CN105543269B

CN105543269B - 利用球孢白僵菌BbP4-ATPase基因提高植物对黄萎病抗性的方法

Info

Publication number: CN105543269B
Application number: CN201510738033.0A
Authority: CN
Inventors: 裴炎; 李玉杰; 陈杨; 范艳华; 侯磊; 李先碧; 宋水清
Original assignee: Southwest University
Current assignee: Southwest University
Priority date: 2015-11-03
Filing date: 2015-11-03
Publication date: 2019-09-20
Anticipated expiration: 2035-11-03
Also published as: CN105543269A; WO2017076305A1

Abstract

本发明涉及球孢白僵菌BbP4‑ATPase基因在提高植物对黄萎病抗性中的用途，以及提高植物对黄萎病抗性的方法，通过在目标植物体内表达球孢白僵菌BbP4‑ATPase基因而提高所述植物对黄萎病的抗性。本发明利用对病原菌毒素的解毒而提高植物的抗性，不具有病原菌小种抗性的特点。因此，可以广泛应用于提高不同病原菌生理小种的抗性，不存在小种专一性抗性的特点。

Description

利用球孢白僵菌BbP4-ATPase基因提高植物对黄萎病抗性的方法

技术领域

本发明属于植物基因工程领域。具体地说，涉及利用基因工程技术提高植物抗病性的方法。

背景技术

黄萎病严重影响作物的产量和品质，全球每年因黄萎病引起的损失达数十亿美元(Pegg et al.,2002)。报道称马铃薯因感染黄萎病年产量减少50％以上，通常情况下可以引起10-15％的减产(Powelson et al.,1993；Rowe et al.,1987，2002)；生菜种植区，黄萎病引起的损失非常容易达到100％(Subbarao et al.,1997)；Levinet(2003)等研究发现，油橄榄因黄萎病引起的减产可以达到70％以上；黄萎病也是多数植棉国家的棉花主要病害，比如，澳大利亚、巴西、保加利亚、中国、希腊、秘鲁、土耳其、乌干达、美国和乌兹别克斯坦等国家，可以造成30％以上棉花的减产(Bolek et al.,2005)，发病严重的地区或年份减产可以达到100％。黄萎病是制约我国棉花生产的一种主要病害，目前我国各棉区的发病面积已占植棉总面积的50％以上，每年损失皮棉7.5-10万吨，直接经济损失16-20亿元(肖松华等,2006)。在我国棉花黄萎病重病地块逐年增多，危害逐年加重，已成为当前实现棉花高产、稳产的主要限制因素。黄萎病不仅引起作物大量减产和产品品质降低，其致病菌产生的毒素也能危害人类的健康。

黄萎病主要是由大丽枝菌Verticillium dahliae Kleb和黑白轮枝菌Verticillium alboatrum侵染引起的一种土传维管束病害。病原菌一旦侵入植物体内，便没有有效的防治方法。黄萎病菌寄主范围广，可以侵染包括所有双子叶植物在内的200多种植物，病原菌能以微菌核的形式在土壤中存活20年左右(Klosterman et al.,2009)，除2001年Kawchuk等从番茄中克隆得到1个针对茄属黄萎病菌的抗病基因Ve以外，几乎没有克隆到来自其他植物的抗病基因，对Ve抗病基因的机制研究表明该基因只对黄萎病菌的部分小种具有抗性(Fradin et al.,2009)。早期的研究认为，植物感染黄萎病后，其导管被孢子、菌丝以及病原菌通过植物细胞形成的胶状物等堵塞而致萎蔫坏死(Agrios,2005)，但是，随后的研究表明，导管堵塞不是黄萎病萎蔫的主要原因，随着研究的不断深入，人们认识到黄萎病菌产生的毒素是导致植物萎蔫的重要因素(Fradin et al.,2006)。还有一些学者认为，维管束的堵塞也是基于毒素的诱导效应(陈旭升等，1998)。

实践证明，利用抗病品种是防治黄萎病危害的唯一经济有效的途径。传统育种方法虽然能利用作物本身或亲缘种的抗性基因选育抗病品种，但存在着可利用的抗性品种资源少，选育时间长，耗资大等缺点；施用化学药剂不仅难以有效防治黄萎病而且污染环境。随着植物基因工程技术的不断发展以及对植物和病原物相互作用的深入了解使得将外源抗性基因导入植物来提高抗病性成为一条有效途径。通过转基因技术可以打破传统育种中的种间不亲和现象，消除杂交障碍，极大地拓宽了抗性基因的来源和应用(Grover andGowthama,2003)。

利用外源抗病基因产物抑制黄萎病菌在植株体内的生长和繁殖可以提高植物对黄萎病的抗性，另一方面，基于黄萎病菌毒素的致病机理，提高植物对黄萎病菌毒素的解毒能力，也是提高植物对黄萎病抗性的有效方法之一。但是，绝大数研究者主要利用前一种方法达到提高植物抗性的目的，尚未见成功利用外源基因的表达产物解毒病原菌产生的毒素来提高对黄萎病抗性的报道。

发明内容

本发明的一个目的在于提供球孢白僵菌BbP4-ATPase基因在提高植物对黄萎病抗性中的用途，通过将球孢白僵菌BbP4-ATPase基因整合进入目标植物构建转基因植物，并使得所述BbP4-ATPase基因在植物中表达而提高植物对黄萎病的抗性。

本发明的另一个目的在于提供一种提高植物对黄萎病抗性的方法，通过在目标植物体内表达外源基因而提高所述植物对黄萎病的抗性，所述外源基因为球孢白僵菌BbP4-ATPase基因。

更具体地，本发明的方法，包括下述步骤：

将球孢白僵菌BbP4-ATPase基因整合进入目标植物构建转基因植物，并使得所述BbP4-ATPase基因在植物中表达。

优选地，所述的方法，包括下述步骤：

1)构建含有来自球孢白僵菌BbP4-ATPase基因的重组植物表达载体；

2)将所述重组植物表达载体导入目标植物中，使得球孢白僵菌BbP4-ATPase基因在目标植物中组成型表达；

3)获得具有提高的抗黄萎病的转基因植物。

优选地，所述球孢白僵菌BbP4-ATPase基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.15所示。

本发明的方法可以适用于的目标植物优选为番茄、烟草或棉花。

本发明方法中，步骤1)中的重组植物表达载体具有如图8所示的结构。

本发明的再一个目的是提供一种具有黄萎病抗性的转基因植物的制备方法，包括以下步骤：

i)获得球孢白僵菌BbP4-ATPase基因，并将其可操作地插入植物表达载体中，构建植物表达载体；

ii)用步骤i)获得的植物表达载体转化宿主，获得转化体；

iii)用步骤ii)获得的转化体转化植物，获得转基因植物。

本发明的目的是这样实现的：一种提高植物对黄萎病病抗性的方法，是将含有来自球孢白僵菌的P类ATP酶基因的重组植物表达载体分别导入目标植物中，实现这些基因在植物中的组成型表达，提高转基因植物对黄萎病菌毒素的解毒能力，进而获得抗黄萎病的转基因植物，所述的转基因植物对黄萎病的抗性优于目标植物。

