CN103088047A

CN103088047A - 一种由根癌农杆菌介导的丝状真菌基因rna干扰方法

Info

Publication number: CN103088047A
Application number: CN2013100478432A
Authority: CN
Inventors: 张振颖; 侯彬彬; 刘晓明
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2013-02-05
Filing date: 2013-02-05
Publication date: 2013-05-08
Anticipated expiration: 2033-02-05
Also published as: CN103088047B

Abstract

本发明公开一种根癌农杆菌介导的适于多种丝状真菌基因研究用的RNA干扰方法，其通过基因重组及干扰体系筛选的方法获得了适于根癌农杆菌转染的重组载体PCB309-pfgrt，并且优化了根癌农杆菌的转化体系。本发明解决了丝状真菌RNA干扰载体构建困难及干扰效率低下的问题。在丝状真菌基因功能及遗传转化方面具有广泛的应用前景。

Description

一种由根癌农杆菌介导的丝状真菌基因RNA干扰方法

技术领域

本发明属于RNA干扰技术领域。具体涉及一种重组载体PCB309-pfgrt、用于转染的根癌农杆菌，以及由根癌农杆菌介导的丝状真菌基因RNA干扰方法。

背景技术

RNA干扰是真核生物中相对保守的基因沉默机制，它通过内源或外源双链RNA介导细胞内mRNA发生特异性降解或翻译的抑制，从而导致靶基因的表达沉默，并产生相应的功能表型缺失。1992年，Macino首次在粗糙脉胞菌中发现真菌中存在RNAi的现象后，RNAi技术渐成为一种对真菌进行遗传改造的新手段。在丝状真菌中RNAi技术具有特殊的优势：不受丝状真菌的多核现象、异核现象和非同源重组频率高的干扰，特别是当需要使多个基因的表达同时下调时，使用RNA干扰比基因敲除更加方便。然而，真正将RNAi技术用在丝状真菌的各项研究时还存在很多问题：真菌细胞多为多倍体，细胞壁含有较多的多糖及多糖蛋白等成分，使得RNA沉默的效果并不如在原生、动物细胞中理想，存在干扰效率低下、有脱靶效应等缺陷。因此选择恰当的遗传转化方法并制备合适的转染载体，可以更高效的导入siRNA，保证导入siRNA的稳定性，有效延长RNAi的作用时间，进而大大提高靶基因抑制效率，更好的对丝状真菌进行基因改造。

目前存在的遗传转化方法众多：CaCl₂/聚乙二醇法，醋酸锂转化法，电穿孔转化法，粒子轰击法和根癌农杆菌转化法。与其他方法相比，在丝状真菌的研究中根癌农杆菌转化法具有如下优势：①不需制备原生质体，各种类型的完整细胞（如分生孢子，菌丝体，子实体）均可作为转化受体。②产生的突变子大多数为单拷贝插入，其标签基因的分离更容易。③插入随机性更好，亦能用于同源重组。由此可见，根癌农杆菌介导的真菌遗传转化方法不失为真菌遗传学研究领域的一种重要手段，而构建适于农杆菌介导的、能够转染丝状真菌的干扰载体尤为必要。常用的植物双元表达载体都比较大，多数在10kb以上。做载体构建时操作困难，转化效率低，而且可用的单一酶切位点很少。本发明对现有的植物双元表达载体进行改造，而改造后的载体只有3.5Kb，并加入了多克隆位点，从而适于真菌基因的干扰沉默研究中。另外，目前文献报道干扰载体的适用范围多较局限，为种属特异性，仅适于皮肤癣菌属/青霉菌属/曲霉菌属，大大限制了其应用范围。本发明将改造后的载体加入了真菌通用启动子Ptrpc、间隔序列和终止子Ttrpc，并引入了潮霉素抗性基因，使其在间隔序列两侧加上目的基因的正反向干扰序列后即可广泛用在多种真菌基因干扰的研究中。现存的很多真菌基因干扰方法存在转化效率低，稳定性差等缺点，本发明使用根癌农杆菌的转化体系，并对转化体系中诱导剂的种类和浓度，培养时间，培养温度，根癌农杆菌与受体菌浓度之比等条件参数进行优化，提高了转化效率，保证了导入siRNA的稳定性，明显提高了吧基因的抑制效率。

发明内容

本发明提供了一种由根癌农杆菌介导的适于多种丝状真菌基因研究用的RNA干扰方法，具体如下：干扰载体构建，包括干扰载体的序列特征，目的基因正反相干扰序列替换的位置，载体构建的具体条件；根癌农杆菌转化体系中供体菌与受体菌浓度之比，培养温度，培养时间，诱导剂种类和浓度等条件参数。

