CN104830860A - 一种可以提高植物基因表达活性的间隔重复序列及应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种可以提高植物基因表达活性的间隔重复序列，即拟南芥一木葡聚糖内转糖苷酶/水解酶At2g14620基因启动子上的一段间隔重复序列在转基因植物拟南芥中提高目的基因表达中的用途。当把该间隔重复序列删除时，启动子活性急剧降低，因此，该间隔重复序列具有增强基因表达的特征。应用本发明的间隔重复序列进行植物的转基因研究，可以提高目标基因的表达，具有重要的经济和社会效益。

Description

一种可以提高植物基因表达活性的间隔重复序列及应用

技术领域

本发明涉及一种可以提高植物基因表达活性的间隔重复序列及应用，属于植物间隔重复序列领域，特别涉及一种可提高基因表达活性的木葡聚糖内转糖苷酶/水解酶At2g14620基因启动子上的一段间隔重复序列，以及该间隔重复序列在植物转基因开发上的用途。

背景技术

基因表达调控是现代分子生物学研究的热点之一，阐明基因表达调控的时空规律有助于更好的揭示生物生长发育规律、形态结构特征及其生物学功能。基因表达调控主要表现在以下三个方面：第一，转录水平上的调控；第二，mRNA加工、成熟水平上的调控；第三，翻译水平上的调控。真核生物大多数是由多细胞组成的，细胞核结构的存在使转录和翻译过程在时间和空间上彼此分开，因此，真核生物基因表达的调控可以发生在不同水平上。真核生物的DNA与蛋白质结合在一起，形成十分复杂的染色质结构，染色质构象的变化、染色质中蛋白质的变化及染色质对DNA酶敏感程度的变化都会对基因表达产生影响（Nature 2007，447：33-367； Nat Rev Genet 2009，10：161-172）。另外，真核生物基因组DNA中大量的重复序列，也是影响真核基因的表达重要因素（Nucleic Acids Res 2012，40：3870-3885）。

按照重复序列在基因组中的分布方式，可以分为两种主要类型：串联重复序列和散布重复序列。串联重复序列以重复单元首尾相连的方式分布在特定染色体区域；而散布重复序列分散在整个基因组中。随着研究的发展，越来越多的实验表明这些重复序列发挥着重要的功能。它们在基因组中通常以特定的结构形式存在，对转录和其它基因组功能产生影响（Res Microbiol 2002，153：447-453）。在细胞分裂过程中，着丝粒处的重复序列与蛋白质组成复合体，作为联系染色体和纺锤体微管的关键结构，以保证染色体的准确分离（Chromosome Res 2003，11：241-253）。同样，端粒处的重复序列在保证染色体稳定中也起着重要作用（J Biol Chem 1990, 265：5919-5921）。

间隔重复序列是指重复单元仅被一段DNA片段隔开的重复序列，该序列类似与细菌中的成簇的规律间隔的短回文重复序列（Clustered regularly interspaced short palindromic repeats, CRISPR）（Annu Rev Genet 2011，45：273-297；Science 2014，346：1258096），CRISPR序列中重复单元重复次数至少要在4次以上，而本申请中所指的间隔重复序列重复单元重复次数限定为2次。

木葡聚糖内转糖苷酶/水解酶是一类参与细胞壁重构与修饰的关键酶，它通过切割和重新移植木葡聚糖的作用，在不降低细胞壁机械性质的前提下提供细胞壁的延展性，从而支持由膨压驱动的细胞体积增长，研究表明：木葡聚糖内转糖苷酶/水解酶基因的转录活性参与了植物根的伸长。基于理论研究和生产实践的需要，本发明人在拟南芥木葡聚糖内转糖苷酶/水解酶At2g14620基因启动子上中鉴定了一种可以提高基因表达活性的间隔重复序列，它在植物基因工程的产业化中具有广泛应用。

