CN107604001A - 一种基于真空渗入的甘蓝和甘蓝型油菜叶片瞬时表达的方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种基于真空渗入的甘蓝和甘蓝型油菜叶片瞬时表达的方法。该方法包括用农杆菌侵染液悬浮活化后的农杆菌；将甘蓝或甘蓝型油菜幼苗叶片切割成小块；将叶片小块置于农杆菌侵染液中，抽真空处理促进农杆菌对植物组织的渗入；将农杆菌侵染后的叶片小块暗培养的步骤。本发明结合叶片预处理和真空处理实现农杆菌渗入甘蓝或甘蓝型油菜叶片组织中从而实现农杆菌高效浸染甘蓝或甘蓝型油菜细胞，并且可以实现高效率的甘蓝和甘蓝型油菜中外源基因瞬时表达。

Description

一种基于真空渗入的甘蓝和甘蓝型油菜叶片瞬时表达的方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种基于真空渗入的甘蓝和甘蓝型油菜叶片瞬时表达的方法。

背景技术

瞬时表达方法是指将外源基因转入细胞中，通过外源基因在目的细胞中的表达获得表达产物或特定性状的方法。通常用于研究蛋白功能、启动子特性、外源基因表达产物的收集以及新生物学工具的测试等。目前常用的瞬时表达方法为基因枪或PEG介导的原生质体外源基因表达，或农杆菌介导的叶片瞬时表达，但两种方法多用于拟南芥或烟草等模式植物中。

与原生质体中的瞬时表达方法相比，农杆菌介导的烟草叶片瞬时表达方法操作更简单，成本更低。但该方法局限很多，由于甘蓝和甘蓝型油菜的叶片结构或气孔形态、特性与烟草不同，用于烟草叶片的瞬时表达方法不适用于甘蓝和甘蓝型油菜。此外，由于甘蓝和甘蓝型油菜的表皮细胞与叶肉细胞结合太过紧密，通过撕表皮促进侵染的方法也不可行。目前有少量报导利用PEG或农杆菌介导的甘蓝或甘蓝型油菜的原生质体转化，或者使用基因枪轰击原生质体的方法进行瞬时表达实验。但原生质体制备、转化及培养对实验操作要求较高，并且试剂成本高，实验周期长(Thomzik,J.E.,and Hain,R.,1990.TransgenicBrassica napus plants obtained by cocultivation of protoplasts withAgrobacterium tumefaciens.Plant cell reports 9,233-236；Nugent,G.D.et al.,2006.Nuclear and plastid transformation of Brassica oleracea var.botrytis(cauliflower)using PEG-mediated uptake of DNA into protoplasts.Plant Science170,135-142；滕蕾,黄瑾,赵竹露,李旭锋,杨毅.Fibrillin操纵子在甘蓝型油菜和拟南芥中的瞬时表达.四川大学学报(自然科学版),2006,(06):1394-1398.)。其中，Nugent(2006)等对甘蓝原生质体转化后的阳性统计发现，可长成愈伤组织的阳性转化子在所有细胞中的比例低至0.3×10^-5～1.2×10^-5，滕蕾等(2006)也认为甘蓝型油菜原生质体制备比拟南芥的困难得多。此外，一些研究报道了用农杆菌介导的子叶或下胚轴的瞬时表达(谭小力,诸葛锐军,李冠英,卢长明,王政,张志燕.农杆菌介导的油菜子叶瞬时表达.生物学杂志,2012,29(06):93-96；景寅,李煦,汪晓峰.甘蓝型油菜BnGOLS1基因启动子的克隆、序列分析及瞬时表达.植物生理学报,2012,48(01):67-74.)。由于农杆菌只有在特定诱导因子存在时才能侵染植物组织非伤口处的细胞，而这些研究中均直接使用菌液而不是特定的侵染专用缓冲液进行侵染，即使农杆菌渗入组织中，侵染效率也严重受限。CRISPR/Cas9技术及其他生物学工具等在甘蓝或甘蓝型油菜中的瞬时研究工作对侵染效率有很高要求，因此一种高效的甘蓝或甘蓝型油菜瞬时表达方法需求非常迫切。