为有效提高RNAi技术对丝状真菌靶基因的抑制效率，本发明采用的技术方案内容有：

（一）对于重组载体PCB309-pfgrt：

本发明涉及的重组载体PCB309-pfgrt，其碱基序列为SEQ ID NO.21。

本发明的另外一方面在于，提供一种转染重组载体PCB309-pfgrt的根癌农杆菌。

对于上文所述的转染重组载体PCB309-pfgrt的根癌农杆菌，较优的情况下，根癌农杆菌为根癌农杆菌EHA105。

对于上文所述的转染重组载体PCB309-pfgrt的根癌农杆菌，其制备方法包括：

(a)将重组载体PCB309-pfgrt采用电击的方法转化根癌农杆菌EHA105感受态细胞；再用含有抗生素Kan50mg/ml和利福平25mg/的LB培养基筛选阳性克隆；

(b)用引物SEQ ID NO.9和10对步骤（a）筛选的阳性克隆进行PCR鉴定。

对于上文所述的转染重组载体PCB309-pfgrt的根癌农杆菌，其步骤（b）中所述的PCR鉴定条件为：94℃预变性1min；94℃变性30sec，55℃退火45sec，72℃延伸2min，30个循环；72℃10min。

对于上文所构建的适于根癌农杆菌转染用的重组载体PCB309-pfgrt，其特征为：导入了真菌通用启动子PtrpC、终止子TtrpC、发夹结构gus基因、潮霉素抗性基因Hypr。具体技术方案包括中间载体PCB301、PCB309、PUC-pgt、PUC-pfgrt、PCB309-pfgrt的构建，实施例中有具体的实施方法，此处概括为：

a.PCB301的构建：扩增RK2复制区和nptⅡ后，再以其扩增产物为模版扩增RK2复制区和nptⅡ去除isl非必须区；扩增T-DNA的全部区域与PCB299相连得到环形质粒PCB300后再以PCB300为模版扩增T-DNA的边界序列和PCB的序列，并与pBlueScriptⅡ的多克隆位点（MCS）相连，得到PCB301。

b.PCB309的构建：扩增Ptrp启动子，潮霉素抗性基因Hypr，Ttrpc终止子，与PCB301相连，得到PCB309。

c.PUC-pgt的构建：扩增Ptrp启动子，间隔序列gus，Ttrpc终止子得到片段与SimpleT载体相连。

d.PUC-pfgrt的构建：扩增干扰基因的正反向干扰序列，酶切纯化与PUC-pgt相连。

e.PCB309-pfgrt的构建：PCB309与PUC-pfgrt酶切产物相连即是。

本发明的另一方面，在于提供一种丝状真菌基因RNA干扰方法，其包括以下步骤：

①如权利要求3所述的转染重组载体PCB309-pfgrt的根癌农杆菌与真菌细胞混合后，涂布于含200μmol/L的乙酰丁香酮的诱导培养基平板，25℃避光培养48h；

②将步骤①获得的菌落转移到筛选培养基平板（诱导培养基平板中加入100mg/L潮霉素，200uM头孢噻肟钠）上培养4天，收集生长的阳性菌落接种于沙氏培养基，4℃保存；

其中，所述的诱导培养基平板为：琼脂15g/L,K-缓冲液8ml/L,Mn缓冲液20ml/L,1%CaCl₂.2H₂O1ml/L,0.01%FeSO₄10ml/L,微量元素5ml/L，20%NH₄NO₃2.5ml/L,50%甘油10ml/L1M MES40ml/L，20%葡萄糖10ml/L。

对于上文丝状真菌基因RNA干扰方法中，所述的真菌细胞为丝状真菌。

对于上文丝状真菌基因RNA干扰方法中，所述的丝状真菌为申克孢子丝菌或犬小孢子菌。

（二）对于上文所述的优化根癌农杆菌的转化体系：

根癌农杆菌介导的丝状真菌的遗传转化体系中，选用合适浓度的潮霉素对突变体的选择至关重要。本发明实施例中证明了，以申克孢子丝菌为例，潮霉素最佳浓度为100μg/ml。

本发明实施例中证明了，农杆菌悬液培养时，诱导培养基中添加200μmol/AS，在筛选培养基上可获得潮霉素抗性菌落，不添加乙酰丁香酮（AS）,则无菌落出现，表明农杆菌培养时，添加AS诱导vir基因的表达，对T-DNA插入到丝状真菌中至关重要的。