发明内容

本发明目的在于提供拟南芥木葡聚糖内转糖苷酶/水解酶At2g14620基因启动子上的一段间隔重复序列，以及该序列在植物基因工程中用于增强目的基因表达的用途，为后续开发高效表达转基因产品奠定基础。

本发明从拟南芥中克隆了木葡聚糖内转糖苷酶/水解酶At2g14620基因启动子区（SEQ ID NO.4）的一段间隔重复序列，并研究了该间隔重复序列增强β-D-葡糖醛酸酶（GUS）基因的表达。

 SEQ ID NO.4如下所示，其中序列表中标下划线的部分为两个重复序列，它们中间被一段间隔序列隔开。

aagcttttct ttggattgaa taaatcccca cgcgatgata tgttatctct ctgcatgaaa gtaatgaata aaccttttca acaatctatt aacaatgcaa agacttctaa gcaagaaaag tcgtataagt tttttctttt tggtaaaatt tagtttaaaa tcgtgtccgt tgtttatttg ccagatggca ttttctatta gatttaaaat atgtcagcaa tctatttaac tttaatgcga acggataaaa tgagatttta gcggttaact tgatcaaaat ctaataaaaa gttacaaact aaaatgaatg ataaatgaag gttacatgca tggagaaatt ttttactttg taaatgactt gctgcctaat aaaaattagt tatttttaat atttaaaaga aaacataata tgtaagttaa taagtatgaa ttgtaaggaa gcaaacattc ttacgttttg aaaaaagaaa acaaaaagat

tcctacgtaa gtatgtattc tctttgcttc tccacaaaga tattctttgt ataggacaca atttacttta aacacacaat acaatatgta tatatactaa tcaatgatcg ttatatatat tctttgtata ggacacaatt tactttaaac acttttcatg caatacaata tgtatatatactaatcaatg atcgttatat atgtccatcg tactcaacct caaacatctt aa

该间隔重复序列位于At2g14620基因翻译起始位点ATG上游-159至-33处，当把该间隔重复序列删除时，该启动子的活性急剧降低。可见这段间隔重复序列具有增强报告基因GUS表达活性的作用。

本发明还提供所述的At2g14620基因启动子区的一段间隔重复序列在转基因植物中提高目的基因表达的用途。所述的植物优选为拟南芥。所述的目的基因优选为GUS基因。

本发明的间隔重复序列来源于拟南芥，通过验证能增强外源GUS基因的表达，因此，本发明的间隔重复序列具有调控目的基因表达的功能。

本发明的有益效果：

1.      本发明公开的拟南芥At2g14620基因的启动子及其间隔重复序列，该间

隔重复序列具有顺式调控元件的功能，它可以作为酵母单杂交系统中的诱饵克隆细胞壁重构（或修饰）的关键的转录因子并导入植物，提高植物根生长能力，达到改良植物目的；

2.      本发明人提供的间隔重复序列参与植物基因表达调控功能，启动子突变

及融合GUS报告基因表达分析表明该间隔重复序列对维持该启动子的活性必不可少；

3.      利用本发明启动子上的间隔重复序列可进行细胞壁重构（或修饰）调控

机制的研究；

4.      利用本发明的间隔重复序列与所需目的基因连接，可以使外源基因特定

在植物根部表达，有助于植物性状的改良。

附图说明

图1为CR6启动子片段克隆电泳图，M（分子量标准物）：DL2000；

图2为CR6m启动子片段克隆电泳图，M（分子量标准物）：DL2000；

图3为构建的启动子表达载体（CR6::GUS和CR6m:GUS）结构示意图。

图4为CR6::GUS转基因拟南芥植株GUS组织化学染色图。

图5为CR6m::GUS转基因拟南芥植株GUS组织化学染色图。

具体实施方式

下面结合具体实施例和附图内容对本发明进一步阐述。

实施例1：全长启动子和缺失启动子的构建

以拟南芥（Arabidopsis thaliana, Columbia ecotype）叶片为材料，用CTAB法（EMBO J 1987, 6:3901-3907）提取植物总DNA。以植物总DNA为模板，通过特异引物扩增木葡聚糖内转糖苷酶/水解酶At2g14620基因启动子区的一段间隔重复序列段。