发明内容

为了解决现有技术中农杆菌侵染甘蓝和甘蓝型油菜叶片效率较低的问题，本发明提供一种基于真空渗入的甘蓝和甘蓝型油菜叶片瞬时表达的方法，有效地解决了上述问题。

本发明的所述的基于真空渗入的甘蓝和甘蓝型油菜叶片瞬时表达的方法，其技术方案包括以下步骤：

1)用农杆菌侵染液悬浮活化后的农杆菌；

2)将甘蓝或甘蓝型油菜幼苗叶片切割成小块；

3)将叶片小块置于农杆菌侵染液中，抽真空处理促进农杆菌对植物组织的渗入；

4)将农杆菌侵染后的叶片小块暗培养。

在所述用农杆菌侵染液悬浮活化后的农杆菌中，农杆菌指根癌农杆菌为GV3101或EHA105等常用于甘蓝和甘蓝型油菜侵染的菌株。

在所述用农杆菌侵染液悬浮活化后的农杆菌中，农杆菌在含有相应抗生素的LB液体培养至OD600约为0.7，将农杆菌离心富集后2倍培养基体积的农杆菌重悬液重悬菌体。

所述农杆菌侵染液的组成成分为：1×MS，20g/L蔗糖，100μM乙酰丁香酮，10mM 2-(N-吗啡啉)乙磺酸，1.5mM MgSO₄，20μM FeSO₄，100μM CaCl₂，20mM NH₄Cl，pH 5.5；配制完成后用0.02μm规格的滤头过滤除菌。

在将甘蓝或甘蓝型油菜幼苗叶片切割成小块中，用双面刀片或手术刀将生长1～4周的甘蓝或甘蓝型油菜幼苗叶片去除边缘、切成面积约0.5cm²大小的小块。

在所述甘蓝或甘蓝型油菜幼苗叶片切割成小块中，甘蓝或甘蓝型油菜幼苗的叶片可以为子叶、真叶以及叶柄等组织器官。

在所述甘蓝或甘蓝型油菜幼苗叶片切割成小块中，甘蓝或甘蓝型油菜幼苗生长周期为1～6周。

在将叶片小块置于农杆菌侵染液中，抽真空处理促进农杆菌对植物组织的渗入中，将浸没于农杆菌侵染液中的叶片切块置于可以形成真空的装置中，并制造低压环境,抽真空至0.05MPa，维持5min。

在将农杆菌侵染后的叶片小块暗培养中，将侵染后的叶片在室温下的黑暗中放置1～5天。

本发明的有益效果是：提供了一种可以提高农杆菌侵染活性的缓冲液，结合叶片预处理和真空处理实现农杆菌渗入甘蓝或甘蓝型油菜叶片组织中从而实现农杆菌高效浸染甘蓝或甘蓝型油菜细胞；并且可以实现高效率的甘蓝和甘蓝型油菜中外源基因瞬时表达。

附图说明

图1处理甘蓝型油菜叶片的GUS染色结果：用含GUS表达载体的农杆菌侵染甘蓝型油菜叶片，GUS染色后叶片受不同程度的侵染。图A为进行0.05MPa真空处理5min后的样本GUS染色结果；图B为用0.1MPa真空处理5min后的样本GUS染色结果；图C为不进行真空处理的样本染色结果；图D为0.05MPa真空处理10min后的染色结果；图E为用10mM MgCl2溶液作为侵染液，在0.05MPa下处理5min后的叶片染色结果；图F为采用叶片无针头注射农杆菌的瞬时表达方法处理样本的染色结果。

图2CRISPR/Cas9系统介导了甘蓝型油菜的基因组定点突变：电泳检测酶切前后的野生型和突变后PCR产物，并对未被消化产物进行测序，得到突变后产物测序峰图。图A为PCR及酶切实验，泳道M为DNA Marker，泳道1为CRISPR突变后的样本PCR产物酶切后电泳，泳道2为非突变样本PCR产物酶切后电泳，泳道3为突变样本PCR产物酶切前电泳。B图为回收A图泳道1中未被消化条带，即突变后产物经TA克隆后随机选择阳性菌落测序的部分峰图。方框内为PAM序列。

图3突变后产物的序列。加粗为PAM，灰色阴影为设计靶位点序列，方框标出的为发生突变碱基，“-”短线为缺失碱基，双下划线标出的为插入碱基，下划线标出的为Nde I限制性酶切位点。

图4 pCAMBIA-1303双元表达载体图谱。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细说明：