农杆菌转化宿主，共培养的时间十分重要：共培养的时间过短，转化子少；共培养的时间过长，非转化子背景过重，不利于后期筛选，本发明实施例中证明了48h为最佳共培养时间。

扩增Ptrpc启动子、潮霉素抗性基因Hypr和Ttrpc终止子的序列，得到片段长度约1.8kb。

本发明实现了对常见双相致病菌孢子丝菌双组份信号传导通路中组氨酸蛋白激酶DRK1基因的有效修饰，明显下调了该基因的表达水平，抑制了孢子丝菌由菌丝相向酵母相的转化，降低了孢子丝菌菌株的致病性；还实现了对常见浅部致病菌犬小孢子菌PQ-LRP基因的有效修饰，明显下调了该基因的表达水平。

本发明的实施例中最终确定：1ml OD₆₀₀nm为0.6-0.8的根癌农杆菌细胞与1ml浓度为5×10⁶个/ml真菌细胞（孢子、分生孢子、菌丝体等）混合共培养48小时后，混合物涂布于含100μg/ml潮霉素、200μmol/L的乙酰丁香酮（AS）的诱导培养基琼脂平板上，25℃避光培养96h，传代5次，获得稳定表达的转化子。

本发明的创新特征是：

（1）应用范围：可广泛的用在多种丝状真菌基因的RNAi研究中。

（2）应用前景：该方法操作简便、转化效率高、转化子稳定，具有很好的应用前景。

（3）成为基因功能分析的工具（有可能设计出RNAi芯片，高通量的筛选药物靶基因，了解基因功能）；有用于疾病治疗的前景（抗病毒感染方面，基因治疗和抗肿瘤方面，寄生虫基因功能研究和抗寄生虫药物方面，自身免疫疾病方面）；新型药物的研究及临床应用，生物医学研究等。

附图说明

图1：重组载体pCB289酶切鉴定图；其中，1为marker:DL4500；2为4566bp的PCB289酶切产物；

图2：重组载体pCB299酶切鉴定图；其中，1为marker:DL4500；2为3166bp的pCB299酶切产物；

图3：重组载体pCB300酶切鉴定图；其中，1为marker:DL4500；2为6373bp的pCB300PCR产物;

图4：重组载体pCB309酶切鉴定图；其中，1为marker:DL4500；2为5474bp的pCB309酶切产物；

图5：重组载体pUC-pgt PCR鉴定图；其中，1为marker:DL4500；2为2200bp的PUC-pgtPCR产物;

图6：重组载体pUC-pfgt PCR鉴定图（f为孢子丝菌DRK1基因的正反向干扰序列）；其中，1为marker:DL4500；2为pUC-pfgt PCR产物；

图7：重组载体PUC-pfgrt酶切鉴定图（f、g为孢子丝菌DRK1基因的正反向干扰序列）；如其中，1为marker:DL4500；2为3400bp的PUC-pfgrt酶切产物；

图8：重组载体pCB309-pfgrt酶切鉴定图（f、g为孢子丝菌DRK1基因的正反向干扰序列；其中，1为marker:DL2000；2为pCB309-pfgrt酶切产物；

图9：孢子丝菌菌株在干扰前后的生长情况。（由左至右依次为：1标准株，2空转株，3干扰株，均为25℃），干扰株生长缓慢，黑色素产量明显减少。

具体实施方式

本发明实施例中用到了基因工程相关的实验技术，其操作步骤均为本领域技术人员的共知常识，因此在实施例1~2中涉及下述实验的步骤均概括描述，例如：

1．感受态细胞的制备：具体实验步骤参考《分子克隆实验指南》（第三版）。

2.转化感受态细胞：具体实验步骤参考《分子克隆实验指南》（第三版）。

3.酶切方法：限制性内切酶的使用量、缓冲液选择及酶切体系等参数，参考大连Takara公司附带的使用说明书；

4.提取质粒方法：参考质粒提取试剂盒附带的说明书（天根生化科技有限公司）

5.纯化PCR产物的方法：参考DNA纯化回收试剂盒附带的说明书（天根生化科技有限公司）

6.PCR产物与载体片段的连接：DNA连接酶，Taq酶的使用方法，参考大连Takara公司附带的使用说明书。

另外，本发明涉及的部分仪器及试剂信息如下：

实验菌株：大肠杆菌DH5α，根癌农杆菌（EHA105），申克氏孢子丝菌ATCC10268为实验室保存菌种，均可由常规的商业途径获得

实验试剂：质粒pBI121和pBlueScriptII获赠于大连理工大学生命学院，pSilent-1购自于美国真菌遗传资源中心(Fungal Genetics Stock Center)；XbaI，XhoI，SpeI，Sac I，KpnI，BglII，HindIII等限制性内切酶，T4DNA连接酶，Taq酶；T载体，DNA分子量Marker（Marker III）（购自大连Takara公司），质粒提取试剂盒，DNA纯化回收试剂盒（天根生化科技有限公司），LB液体/固体培养基（购自大连博诺公司）。