所述扩增木葡聚糖内转糖苷酶/水解酶At2g14620基因启动子区的特异引物序列如下：

CR6-1（5’-AAGCTTTTCTTTGGATTGAATAAATCCCCA-3’，如SEQ ID NO.1所示，引入了HindIII位点）；

CR6-2（5’-GGATCCTTAAGATGTTTGAGGTTGAGTACGAT-3’ ，如SEQ ID NO.2所示，引入了BamHI位点）；

CR6-4（5’-GGATCCTGTGTTTAAAGTAAAT-3’ ，如SEQ ID NO.3所示，引入了BamHI位点）。

其中引物CR6-1/CR6-2扩增出712bp全长启动子片段（命名为CR6）（图1），引物CR6-1/CR6-4扩增的556bp片段（命名为CR6m）（图2）。PCR产物CR6和CR6m直接与pGEM-T克隆载体（购自Promaga）连接，转化DH5α大肠杆菌感受态菌株，筛选阳性克隆（内含有全长启动子片段CR6和突变的启动子片段CR6m）。

实施例2：GUS融合表达载体的构建

用限制性酶HindIII和BanHI分别双酶切实施例1中的两种阳性克隆及双元表达载体pBI121（购自北京天恩泽基因有限公司，实验室保存），将酶切后的全长启动子及缺失启动子片段分别与pBI121酶切片段连接，构建启动子表达载体（CR6::GUS和CR6m::GUS）（图3），分别把它们转化到DH5α大肠杆菌感受态菌株中，进行扩繁。

实施例3：农杆菌转化

将构建好的表达载体（CR6::GUS和CR6m::GUS）转入农杆菌宿主细胞EHA105（国家微生物资源库www.matrs.com获得，产品ID为20110114049，实验室保存）中。具体方法如下：构建的表达载体（CR6::GUS和CR6m::GUS）大肠杆菌菌株接种到10mL含Km（50μg/mL）LB液体培养基中，37℃过夜培养后，提质粒，为后续转化农杆菌备用。EHA105农杆菌菌株接种5mL含Sm（50μg/mL）YEP液体培养基中，28℃下200rpm培养48小时。离心收集菌体，用0.1M冰冻CaCl₂重悬，冰上放置20分钟后，4℃下5000rpm离心2分钟，收集的菌体用200μL 0.1M冰冻CaCl₂悬浮。然后加入制备好的表达载体质粒（CR6::GUS和CR6m::GUS），冰上放置20分钟，-70℃放置10分钟，37℃放置5分钟后加入800μL不含抗生素的YEP液体培养基，28℃培养4小时后，离心收集菌体，用玻璃涂棒涂布与含有Km（50μg/mL）和Sm（50μg/mL）的YEP固体培养基平板上，28℃培养2天。用特异性引物对菌落进行PCR鉴定，筛选阳性克隆。

实施例4：拟南芥转化

将含表达载体（CR6::GUS和CR6m::GUS）的农杆菌菌株（实施例3中已构建）接种于含Km（50μg/mL）和Sm（50μg/mL）的YEP培养基中，培养至对数生长期，离心收集菌体，重悬于MMA溶液（10mM MES、100μM乙酰丁香酮、10mM MgCl₂），并调整菌液浓度至OD₆₀₀=1.2，28℃静置2小时。取生长10天的拟南芥植株，将其放置于MMA溶液中，25℃人工气候箱内黑暗培养48小时后取样进行GUS组织化学染色。

实施例5：GUS组织化学染色

将实施例4中的拟南芥植株取出，用吸水纸吸干后置于含有1mM X-Gluc染色液中，37℃温育5小时，样品经75%乙醇脱水后观察照相。结果见图4和图5，含有间隔重复序列的全长启动子CR6的转基因植株表达较高的GUS活性，而间隔重复序列突变的启动子CR6m几乎检测不到表达的GUS活性。