具体地，本发明利用球孢白僵菌BbP4-ATPase提高植物对黄萎病抗性的方法，包括如下的步骤：

1)获得球孢白僵菌BbP4-ATPase基因：引入BamHI和SpeI酶切位点设计引物，然后以球孢白僵菌cDNA为模板进行PCR扩增，扩增产物即为添加酶切位点的BbP4-ATPase基因序列；

2)构建组成型表达BbP4-ATPase基因的植物表达载体：将扩增获得的BbP4-ATPase基因序列插入植物表达载体pLGN-35S-Nos，构建一个新的植物表达载体，命名为pLGN-35S-BbP4-ATPase；

3)植物的遗传转化：利用根癌农杆菌介导法，将上述步骤2)获得的pLGN-35S-BbP4-ATPase植物表达载体整合入植物基因组，实现BbP4-ATPase基因在转基因植物内的组成型表达，提高转基因植物对黄萎病的抗性；

4)抗黄萎病的BbP4-ATPase转基因植株的获得：将上述步骤3)获得的转基因植物进一步进行繁殖、分子鉴定和抗病鉴定，获得对黄萎病抗性提高的BbP4-ATPase转基因植株。

进一步，组成型表达的pLGN-35S-BbP4-ATPase植物表达载体构建的步骤包括：获得球孢白僵菌的cDNA后，设计上游引物：5’-CGGGATCCATGGCTGGACGACCTCCTGG(BamHI)-3’，下游引物5’-GACTAGTCTATTGCGGACGCGAGCTGG(SpeI)-3’进行PCR扩增，扩增产物和pLGN-35S-Nos载体质粒分别进行BamHI和SpeI双酶切，并分别回收酶切后的大片段，再利用连接酶将回收片段进行连接，构建一个新的植物表达载体，命名为pLGN-35S-BbP4-ATPase，以实现BbP4-ATPase基因在转基因植物内的组成型表达。

本发明所提供的提高植物对黄萎病抗性的方法，是将来自球孢白僵菌的BbP4-ATPase基因分别转入烟草、番茄和棉花细胞中，实现这些基因在转基因植株中的组成型表达，利用外源基因编码的P4类ATP酶解毒黄萎病菌在植物体内产生的毒素，提高转基因植物对黄萎病菌毒素的解毒能力，进而提高转基因植物对黄萎病的抗病性。

本发明结合球孢白僵菌BbP4-ATPase突变体对环孢菌素A(CsA)敏感的特性，同时，CsA是一种由11个氨基酸组成的亲脂疏水性环肽，所以也结合了CsA和黄萎病菌毒素部分结构的相似性，以及黄萎病菌致病机理的特性，创造性地提出利用球孢白僵菌BbP4-ATPase基因在转基因植物内组成型表达，提高转基因植物对黄萎病菌毒素的解毒能力，进而提高转基因植物对黄萎病的抗性的策略。

本发明主要是利用转基因产物对黄萎菌毒素的解毒能力提高植物抗病性，更进一步的以相同的方式利用转基因产物提高植物对真菌毒素的解毒能力也是本发明的保护范围。同时本发明中涉及的植物表达载体，转化细胞等也在本发明的保护范围内。

本发明获得的BbP4-ATPase转基因烟草，T₀代幼苗利用伤根灌菌液法接种高毒力L2-1菌株30d，病情指数为34.87，较野生型对照分别降低40.78。接种30d，38个BbP4-ATPase转化子中还有9个转化子没有出现病症。BbP4-ATPase转基因棉花T₁代幼苗，利用浸根接种法接种V991落叶型黄萎病菌株20d，非转基因对照病情指数达到了82.24，BbP4-TAPase转基因棉花有2个株系的病情指数低于10，分别为8.33和4.55。利用本发明获得的转基因番茄T₀代幼苗植株利用伤根灌菌液法接种高毒力L2-1菌株，非转基因番茄的病情指数达到78.33，BbP4-ATPase转基因番茄的病情指数为44.44，较野生型对照降低33.89。研究结果表明，利用本发明方法获得的转基因棉花、烟草和番茄可以显著提转基因植物对黄萎病的抗病性。说明，本发明提供的提高植物对黄萎病抗性的方法效果显著。该方法不仅适用于棉花、烟草和番茄，所有能受黄萎病菌侵染的植物均可利用该方法提高对黄萎病的抗性。

本发明提供的方法主要是利用对病原菌毒素的解毒而提高植物的抗性，因而不具有病原菌小种抗性的特点。因此，可以广泛应用于提高不同病原菌生理小种的抗性，不存在小种专一性抗性的特点。

附图说明

图1为CsA敏感型球孢白僵菌突变体的筛选

WT：球孢白僵菌野生型菌株Bb0062；Control：球孢白僵菌T-DNA随机插入转化子；Mu129和Mu134：CsA敏感型球孢白僵菌T-DNA随机插入转化子；CZA：察氏固体培养基；CsA：环孢菌素A；标尺＝1cm。

图2为BbP4-ATPase同源重组载体图

Bar：草丁膦除草剂(phosphinothricin)抗性基因；PtrpC：来源于构巢曲霉的真菌组成性启动子；TtrpC：构巢曲霉色氨酸合成酶基因的终止子；BbP4-ATPase LB：BbP4-ATPase基因5’侧翼序列；BbP4-ATPase RB：BbP4-ATPase基因3’侧翼序列；KanR：卡那霉素抗性基因。

图3为BbP4-ATPase同源重组载体质粒酶切验证结果

M：DNA分子量标准Marker15，1：NcoI/BamHI酶切片段。

用NcoI/BamHI酶切pK2-BbP4-ATPaseLB-bar-BbP4-ATPaseRB质粒载体，获得的目的片段为2Kb。

图4为BbP4-ATPase基因破坏突变体PCR验证结果

M：DNA分子量标准Marker15；1：pK2-BbP4-ATPaseLB-bar-BbP4-ATPaseRB质粒；2：BbP4-ATPase基因破坏突变体△BbP4-ATPase；3：异源重组转化子；4：球孢白僵菌野生型菌株Bb0062。

图5为BbP4-ATPase基因破坏突变体的表型

WT:球孢白僵菌野生型菌株Bb0062；Mu129：CsA敏感型球孢白僵菌T-DNA随机插入转化子；△BbP4-ATPase：BbP4-ATPase基因破坏突变体；CZA：察氏固体培养基；CsA：环孢菌素A。

