CN103146736A

CN103146736A - 一种植物表达载体pGⅡ0229-GUS的构建及应用

Info

Publication number: CN103146736A
Application number: CN2013101023190A
Authority: CN
Inventors: 高世武; 林庆良; 郭晋隆; 许莉萍; 王天池; 阙友雄
Original assignee: Fujian Agriculture and Forestry University
Current assignee: Fujian Agriculture and Forestry University
Priority date: 2013-03-28
Filing date: 2013-03-28
Publication date: 2013-06-12

Abstract

本发明涉及一种植物表达载体pGⅡ0229-GUS的构建及应用。植物表达载体pGⅡ0229-GUS的构建方法，包括引物设计、PCR扩增和载体构建。本发明设计的特异引物通过PCR扩增获得的目的片段，包含有35s启动子、GUS瞬时表达基因和NOS终止子，是一个完整的基因表达盒；植物表达载体pGⅡ0229-GUS只有7333bp，载体质粒小，含有左右边界，可以在农杆菌侵染转化上应用，也可以在基因枪轰击转化上应用。在遗传转化甘蔗时，GUS的瞬时表达率达到65%以上，适用于甘蔗，也适用于其他植物。

Description

一种植物表达载体pGⅡ0229-GUS的构建及应用

技术领域　

本发明涉及一种植物表达载体的构建及应用，具体涉及一种植物表达载体pGⅡ0229-GUS的构建及应用，属于生物技术领域。

背景技术

甘蔗（Saccharum Complex）是最主要的糖料作物，蔗糖占世界食糖总产的76%，占我国食糖总产的92%；甘蔗也是最重要的生物质能源作物之一，是迄今大田栽培作物中单位面积生物量和燃料乙醇产量最大的C4植物。甘蔗品种改良对产业科技进步贡献率高达60%，但是甘蔗是高度杂合的无性繁殖作物，遗传背景非常复杂，表现为异源多倍体和多倍的非整倍体，染色体个数40～120个不等，变化幅度之大为其它作物所不及，常规有性杂交育种，从实生苗开始一般需要10～13年才能从10～30万株分离群体中培育出1个达到审（鉴）定要求的品种。

现代分子生物学的发展和研究技术手段的进步，使品种的定向改良和目标性状育种成为可能。利用转基因技术改良甘蔗品种具有独特的优势，原因在于：（1）甘蔗属于转基因安全等级为I级的工业原料作物，批准转基因甘蔗产业化应用相对容易；（2）甘蔗又是无性繁殖作物，只要选到优良的单株就可以通过离体无性繁殖的方式，快速扩大群体并保持遗传上的稳定性。目前甘蔗转基因技术主要有两个途径，一是基因枪轰击法，二是农杆菌介导法，二者在甘蔗遗传转化上已经有应用实例，但是这两种技术在甘蔗转基因应用上，转化效率都很低。为了提高甘蔗转化效率，仍需进一步对转化体系进行优化。但是目前用于体系优化的瞬时表达载体转化效率低，不利于对甘蔗遗传转化体系的优化。为此，为了建立更好的甘蔗转基因优化体系，我们探讨了一个新的瞬时植物表达载体构建及其在甘蔗遗传转化上的应用，目的是获得一个瞬时表达效率高的载体，从而能更有效地对甘蔗遗传转化体系进行优化，进而建立一种可实现甘蔗高效转化的技术方法，为甘蔗转基因改良提供技术支撑。

发明内容

本发明的目的是提供一种植物表达载体pGⅡ0229-GUS的构建方法及应用。针对现有甘蔗遗传转化体系优化时所用载体瞬时表达效率不高问题，提供一种转化效率高的载体。通过克隆获得瞬时基因表达盒，进而将其构建到植物表达载体中，获得一个新的瞬时植物表达载体，提高转化效率，从而建立更好的甘蔗外源基因遗传转化体系。

本发明的目的是通过以下方法实现的。

本发明的一种植物表达载体pGⅡ0229-GUS的构建方法，包括引物设计、基因克隆和载体构建；其特征在于操作步骤如下：

1、引物设计：人工设计合成特异引物序列

Forward primer: 5’- GCAAGCTTTTTCCCGCCTTCAGTTTAGC - 3’

