CN101967483B

CN101967483B - 棉花fdh基因的启动子及其应用

Info

Publication number: CN101967483B
Application number: CN 201010291850
Authority: CN
Inventors: 朱玉贤; 秦咏梅; 柳皋隽
Original assignee: Peking University
Current assignee: Peking University
Priority date: 2010-09-26
Filing date: 2010-09-26
Publication date: 2013-03-27
Anticipated expiration: 2030-09-26
Also published as: CN101967483A

Abstract

本发明公开了棉花FDH基因的启动子及其应用。本发明所提供的棉花FDH基因为如下1)-3)中任一所述的DNA分子：1)序列表中序列1所示的DNA分子；2)在严格条件下与1)的DNA分子杂交且具有相同功能的DNA分子；3)与1)或2)的DNA分子具有90％以上同源性且具有相同功能的DNA分子。本发明构建了1个FDH基因启动子片段(807bp)驱动GUS基因表达载体。GUS组织化学染色证实这个启动子片段能指导报告基因在棉花纤维中正常表达。因此，FDH启动子可用于研究棉花纤维的发育、品质改良以及外源基因在棉花纤维中的特异表达。

Description

棉花FDH基因的启动子及其应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域中棉花FDH基因的启动子及其应用。

背景技术

我国是全球最大的棉花生产国，棉花作为首要的纤维作物和重要的油料作物在我国国民经济中起着举足轻重的作用。由于人民对于生活水平要求的不断提高，纺织工业快速发展，以至对棉纤维品质的要求越来越高。我国棉花纤维品质偏差，比强度也比较低，棉纤维品质问题已成为制约我国棉花产业可持续发展的主要障碍。

棉纤维发育可分成四个相互重叠的时期：纤维细胞的起始(开花前1天至开花后2-3天)、伸长(开花后2-3天至25天)、次生壁沉积(开花后16天至45天)及成熟期(开花后45天至50天)。对于快速伸长时期的纤维，其伸长的峰值速率可达到2毫米/天。纤维的长度与强度决定了纤维的品质，研究棉纤维发育的分子机理是棉花遗传改良的基础。

启动子位于基因5’端上游(非翻译区)的一段DNA序列，作为调控基因表达的“开关”，控制基因表达的起始时间和表达的程度，因此，启动子是决定基因特异性表达的DNA序列，受其调控的基因表达呈现明显的组织特异性和发育的阶段性。在棉纤维遗传改良中，纤维特异启动子是重要的基因工程元件，利用此类启动子可驱动对纤维品质改良有用的基因在纤维中实现特异性的表达。因此，分离与克隆特异性强、活性高的启动子是棉纤维基因工程改良的重要内容，是建立棉花高效遗传转化体系的基础。

启动子不仅决定着基因的时空表达，也决定了基因的表达强度。目前，在植物基因工程中，CaMV35S启动子被广泛应用。CaMV35S启动子是组成型表达启动子，驱动外源基因在植物各组织的发育过程中表达。但是，在利用分子生物学手段对植物进行改良的过程中，人们更希望插入的外源基因可以在特定的组织中特异表达，从而在获得优良性状的同时不影响其他特性。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种DNA分子。

本发明所提供的DNA分子，来源于棉花(Gossypium spp.)，为如下1)-3)中任一所述的DNA分子：

1)序列表中序列1所示的DNA分子；

2)在严格条件下与1)的DNA分子杂交且具有相同功能的DNA分子；

3)与1)或2)的DNA分子具有90％以上同源性且具有相同功能的DNA分子。

含有所述DNA分子的表达盒、重组表达载体、转基因细胞系或重组菌也属于本发明的保护范围。

所述重组表达载体为用所述DNA分子替换pCAMBIA 1305载体上的35S启动子得到的重组表达载体。

本发明的另一个目的是提供所述DNA分子在使目的基因在棉纤维细胞中表达中的应用。

本发明构建了1个FDH基因启动子片段(807bp)驱动GUS基因表达载体。GUS组织化学染色证实这个启动子片段能指导报告基因在棉花纤维中正常表达。因此，FDH启动子可用于研究棉花纤维的发育、品质改良以及外源基因在棉花纤维中的特异表达。

附图说明

图1为实时定量qRT-PCR检测FDH基因在棉花不同组织的表达。

图2为陆地棉FDH基因启动子序列分析。

图3为棉花胚珠瞬时表达体系分析FDH promoter-pCAMBIA1305载体启动GUS基因的表达。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、克隆陆地棉FDH基因启动子序列