图6为pLGN-35S-Nos植物表达载体构建流程图

LF-LF:重组酶识别位点(LoxpRT)，为全基因合成而成；35S-MCS-Nos来自pBIN AR载体(GenBank:AB752377.1)，通过PCR获得；NPTⅡ基因来自细菌转座子Tn5上的aphA2；GUS基因为报告基因，来自大肠杆菌。

图7为pLGN-35S-BbP4-ATPase载体质粒酶切验证结果

M：DNA分子量标准Marker15；BbP：pLGN-35S-BbP4-ATPase载体质粒经酶切后的获得的BbP4-ATPase目标片段。

图8为pLGN-35S-BbP4-ATPase植物表达载体图

pLGN-35S-BbP4-ATPase植物表达载体图，该载体中包含一个2×35S启动的GUS::NPTⅡ融合基因的表达框，一个35S启动的BbP4-ATPase基因的表达框。

图9为BbP4-ATPase转基因烟草GUS组织化学染色分析

WT：野生型的非转基因烟草；BbP：BbP4-ATPase转基因烟草。

图10为BbP4-ATPase转基因烟草GUS阳性植株的PCR扩增鉴定部分结果

bp：碱基对；M：DNA标准分子量DL2000；1：野生型非转基因阴性对照；2：质粒阳性对照；3-17：GUS染色阳性转基因烟草植株。BbP：BbP4-ATPase转基因烟草GUS阳性植株的PCR扩增结果。

图11为接种黄萎病菌30d，BbP4-ATPase转基因烟草植株的表型

WT：野生型的非转基因烟草；BbP：BbP4-ATPase转基因烟草。

图12为BbP4-ATPase和VdP4-ATPase转基因株系中外源基因的表达水平和病级比较

WT：野生型对照；BbP-1、BbP-4……BbP-39：BbP4-ATPase转基因烟草株系(独立的转化子)。

图13为BbP4-ATPase转基因棉花GUS组织化学染色分析

WT：野生型的非转基因棉花；BbP：BbP4-ATPase转基因棉花。

图14为BbP4-ATPase转基因棉花GUS阳性植株的PCR扩增鉴定部分结果

bp：碱基对；M：DNA标准分子量DL2000；1：野生型非转基因阴性对照；2：质粒阳性对照；3-17：GUS阳性转基因烟草植株。BbP：BbP4-ATPase转基因棉花。

图15为接种黄萎病菌20d，BbP4-ATPase转基因棉花T1代株系的病级、发病率(％)和病情指数

Null：转基因株系中分离的非转基因植株对照；B1、B10、B50、B53、B56、B57、B58、B6、B60和B61：BbP4-ATPase转基因棉花独立的转化子。

图16为接种黄萎病菌20d，BbP4-ATPase转基因棉花T1代幼苗的表型

WT：野生型的非转基因棉花；BbP：BbP4-ATPase转基因棉花；VdP：VdP4-ATPase转基因棉花。

图17为BbP4-ATPase转基因棉花外源基因的表达水平

图18为BbP4-ATPase转基因番茄GUS组织化学染色分析

WT：野生型对照；BbP：BbP4-ATPase转基因番茄。

图19为BbP4-ATPase转基因番茄GUS阳性植株的PCR扩增鉴定部分结果

bp：碱基对；M：DNA标准分子量；1：野生型非转基因阴性对照；2：质粒阳性对照；3-17：GUS染色呈阳性反应的番茄植株。

图20为接种黄萎病菌30d，植株的表型

WT：野生型对照；BbP：BbP4-ATPase转基因番茄。

具体实施方式

下面结合附图对本发明做进一步的详细说明，但以下说明并不对本发明进行限定。

本发明实施实例中的药品试剂未进行具体说明的均为国产常规化学试剂，材料方法未进行具体说明的均参考《分子克隆实验指南》(Sambrook和Russell，2001)。

1、发明技术核心策略的提出

1.1BbP4-ATPase基因缺失球孢白僵菌突变体的获得

1.1.1CsA敏感型球孢白僵菌T-DNA插入突变体的获得

根据Luo等(2009)构建突变体库的方法，获得球孢白僵菌T-DNA插入突变体库，并利用突变体对CsA敏感性的差异进行筛选，以100μg/mL的CsA为筛选压，获得了2个CsA敏感型突变体，分别命名为Mu129和Mu134(图1)。

取2μL球孢白僵菌分生孢子悬浮液(1×10⁷个/mL)，分别点状接种于CZA(察氏固体培养基)和附加100μg/mL环孢菌素A(CsA)的CZA培养基中，26℃培养10d后进行观察和拍照。

1.1.2球孢白僵菌CsA耐受相关基因的克隆

1)球孢白僵菌基因组DNA的提取

参照方卫国等(2002)丝状真菌DNA提取方法稍有改变进行球孢白僵菌基因组DNA的提取，具体操作如下：

1.接种球孢白僵菌(Beauveria bassiana)于1/4SDY(沙氏液体培养基)培养基中，26℃，200rpm，振荡培养3天，真空抽滤收集菌丝；

2.液氮速冻菌丝，研磨，每100mg菌丝加入300μL DNA提取液(PH7.5Tris-HCl0.2M,NaCl 0.5M,EDTA0.01M,SDS 0.035M)，混匀，冰上放置10min；

3.加入等体积的氯仿:异戊醇(24:1)，剧烈的涡旋5min；

4.12000rpm，4℃，10min离心，取上清液，加入一半体积的碱酚进行抽提，再加入与碱酚等体积的氯仿:异戊醇(24:1)抽提；

5.12000rpm，4℃，10min离心，取上清液，加入等体积的氯仿:异戊醇(24:1)再次抽提。

6、重复步骤5，取上清液至新离心管中；

7.加入所取上清液2.5倍体积冰浴无水乙醇，-80℃沉淀30min以上；

8.10000rpm，4℃，离心10min收集沉淀；

9.75％乙醇漂洗沉淀，真空干燥后，用ddH₂O溶解沉淀并用RNA酶进行处理，即得球孢白僵菌基因组DNA。

2)球孢白僵菌CsA耐受相关基因的克隆

以球孢白僵菌基因组DNA为模板，利用YADE法(肖月华等，2002；Fang etal.,2005)克隆Mu129和Mu134基因组中T-DNA插入位点侧翼序列，通过NCBI(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)比对后分析发现Mu129和Mu134中被破坏的是同一个基因，即phospholipid-translocatingP-ATPase ATPase，该基因编码的蛋白与来自酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的P4-ATPase Drs2具有约60％的相似度，因此将该基因命名为BbP4-ATPase。

1.1.3BbP4-ATPase基因破坏载体的构建

为了进一步证明CsA敏感突变体表现的CsA敏感的特性是BbP4-ATPase基因突变所致，构建球孢白僵菌的BbP4-ATPase基因破坏载体进行验证。在BbP4-ATPase基因的核苷酸序列上下游各取一段序列作为同源重组的置换片段。