Reverse primer: 5’- GCTCTAGAACACTGATAGTTTAATTCC - 3’；

　 2、PCR扩增： PCR反应体系是10×PCR Buffer 2.5 μl，dNTP 2.0 μl，10 μmol/L的Forward primer 1.0 μl，10 μmol/L的Reverse primer 1.0 μl，5 U/μl的Ex Taq 酶0.125 μl，100 ng/μl的DNA模板1.0 μl，加ddH₂O至终体积25 μl；PCR程序是95℃预变性5 min，95℃变性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸3 min，30个循环，最后72℃延伸10 min；所述DNA模板是以pCAMBIA2301质粒为DNA模板；

　　3、载体构建：将步骤2的PCR扩增产物通过琼脂糖凝胶电泳进行分离，回收目的片段Ⅰ，并将获得的目的片段Ⅰ用限制性内切酶HindIII和XbaI进行酶切，回收目的片段Ⅱ，同时将pGreenII0229质粒DNA用限制性内切酶HindIII和XbaI进行酶切，回收目的片段Ⅲ，将回收的目的片段Ⅱ和目的片段Ⅲ用T4-DNA连接酶进行连接，并将连接产物转化至大肠杆菌DH5α中，挑取阳性克隆验证，获得pGⅡ0229-GUS载体；所述目的片段Ⅰ是指用特异引物扩增出的含有35s启动子、GUS瞬时表达基因和nos终止子的核酸片段；目的片段Ⅱ是指用限制性内切酶HindIII和XbaI酶切目的片段Ⅰ后2927bp的核酸片段；目的片段Ⅲ是指用限制性内切酶HindIII和XbaI酶切pGreenII0229质粒DNA后4406bp的核酸片段；所述琼脂糖凝胶电泳，参照《分子克隆》工具书中琼脂糖凝胶电泳的方法；所述将连接产物转化至大肠杆菌DH5α中，转化方法参照《分子克隆》工具书中用氯化钙制备和转化感受态大肠杆菌的方法；所述酶切方法，参照限制性内切酶的说明书；所述回收方法，参照胶回收试剂盒说明书；所述用T4-DNA连接酶进行连接方法，参照T4-DNA连接酶操作说明书；

所述携带GUS 基因的植物表达载体pCAMBIA2301、根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）菌株EHA105、植物表达载体pGreenII0229、大肠杆菌DH5α，均由商业购买获得。

本发明的一种植物表达载体pGⅡ0229-GUS，可以在农杆菌侵染转化上应用，也可以在基因枪轰击转化上应用。

若GUS基因成功导入甘蔗组织细胞并在其中表达，则甘蔗心叶被染成蓝色。对构建获得的植物表达载体pGⅡ0229-GUS与原植物表达载体pCAMBIA2301在农杆菌侵染转化和基因枪轰击转化上的应用进行试验，结果如表1和表2所示。表１的试验结果表明，甘蔗心叶在进行农杆菌侵染转化时，植物表达载体pGⅡ0229-GUS比原来的植物表达载体pCAMBIA2301的瞬时表达率提高105.7%，经显著性测验，二者之间呈极显著差异。表2的试验结果表明，甘蔗心叶在进行基因枪轰击转化时，植物表达载体pGⅡ0229-GUS比原来的植物表达载体pCAMBIA2301的瞬时表达率提高103.1%，经显著性测验，二者之间呈极显著差异。

表1 农杆菌侵染转化时不同植物表达载体GUS瞬时表达率的影响

Figure 2013101023190100002DEST_PATH_IMAGE001

注：甘蔗品种为福农39

表2 基因枪轰击转化时不同植物表达载体GUS瞬时表达率的影响

注：甘蔗品种为福农39

表1和表2采用字母标记方法来表示多重比较结果，按照统计分析平均数多重比较标记字母法规定，用小写拉丁字母a、b、c、d......表示差异显著水平α＝0.05，用大写拉丁字母A、B、C、D......表示差异显著水平α＝0.01。先将各处理平均数由大到小排列，最大平均数后标记a或A，并将该平均数与以下各平均数相比，差异显著的依次标记b或B。依次类推，不显著的标记同一字母。两平均数之间凡有相同字母的即为差异不显著，否则为差异显著。