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明可从商业途径得到。

表达载体pCAMBIA-1303：序列信息：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/7638078，在文献“Caramelo-Nunes,C.et al.,2013.Dynamic binding capacity andspecificity of3,8-diamino-6-phenylphenanthridine-Sepharose support forpurification of supercoiled plasmid deoxyribonucleic acid.Journal ofchromatography.A 1307,91-98”中公开过，其图谱如图4。

CRISPR/Cas9系统载体pYLgRNA-AtU6-1和pYLCRISPR/Cas9-DH：在文献“Ma,X.etal.,2015.A robust CRISPR/Cas9system for convenient,high-efficiency multiplexgenome editing in monocot and dicot plants.Mol.Plant 8,1274-1284”中公开过，公众可从华南农业大学生命科学学院获得。

油菜品种“扬油9号”在文献“李爱民,周德银,惠飞虎,张永泰,周如美,张永吉,张瑛,祁建波.大籽粒优质甘蓝型油菜新品种扬油9号的选育.江苏农业科学,2014,42(02):78-79.”中公开过，公众可从扬州里下河农科所获得。

实施例1：利用基于真空渗入的瞬时表达的方法将GUS基因的甘蓝型油菜叶片中表达

1.农杆菌培养

农杆菌菌种为使用冻融转化法获得的。含GUS基因表达元件的pCAMBIA-1303载体(载体序列信息：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/7638078)，市售，本申请人实验室保存，可以对外界发放。

将含pCAMBIA-1303双元表达载体的根癌农杆菌GV3101菌种活化后，在10ml LB(含50mg/ml Rif(利福平)+100mg/l Kan(卡那霉素))培养基中30℃培养约12h，至OD600≈0.7进行下一步实验。共准备3份相同的农杆菌菌液。

2.甘蓝型油菜种植

将“扬油9号”种子消毒(75％乙醇消毒2min，50％次氯酸钠消毒15min)后，在温室中培养条件为：光照16h，黑暗8h，光照强度7000lux，温度24℃培养2周。

3.叶片预处理

将甘蓝型油菜叶片从叶柄处剪下并置于干净的白纸上，用手术刀或双面刀片切去叶片边缘，并将剩余叶片切成面积约为0.5cm×1.0cm或稍小的小块。切块的过程中，如果白纸上出现绿色划痕，说明刀片太钝导致了细胞受损，需要更换新刀片。预处理完成的叶片需要立即进行后续实验。

4.农杆菌侵染

农杆菌侵染液配制：1×MS，20g/L蔗糖，100μM乙酰丁香酮，10mM 2-(N-吗啡啉)乙磺酸，1.5mM MgSO₄，20μM FeSO₄，100μM CaCl₂，20mM NH₄Cl，pH 5.5；配制完成后用0.02μm规格的滤头过滤除菌。

将农杆菌菌液在6000rpm下离心5min，去除上清，用10ml本发明配制的农杆菌侵染液洗1次，再用20ml上述农杆菌侵染液重悬；同时再取另外2份10ml农杆菌离心，分别用20mlLB液体培养基和20ml 10mM MCl₂(含100μM AS)溶液重悬。其中，所述浓度10mM的MCl₂溶液是烟草叶片瞬时表达时的常用侵染液(Zhang,Y.,and Dong,J.,2016.Imaging SpatialReorganization of a MAPK Signaling Pathway Using the Tobacco TransientExpression System.Journal of visualized experiments:JoVE；Poulsen,L.R.,Palmgren,M.G.,and Lopez-Marques,R.L.,2016.Transient Expression of P-typeATPases in Tobacco Epidermal Cells.Methods Mol Biol 1377,383-393)。将叶片用镊子小心地转移至农杆菌侵染液中，轻轻浸没于其中。将样品放置在真空干燥器中抽真空，使压力维持在0.05MPa并保持5min。同时做对照组1，抽真空处理，压力为0.1MPa，保持5min；；对照组2，除不经过真空处理外其他实验条件完全一致；对照组3，0.05MPa保持10min；对照组4，将叶片用10mM MCl₂重悬的农杆菌侵染，真空压力0.05MPa保持5min。另用无针头的注射器吸取农杆菌菌液从甘蓝型油菜真叶或子叶叶片背部注入叶片中作为对照组5。