一、获得陆地棉FDH基因启动子序列

1、用染色体步移法获得基因FDH编码区上游的启动子序列

由于棉花基因组信息尚不完整，用染色体步移法(Genomic Walking)以获得基因编码区上游的启动子序列。染色体步移法是基于PCR和平端内切酶的一项技术。基因组DNA用平端内切酶消化后的片断与Adaptor相连，以此作为模板，用针对Adaptor设计的引物和基因内部引物进行PCR，可以由一段已知的序列来寻找相近的未知基因组DNA序列。

用染色体步移法得到的纤维表达特异性基因FDH编码区上游的启动子序列为807bp，其核苷酸序列如序列表中序列1所示。对此序列进行顺式调控元件分析，序列分析网站为http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/。通过对FDH基因ATG上游807bp的序列顺式调控元件进行分析，确定了转录起始位点TATA box和CART box，初步确定该序列的基本结构，如图2所示。

2、检测获得的基因FDH编码区上游的启动子序列在棉花不同部位的表达

提取野生型陆地棉徐州-142(中国农业科学院棉花研究所国家棉花种质中期库，ZM-01345)的根、茎、幼叶、成熟叶、花、10DPA纤维(10DPA纤维的棉纤维细胞处于伸长期)和10DPA胚珠组织(本实验中所用的10DPA胚珠组织为去掉10DPA纤维的10DPA胚珠组织)，以及无纤维突变体fl(该突变体不产生棉纤维)(中国农业科学院棉花研究所国家棉花种质中期库，ZM-30188)的10DPA的无毛胚珠RNA，反转cDNA第一链后作为实时定量qRT-PCR模板，引物为FDH_RT_SP(SP-sense primer)和FDH_RT_AP(AP-antisense primer)，引物序列如下：

FDH_RT_SP：5’-ATGCTCCGCTGTGCTTTTGTC-3’和

FDH_RT_AP：5’-CATATGCTGCTGCTCGATGTGT-3’。

以无纤维突变体fl为对照，检测该基因在棉花不同部位的表达情况。检测结果如图1所示，从左至右依次为根、茎、幼叶、成熟叶、花、10DPA纤维和10DPA胚珠组织，以及无纤维突变体fl的10DPA的无毛胚珠。以无纤维突变体fl的10DPA的无毛胚珠为对照，FDH基因的表达量以棉花中已知看家基因GhUBQ7相对表达量表示。由图1可见，FDH基因在10DPA纤维中特异表达。

实施例2、陆地棉FDH基因启动子功能鉴定

一、构建表达载体FDH promoter-pCAMBIA 1305

根据实施例1中获得的FDH基因启动子序列，设计了引物5’-FDH pt-KpnI和3’-FDH pt-NcoI，以野生型陆地棉徐州-142的10DPA纤维的基因组DNA为模板，进行PCR扩增。在引物5’端加上了KpnI、NcoI酶切位点及保护碱基。引物序列如下：

5’-FDH pt-KpnI：GGggtaccCTTGCTCGGCTGTCATTTTC，小写字母为KpnI酶切位点，

3’-FDH pt-NcoI：CATGccatggATTAAAAGACCTGGTGTAACGGTGA，小写字母为NcoI酶切位点。

载体pCAMBIA 1305(购自澳大利亚CAMBIA公司)由KpnI和NcoI酶进行酶切鉴定，去掉35S启动子序列，回收大片段。扩增产物经KpnI和NcoI酶切后与载体相连接，取代35S启动子，构建成驱动GUS基因表达载体FDH promoter-pCAMBIA1305，该载体中，在GUS基因上游没有其它任何启动子，只有插入的DNA片段。

将表达载体FDH promoter-pCAMBIA 1305转入大肠杆菌DH5a菌株，抗性筛选，挑取阳性克隆，将阳性克隆进行液体培养，提取质粒，进行测序检测表达载体FDHpromoter-pCAMBIA 1305中的FDH基因启动子序列，测序结果表明，在载体pCAMBIA1305的KpnI和NcoI酶切位点间插入的基因序列与序列表中序列1一致。