实验所用引物均由大连Takara公司合成：

表1.引物序列表

名称	序列（5’--3’）	SEQ ID NO
			PCB298-F	gctctagacc gggctggttg ccctcg	1
PCB298-R	gctctagagt aaagcgctgg ctgctgaac	2
			PCB299-F	cgctcgagcg ggccgggagg gtt	3
PCB299-R	tcctcgagtg gcagcatcac ccataat	4
			PCB300-F	ggccactagt tctggggaac cctgt	5
PCB300-R	ggactagtgg actgatgggc tgcctgtat	6
			PCB301-F	tgggtaccaa aaccacccca gtacta	7
PCB301-R	tcgagctcag attgtcgttt ccc	8
			HPH-F	cggggtaccg acgttaactg atattgaagg agc	9
HPH-R	cccaagctta acccaggggc tggtgac	10
			PUT-F	ggactagtga attcatgcca gttgttcc	11
PUT-R	cgagctcgga tcctctagaa agaaggatta c	12
			DRK1-F	cggggtaccc tcgaggatca accagatggt gtacaacc	13
DRK1-R	gaagatctaa gcttcgggat accgataccc gtgt	14

实验仪器：

DHP-9052型电热恒温培养箱（上海-恒科技有限公司）；

台式高速冷冻离心机Centrifuge5804（艾本德中国有限公司）；

台式高速离心机（无锡市瑞江分析仪器有限公司；型号：RJ-TGL-16G）；

CA-1390洁净工作台（上海上净净化设备有限公司）；电泳仪（北京六厂DYY-III2型稳压稳流电泳仪）；HWS12型电热恒温水浴锅（上海-恒科技有限公司）；DHG-914OA型电热恒温鼓风干燥箱（上海-恒科技有限公司）。

下述实施例中使用的PCR方法为本领域技术人员的共知常识；酶切反应体系依照说明书提示完成。基因片段和质粒的连接反应体系中使用的聚合酶、缓冲液如无特殊说明均有常规途径获得，或常规方法使用。

实施例1PCB309的构建

1.构建pCB298：以pBI121为模板，用引物PCB298-F和PCB298-R扩增RK2复制区和nptⅡ,长4566bp。反应条件为94℃预变性1min；94℃变性30sec，55℃退火45sec，72℃延伸4min，30个循环；72℃10min。PCR片段纯化回收，用XbaI单酶切，酶切后再纯化回收。酶切后的纯化片段进行连接，将单片段连接为环形质粒。连接产物转化到大肠杆菌DH5α，挑取单菌落，提质粒，XbaI单酶切验证。

重组载体pCB289酶切鉴定图如图1：其中，1为marker:DL4500；2为4566bp的PCB289酶切产物；酶切产物与预期结果一致，证明获得阳性克隆菌株。

PCR反应体系如下：

酶切体系：

酶切温度：37℃，时间：3h。

连接体系：

连接温度：22℃，时间：2h。

2.构建pCB299：以pCB298为模板，用引物PCB299-F和PCB299-R扩增RK2复制区和nptⅡ去除is1非必须区，得到片段长度3166bp。反应条件为94℃预变性1min；94℃变性30sec，55℃退火45sec，72℃延伸2min，30个循环；72℃10min。将PCR片段纯化回收，用XhoI单酶切，酶切后再纯化回收。酶切后的纯化片段进行连接，将单片段连接为环形质粒。将连接产物转化到大肠杆菌DH5α，挑取单菌落，提质粒，用XhoI酶切验证。

重组载体pCB299酶切鉴定图如图2：其中，1为marker:DL4500；2为3166bp的pCB299酶切产物；酶切产物与预期结果一致，证明获得阳性克隆菌株。

PCR反应体系：

酶切体系：

酶切温度：37℃，时间：3h。

连接体系：

连接温度：22℃，时间：2h。

3.构建pCB300：以pBI121为模板，用引物PCB300-F和PCB300-R扩增pBI121的T-DNA全部区域，得到片段长度6373bp。反应条件为94℃预变性1min；94℃变性30sec，55℃退火45sec，72℃延伸6min，30个循环；72℃10min。将PCR片段纯化回收，用SpeI单酶切；将pCB299用XbaI单酶切。酶切后再分别纯化回收。酶切后的纯化PCR片段与pCB299进行连接，连接为环形质粒。将连接产物转化到大肠杆菌DH5α，挑取单菌落，提质粒，用引物PCB298-F和PCB298-R鉴定，获得预期扩增片段，证明获得阳性克隆菌株，如图3所示。

