌的双蒸水到50μL。

PCR扩增反应条件为：94℃预热变性5min，然后进入循环阶段，94℃热变性30s，54℃复性30s，72℃延伸1min，进行30个循环，最后72℃延伸10min。反应结束后，取5μL产物进行1.0%琼脂糖凝胶电泳检测。结果见图3所示，所提取的稻曲菌转化子基因组DNA，利用gfp引物gfp-F和gfp-R扩增得到的PCR产物条带清晰，大小均在700bp左右，符合预期的片段大小。经凝胶电泳及测序分析，表明绿色荧光蛋白(gfp)基因已经转入稻曲菌中。

表2扩增gfp基因的引物序列

实施例2稻曲菌对潮霉素B的敏感性检测

在PSA固体培养基中加入潮霉素B，使潮霉素B的终浓度为100μg/ml。分别将野生型稻曲菌SX02-01、实施例1方法获得的转化子（即含有质粒pCAMBIA1300-TrpC-GFP的稻曲菌SX0201），用直径5mm的打孔器在菌落边缘打取菌丝块，然后将菌丝块接种到上述含有潮霉素B的PSA固体培养基上，26℃下培养8d。结果见图1和图2所示。结果表明，野生型稻曲菌SX02-01因为不含有潮霉素基因，无法在含有潮霉素B抗生素的培养基上生长，而实施例1方法获得的转化子（即含有潮霉素B基因的稻曲菌SX02-01）因为转入了潮霉素基因能够在含有潮霉素B（终浓度为100μg/mL）抗生素的培养基上生长。

PSA固体培养基终浓度组成为：马铃薯200g/L、蔗糖20g/L、琼脂20g/L，溶剂为水，pH7.0。PSA液体培养基终浓度组成为：马铃薯200g/L、蔗糖20g/L，溶剂为水，pH7.0。

为了确定野生型稻曲菌SX02-01是否自身具有潮霉素的抗性，进行了野生型稻曲菌潮霉素浓度筛选：在超净工作台，接种野生型稻曲菌SX02-01于50mlPSA液体培养基中，26℃、200rpm、黑暗培养36h，取菌丝研磨碎后加无菌水配成悬浮液，取10μl悬浮液涂布在含潮霉素B的PSA固体培养基平板上，潮霉素B的终浓度为50μg/ml，26℃下培养8d后观察其生长状况，同样条件下将潮霉素B的终浓度改为30μg/ml进行比较。结果表明，野生型稻曲菌在不含潮霉素的培养基生长良好，在含有30μg/ml的培养基中生长明显受抑制，野生型稻曲菌SX02-01在含50μg/ml潮霉素B的PSA固体培养基上就不能生长。为了排除个别稻曲菌有一定潮霉素抗性的情况，在农杆菌转化实验中加大潮霉素的用量。因此，确定潮霉素筛选转化子浓度为100μg/ml。

实施例3金属离子激活剂对农杆菌转化效果的影响

将实施例1步骤（2）中改良AIM培养液中CoCl₂·6H₂O的终浓度改成50、100、150mg/L，以不含钴离子的改良AIM培养液为对照，共培养温度为22℃，培养时间为40h，其他操作同实施例1（转化、预诱导、共培养、选择培养、复筛及PCR检测），结果见表3所示，金属钴离子对转化有明显的促进作用，其中钴离子浓度为100mg/L的转化率最大，可以达到90.57%。

表3农杆菌添加金属离子激活剂的转化效果

转化率=阳性菌/总菌数×100%

实施例4共培养温度对转化率的影响

将实施例1步骤（3）中共培养温度改为20℃、22℃和24℃，其他操作同实施例1，转化率为80.12%，88.76%，83.23%。

实施例5稻曲菌孢子液浓度对转化率的影响

将实施例1步骤（3）中稻曲菌SX0201孢子液的浓度10⁵个/mL、10⁶个/mL、10⁷个/mL，其他操作同实施例1，转化率为81.52%，88.61%，83.20%。