采用pGⅡ0229-GUS表达载体遗传转化甘蔗时，GUS的瞬时表达率达到65%以上。

综上所述，本发明一种植物表达载体pGⅡ0229-GUS的构建及应用具有如下有益效果：

1. 本发明设计的特异引物通过PCR扩增获得的目的片段Ⅰ中，包含有35s启动子、GUS瞬时表达基因和NOS终止子，是一个完整的基因表达盒；

2. 本发明获得的植物表达载体pGⅡ0229-GUS只有7333bp，载体质粒小，适应于基因枪轰击转化；

3. 本发明获得的植物表达载体pGⅡ0229-GUS含有左右边界，适用于农杆菌侵染转化；

4. 本发明获得的植物表达载体pGⅡ0229-GUS在遗传转化甘蔗时，GUS的瞬时表达率达到65%以上，应用于甘蔗遗传转化体系参数的优化，效果良好；

5. 本发明获得的植物表达载体pGⅡ0229-GUS不仅适用于甘蔗，也适用于其他植物。

附图说明

图1为pGⅡ0229-GUS载体的酶切验证图；M表示Maker；a表示HindIII单酶切；b表示HindIII和XbaI双酶切；

图2为构建完成的pGⅡ0229-GUS质粒图谱。

具体实施方式

　为了进一步阐明本发明而不是限制本发明，以下结合实施例加以说明。

实施例一：一种植物表达载体pGⅡ0229-GUS的构建方法

一种植物表达载体pGⅡ0229-GUS的构建方法，包括以下步骤：

1、引物设计：人工设计合成特异引物序列

Forward primer: 5’- GCAAGCTTTTTCCCGCCTTCAGTTTAGC - 3’

Reverse primer: 5’- GCTCTAGAACACTGATAGTTTAATTCC - 3’；

2、PCR扩增：PCR反应体系配制如表3所示。

表3 PCR反应体系配制表

PCR程序是95℃预变性5 min，95℃变性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸3 min，30个循环，最后延伸10 min；

3、载体构建：

（1）目的片段Ⅰ的获得：将步骤2的PCR扩增产物通过琼脂糖凝胶电泳进行分离，回收目的片段Ⅰ；

（2）目的片段Ⅱ的获得：将回收的目的片段Ⅰ用限制性内切酶HindIII和XbaI进行酶切，并将酶切产物通过琼脂糖凝胶电泳进行分离，回收目的片段Ⅱ；

（3）目的片段Ⅲ的获得：将pGreenII0229质粒DNA用限制性内切酶HindIII和XbaI进行酶切，并将酶切产物通过琼脂糖凝胶电泳进行分离，回收目的片段Ⅲ；

（4）pGⅡ0229-GUS载体获得：将获得的目的片段Ⅱ和目的片段Ⅲ用T4-DNA连接酶进行连接，并将连接产物转化至大肠杆菌DH5α中，挑取阳性克隆，置于含有50 mg/ml卡那霉素的LB液体培养基中，37℃，150 rpm/min振荡培养8 h，提取阳性克隆质粒DNA，用限制性内切酶HindIII和XbaI进行酶切验证，获得pGⅡ0229-GUS载体；所述提取阳性克隆质粒DNA方法，参照《分子克隆》工具书中SDS碱裂解法制备质粒DNA的方法；酶切验证图如图1所示；构建完成的pGⅡ0229-GUS质粒图谱如图2所示。

实施例二：　一种植物表达载体pGⅡ0229-GUS在农杆菌侵染转化上的应用

一种植物表达载体pGⅡ0229-GUS在农杆菌侵染转化上的应用，包括以下步骤：

1、材料选择：选择携带GUS基因的植物表达载体pGⅡ0229-GUS和pCAMBIA2301，导入根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）菌株EHA105中，获得A菌液和B菌液；所述A菌液为含有植物表达载体pGⅡ0229-GUS的阳性菌液，B菌液为含有植物表达载体pCAMBIA2301的阳性菌液；选择甘蔗品种为福农39；所述导入方法，参照余云舟等在吉林农业大学学报上发表的文章《重组质粒导入根癌农杆菌冻融法的研究》，2003,25（3）：257-259,262；