二、基因枪法转化胚珠

1、实验材料

野生型陆地棉徐州-142在温室中培养，开花一天后收取棉花整花。

2、实验试剂

金粉：直径为1.0μm

CaCl2：2.5M/L

亚精胺：0.1M/L

基因枪所用试剂均购于Bio-Rad公司。

3、实验仪器

超声破碎仪

基因枪，购于Bio-Rad公司，型号PDS-1000/H2Biolistic

4、实验用品

1100p压力膜，承载膜，铜网，全套设备均购于Bio-Rad公司。

5、固体培养基

固体培养基在棉花组培液液体培养基的基础上，另加0.6％琼脂粉，灭菌后倒平板。棉花组培液液体培养基的组成为表1所示。

表1棉花组培液液体培养基的组成

6、实验步骤

a)将金粉悬浮在100％乙醇中，终浓度为50mg/ml。超声破碎1min，间隔1min，破碎5次。13,000g离10sec。

b)再用100％乙醇乙醇洗两次。13,000g离心收集时注意不能让金粉沉淀在离心管表面。

c)涡旋数十sec，再离心，用双蒸水洗三次。

d)在1.5ml离心管里加入以下试剂，做基因枪子弹

金粉颗粒悬液 20μL

质粒DNA(2mg/ml) 2μL

CaCl2 20μL

亚精胺 8μL

根据所提质粒浓度，金粉颗粒悬液和质粒DNA的比例可调节。

e)冰上放置20min，每隔数min涡旋1min。

f)加入80μL100％醇，涡旋，13,000转离20sec，移去上清。

g)用200μL100％乙醇洗3～4次。

每次先加20～30μL乙醇，剧烈涡旋，再加入剩下的乙醇，再离心。

h)最后用20μL乙醇悬浮。

i)取组织培养得到的棉花的胚珠，集中放在平板培养基中心位置。每个平板放三朵花的胚珠。

j)用100％异丙醇浸泡压力膜，承载膜，铜网和承载膜钢圈，之后用75％乙醇浸泡，然后用100％乙醇浸泡。

k)待乙醇完全挥发后，将承载膜装在承载膜钢圈上，再小心将子弹吹打混匀点在承载膜中心位置。装上压力膜，将载有胚珠的平板放在10或者15cm处。启动基因枪。

1)将打过基因枪的胚珠在原来培养基上，30℃恒温箱，培养2～3天，此时野生型陆地棉徐州-142的胚珠产生棉纤维细胞，无纤维突变体fl不产生棉纤维细胞。

利用上述基因枪转化的方法分别将载体pCAMBIA 1305和表达载体FDHpromoter-pCAMBIA 1305转入野生型陆地棉徐州-142和无纤维突变体fl的胚珠中；同时分别将载体pCAMBIA 1305和表达载体FDH promoter-pCAMBIA 1305转入洋葱表皮细胞中。

三、GUS染色

1、实验仪器及试剂

解剖镜，恒温箱

GUS染液配方[22]

磷酸缓冲液(PH7.0)100mM

EDTA(PH8) 1mM

Triton-X- 1001％

氰亚铁酸钾 5mM

铁氰化钾 5mM

X-Gluc 1mg

2、实验步骤

先在1.5mL EP管里加入5μL N，N-二甲基甲酰胺溶解1mgX-Gluc，涡旋1min，再加入上述其他试剂。最后用双蒸水补至1mL。

将上述培养2～3天的胚珠和洋葱表皮放入配好的GUS染液中，置于37℃恒温箱，染1.5h。再用解剖镜镜鉴拍照，结果如图3所示。图3中1为表达载体FDHpromoter-pCAMBIA 1305转入野生型陆地棉徐州-142的胚珠中GUS染色结果，2为载体pCAMBIA 1305转入野生型陆地棉徐州-142的胚珠中GUS染色结果，3为表达载体FDH promoter-pCAMBIA 1305转入无纤维突变体fl的胚珠中GUS染色结果，4为载体pCAMBIA 1305转入无纤维突变体fl的胚珠中GUS染色结果，5为表达载体FDHpromoter-pCAMBIA 1305转入洋葱表皮细胞中GUS染色结果，6为载体pCAMBIA1305转入洋葱表皮细胞中GUS染色结果。从图3中可见，在1中有蓝色显示，表明GUS基因有表达，表明本发明的DNA分子具有启动子功能。在1中有蓝色显示，而在3和5中，没有蓝色显示，表明本发明的FDH启动子仅使GUS基因在棉纤维细胞中表达，在其它组织中不表达。在2、4和6中均有蓝色显示，表明35S启动子既使GUS基因在棉纤维细胞中表达，又在其它组织中表达。GUS组织化学检测结果表明，FDH启动子能够启动GUS表达，且FDH启动子启动GUS表达仅限于棉纤维细胞中。

Claims

1.一种DNA分子，为序列表中序列1所示的DNA分子。

2.含有权利要求1所述的DNA分子的重组表达载体。

3.根据权利要求2所述的重组表达载体，其特征在于：所述重组表达载体为用权利要求1所述的DNA分子替换pCAMBIA 1305载体上的CaMV35S启动子得到的重组表达载体。

4.含有权利要求1所述的DNA分子的表达盒。

5.含有权利要求1所述的DNA分子的转基因细胞系。

6.含有权利要求1所述的DNA分子的重组菌。

7.权利要求1所述的DNA分子在使目的基因在棉纤维细胞中表达中的应用。