PCR反应体系

酶切体系

酶切温度：37℃，时间：3h。

连接体系：

连接温度：22℃，时间：2h。

4.构建pCB301：以pCB300为模板，用引物PCB301-F和PCB301-R扩增T-DNA边界序列和pCB300的序列，得到片段长度3400bp。反应条件为94℃预变性1min；94℃变性30sec，55℃退火45sec，72℃延伸3min，30个循环；72℃10min。将PCR片段纯化回收，用Sac I和KpnI双酶切；将pBlueScriptII用Sac I和KpnI双酶切。酶切后再分别纯化回收。酶切后的纯化PCR片段与pBlueScriptII切下来的多克隆位点（MCS）进行连接，连接为环形质粒得到pCB301。将连接产物转化到大肠杆菌DH5α，挑取单菌落，提质粒，测序验证。获得3400bp的预期产物，证明获得阳性克隆菌株，测序结果如SEQ ID NO.15。

PCR反应体系如下：

酶切体系：

酶切温度：37℃，时间：3h。

连接体系：

连接温度：22℃，时间：2h。

5.构建pCB309：以pSilent-1质粒为模板，用引物HPH-F和HPH-R扩增Ptrpc启动子、潮霉素抗性基因和Ttrpc终止子的序列，得到片段长度约1.8kb。反应条件为94℃预变性1min；94℃变性30sec，55℃退火45sec，72℃延伸2min，30个循环；72℃10min。将PCR片段纯化回收，用KpnI和HindIII双酶切；将pCB301用KpnI和HindIII双酶切。酶切后再分别纯化回收。将酶切后的纯化PCR片段与酶切后纯化的pCB301载体进行连接，连接为环形质粒得到pCB309。将连接产物转化到大肠杆菌DH5α，挑取单菌落，提质粒，KpnI和HindIII双酶切验证。

重组载体pCB309酶切鉴定图如图4：其中，1为marker:DL4500；2为5474bp的pCB309酶切产物；酶切产物与预期结果一致，证明获得阳性克隆菌株。

PCR反应体系

酶切体系

酶切温度：37℃，时间：3h。

连接体系：

连接温度：22℃，时间：2h。

实施例2.RNA干扰载体pCB309-pfgrt的构建

1.pUC-pgt的构建

以pSilent-1质粒为模板，用引物PUT-F和PUT-R扩增Ptrpc启动子、Gus间隔序列和Ttrpc终止子的序列，得到片段长度约2.2kb。反应条件为94℃预变性1min；94℃变性30sec，55℃退火45sec，72℃延伸3min，30个循环；72℃10min。将纯化后的PCR片段与Simple T载体进行连接，连接为环形质粒得到pUC-pgt。将连接产物转化到大肠杆菌DH5α，挑取单菌落，提质粒，用引物PUT-F和PUT-R进行PCR验证，将阳性克隆命名为重组载体pUC-pgt。

重组载体pUC-pgt PCR鉴定图；图5：其中，1为marker:DL4500；2为2200bp的PUC-pgtPCR产物;产物与预期结果一致，证明获得阳性克隆菌株。

PCR反应体系

连接体系：

连接温度：22℃，时间：2h。

2.pUC-pfgt的构建

(a)孢子丝菌cDNA的提取：参照分子克隆实验指南的实验方法，提取孢子丝菌ATCC10268总RNA，反转录成cDNA。

(b)以孢子丝菌cDNA为模板，用引物DRK1-F和DRK1-R扩增DRK1基因的干扰序列，得到片段长度约600bp。反应条件为94℃预变性1min；94℃变性30sec，55℃退火45sec，72℃延伸30sec，30个循环；72℃10min。

PCR反应体系如下：

(c)将PCR片段纯化回收，用XhoI和HindIII双酶切；将pUC-pgt用XhoI和HindIII双酶切。酶切后再分别纯化回收。酶切温度：37℃，时间：3h。

