CN116732036A - 一种棉花组成型强启动子PGhFDH-Pro及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及基因工程技术领域，公开了一种棉花组成型强启动子PGhFDH‑Pro及其应用，强启动子PGhFDH‑Pro的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明还以棉花基因组DNA为模板，使用扩增引物进行PCR扩增，PCR产物片段经过TA克隆连接到T载体上，筛选阳性克隆，并测序正确后，得到PGhFDH‑Pro质粒，将棉花pGhFDH‑Pro的启动子构建到携带GUS基因植物表达载体pGWB433上的，先将测序正确的pGhFDH‑Pro的启动子序列连接到pDONORzeo中间载体上进行BP反应，测序正确后进行LR反应，然后将目的片段置换到植物表达载体pGWB433上，得到含有强启动子PGhFDH‑Pro的表达载体。本发明的强启动子PGhFDH‑Pro能够特异地驱动外源基因在棉花不同生长阶段不同器官中强烈表达，为植物基因工程的应用提供了一个良好的资源，为应用于植物性状改良的转基因研究奠定了基础。
Description
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及一种棉花组成型强启动子PGhFDH-Pro及其应用。
背景技术
棉花是世界上最重要的天然纤维作物，也是我国主要的经济作物之一。棉花具有纺织、产油、蜜源等多种用途，我国是棉花生成和消费大国，棉花生产在我国国民经济中占有重要的地位。近年来，植物组织器官和发育特异性表达的研究成为植物分子生物学的一个重要研究领域，特别是在植物基因工程的实用化阶段中，为了使目的基因在特定的组织器官和特定的发育阶段优先表达，对组织特异性表达的研究更是成为热点。由于棉花纤维的发育直接影响纤维的品质和产量，因此，研究和筛选特异表达的启动子不仅有助于解析基因表达调控的分子机制，并可为植物基因工程提供有用的调控元件。
启动子是一段位于结构基因5'端上游区的DNA序列，可以与RNA聚合酶特异性结合与识别，并且可以调控转录的起始。启动子序列结构中存在多个作用元件，因此启动子的研究对于研究表达调控、植物基因工程及表达目的蛋白有着重要的意义。目前，组成型CaMV35S启动子在棉花基因工程中被大量使用，但由于其本身存在一定的缺陷，导致实验未能出现预期的结果。因此分离鉴定新型高效的能够在棉花中驱动的启动子，在棉花分子育种中将具有重要的应用价值。
根据启动子的作用方式和功能，植物基因工程中常用的启动子可以分为3类：组成型启动子、组织特异性启动子和诱导型启动子。组成型启动子能够驱动内源或者外源基因在植物的所有组织及全生育期持续表达，对于某个目标基因的表达基因重要的意义。目前在植物基因中应用较为广泛的组成型启动子包括CaMV 35S(Odell et al.,1985)、NOS(Marton et al.,1979)和Actin(Christensen et al.,1992)等，其中CaMV 35S启动子是在植物转基因应用中的主要启动子。组成型启动子具有诸多优点，如研究充分、易于获取、表达稳定、调控不受外界条件的影响，所启动基因的表达具有持续性，在植物基因工程中最为广泛的应用价值。然而，组成型启动子具有一些局限性，外源基因的组成型表达使大量异源蛋白质或代谢产物在植物体内积累，植物原有的代谢平衡被扰乱，或者一些有毒代谢产物阻碍了植物的正常生长，甚至导致死亡。因此，植物内源的组成型启动子的可用性对于用于植物遗传转化的成功具有重要作用。
鉴定植物的组成型启动子，对于棉花转基因工程的应用来说，是一个重要且广泛的重要资源。虽然目前已从不同植物克隆到了不同类型的启动子，但棉花中能够中高效表达的内源组成型启动子的克隆及应用报道较少。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的是提供一种棉花组成型强启动子PGhFDH-Pro及其应用，该强启动子PGhFDH-Pro能够特异地驱动外源基因在棉花不同生长阶段不同器官中强烈表达，为植物基因工程的应用提供了一个良好的资源，为应用于植物性状改良的转基因研究奠定了基础。
本发明通过以下技术手段解决上述技术问题：
本发明的第一方面在于提供了一种棉花组成型强启动子PGhFDH-Pro，所述强启动子PGhFDH-Pro的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明的第二方面在于提供了含有上述强启动子PGhFDH-Pro的表达载体。
在一些实施方式中，所述表达载体为植物表达载体，所述植物表达载体为PGhFDH-Pro::GUS。
本发明的第三方面在于提供了上述表达载体的构建方法，所述构建方法如下：