扩增BbP4-ATPaseLB片段所用引物为：

BbP4-ATPaseLB-F:5’-GGAATTCCGATGTCGTTCGAGTCGAAT-3’(EcoRI)(SEQ ID NO.1)

BbP4-ATPaseLB-R:5’-GGAATTCGTGTAGGCGTTCAAGAATGA-3’(EcoRI),(SEQ IDNO.2)

扩增BbP4-ATPaseRB片段所用引物为：

BbP4-ATPaseRB-F:5’-GCTCTAGAAGCTTGCCATAATGTGCAAG-3’(XbaI)(SEQ ID NO.3)

BbP4-ATPaseRB-R:5’-CCCAAGCTTTTCTTGGTGGTGTCGTAGGC-3’(HinDIII)(SEQ IDNO.4)。

扩增体系为：10×LATaq PCR Buffer2.5μL，25mM MgCl₂2.5μL，2.5mMdNTPMixture 4μL，100μg/μL球孢白僵菌基因组模板2μL，10μM上下游引物各1μL，LATaq5U/μL 0.25μL,加水至25μL体系。扩增程序为：94℃5min；95℃30s，56℃30s，72℃1min 30s，循环30次；72℃10min。

载体构建流程如下：

1)以球孢白僵菌基因组DNA为模板分别扩增获得BbP4-ATPaseLB和BbP4-ATPaseRB片段，并分别回收PCR扩增产物；

2)用XbaI/HinDIII消化步骤1)获得的胶回收BbP4-ATPaseRB产物，并再次回收酶切后的片段，构建入利用相同酶消化的pK2-bar载体，获得pK2-bar-BbP4-ATPaseRB；

3)用EcoRI酶切步骤1)的胶回收BbP4-ATPaseLB产物，再次回收酶切后的片段，将该片段构建入利用相同酶进行酶切且做去磷酸化处理的pK2-bar-BbP4-ATPaseRB载体中，获得pK2-BbP4-ATPaseLB-bar-BbP4-ATPaseRB，用NcoI/BamHI酶切验证连接方向，切下片段长约2kb为正确的连接。构建的基因破坏载体图谱见图2，酶切验证结果见图3。

1.1.4BbP4-ATPase基因缺失突变体的获得及验证

将1.1.3中构建好的载体pK2-BbP4-ATPaseLB-bar-BbP4-ATPaseRB利用电击法导入根癌农杆菌AGL-1，提取质粒并进行酶切验证，获得图3所示结果的AGL-1转化子用于转化球孢白僵菌。以野生型球孢白僵菌Bb0062为受体，参照Fang等(2004)的方法进行农杆菌介导的球孢白僵菌的遗传转化，利用PCR对获得的转化子进行验证，验证所用引物为MS-F:

5’-CGTAAGAGAATGTCGACCAT-3’/MS-R:

5’-CTGAATCATCGACACGTCGT-3’，同源重组转化子将扩增出1862bp的片段，野生型菌株扩增出789bp的片段，而异源重组转化子将扩增出1862bp/789bp两个片段。PCR扩增体系如下：10×LATaq PCR Buffer 2.5μL，25mM MgCl₂2.5μL，2.5mM dNTP Mixture 4μL，100μg/μL球孢白僵菌基因组模板2μL，10μM上下游引物各1μL，LATaq 5U/μL 0.25μL加水至25μL体系。扩增程序为：94℃5min；95℃30s，56℃30s，72℃1min 30s，循环30次；72℃10min。扩增结果如图4所示，同时对同源重组突变体的表型做进一步的分析验证，结果显示(图5)，CsA敏感型突变体与BbP4-ATPase基因缺失突变体表型一致。表明，实施实例1.1.1获得的CsA敏感型突变体为BbP4-ATPase基因缺失突变体。

取2μL球孢白僵菌分生孢子悬浮液(1×10⁷个/mL)，分别点状接种于CZA和附加10μg/mL环孢菌素A(CsA)的CZA培养基中，26℃培养10d后进行观察和拍照，BbP4-ATPase基因破坏突变体和Mu129突变体获得一致的表型。标尺＝1cm。

1.2发明技术核心策略的提出

实施实例1.1.4的研究结果表明，球孢白僵菌BbP4-ATPase基因破坏突变体对CsA较为敏感。BbP4-ATPase是一种膜蛋白，参与细胞内的囊泡运输，所以我们推测，CsA可能以囊泡运输的方式被运输至某一特定部位进行分解或利用(如液泡)，从而提高球孢白僵菌对CsA的耐受性，而CsA是一种由11个氨基酸组成的亲脂疏水性环肽，其结构可能与黄萎病菌毒素的某些致病组分的结构类似，因此，结合黄萎病菌致病机制，本发明创造性地提出该发明的核心策略，“在转基因植株内利用球孢白僵菌和黄萎病菌的P类ATP酶来解毒黄萎病菌毒素，进而提高转基因植株对黄萎病的抗性”。

2、BbP4-ATPase基因的克隆

2.1球孢白僵菌RNA的提取及cDNA的合成

取适量球孢白僵菌野生型菌株Bb0062菌丝于50mL 1/4SDY(1/4沙氏液体培养基)培养基中，200rpm，26℃振荡培养3天，抽滤、收集菌丝，利用液氮研磨法，按Aidlab公司的EASYspin RNA快速提取试剂盒使用说明书提取球孢白僵菌的总RNA，获得的RNA利用1％琼脂糖电泳检测质量。再利用TaKaRA公司的RT reagent Kit withgDNAEraser试剂盒合成cDNA，操作严格按说明书进行。

2.2BbP4-ATPase基因的克隆

以实施实例2.1获得的球孢白僵菌cDNA为模板，以BbP4-ATPase基因上游引物5’-CGGGATCCATGGCTGGACGACCTCCTGG(BamHI)-3’和下游引物5’-GACTAGTCTATTGCGGACGCGAGCTGG(SpeI)-3’为引物，利用KOD-Plus-Neo(TOYOBO)酶进行PCR扩增，回收扩增产物，获得带有BamHI/SpeI酶切位点的BbP4-ATPase片段。

PCR扩增体系为：10×PCR Buffer 5μL，2mM dNTPs 5μL，25mM MgSO₄3μL，10μM上下游引物各2μL，模板(50μg/μL)4μL，KOD-Plus-Neo 1μL(1U/μL)，加水至50μL，扩增程序为94℃2min；98℃10s，68℃4min 30s，循环40次。

3、pLGN-35S-BbP4-ATPase植物表达载体的构建及农杆菌转化子的获得

3.1pLGN-35S-Nos植物表达载体的获得

pLGN-35S-Nos为本实验室由pCambia2300改造而来的一个双元植物表达载体。其T-DNA区段(RB和LB之间区域)替换成组成型启动子CaMV35S-P控制的报告基因GUS和标记基因NPTII的融合基因表达盒，并在这个表达盒两端各添加了一个LoxpFRT重组酶识别位点，以及另一个由CaMV35S-P控制的表达盒，具体过程如图6所示。