酶切体系：

(d)将酶切后的纯化PCR片段与酶切后纯化的pUC-pgt载体进行连接，连接为环形质粒得到pUC-pfgt。连接温度：22℃，时间：2h。

连接体系：

(e)将连接产物转化到大肠杆菌DH5α，挑取单菌落，提质粒，PCR验证（图6）。

3.pUC-pfgrt的构建：

(a)以申克氏孢子丝菌ATCC10268cDNA为模板，用引物DRK1-F和DRK1-R扩增DRK1基因的干扰序列，得到片段长度约600bp。反应条件为94℃预变性1min；94℃变性30sec，55℃退火45sec，72℃延伸30sec，30个循环；72℃10min。

PCR反应体系如下：

(b)将PCR片段纯化回收，用BglII和KpnI双酶切；将pUC-pfgt用BglII和KpnI双酶切,37℃，3h。酶切后再分别纯化回收。

酶切体系：

(c)将酶切后的纯化PCR片段与酶切后纯化的pUC-pfgt载体进行连接，连接为环形质粒得到pUC-pfgrt。连接温度：22℃，时间：2h。

连接体系：

(d)将连接产物转化到大肠杆菌DH5α，挑取单菌落，提质粒，XhoI单酶切验证。

重组载体PUC-pfgrt酶切鉴定图（f、g为孢子丝菌DRK1基因的正反向干扰序列）；如图7：其中，1为marker:DL4500；2为3400bp PUC-pfgrt酶切产物；酶切产物与预期结果一致，证明获得阳性克隆菌株。

3.pCB309-pfgrt的构建

(a)将pUC-pfgrt和pCB309分别用SpeI和SacI双酶切,酶切温度：37℃，时间：3h。酶切后再分别纯化回收。

酶切体系：

(b)将从pUC-pfgrt酶切并纯化的pfgrt片段(3.4kb)与酶切后纯化的pCB-309载体进行连接，连接为环形质粒得到pCB309-pfgrt。连接温度：22℃，时间：2h。

连接体系：

(c)将连接产物转化到大肠杆菌DH5α，挑取单菌落，提质粒，SpeI和SacI双酶切验证。重组载体pCB309-pfgrt酶切鉴定图（f、g为孢子丝菌DRK1基因的正反向干扰序列）；如图8：其中，1为marker:DL2000；2为pCB309-pfgrt酶切产物）；酶切产物与预期结果一致，证明获得阳性克隆菌株。酶切产物纯化回收测序结果如SEQ ID NO.20。

(d)重组载体pCB309-pfgrt的完整测序结果如SEQ ID NO.21。

实施例3转化根癌农杆菌

由根癌农杆菌介导，以重组载体PCB309-pfgrt对孢子丝菌的组氨酸激酶DRK1进行基因干扰。

1.根癌农杆菌感受态细胞的制备：

(a)由冰箱保存的菌种EHA105划板以备挑单菌落SOB或LB固体平板，不加抗生素，常规3~4区划板。

(b)接种感受态细胞：用灭菌牙签挑一个单菌落1~2mlSOB液体培养基中（利福平50μg/ml,用无菌镊子夹住一根牙签，挑一个单菌落连牙签一起放入摇菌管中）。注：SOB放入MgCl2,在400mlSOB中加入2mol/l的MgCl₂2ml,摇匀，再抽出几毫升备用。

(c)将接菌后的试管于28℃，300r/min,培养6h,然后导入20mlSOB液体培养基中（三角瓶装，纱布封口，按约1:500的量转接），300r/min，37℃培养到3hr时，测一次OD600。

(d)之后每隔十分钟测一次，当OD值接近0.76时每隔2min测一次，至OD=0.76时，立刻将菌液置冰水浴中，不断摇动，随后在50ml离心管（预冷）中离心，4℃，2000g,10min，弃上清。用预冷的灭菌重蒸水洗：加少量水悬浮菌体（在冰水中振摇）再把水加满，轻摇混匀后离心2200g，10min,弃上清。

(e)再用预冷的10%甘油（V/V）以同样方法洗两次，离心2400g,10min,最后一次倒尽甘油，用残存在管壁的甘油悬浮细胞（冰水摇阵），用减去Tip的枪头，每100μl分装1个EP管，用-80℃的乙醇迅速冰冻（EP管要盖严，浸泡于-80℃的乙醇，以防乙醇进入，乙醇在-80℃呈液态）-80℃保存备用（5-50ml/管）。

2.以干扰质粒PCB309-pfgrt及空转质粒PCB309转化根癌农杆菌感受态细胞，挑选阳性克隆验证

(a)将质粒采用电击的方法转化根癌农杆菌，将感受态细胞和待转化的DNA于冰上操作，取待转化的质粒PCB309-pfgrt和PCB309各1μl混入感受态细胞中，混匀。