以棉花基因组DNA为模板，使用扩增引物进行PCR扩增，得到的PCR产物片段经过TA克隆连接到T载体上，筛选阳性克隆，并测序正确后，得到PGhFDH-Pro质粒；
将棉花pGhFDH-Pro的启动子构建到携带GUS基因植物表达载体pGWB433上的，先将测序正确的pGhFDH-Pro的启动子序列连接到pDONORzeo中间载体上进行BP反应，测序正确后进行LR反应，然后将目的片段置换到植物表达载体pGWB433上。
在一些实施方式中，所述扩增引物包括：
M13F的序列如SEQ ID NO.2所示；
M13R的序列如SEQ ID NO.3所示；
BP-pGhFDH-Pro-F的序列如SEQ ID NO.4所示；
BP-pGhFDH-Pro-R的序列如SEQ ID NO.5所示；
GUS-R的序列如SEQ ID NO.6所示。
本发明的第四方面在于提供了上述棉花组成型强启动子PGhFDH-Pro在制备转基因植物中的应用，所述转基因植物为棉花或拟南芥。
本发明的第五方面在于提供了上述表达载体在制备转基因植物中的应用，所述转基因植物为棉花或拟南芥。
本发明具有以下有益效果：
(1)本发明提供了棉花组成型强启动子PGhFDH-Pro，该启动子具有启动子基本的组成元件活性，可以驱动下游外源基因在转基因拟南芥及棉花的各个组织中表达，表明了该启动子是一个组成型强启动子；
(2)经验证，本发明的棉花组成型强启动子PGhFDH-Pro在叶片、茎秆、花瓣、花药、胚、种子及不同纤维发育时期都具有很高的GUS活性，说明该启动子具有非常强大的功能，在未来棉花乃至其他植物的基因工程的应用提供了一个良好的资源，为应用于植物性状改良的转基因研究奠定了基础。
附图说明
图1为pGhFDH-pro核酸序列及作用元件图；
图2为转pGhFDH::GUS基因拟南芥的GUS组织化学定位图；
图3为转CaMV35S::GUS基因棉花的GUS组织化学定位图；
图4为转pGhFDH::GUS基因棉花的GUS组织化学定位图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明实施例中的试剂药品未做具体说明的均为普通市售，材料方法未做具体说明的均参考《分子克隆实验指南》(Sambrook和Russell,2001)。所用的植物实验材料为陆地棉(Gossypium hirsutum)Jin668和拟南芥(Arabidopsis thaliana)。
棉花属于(Gossypium)是双子叶锦葵科(Malvaceae)科植物，具有极高的经济价值。鉴定植物的组成型启动子，对于棉花转基因工程的应用来说，是一个重要且广泛的重要资源。虽然目前已从不同植物克隆到了不同类型的启动子，但棉花中能够中高效表达的内源组成型启动子的克隆及应用报道较少。
本发明首次发现、定位一个新的棉花组成型强启动子pGhFDH-Pro，为深入探究棉花pGhFDH-Pro启动子在基因工程中的应用奠定了基础；其能够特异地驱动外源基因在植物不同生长阶段不同器官中强烈表达，克服组成型启动子的一些局限性(如时空特异性差、基因沉默和植物能耗增加等)，为植物基因工程的应用提供了一个良好的资源，为应用于植物性状改良的转基因研究奠定了基础。具体如下：
1.PCR扩增及克隆
通过CTAB法按照常规步骤提取陆地棉Jin668的DNA后，根据SEQ ID NO.1在棉花DNA中的序列，分别针对首尾设计基因特异引物，如表1所示，利用DNA作为模板，进行PCR扩增得到pGhFDH-Pro的启动子序列，用20μLPCR反应体系：15μLddH2O，2μL 10XEasyTaqBuffer，0.4μL dNTP，0.2μL Forward/Reverse Primer，0.2μLEasyTaq，DNA模板2μL。PCR反应程序为：98℃预变性5min，循环数为1；第2步到第4步：98℃变性30s，57℃退火30s，72℃延伸30s，共循环28次；72℃，5min。
表1：特异引物序列
随后将PCR扩增产物进行凝胶电泳检测，根据片段大小确定为阳性片段后进行TA克隆。用5μL反应体系：2.5μL2xRapid Ligation Buffer，0.5μLT4 DNA Ligas，1μLpGEM-TEasy，1μL已纯化PCR产物。16℃连接4～5h，连接产物转化DH5α，冰浴15-30min，42℃热激90s，冰浴2min，转移至2ml灭菌离心管，加300μL SOC，37℃小摇30min，取200μL涂布于Amp+皿并晾干，在37℃培养箱倒置培养14-18h。
待培养皿长出菌落后，加1ml Amp+LB于2ml灭菌离心管，挑若干个单克隆混匀，37℃小摇4-6h，菌液浑浊后取2μL菌液进行PCR检测(引物：M13F/R-TA)，取2-3个阳性克隆测序，序列正确的菌液进行保菌。