2、转化菌液制备：吸取100 μl A菌液和B菌液分别转至同时含有利福平35 mg/L和卡那霉素 50 mg/L的50 ml LB液体培养基中扩繁，在25～28℃、150 rpm/min振荡培养至OD₆₀₀=1.0，将扩繁后的A菌液和B菌液分别于室温、5000 rpm 离心5 min ，获得的菌体重悬于侵染液中；再次于室温、5000 rpm将重悬后的菌液分别离心5 min 后，获得的菌体再次重悬于侵染液中，并用侵染液分别将二者稀释至OD₆₀₀=0.8，获得2种转化菌液，即A转化菌液和B转化菌液，分别将2种转化菌液转至250 ml的三角瓶中，每瓶100 ml；所述LB培养基为：10 g/L胰蛋白胨、5 g/L酵母提取物和10 g/L 氯化钠，pH 7.0；所述侵染液为：1/2MS＋100μmol/L乙酰丁香酮+20.0 g/L蔗糖，pH 5.8；所述MS培养基为1962年，Murashige和Skoog公开的MS培养基；

3、侵染方法：在甘蔗植株顶端部分，取白色心叶的肥厚带中生长点以上10 cm内的幼嫩心叶，用体积浓度为75 %的乙醇消毒后，将其切成厚度不大于3 mm的圆片，接种至MS＋3.0 mg/L 2.4-D＋20.0 g/L蔗糖＋6.0 g/L琼脂粉 pH 5.8的诱导培养基上诱导培养7 d，然后分别浸入步骤2的2种转化菌液中，转化菌液要没过侵染材料，150 rpm/min振荡侵染30 min；

4、共培养：将步骤3侵染后的2种材料从转化菌液中取出后，用灭菌滤纸吸干表面的转化菌液，分别转至1/2MS＋3.0 mg/L 2.4-D＋100μmol/L 乙酰丁香酮＋20.0 g/L蔗糖＋6.0 g/L琼脂粉 pH 5.8的共培养培养基中，在22℃黑暗条件下共培养3 d；

5、选择培养：将共培养后的2种材料移至MS＋3.0 mg/L 2.4-D＋300 mg/L Timentin＋20.0 g/L蔗糖+ 6.0 g/L琼脂粉 pH 5.8的选择培养基中，在28℃黑暗条件下选择培养4 d；

6、GUS活性组织化学染色：将选择培养4 d后的2种材料放入GUS染色液中，37℃静置保温16 h，用体积浓度为75%的酒精脱色即可；所述GUS染色液成分为：pH 7.0的100 mmol/L磷酸钠缓冲液、10 mmol/L EDTA，1 mmol/L铁氰化钾，0.1% Triton X-100， 2 mmol/L X-Gluc。

试验结果表明，选择甘蔗福农39，使用植物表达载体pGⅡ0229-GUS进行农杆菌侵染转化时，GUS瞬时表达率达到了68.9%，比原植物表达载体pCAMBIA2301的瞬时表达率提高了105.7%。

实施例三：　一种植物表达载体pGⅡ0229-GUS在基因枪轰击转化上的应用

一种植物表达载体pGⅡ0229-GUS在基因枪轰击转化上的应用，包括以下步骤：

1、材料选择：选择携带GUS基因的植物表达载体pGⅡ0229-GUS和pCAMBIA2301，用核酸蛋白测定仪分别测定pGⅡ0229-GUS质粒DNA和pCAMBIA2301质粒DNA的浓度和纯度，并分别将2种质粒DNA定量至1 μg/μl；选择甘蔗品种为福农39；

2、受体材料的预处理: 在甘蔗植株顶端部分，取白色心叶的肥厚带中生长点以上10 cm内的幼嫩心叶，用体积浓度为75 %的乙醇消毒后，并将其切成厚度不大于3 mm的圆片，接种至MS＋3.0 mg/L 2.4-D＋20 g/L蔗糖＋6 g/L琼脂粉，pH 5.8的诱导培养上诱导培养7 d，在基因枪轰击前4h转至MS＋2 mg/L 2,4-D＋0.2 mol/L山梨醇＋0.2 mol/L甘露醇＋30 g/L蔗糖＋6 g/L琼脂粉 pH 5.8的渗透培养基中，进行预处理；