3.2pLGN-35S-BbP4-ATPase植物表达载体的构建

将上述实施实例2.2获得的片段用BamHI和SpeI进行双酶切，并回收酶切片段，同时用BamHI和SpeI进行双酶切pLGN-35S-Nos质粒，并回收酶切后的大片段，然后利用T4DNA连接酶连接回收的BbP4-ATPase片段和pLGN-35S-Nos片段，连接产物转化大肠杆菌DH5α，筛选阳性克隆并进行酶切验证(如图7所示)，结果表明，已成功将BbP4-ATPase基因片段连接入pLGN-35S-Nos载体，根据载体序列设计引物进行测序分析，测序验证获得的BbP4-ATPase基因序列见SEQ ID NO.15，-80℃保存pLGN-35S-BbP4-ATPase植物表达载体阳性克隆备用，载体具有图8所示的结构。

3.3pLGN-35S-BbP4-ATPase植物表达载体的重组农杆菌的获得

利用电转化法，将步骤3.1获得的pLGN-35S-BbP4-ATPase植物表达载体转入农杆菌LBA4404感受态细胞，利用抗生素筛选标记基因进行抗性筛选，获得阳性克隆，再提取农杆菌质粒并用BamHI和SpeI进行双酶切验证(验证结果与图7酶切验证结果相同)，获得含有pLGN-35S-BbP4-ATPase植物表达载体的重组农杆菌。

提取pLGN-35S-BbP4-ATPase载体转化的大肠杆菌或农杆菌质粒，BamHI和SpeI进行双酶切后利用1％的琼脂糖凝胶进行电泳，获得了约4080bp的目的片段。

4、转基因植株的分子鉴定

4.1转基因植株的GUS组织化学染色鉴定

参照Jefferson等(1987)的方法，用9mm孔径把孔器切取再生烟草、番茄或棉花植株幼嫩叶片置GUS染色液(500mg/L X-Gluc，0.1mol/L K₃Fe(CN)₆，0.1mol/L K₄Fe(CN)₆，1％Triton X-100(v/v)，0.01mol/L Na₂EDTA，pH7.0的0.1mol/L磷酸缓冲液)中，37℃保温2h。染色后，75％乙醇脱色，每4h更换一次脱色液，直至未着色部分的颜色完全褪去。叶片都没有蓝色出现的再生材料为非转基因植株，染出蓝色的为转基因植株。

4.2BbP4-ATPase转基因植株的PCR扩增鉴定

所有再生的GUS组织化学染色呈阳性反应的烟草、番茄和棉花植株，取其幼苗叶片约0.1g，按照说明书的操作程序，利用Aidlab公司的新型植物基因组DNA快速提取试剂盒提取DNA，获得DNA后用1％的琼脂糖凝胶电泳检测DNA的质量，然后以提取的DNA为模板，扩增BbP4-ATPase基因的片段，以检测再生植株是否都整合了BbP4-ATPas基因。

BbP4-ATPase基因PCR扩增引物为：上游引物：5’-AACAGGCCGATAATGCGCTA-3’；下游引物：5’-GTCTCGGGAAGTCCTTGC TT-3’。

25μL扩增体系包括：10×LAPCR Buffer，2.5μL；25mmol/L MgCL₂，2.5μL；2.5mmol/L dNTP Mixture，2μL；模板DNA，1μL(约10ng)；5μmol/L上游引物，1μL；5μmol/L下游引物，1μL；LATaq酶，0.2μL；ddH₂O，14.8μL。

PCR温度循环参数：94℃，5min；94℃，30s，57℃，30s，72℃，30s，扩增30个循环；72℃，10min。最后扩增产物用1％的琼脂糖凝胶电泳检测。

5、抗病鉴定致病菌的获得及植株病级统计标准

5.1抗病鉴定用致病菌的获得

PDA固体培养基活化的落叶型黄萎病菌V991(Verticillium dahliae，中国农业科学研究院植物保护研究所，简桂良研究员惠赠)或强致病力L2-1菌株(河北农业大学，马峙英教授惠赠)，挑取少许菌丝接种入CZB(察氏液体培养基)中，180rpm，26℃振荡培养7d，再按10％(菌液/CZB培养基)的比例接种入CZB培养基，180rpm，26℃振荡培养7d，用四层无菌纱布过滤去除菌液中的菌丝及杂质，去离子水调整黄萎病菌孢子浓度达到10⁷个/ml，该孢子悬浮液即为抗病鉴定接种的致病菌接种液。

5.2转基因植株的病级统计标准

参照Bhat和Subbarao(1999)的棉花幼苗病级的5级病级统计方法，统计棉花、烟草和番茄植株的病级。

0级：植株外表无病症；

1级：植株叶片1/3以下显病症；

2级：植株叶片1/3-2/3显病症；

3级：植株叶片2/3以上显病症；

4级：植株叶片全部表现病症。

5.3发病率和病情指数计算公式

6、基因转录表达检测

6.1RNA的提取及cDNA的合成

利用植物RNA快速提取试剂盒(Aidlab产品)，提取植物RNA，所有操作严格按说明书进行，获得的RNA利用1％琼脂糖电泳检测质量。再利用RT reagent Kitwith gDNAEraser试剂盒(TaKaRa产品)合成cDNA，再以cDNA为模板扩增目标基因，RNA中植物基因组DNA的去除以及cDNA的合成均严格按说明书进行。

6.2基因转录表达检测

利用Real-time PCR方法检测植株内转基因的表达水平。为均一化cDNA浓度，棉花以GhHIS3基因为内标，烟草则以18S基因为内标。

20μL反应体系包括：cDNA1μL，上下游引物各1μL，2×iQ SYBR Green Supermix 10μL，用无RNA酶的双蒸水补足20μL。

扩增程序为：95℃预扩增3min；94℃10s，56℃30s，72℃30s，共扩增40个循环。扩增完成后利用Gene Study软件分析基因的相对表达量。

7、烟草的遗传转化及转基因植株的获得

7.1烟草遗传转化用培养基

MSB：MS无机盐(Murashige and Skoog,1962)+B5有机(Gamborg等，1968)。

种子萌发培养基：MSB+30g/L蔗糖，加入2.0g/L Gelrite进行固化，pH6.0。

共培养培养基：MSB+30g/L蔗糖+0.5mg/L IAA(吲哚乙酸)+2.0mg/L 6-BA(6-苄氨基嘌呤)，加入2.0g/L Gelrite进行固化，pH5.4。

愈伤诱导培养基：MSB+30g/L蔗糖+0.5mg/L IAA+2.0mg/L 6-BA+400mg/L Cef(头孢霉素)+100mg/L Km(卡那霉素)，加入2.0g/L Gelrite进行固化，pH5.8。