实施例6不同种类稻曲菌遗传转化效果

将实施例1步骤（3）共培养过程中的稻曲菌SX02-01菌株分别用稻曲菌ZJ02-02菌株（由浙江大学生物技术研究所提供）和稻曲菌SY04菌株（由浙江大学生物技术研究所提供）替换，共培养温度22℃，时间为40h，采用实施例1中PCR方法进行检测潮霉素磷酸转移酶基因（hpt）和绿色荧光蛋白基因（gfp），其他操作同实施例1，结果见表4所示。说明稻曲菌SX02-01，稻曲菌ZJ02-02，稻曲菌SY04均取得较好的转化结果，其中稻曲菌SX02-01的转化率最高，达到91.20%。

表4三种稻曲菌菌种使用该法转基因效果

稻曲菌	总菌数	阳性菌（PCR检测）	转化率
				稻曲菌SX02-01	500	456	91.20%
稻曲菌ZJ02-02	650	542	83.38%
				稻曲菌SY04	610	510	83.61%

转化率=阳性菌/总菌数×100%

实施例7稻曲菌SX02-01在不同膜上培养转化效果

将实施例1步骤（3）共培养过程中，改良AIM固体培养基平板上的膜分别用普通滤纸（定性滤纸）和硝酸纤维素膜（NC，孔径0.45μm）替代，以不铺膜作为对照，共培养温度22℃，时间为40h，采用实施例1中PCR方法进行检测潮霉素磷酸转移酶基因（hpt）和绿色荧光蛋白基因（gfp），其他操作同实施例1，结果见表5所示。结果表明，如果培养基上不铺膜，转化率仅有37%，而使用PVDF膜转化率大大高于使用普通滤纸和硝酸纤维素膜，使用PVDF膜转化率达到91.35%。

表5稻曲菌SX02-01在不同膜上培养转化效果

膜的种类	总菌数	阳性菌（PCR检测）	转化率
				无膜	300	171	37.00%
普通滤纸	340	240	70.59%
				硝酸纤维素膜	450	380	84.44%
PVDF膜	520	475	91.35%

转化率=阳性菌/总菌数×100%

本发明以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims

1.一种农杆菌介导遗传转化稻曲菌的方法，其特征在于所述方法按如下步骤进行：（1）质粒转化农杆菌：将构巢曲霉启动子和标记基因重组到带有潮霉素B基因的质粒中获得重组质粒，然后用重组质粒转化农杆菌，获得含有潮霉素B基因和标记基因的农杆菌；所述农杆菌为农杆菌AGL-1；（2）预诱导：将含有潮霉素B基因和标记基因的农杆菌接种至含有卡那霉素和利福平的LB液体培养基中，28℃、150rpm、黑暗条件下培养至OD₆₀₀为0.5~0.8，取培养液离心，将沉淀用改良AIM培养液洗涤后再用含有终浓度150~250μmol/L乙酰丁香酮的改良AIM培养液稀释至OD₆₀₀为0.1~0.3，在28℃、150rpm、黑暗条件下诱导培养至OD₆₀₀为0.3~0.5，获得预诱导后的农杆菌菌液；所述改良AIM培养液终浓度组成为：8~12mg/LCaCl₂ ^.2H₂O、0.8~1.2mg/LFeSO₄、400~600mg/LNH₄NO₃、体积浓度0.4~0.6%glycerol、30~50mmol/LMES、0.5~0.7g/LMgSO₄ ^.7H₂O、0.2~0.4g/LNaCl、1.8~2.2g/L葡萄糖、50~150mg/LZnSO₄ ^.7H₂O、50~150mg/LCuSO₄ ^.5H₂O、50~150mg/LH₃BO₃，50~150mg/LNa₂MoO₄ ^.2H₂O和50~150mg/LCoCl₂ ^.6H₂O，溶剂为0.01M磷酸缓冲液，pH4.8；（3）共培养：将稻曲菌接种在PSA液体培养基中，24~28℃培养至OD₆₀₀为0.7~1.0，将培养液用纱布过滤，滤液离心，沉淀加入PSA液体培养基，获得稻曲菌孢子液，然后将稻曲菌孢子液与步骤（2）获得的预诱导后的农杆菌菌液以体积比1：1混合制成混合菌液，将混合菌液均匀涂布于表面铺有PVDF膜的含乙酰丁香酮的改良AIM固体培养基平板上，黑暗条件下于20~24℃共培养36~48h，再将共培养后的PVDF膜剪成小片并铺在改良的选择培养基CM上26℃培养4~5d，获得含有潮霉素B基因的稻曲菌；所述含乙酰丁香酮的改良AIM固体培养基终浓度组成为：8~12mg/LCaCl₂ ^.2H₂O、0.8~1.2mg/LFeSO₄、400~600mg/LNH₄NO₃、体积浓度0.4~0.6%glycerol、30~50mmol/LMES、0.5~0.7g/LMgSO₄ ^.7H₂O、0.2~0.4g/LNaCl、1.8~2.2g/L葡萄糖、50~150mg/LZnSO₄ ^.7H₂O、50~150mg/LCuSO₄ ^.5H₂O、50~150mg/LH₃BO₃，50~150mg/LNa₂MoO₄ ^.2H₂O和50~150mg/LCoCl₂·6H₂O、150~250μmol/L乙酰丁香酮和13~18g/L琼脂，溶剂为0.01M磷酸缓冲液，pH7.0；所述改良的选择培养基CM终浓度组成为：马铃薯200g/L、蔗糖20g/L、琼脂20g/L、100μg/mL潮霉素B、400μg/mL头孢霉素、60μg/mL链霉素、100μg/mL卡那霉素，溶剂为水，pH7.0。