                         SEQUENCE LISTING

 

<110>  江苏大学

 

<120>  一种可以提高植物基因表达活性的间隔重复序列及应用

 

<130>  一种可以提高植物基因表达活性的间隔重复序列及应用

 

<160>  4    

 

<170>  PatentIn version 3.3

 

<210>  1

<211>  30

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  1

aagcttttct ttggattgaa taaatcccca                                      30

 

 

<210>  2

<211>  32

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  2

ggatccttaa gatgtttgag gttgagtacg at                                   32

 

 

<210>  3

<211>  22

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  3

ggatcctgtg tttaaagtaa at                                              22

 

 

<210>  4

<211>  712

<212>  DNA

<213>  拟南芥 Arabidopsis thaliana

 

<400>  4

aagcttttct ttggattgaa taaatcccca cgcgatgata tgttatctct ctgcatgaaa     60

 

gtaatgaata aaccttttca acaatctatt aacaatgcaa agacttctaa gcaagaaaag    120

 

tcgtataagt tttttctttt tggtaaaatt tagtttaaaa tcgtgtccgt tgtttatttg    180

 

ccagatggca ttttctatta gatttaaaat atgtcagcaa tctatttaac tttaatgcga    240

 

acggataaaa tgagatttta gcggttaact tgatcaaaat ctaataaaaa gttacaaact    300

 

aaaatgaatg ataaatgaag gttacatgca tggagaaatt ttttactttg taaatgactt    360

 

gctgcctaat aaaaattagt tatttttaat atttaaaaga aaacataata tgtaagttaa    420

 

taagtatgaa ttgtaaggaa gcaaacattc ttacgttttg aaaaaagaaa acaaaaagat    480

 

tcctacgtaa gtatgtattc tctttgcttc tccacaaaga tattctttgt ataggacaca    540

 

atttacttta aacacacaat acaatatgta tatatactaa tcaatgatcg ttatatatat    600

 

tctttgtata ggacacaatt tactttaaac acttttcatg caatacaata tgtatatata    660

 

ctaatcaatg atcgttatat atgtccatcg tactcaacct caaacatctt aa            712

 

 

Claims (5)

1.一种间隔重复序列在提高植物目的基因表达活性中的应用，其特征在于，所述间隔重复序列为拟南芥（Arabidopsis thaliana）木葡聚糖内转糖苷酶/水解酶At2g14620基因启动子区上的一段间隔重复序列，其序列如SEQ ID NO.4所示；所述的植物为转基因植物。

2. 根据权利要求1所述的一种间隔重复序列在提高植物基因表达活性中的应用，其特征在于，所述的植物为拟南芥。

3. 根据权利要求1所述的一种间隔重复序列在提高植物基因表达活性中的应用，其特征在于，其中所述的目的基因为β-D-葡糖醛酸酶（GUS）基因。

4. 根据权利要求1所述的一种间隔重复序列在提高植物基因表达活性中的应用，其特征在于，其中所述扩增木葡聚糖内转糖苷酶/水解酶At2g14620基因启动子区的特异引物序列如下：

CR6-1：5’-AAGCTTTTCTTTGGATTGAATAAATCCCCA-3’，如SEQ ID NO.1所示，引入了HindIII位点；

CR6-2：5’-GGATCCTTAAGATGTTTGAGGTTGAGTACGAT-3’ ，如SEQ ID NO.2所示，引入了BamHI位点；

CR6-4：5’-GGATCCTGTGTTTAAAGTAAAT-3’ ，如SEQ ID NO.3所示，引入了BamHI位点；

    其中，下划线部分为酶切位点位置，引物CR6-1/CR6-2扩增出全长启动子片段命名为CR6，引物CR6-1/CR6-4扩增的不包含间隔重复序列的片段命名为CR6m。

5. 一种启动子表达载体CR6::GUS，其特征在于，所述启动子表达载体CR6::GUS包含GUS基因和木葡聚糖内转糖苷酶/水解酶At2g14620基因全长启动子片段。