采用同源克隆的方法从陆地棉J668中克隆了821bp的pGhFDH-Pro的启动子序列，利用启动子结构预测网站(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)进行结构预测发现该启动子有9个CAAT BOX和15个TATA BOX，同时检测到多个光响应和激素响应位点，如图1所示。经测序，该启动子的DNA序列如SEQ ID NO：1所示，命名为pGhFDH-Pro，具体如下：
5’-GAAAATCCACAACACCTTGCTCGGCTGTCATTTTCGAGAAAAAAATATCTTAATT CGAAATTTATTGGATAGTTTAAGTTTTGTGGCATATACATTTTAACCAAAGAAAAAAAACCATGCAGTGGGTTATTAATGGAAATCCAACCGATTGCCTGAATCTGAACCATACCCTGAACTTGAAATCGGGCAGGATTTCCTGTTCCACAAACCCAACATGTTGAACCAAAGAATCCAGAACCTTCTCTATTCGGTGTGCAAGTGGTGCTTTGTGGTTTAGACCTTTAAGTCTGCTGCTTTACTACTACCTATTTATTTCAAGTAAAGATGGTGGTTATGTATTTTTATAGATATGTGCAACTAAGGCTTAAACAGCTTATGCCAGCTGCTACCTTCAAAAGGAGAACCTCCCAACTACTCCCTCCAATGCAATCTTAATTATGGGTTTATTTGTCTTTGCACATTATTTGAGTGCAAAAACAAAATGGAAGGCAAAGGATAAGACTGAATATCCAAAAAAAAATTCACAAGAAAATGTAGGTTCCACAAACAACTTTATATCACACATACATGTATTACCAGTTGGTAATCGTAATAAACCAAACAAAAACCCTGTTTTATTGCCTTTGAATTGGACTAGATTTCATTTAATGAAAGAATTCATGGCGATTTCAAAACCTTTCAACTACTTACCACCGGTCCAAGTTGGTGTAAACATTAACTATATCCACCCACCACCTTTCATCCCACATTAATGCATCCCTCTCTCTCTATATATATGTATGTATGGTGGTGGTTCTTCACCGTTACACCAGGTCTTTTAA-3’
2.表达载体的构建
利用Gateway技术将棉花pGhFDH-Pro的启动子构建到携带GUS基因植物表达载体pGWB433上的，先将测序正确的pGhFDH-Pro的启动子序列连接到pDONORzeo中间载体上进行BP反应，测序正确后进行LR反应，最终将目的片段置换到植物表达载体pGWB433上。具体操作步骤如下：
(1)合成BP引物，即在原引物5’上游加BP接头。以携带目的基因的质粒为模板进行PCR反应，阳检后取2μL进行BP反应，用5μL反应体系：1.5μL ddH2O，1μLpDONER 221(Kan+)/pDONERZeo(zeo+)，2μL已纯化PCR产物，0.5μLGateway BP Clonase。25℃放置4h，转化至TOP10或DH5α，复苏后取适当菌液涂步于Kan+皿中，在37℃培养箱倒置培养14-18h。
(2)挑单克隆进行阳性检测(引物：M13R/BP-pGhFDH-Pro-F或M13F/BP-pGhFDH-Pro-R)，检测正确后，保菌，提质粒。
(3)采用5μL LR反应体系：2.5μLddH2O，1μLpGWB433(Spe+)，1μLBP质粒，0.5μLGateway LR Clonase。室温放置4h左右，转化TOP10，在Spe+抗性培养皿上涂布。
(4)挑单克隆检测(引物：BP-pGhFDH-Pro-F/Gus-R)，检测正确后保菌，提质粒。并取2μL质粒电击转化农杆菌GV3101，用500μL SOC混匀，取100μL涂步于Spe+Rif的培养皿中，封口，于28℃培养箱倒置培养2-3天。
(5)挑单克隆检测农杆菌(引物：BP-pGhFDH-Pro-F/Gus-R)，取2-3个克隆保菌。
3.棉花与拟南芥的遗传转化
采用农杆菌介导的转化法以pGhFDH-pro::GUS转化拟南芥，用75％乙醇或无菌水浸泡拟南芥种子30s，10％次氯酸钠溶液浸泡10min，无菌水冲洗3～5次，每次1min，将消毒后的种子放在配置好的含有Kan抗性的1/2MS培养基上，于24℃下培养，若植株能正常生长且长出真叶，颜色呈绿色，则初步筛选获得阳性植株T1。拟南芥在培养基中生长到适合移栽的时期后，将拟南芥移栽到土壤中，收获种子后用T2代材料进行GUS染色及检测。
采用农杆菌介导的下胚轴遗传转化法，用pGhFDH-pro::GUS和CaMV 35S::GUS转化陆地棉Jin668。取无菌苗的下胚轴作为外植体材料，用含有重组质粒的菌液侵染10min，将侵染后的下胚轴转移到共培养基中暗培养3天，后经历诱导愈伤组织、分化成胚、分化成苗及生根阶段，待再生植株适应外界环境后将其移栽到大钵子中置于棉花温室中生长管理。