3、基因枪微弹的制备及轰击：按照Bio-Rad公司的PDS-1000/He型基因枪操作说明书制备微弹，DNA分别为pGⅡ0229-GUS质粒DNA和pCAMBIA2301质粒DNA，制备2种微弹，调整轰击距离6 cm、气压1,100 psi，用2种微弹分别轰击预处理的材料，将轰击后的2种材料分散开，继续在渗透培养基上处理20 h；

4、恢复培养：将步骤3处理后的2种材料转至MS＋2.0 mg/L 2.4-D+20 g/L蔗糖＋6 g/L琼脂粉 pH 5.8的恢复培养基，恢复培养6 d；

5、GUS活性组织化学染色：将选恢复培养6 d后的2种材料放入GUS染色液中，37℃静置保温16 h，体积浓度为75%酒精脱色即可；所述GUS染色液为：pH=7.0的100 mmol/L磷酸钠缓冲液、10 mmol/L EDTA，1 mmol/L铁氰化钾，0.1% Triton X-100， 2mmol/L X-Gluc。

试验结果表明，选择甘蔗福农39，使用植物表达载体pGⅡ0229-GUS进行基因枪轰击转化时，GUS瞬时表达率达到了86.5%，比原植物表达载体pCAMBIA2301的瞬时表达率提高了103.1%。

瞬时表达率是在遗传转化上进行体系优化时的关键指标，如果瞬时表达率过低，则对体系参数进行优化时可能产生较大的误差。构建获得的植物表达载体pGⅡ0229-GUS既适用于农杆菌侵染转化，也适用于基因枪轰击转化，并且瞬时表达率达到65%以上，应用于对甘蔗遗传转化体系参数的优化，效果良好。该载体也适用于其他植物遗传转化时体系的优化。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

SEQUENCE LISTING

序列表

<110> 福建农林大学

<120> 一种植物表达载体pGⅡ0229-GUS的构建及应用

<130>

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

gcaagctttttcccgccttc agtttagc 28

<210> 2

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

gctctagaacactgatagtt taattcc 27

Claims

1.一种植物表达载体pGⅡ0229-GUS的构建方法，包括引物设计、PCR扩增和载体构建；其特征在于：

（1）引物设计：人工设计合成特异引物序列

Forward primer: 5’- GCAAGCTTTTTCCCGCCTTCAGTTTAGC - 3’

Reverse primer: 5’- GCTCTAGAACACTGATAGTTTAATTCC - 3’；

　（2）PCR扩增： PCR反应体系是10×PCR Buffer 2.5 μl，dNTP 2.0 μl，10 μmol/L的Forward primer 1.0 μl，10 μmol/L的Reverse primer 1.0 μl，5 U/μl的Ex Taq 酶0.125 μl，100 ng/μl的DNA模板1.0 μl，加ddH₂O至终体积25 μl；PCR程序是95℃预变性5 min，95℃变性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸3 min，30个循环，最后72℃延伸10 min；所述DNA模板是以pCAMBIA2301质粒为DNA模板；

（3）载体构建：将步骤（2）的PCR扩增产物通过琼脂糖凝胶电泳进行分离，回收目的片段Ⅰ，并将获得的目的片段Ⅰ用限制性内切酶HindIII和XbaI进行酶切，回收目的片段Ⅱ，同时将pGreenII0229质粒DNA用限制性内切酶HindIII和XbaI进行酶切，回收目的片段Ⅲ，将回收的目的片段Ⅱ和目的片段Ⅲ用T4-DNA连接酶进行连接，并将连接产物转化至大肠杆菌DH5α中，挑取阳性克隆验证，获得pGⅡ0229-GUS载体；所述目的片段Ⅰ是指用特异引物扩增出的含有35s启动子、GUS瞬时表达基因和nos终止子的核酸片段；目的片段Ⅱ是指用限制性内切酶HindIII和XbaI酶切目的片段Ⅰ后2927bp的核酸片段；目的片段Ⅲ是指用限制性内切酶HindIII和XbaI酶切pGreenII0229质粒DNA后4406bp的核酸片段。

2.一种植物表达载体pGⅡ0229-GUS在农杆菌侵染转化上应用。

3.一种植物表达载体pGⅡ0229-GUS在基因枪轰击转化上应用。