幼芽诱导培养基：MSB+30g/L蔗糖+2.0mg/L 6-BA，200mg/L Cef+100mg/L Km，加入2.0g/L Gelrite进行固化，pH5.8。

生根培养基：MSB+30g/L蔗糖+200mg/L Cef，加入2.5g/L Gelrite进行固化，pH5.8。

7.2烟草遗传转化外植体的获得

取成熟烟草种子数粒，75％的酒精灭菌1min，快速倾去酒精；1％的次氯酸钠溶液灭菌15min，期间不停振荡，以达到充分消毒的目的；倾去氯酸钠溶液，利用无菌双蒸水漂洗种子7-8次。无菌条件下120rpm，室温振荡培养至种子萌芽，再转入种子萌发培养基，16h光照/8h暗培养条件下培养至4-6片真叶。取生长完全的真叶，超净台上无菌条件下用手术刀片切成3-5mm介方的叶盘用作转化的外植体。

7.3农杆菌浸染液的制备

-80℃保存的含pLGN-35S-BbP4-ATPase载体的农杆菌菌株划线培养获得单菌落，再挑取单菌落，接种入附加50mg/L Km和125mg/L Sm(硫酸链霉素)的YEB培养基中(5g/L蔗糖，1g/L细菌用酵母抽提物，10g/L细菌用胰化蛋白胨，0.5g/L MgSO₄·7H₂O，pH7.0)，28℃、200rmp振荡培养过夜，至菌液OD600值达到0.8时，取菌液离心，菌体用添加同体积MSB液体培养基重悬，重悬液即为转化用的农杆菌浸染液。

7.4烟草的遗传转化及植株再生

步骤7.2获得的叶盘外植体于步骤7.3制备的农杆菌浸染液内浸染30min，之后倾去菌液，经农杆菌感染的烟草外植体，接种至共培养培养基内，26℃暗培养2d，然后继代入愈伤诱导培养基，14d后继代入芽诱导培养基，再培养约14d，切取再生绿芽继代入生根培养基中，生根培养基内培养至2-3叶幼苗，洗净根周围的琼脂，移栽入盛装草炭土的营养钵内，并放置于温室进行培养。

7.5转基因烟草的分子鉴定及转基因植株的获得

按照实施实例6的方法分别对再生的烟草植株进行GUS组织化学染色和PCR扩增鉴定。凡烟草叶片GUS组织化学染色能获得如图9所示蓝色的植株均是转基因植株。经GUS组织化学染色鉴定共获得了38个BbP4-ATPase转基因烟草株系。为了进一步确定GUS组织化学染色鉴定呈阳性反应的植株内是否都整合了BbP4-ATPase基因，所有GUS染色呈阳性反应的再生植株提取叶片总DNA后，再以DNA为模板，以合成的序列9和序列10为引物，扩增BbP4-ATPase基因片段，结果显示，所有BbP4-ATPase转基因再生烟草GUS阳性反应植株都能扩增获得BbP4-ATPase基因约240bp的目标片段，(图10)，说明GUS染色阳性植株内均整合了BbP4-ATPase基因。经GUS组织化学染色和PCR扩增鉴定，共获得了38个BbP4-ATPase转基因烟草的独立转化子，所有这些转化子全部用于抗病鉴定分析。

以转基因烟草GUS染色呈阳性反应植株叶片的DNA为模板，以合成的SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10为引物扩增BbP4-ATPase基因的片段，所有GUS染色阳性反应的植株都能扩增获得约240bp的BbP4-ATPase基因的目的片段。

8、转基因烟草对黄萎病的抗性

经实施实例7遗传转化和分子鉴定获得的转基因烟草植株温室内生长至6-10片叶时，利用手术刀片在离植株约1-2cm处进行伤根处理，然后每株浇灌实施实例5.1制备的L2-1接种液30mL(伤根灌菌液法)，置22℃(夜间)-26℃(白天)的人工气候室内培养。接种30d，按实施实例7.2的标准统计转基因植株的病级。结果显示，38个独立的BbP4-ATPase转化子的平均病级为1.39，病情指数为34.87。而野生型非转基因对照(再生的野生型植株)的平均病级为3.03，病情指数为75.65(表1)，与非转基因对照相比，BbP4-ATPase转基因株系的病情指数降低了40.7。

接种30d，BbP4-ATPase转基因烟草不仅病级和病情指数明显低于野生型非转基因对照，而且38个BbP4-ATPase转化子中有9个转化子，而非转基因对照植株全部严重萎蔫，叶片失绿(图11)。随机选取5个未发病转化子利用腋芽进行扩大繁殖，然后再利用相同的方式接种黄萎病菌，进行抗病鉴定，结果显示接种30天，这些转化子仍未表现出明显的病症，进一步证实获得的抗病转基因烟草对黄萎病的抗性显著提高。结果表明，利用BbP4-ATPase基因能明显提高转基因烟草对黄萎病的抗病性。

为了进一步明确转基因株系抗病水平提高与转基因表达水平间的关系，随机选取20个BbP4-ATPase转基因烟草为研究对象，以实施实例6.1的方法提取转基因烟草植株叶片的RNA，并按实施实例6.1的方法合成cDNA，再以cDNA为模板扩增BbP4-ATPase基因片段，然后按实施实例6.2的方法进行定量PCR扩增，以18S rRNA基因为内标。结果显示，所有转转基因植株内BbP4-ATPase基因都能进行有效的转录表达，且转录表达水平越高转基因植株的病级越低，即抗性与转基因的转录表达水平存在着一定的相关性，其转基因的转录表达水平越高，转基因植株对黄萎病的抗性越好。转基因株系的表达水平和病级见图12。

具体方法：以转基因烟草幼苗叶片为材料，提取转基因植株的RNA，并反转录合成cDNA，以cDNA为模板，以合成的SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10为引物扩增BbP4-ATPase基因，以烟草的18S rRNA基因为内标基因，并以合成的SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12为引物进行扩增，扩增完成后利用Gene Study软件分析基因的相对表达量。

表1接种黄萎病菌30d，BbP4-ATPase转基因烟草的病级和病情指数

	转化子总数(个)	未发病转化子数(个)	平均病级	病情指数
					WT	36	0	3.03	75.69
BbP4-ATPase	38	9	1.39	34.87

WT：野生型植株；BbP4-ATPase：BbP4-ATPase转基因烟草植株。

38个BbP4-ATPase转基因烟草转化子全部利用伤根灌菌液法接种黄萎病菌孢子悬浮液(10⁷个孢子/mL)，接种30d，按0-4级的5级标准统计每个转化子的病级，然后分别计算所有转化子和对照的平均病级和病情指数。非转基因对照全部严重发病，平均病级达到了3.03，病情指数达到了75.69，而BbP4-ATPase转基因株系的平均病级为1.39，病情指数为34.87。