(b)吸取置于已经预冷的电击杯中，擦去电击杯外的冷凝水和蒸汽，推入电击仪中，电压为1.8V，在电击杯中加入1mlLB培养基，冲洗，使转化后的细胞与培养基充分混合，吸取入试管中，28℃培养活化1小时。

(c)将培养好的菌液加入EP管中离心，弃上清，用剩余的液体重悬菌体，全部涂到含有抗生素Kan的LB培养基中。（Kan50mg/ml,利福平25mg/ml）

(d)培养2天后挑取阳性克隆，提取PCB309-pfgrt质粒，验证。

用引物HPH-F和HPH-R扩增Ptrpc启动子、潮霉素抗性基因和Ttrpc终止子的序列，得到片段长度约1.8kb。反应条件为94℃预变性1min；94℃变性30sec，55℃退火45sec，72℃延伸2min，30个循环；72℃10min。

3.根癌农杆菌介导重组载体PCB309-pfgrt及PCB-309转染孢子丝菌

(a)申克氏孢子丝菌ATCC10268分生孢子的制备:（1）将申克氏孢子丝菌ATCC10268分生孢子接种于沙氏培养基，25℃培养5天，使其产生分生孢子；（2）在已产孢的沙氏培养基，用无菌牙签轻轻刮取孢子，加入1ml水，轻轻震荡，收集分生孢子；（3）使用血细胞计数板确定孢子浓度，并用诱导液体培养基稀释分生孢子，达到最终浓度为5×10⁶个/ml。

(b)确定申克氏孢子丝菌对潮霉素的敏感性:将申克氏孢子丝菌ATCC10268分生孢子（10⁴/ml,涂100μl）接种于含有（0，50，100，150，200，300μg/ml潮霉素）的沙氏培养基（蛋白胨10g/L,葡萄糖40g/L，琼脂15g/L）上，25℃培养5天，观察孢子萌发及生长状态，确定最佳使用浓度为100μg/ml。

(c)农杆菌细胞的制备:（1）将转化有PCB309-pfgrt及PCB-309的根癌农杆菌（EHA105）菌保分别接种于含有20μg/ml Rif（利福平）和100μg/ml Kan（卡那霉素）的LB液体培养基（蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠10g/L，琼脂15g/L）中，28℃震荡培养24小时；200rpm（2）将上述培养农杆菌细胞收集于1.5ml离心管，室温，2400g离心10min，弃上清；（3）用诱导液体培养基重悬细胞，室温，2400g离心10min，弃上清；（4）在100ml锥形瓶中，将农杆菌细胞重悬于15ml添加200μmol/LAS的诱导液体培养基，28℃震荡培养8小时；100rpm（5）用分光光度计在600nm处测量OD值，当OD₆₀₀nm为0.6-0.8时，用于转化。

(d)农杆菌与申克氏孢子丝菌共培养：（1）取1ml OD₆₀₀nm为0.6-0.8的步骤（c）制得的含有重组载体PCB309-pfgrt的根癌农杆菌（EHA105）细胞与1ml浓度为5×10⁶个/ml的步骤（b）制得的申克氏孢子丝菌混合后，分别涂布于加200μmol/AS和无AS的诱导培养基平板上，25℃避光培养24h,36h,48h,60h。

(e)筛选转化子：（1）将步骤（d）制得的共培养的含有农杆菌和分生孢子的菌落转移到筛选培养基平板（诱导培养基平板中加入100mg/L潮霉素，200uM头孢噻肟钠）上培养4天，收集生长的阳性菌落接种于沙氏培养基，4℃保存。（2）为了计算转化率，评价该方法的转化效率，取1ml含有5×10⁶个细胞的孢子丝菌菌悬液，接种至筛选培养基平板上培养4天，收集生长的菌落，测定细胞数为4.4×10⁶个，计算转化率，再将具有潮霉素抗性的申克氏孢子丝菌转种于沙氏培养基，4℃保存备用。

结果：计算转化率（4.4×10⁶/5×10⁶）88%。

(f)检测转化子的遗传稳定性：随机挑选不同批次的转化实验制得的20个阳性转化子，在无潮霉素的沙氏培养基上连续传代5次后，再转移至筛选培养基平板上，观察转化子是否仍具有潮霉素抗性，以确定转化子是否具有遗传稳定性。

结果：20个阳性转化子均见菌落生长，提示阳性转化子的遗传稳定性好。

上述步骤(a)和（c）中所述的诱导液体培养基为：K-缓冲液8ml/L,Mn缓冲液20ml/L,1%CaCl₂.2H₂O1ml/L,0.01%FeSO₄10ml/L,微量元素5ml/L，20%NH₄NO₃2.5ml/L,50%甘油10ml/L1M MES40ml/L，20%葡萄糖10ml/L。