2.如权利要求1所述农杆菌介导遗传转化稻曲菌的方法，其特征在于步骤（1）所述转化方法为：将农杆菌单菌落接种在含有终浓度50μg/ml利福平的LB固体培养基上，27~29℃培养至浅黄色菌落出现，挑取单菌落转接到含有终浓度50μg/ml利福平的LB液体培养基中，在27~29℃、150rpm、黑暗条件下培养至OD₆₀₀为0.8~1.0，取培养液加入新鲜的含有终浓度50μg/ml利福平的LB液体培养基中，27~29℃、150rpm、黑暗条件下振荡培养至OD₆₀₀为0.5~0.8，然后冰浴10~15min后于10000rpm条件下离心30~60s；弃上清液，冰浴条件下，将沉淀用灭菌的20mmol/LCaCl₂水溶液悬浮后加入1/10倍体积的0.8~1.0μg/ml含有潮霉素B基因和标记基因的重组质粒，混匀，置于液氮中冷冻3~5min后于37℃水浴中解冻，再加入5~8倍体积的LB液体培养基，于28℃、150rpm、黑暗条件下振荡培养至OD₆₀₀为0.3~0.5；离心，去除四分之三体积的上清液，剩余上清液与沉淀悬浮混匀成悬浮液，取悬浮液均匀涂布在含终浓度100μg/mL卡那霉素和终浓度50μg/mL利福平的LB固体培养基上，待菌液被完全吸收后倒置，28℃培养2~4d，获得含有潮霉素B基因和标记基因的农杆菌菌株；所述含有潮霉素B基因和标记基因的重组质粒是将构巢曲霉启动子和标记基因重组到带有潮霉素B基因的质粒中而获得的，所述LB固体培养基终浓度组成为：胰蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、氯化钠10g/L、琼脂1.5g/L，溶剂为水，pH7.0；所述LB液体培养基终浓度组成为：胰蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、氯化钠10g/L、溶剂为水，pH7.0。

3.如权利要求1所述农杆菌介导遗传转化稻曲菌的方法，其特征在于步骤（2）所述LB液体培养基中卡那霉素终浓度为100μg/mL，利福平终浓度为50μg/mL。

4.如权利要求1所述农杆菌介导遗传转化稻曲菌的方法，其特征在于步骤（2）所述改良AIM培养液中CoCl₂·6H₂O终浓度为100mg/L。

5.如权利要求1所述农杆菌介导遗传转化稻曲菌的方法，其特征在于步骤（2）所述乙酰丁香酮的终浓度为200μmol/L。

6.如权利要求1所述农杆菌介导遗传转化稻曲菌的方法，其特征在于步骤（3）所述稻曲菌孢子液的浓度为10⁵~10⁷个/mL。

7.如权利要求1所述农杆菌介导遗传转化稻曲菌的方法，其特征在于所述PVDF膜孔径为0.45μm。

8.如权利要求1所述农杆菌介导遗传转化稻曲菌的方法，其特征在于步骤（3）所述稻曲菌为稻曲菌SX02-01、稻曲菌ZJ02-02或稻曲菌SY04。