9、棉花的遗传转化：

9.1棉花遗传转化用培养基

基本培养基:MSB(MS无机盐+B5有机)；

种子萌发培养基:1/2MSB+20g/L蔗糖+6g/L琼脂，自来水配制，自然pH；

共培养培养基:MSB+0.5mg/L IAA+0.1mg/L KT(6-糠氨基嘌呤)+30g/L葡萄糖+100μmol/L乙酰丁香酮+2.0g/L Gelrite，pH5.4；

筛选脱菌培养基:MSB+0.5mg/L IAA+0.1mg/L KT+75mg/L Km+500mg/L cef+30g/L葡萄糖+2.0g/L Gelrite，pH5.8；

愈伤诱导培养基:MSB+0.5mg/L IAA+0.1mg/L KT+75mg/L Km+200mg/L cef+30g/L葡萄糖+2.0g/L Gelrite，pH5.8；

胚性愈伤诱导培养基:MSB+0.1mg/L KT+30g/L葡萄糖+2.0g/L Gelrite，pH5.8；

液体悬浮培养基：MSB+1.91g/L硝酸钾+0.1mg/L KT+30g/L葡萄糖,pH5.8；

体胚成熟培养基:MSB+15g/L蔗糖+15g/L葡萄糖+0.1mg/L KT+2.5g/L Gelrite，pH6.0；

成苗培养基:SH+0.4g/L活性碳+20g/L蔗糖，pH6.0。(Schenk&Hildebrandt，1972)

9.2转化外植体的获得

陆地棉种子去壳，籽仁0.1％升汞灭菌10min，无菌自来水漂洗5-6次后，接种于种子萌发培养基，28℃暗培养5-7d。无菌下胚轴切成3-5mm长的切段，作为转化外植体。

9.3转化用农杆菌浸染液的制备

转化用农杆菌的制备同实施实例7.3，培养的农杆菌菌液离心后，菌体用添加同体积的共培养液体培养基重悬，重悬液即为转化用农杆菌浸染液。

9.4棉花下胚轴的遗传转化和胚性愈伤的诱导

外植体用农杆菌浸染液浸染20min，倾去菌液，再用无菌滤纸吸去外植体表面多余的菌液，浸染后的下胚轴切段接种于共培养培养基，26℃暗培养2d，将下胚轴接种至筛选脱菌培养基，20d后继代入附加卡那霉素(Km)和头孢霉素(cef)的愈伤诱导培养基进行愈伤的诱导，间隔20d继代一次，60d后继代入胚性愈伤诱导培养基，获得胚性愈伤后进行液体悬浮培养，以获得大量生长一致的胚性愈伤。

9.5体胚的诱导和成苗培养

液体悬浮培养的胚性愈伤，30目不锈钢筛网过滤，筛下的胚性愈伤均匀分散地接种入体胚成熟培养基，约15d产生大量的体胚，将其继代入SH培养基，促进体胚进一步成苗。3-4叶的再生苗移栽入温室进行繁殖。

9.6BbP4-ATPase转基因棉花的获得和分子验证

以再生的棉花叶片为材料，按实施实例4的方法分别对再生植株进行GUS组织化学染色和PCR扩增鉴定。GUS组织化学染色能获得图13所示的蓝色的植株为转基因植株，以来源于一个外植体的再生植株为一个株系进行计算，经GUS组织化学染色鉴定获得的BbP4-ATPase转基因棉花为10个GUS阳性株系，为185株转基因植株。为进一步确定GUS阳性植株中是否全部整合了BbP4-ATPase基因，按实施实例4.2的方法对转基因植株进行PCR扩增鉴定，结果显示，所有GUS组织化学染色呈阳性反应的植株均能扩增出BbP4-ATPase(约240bp)基因的目标特异带(图14)。以相同的方式对T₁代幼苗进行分子鉴定，经分子鉴定的转基因植株T₁代幼苗均用于抗病分析。

具体方法：以转基因棉花叶片的DNA为模板，以合成的SEQ ID NO.9和SEQ IDNO.10为引物扩增BbP4-ATPase基因的片段，所有GUS染色阳性反应的植株均能扩增出BbP4-ATPase(约240bp)基因的目标特异带。

10、转基因棉花对黄萎病的抗性

温室繁殖T₀代植株收获的种子去壳留籽仁，28℃萌发后进行水培养，直至子叶平展开始出现真叶，采用浸根接种法接种实施实例5.1获得的V991落叶型黄萎病菌，根侵染2d后移栽入营养钵内，然后22℃(夜间)-26℃(白天)，16h光照，8h黑暗条件下培养，接种后间隔5d按实施实例5.2的病级标准统计一次植株的病级，接种20d，转基因株系中分离的非转基因植株(Null)全部发病，病情指数达到82.24，获得的10个转基因BbP4-ATPase株系的病情指数都低于非转基因对照，其中BbP1、BbP10、BbP50、BbP53和BbP58等5个转基因株系的发病率都低于50％，病情指数都低于30，其中发病率分别为38.46％、27.27％、33.33％、18.18％和39.29％，病情指数分别为23.08、18.18、8.33、4.55和25.45(图15)。这5个株中的B50和B53株系的病情指数低于10都达到了抗病水平，其余3个株系达到了耐病水平。利用平均病级进行比较，结果显示，接种20d，非转基因对照的平均病级为3.29，对非落叶型黄萎病V991菌株表现为易感，BbP1、BbP10、BbP50、BbP53和BbP58这5个株系的平均病级分别为0.92、0.73、0.33、0.18和1.02，对黄萎病V991菌株表现为抗或耐。

利用浸根接种法接种落叶型黄萎病菌V991菌株，接种20d，按0-5级病级标准统计病级，并计算发病率、病情指数，以及计算每个株系的平均病级。结果显示，转基因株系的发病率、病情指数和平均病级都明显低于非转基因对照，表明BbP4-ATPase转基因棉花对黄萎病的抗性明显提高。

接种20d，非转基因对照植株因黄萎病菌感染叶片都出现了黄萎病典型的病症，上部叶片失绿变色、部分叶片坏死甚至脱落，而抗性提高的BbP4-ATPase转基因棉花真叶叶色正常，植株生长正常，只是个别植株子叶出现了轻微的病症，有少许病斑(图16)，明显提高了对黄萎病的抗性。

为了进一步说明转基因表达水平与抗病性间的关系，利用Real-time PCR检测外源基因的转录表达水平。以转基因株系为材料，每个株系取三个样品提取RNA，并反转录合成cDNA，然后以cDNA为模板，SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10为引物扩增BbP4-ATPase基因，以GhHIS3基因为内标基因，扩增引物为SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14。结果显示(图17)，所有BbP4-ATPase转基因植株内BbP4-ATPase基因都能有效转录表达，与转基因株系病情指数相比较，转基因表达水平的高低影响着转基因株系的抗性水平，转基因表达水平较高时，转基因株系的抗病性更好。