5.侵染后样品暗培养

将真空处理后的叶片取出，用10ml无农杆菌的侵染液清洗2遍。同时，在玻璃平皿中铺一层滤纸，并加入5ml无菌侵染液润湿。将清洗后的叶片轻轻置于滤纸上，放置在黑暗中，24℃下培养2天。对于注射菌液的油菜幼苗，直接在黑暗中室温培养2天并注意保湿。

6.GUS染色

将培养2天后的叶片取出，置于5ml GUS染色液(1×PBS，0.5M EDTA，50mM K₃[Fe(CN)₆]，50mM K₄[Fe(CN)₆]，10％TritonX-100，20mg/ml X-Gluc)中，37℃水浴锅中染色6h，之后将各样本在70％乙醇中脱色至叶片不含叶绿素为止。如图1所示，A图中为0.05MPa真空处理后的叶片染色结果，B为经过0.1MPa真空处理5min后的样本染色结果，C为未经真空处理的对照染色结果，D为经过0.05MPa处理10min后的样本染色结果，E为叶片用10mM MCl₂重悬的农杆菌侵染后，在0.05MPa下处理5min后的样本染色结果，F为叶片注射样本染色结果。从图中可见A中整个叶片被染成蓝色而且染色程度很深，而B中虽然叶片内部也有部分区域被染色，但染色程度较低，原因可能是在0.1MPa压力下叶片细胞受损严重，失去活性使外源蛋白没有正常表达。图C中仅仅叶片的边缘处被染色，说明不施加压力的情况下农杆菌不能渗入叶片组织内部，只能侵染叶片边缘处的细胞。当将真空处理时间延长到10min时，可以看到GUS蛋白的表达也分布在整个叶片中，但表达量变低，说明在合适的真空压力下可能在过长时间的处理后也会造成细胞受陨。当我们使用常用于烟草叶片瞬时表达用的农杆菌侵染液处理时(图E)，即使经过合适的真空处理，GUS蛋白的表达量也显著低于用本发明的侵染液配方，说明该配方可以显著提高农杆菌侵染甘蓝型油菜叶片的效率。最后，从图F中可以发现，用烟草叶片瞬时表达的方法处理后，仅在叶片注射的很小范围内有少量蓝色产生，说明直接将农杆菌注入叶片时，外源基因表达效率低，农杆菌在叶片中的分布范围小。综上所述，我们的实验证明，将甘蓝型油菜叶片切块并在0.05MPa真空处理5min后农杆菌渗入并侵染了整个叶片，并显著提高了外源基因的表达效率。

实施例2：利用基于真空渗入的瞬时表达方法测试一个CRISPR/Cas9系统介导的基因组定点突变

1.CRISPR突变靶位点设计

CRISPR/Cas9系统需要设计一段长度为20bp的DNA序列用于指导核酸酶Cas9的DNA切割，即突变靶位点。此段序列的设计规则为行业内公开，要求是此段DNA序列的3'端紧连一个5'-NGG(N代表任一碱基)的序列。同时为了构建载体，需要在靶位点序列5'一侧额外加入特定限制性内切酶的粘性末端。本实施例在甘蓝型油菜的八氢番茄红素脱氢酶3(PDS3)基因(LOCUS：HM989809)编码区及5'非编码区序列内，使用在线工具CRISPR-P(http://crispr.hzau.edu.cn/CRISPR/)辅助靶位点设计，最终选择靶位点序列位于翻译起始位点上游-244--264bp处(命名为Tgt-0)，其正向序列为：5'-attgAGGCCTCCAGTACCCCATA-3'(SEQID NO.1)，反向序列为：5'-aaacTATGGGGTACTGGAGGCCT-3'(SEQ ID NO.2)。此位点在预期突变位置(-260--266bp)有一个Nde I限制性酶切位点(5'-CATATG-3')。

2.双链靶序列退火

将靶位点的正向与反向序列混合后，通过退火形成DNA双链。分别将正反向靶序列用TE溶液溶解为100μM母液，然后取正向和反向序列溶液各1μl，加入98μl 0.5×TE溶液混合均匀，配制成1μM工作液，最后取上述混合液10μl至PCR管中，置于PCR仪中，90℃加热30sec，移至室温冷却完成退火，形成双链靶序列。