上述步骤(d)和（e）中所述的诱导培养基平板为：琼脂15g/L,K-缓冲液8ml/L,Mn缓冲液20ml/L,1%CaCl₂.2H₂O1ml/L,0.01%FeSO₄10ml/L,微量元素5ml/L，20%NH₄NO₃2.5ml/L,50%甘油10ml/L1M MES40ml/L，20%葡萄糖10ml/L。

实施例4RT-PCR检测干扰效果

1.应用Real Time PCR方法对申克氏孢子丝菌DRK1组氨酸激酶基因mRNA相对表达量进行分析。

应用SYBR GreenⅠ荧光染料嵌合法，以转有PCB-309的孢子丝菌菌株（空转菌株）样品的总RNA反转录获得的cDNA作为标准品，分别对管家基因(18S)和目的基因(DRK1)制作标准曲线；然后再分别对转有PCB309-pfgrt孢子丝菌菌株（干扰菌株）及标准菌株ATCC10268（野生株）的管家基因(18S)和目的基因(DRK1)进行定量实验，通过管家基因的校正，对各样品中目的基因的相对表达量进行分析。

实时定量反应组成及反应条件

（1）基因组DNA去除反应

于42℃反应2min。

（2）RT反应

于37℃反应15min；于85℃反应5sec。

①Negative Control反应时加入RNase Free dH₂O。

②实际样品检测时，样品总RNA添加量为100ng，每样品做两个平行样。

（3）PCR反应

于95℃，30sec.；再于95℃5sec.、60℃30sec.共40循环；

RT-PCR反应所用引物序列如下：

表2.引物序列表

名称	序列（5’—3’）	SEQ ID NO
			18S-F	agcggaggga tcattacaga g	16
18S-R	cgccagaagc aacgagaa	17
			DRK1-F1	cgatgagtac gcgattgagt tt	18
DRK1-R1	cgcttggaaa tggaaagacc	19

表3.DRK1基因相对表达量结果

在表3中，样品1为空转菌株，样品2为干扰菌株，样品3为野生标准株。

结果如表3所示，本发明所述方法可以很好的实现对孢子丝菌DRK1基因进行干扰，干扰菌株的DRK1表达水平明显下调，其相对表达量仅为野生株的0.339倍。

另外，对比孢子丝菌菌株在干扰前后的生长情况：具体如图9，由左至右依次为1.标准野生株，2.空转菌株，3.干扰菌株。

从图中可以看出：与标准野生株及空转菌株相比较，干扰菌株的生长速度缓慢，黑色素产量明显减少。

Claims

1.一种重组载体PCB309-pfgrt，其碱基序列为SEQ ID NO.21。

2.如权利要求1所述的一种转染重组载体PCB309-pfgrt的根癌农杆菌。

3.如权利要求2所述的转染重组载体PCB309-pfgrt的根癌农杆菌，其特征在于，所述的根癌农杆菌为根癌农杆菌EHA105。

4.根据权利要求3所述的转染重组载体PCB309-pfgrt的根癌农杆菌，其特征在于，其通过以下方法制备：

5.根据权利要求4所述的转染重组载体PCB309-pfgrt的根癌农杆菌，其特征在于，所述的PCR鉴定条件为：94℃预变性1min；94℃变性30sec，55℃退火45sec，72℃延伸2min，30个循环；72℃10min。

6.一种丝状真菌基因RNA干扰方法，其特征在于，包括以下步骤：

②将步骤①获得的菌落转移到筛选培养基平板上培养4天，收集生长的阳性菌落接种于沙氏培养基，4℃保存；

其中，所述的诱导培养基平板为：琼脂15g/L,K-缓冲液8ml/L,Mn缓冲液20ml/L,1%CaCl₂.2H₂O1ml/L,0.01%FeSO₄10ml/L,微量元素5ml/L，20%NH₄NO₃2.5ml/L,50%甘油10ml/L1M MES40ml/L，20%葡萄糖10ml/L。筛选培养基平板：诱导培养基平板中加入100mg/L潮霉素，200uM头孢噻肟钠。

7.根据权利要求6所述的丝状真菌基因RNA干扰方法，其特征在于，所述的真菌细胞为丝状真菌。

8.根据权利要求7所述的丝状真菌基因RNA干扰方法，其特征在于，所述的丝状真菌为申克孢子丝菌或犬小孢子菌。