11、番茄的遗传转化

11.1番茄遗传转化用培养基

基本培养基:MSB0(MS无机+B5有机+30g/L蔗糖，pH5.8)。固体培养基加入6g/L的琼脂(Murashige和Skoog，1962；Gamborg等，1968)；

共培养培养基MSB1:MSB0+2.0mg/L 6-BA+0.2mg/L IAA+100uM AS(乙酰丁香酮)+6g/L琼脂，pH5.4；

筛选培养基MSB2:MSB1+500mg/L cb(羧苄青霉素)+100mg/L Km+6g/L琼脂，pH5.8；

继代培养基MSB3:MSB0+200mg/Lcb+100mg/L Km+6g/L琼脂，pH5.8；

生根培养基MSB4:MSB0+0.5mg/L IAA+200mg/L Cef+50mg/L Km+6g/L琼脂，pH6.0。

11.2番茄遗传转化外植体的获得

Micro-Tom番茄种子1％次氯酸钠溶液灭菌10-15min，然后无菌自来水冲洗5-6次，接种至MSB0培养基上，25℃、16h光照/8h黑暗的光周期于萌发7d左右，生长健壮平展的无菌幼苗子叶切去两端，中部约2/3的部分留作农杆菌介导遗传转化的外植体。

11.3转化用农杆菌浸染液的制备

转化用农杆菌的制备同实施实例7.3，培养的农杆菌菌液离心后，菌体用添加同体积的MSB0液体培养基重悬，重悬液即为转化用农杆菌浸染液。

11.4番茄遗传转化

参考Cortina等(2004)的方法，以生长约7d无菌苗的子叶为外植体，利用根癌农杆菌介导法进行遗传转化。

农杆菌浸染液浸染外植体10min后倾去菌液，无菌吸水纸吸去外植体表面多余菌液，然后接种入铺有一层无菌滤纸的共培养培养基MSB1，25℃暗共培养2d。共培养完成后，将外植体接种入筛选培养基MSB2中进行分化培养，25℃、16h光照/8h黑暗的光周期培养2周，然后将外植体继代入MSB3培养基诱导愈伤生成，每2周继代一次。产生Km抗性幼芽后，将幼芽切下接种入MSB4生根培养基，获得Km抗性再生植株。根长3-5cm的再生幼苗，移栽入温室生长成苗。

11.5转基因番茄的分子鉴定和转基因植株的获得

按照实施实例6的方法分别对再生的番茄植株进行GUS组织化学染色和PCR扩增鉴定。凡番茄叶片GUS组织化学染色能获得如图18所示蓝色的植株均是转基因植株，经GUS组织化学染色鉴定共获得了27株BbP4-ATPase转基因番茄植株，为了进一步确定GUS组织化学染色鉴定呈阳性反应的植株内是否都整合了BbP4-ATPase基因，所有再生植株提取叶片总DNA，再以DNA为模板，以合成SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10为引物，扩增BbP4-ATPase基因的片段，结果显示，所有GUS阳性反应植株都能扩增获得BbP4-ATPase(约240bp)基因的目标特异带(图19)。PCR扩增结果说明，GUS染色呈阳性反应的BbP4-ATPase植株内均整合了BbP4-ATPase基因。经GUS组织化学染色和PCR扩增鉴定，共获得了27个BbP4-ATPase转基因植株，所有这些转化子T₀代植株全部用于抗病鉴定分析。

12、转基因番茄对黄萎病的抗性

经实施例11遗传转化和分子鉴定获得的转基因番茄植株，温室内生长至4-6片叶时，利用手术刀片在离植株约1-2cm处进行伤根处理，每株对称地伤根然后每株浇灌实施实例5.1制备的L2-1接种液15mL，置22℃(夜间)-26℃(白天)的培养室内培养。接种20d，按实施实例5.2的标准统计转基因植株的病级。

抗病鉴定结果显示(表2)，接种30d，野生型对照(再生的野生型植株)的平均病级为3.13，病情指数为78.33。27个BbP4-ATPase转基因番茄转化子的平均病级为1.78，病情指数为44.44，与非转基因对照相比，转基因株系的病情指数降低了33.89。接种30d，BbP4-ATPase转基因番茄不仅病级和病情指数明显低于非转基因对照，而且27个BbP4-ATPase转化子中有12个转化子的病级没有超过1，抗性提高的转基因植株只是最底部的叶片出现轻微的病症，而非转基因对照植株的病级都在3以上，且中上部的叶片已经开始失绿变黄(图20)。

抗病鉴定结果表明，利用BbP4-ATPase基因能明显提高转基因番茄对黄萎病的抗病性。

表2接种黄萎病菌30d，转基因番茄的病级和病情指数

	转化子总数(个)	病级≤1转化子数(个)	平均病级	病情指数
					WT	15	0	3.13	78.33
BbP	27	12	1.78	44.44

CK：野生型对照；BbP：BbP4-ATPase转基因番茄。

所有植株利用伤根灌菌液法接种黄萎病菌孢子悬浮液(10⁷个孢子/mL)，接种30d，按0-4级的5级标准统计每个转化子的病级，然后分别计算所有转化子和对照的平均病级和病情指数。非转基因对照全部发病，平均病级为3.13，病情指数达到了78.33，BbP4-ATPase转基因番茄的病级和病情指数均显著下降。

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Claims

1.球孢白僵菌BbP4-ATPase基因在提高植物对黄萎病抗性中的用途，其特征在于通过将球孢白僵菌BbP4-ATPase基因整合进入目标植物构建转基因植物，并使得所述BbP4-ATPase基因在植物中表达而提高植物对黄萎病的抗性，其中所述球孢白僵菌BbP4-ATPase基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.15所示，所述植物为番茄、烟草或棉花。

2.一种提高植物对黄萎病抗性的方法，其中通过在目标植物体内表达外源基因而提高所述植物对黄萎病的抗性，所述外源基因为球孢白僵菌BbP4-ATPase基因，所述球孢白僵菌BbP4-ATPase基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.15所示，所述植物为番茄、烟草或棉花。

3.权利要求2所述的方法，包括下述步骤：

4.如权利要求2所述的方法，包括下述步骤：

3)获得具有提高的抗黄萎病的转基因植物。

5.如权利要求4所述的方法，其中步骤1)所述的重组植物表达载体如图8所示。

6.一种具有黄萎病抗性的转基因植物的制备方法，包括以下步骤：

ii)用步骤i)获得的植物表达载体转化宿主，获得转化体；

iii)用步骤ii)获得的转化体转化植物，获得转基因植物,

其中所述的球孢白僵菌BbP4-ATPase基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.15所示,所述植物为番茄、烟草或棉花。