4.GUS组织化学染色及活性测定
将转基因植株的不同器官、组织放到配置好的GUS染色液中，37℃保温2h至过夜，经70％酒精脱色后保存，肉眼或在体式显微镜下观察GUS基因表达情况，然后在体式显微镜(Leika MZFLIII)下拍照保存即可，如图2、3、4所示。
图2为转pGhFDH::GUS基因拟南芥的GUS组织化学定位图，图2中，A-D为阴性对照的T2代拟南芥幼苗、花、叶片、果荚，E-H为转CaMV35S::GUS阳性对照的T2代拟南芥幼苗、花、叶片、果荚，I-L为转pGhFDH::GUS的T2代拟南芥幼苗、花、叶片、果荚。
图3为转CaMV35S::GUS基因棉花的GUS组织化学定位图，图3中，A-G为转CaMV35S::GUS阳性对照的T2代棉花、叶片、茎秆纵切面、茎秆横切面、花蕾纵切面、花瓣、雌雄蕊、胚，H-M为转CaMV35S::GUS阳性对照的T2代棉花0DPA、5DPA、10DPA、20DPA、30DPA、成熟纤维。
图4为转pGhFDH::GUS基因棉花的GUS组织化学定位图，图4中，A-G为转pGhFDH::GUS阳性对照的T2代棉花叶片、茎秆纵切面、茎秆横切面、花蕾纵切面、花瓣、雌雄蕊、胚，H-M为转pGhFDH::GUS阳性对照的T2代棉花胚珠0DPA、5DPA、10DPA、20DPA、30DPA、成熟纤维。
图2-4表明，在拟南芥的花、种子、叶片中均观察到GUS着色，在棉花的各个器官中均能观察到染色，并且染色效果与CaMV35S::GUS转化拟南芥和棉花的程度相当。以上结果不仅说明了pGhFDH启动子的序列具有启动子基本的组成元件活性，可以驱动下游GUS基因在转基因拟南芥及棉花的各个组织中表达，表明了该启动子是一个组成型启动子，且在叶片、茎秆、花瓣、花药、胚、种子及不同纤维发育时期都具有很高的GUS活性，说明该启动子具有非常强大的功能，在未来棉花乃至其他植物的基因工程应用中具有很高的价值。
因此，上述棉花组成型强启动子PGhFDH-Pro可以应用在制备转基因植物中，以及上述表达载体也可应用在制备转基因植物中，该转基因植物为棉花或拟南芥。
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。本发明未详细描述的技术、形状、构造部分均为公知技术。
Claims (7)
1.一种棉花组成型强启动子PGhFDH-Pro，其特征在于，所述强启动子PGhFDH-Pro的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.含有如权利要求1所述强启动子PGhFDH-Pro的表达载体。
3.根据权利要求2所述强启动子PGhFDH-Pro的表达载体，其特征在于，所述表达载体为植物表达载体，所述植物表达载体为PGhFDH-Pro::GUS。
4.根据权利要求2或3所述强启动子PGhFDH-Pro的表达载体的构建方法，其特征在于，所述构建方法如下：
以棉花基因组DNA为模板，使用扩增引物进行PCR扩增，得到的PCR产物片段经过TA克隆连接到T载体上，筛选阳性克隆，并测序正确后，得到PGhFDH-Pro质粒；
将棉花pGhFDH-Pro的启动子构建到携带GUS基因植物表达载体pGWB433上的，先将测序正确的pGhFDH-Pro的启动子序列连接到pDONORzeo中间载体上进行BP反应，测序正确后进行LR反应，然后将目的片段置换到植物表达载体pGWB433上。
5.根据权利要求4所述强启动子PGhFDH-Pro的表达载体的构建方法，其特征在于，所述扩增引物包括：
M13F的序列如SEQ ID NO.2所示；
M13R的序列如SEQ ID NO.3所示；
BP-pGhFDH-Pro-F的序列如SEQ ID NO.4所示；
BP-pGhFDH-Pro-R的序列如SEQ ID NO.5所示；
GUS-R的序列如SEQ ID NO.6所示。
6.根据权利要求1所述的棉花组成型强启动子PGhFDH-Pro在制备转基因植物中的应用，其特征在于，所述转基因植物为棉花或拟南芥。
7.根据权利要求2或3所述的表达载体在制备转基因植物中的应用，其特征在于，所述转基因植物为棉花或拟南芥。
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| Title |
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| 袁辉;罗淑萍;张雨良;马德英;: "棉花纤维特异表达GhCesA4启动子的克隆及序列分析", 棉花学报, no. 03, pages 190 - 195 * |
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