3.CRISPR/Cas9载体的构建与转化

CRISPR/Cas9系统载体构建的方法与已发表文章一致(Ma,X.et al.,2015.Arobust CRISPR/Cas9system for convenient,high-efficiency multiplex genomeediting in monocot and dicot plants.Mol.Plant 8,1274-1284)。该系统载体有两部分，一个是sgRNA表达盒载体pYLgRNA-AtU6-1，一个是可表达Cas9基因的植物双元表达载体pYLCRISPR/Cas9-DH。简要来说，首先用限制性内切酶Bsa I将pYLgRNA-AtU6-1切开，与退火后的、带有粘性末端的靶序列连接，并通过重叠PCR(所用引物序列U-F：CTCCGTTTTACCTGTGGAATCG(SEQ ID NO.3)；gR-R：CGGAGGAAAATTCCATCCAC(SEQ ID NO.4))合成sgRNA表达盒(AtU6-1-Target-gRNA scaffold)；用新引物再次PCR扩增(所用引物序列Uctcg-B1'：TTCAGAGGTCTCTCTCGACTAGTGGAATCGGCAGCAAAGG(SEQ ID NO.5)；gRcggt-BL：AGCGTGggtctcGaccgACGCGTCCATCCACTCCAAGCTC(SEQ ID NO.6))该表达盒并切胶纯化。将纯化后的sgRNA表达盒与pYLCRISPR/Cas9-DH载体用边切边连法连接，形成pYLCRISPR/Cas9/sgRNA-DH重组载体。热击法转化大肠杆菌，测序无误后用冻融法转化农杆菌GV3101。

4.农杆菌培养

将含pYLCRISPR/Cas9/sgRNA的GV3101在10ml LB(含50mg/ml Rif+100mg/l Kan)培养基中30℃培养约12h，至OD600≈0.7进行下一步实验。

5.甘蓝型油菜种植

将“扬油9号”种子消毒(75％乙醇消毒2min，50％次氯酸钠消毒15min)后，在温室中培养条件为：光照16h，黑暗8h，光照强度7000lux，温度24℃培养3周。

6.叶片预处理

将甘蓝型油菜叶片从叶柄处剪下并置于干净的白纸上，用手术刀或双面刀片切去叶片边缘，并将剩余叶片切成面积约为0.5cm×1.0cm或稍小的小块。切块的过程中，如果白纸上出现绿色划痕，说明刀片太钝导致了细胞受损，需要更换新刀片。预处理完成的叶片需要立即进行后续实验。

7.农杆菌侵染

将农杆菌菌液在6000rpm下离心5min，去除上清，用10ml农杆菌侵染液洗1次，再用20ml农杆菌侵染液重悬。将叶片用镊子小心地转移至农杆菌侵染液中，轻轻浸没于其中。将样品放置在真空干燥器中抽真空，使压力维持在0.05MPa并保持5min。

5.侵染后样品暗培养

将真空处理后的叶片取出，用10ml无农杆菌的侵染液清洗2遍。同时，在玻璃平皿中铺一层滤纸，并加入5ml无菌侵染液润湿。将清洗后的叶片轻轻置于滤纸上，放置在黑暗中，24℃下培养2天。

6.叶片DNA提取

取培养2天后的叶片0.5g左右，在液氮中磨碎，加入CTAB溶液(3.5M NaCl，100mMTris-HCl，50mM EDTA，1％CTAB)1ml，65℃温育30min，加入等体积的氯仿:异戊醇溶液(体积比24:1)，轻柔混合均匀，静置5分钟后12000rpm离心10min。吸取上层水相，加入2/3体积-20℃预冷的异丙醇，轻柔混合均匀并冷冻10min，12000rpm离心去上清，DNA沉淀于70％乙醇中洗2-3次，晾干后加入加100μl无菌蒸馏水溶解。

7.PCR/RE实验分析在甘蓝型油菜中CRISPR/Cas9系统介导的基因组定点突变

以处理及对照的DNA样本为模板，进行PCR/RE(Polymerase chain reaction/Restriction digestion)分析。本分析方法参考了文献Gao,J.et al.,2015.CRISPR/Cas9-mediated targeted mutagenesis in Nicotiana tabacum.Plant Mol.Biol.87,99-110。其中PCR扩增所用引物为：

Nde I-F:CTGGTGGTAATCTGTATCTTTCGA(SEQ ID NO.7)

Nde I-R:TGTCGGAAACACATAATGGAGA(SEQ ID NO.8)

PCR/RE实验分析结果见图2与图3。图2A为电泳图，M泳道为DNA maker，从上到下依次为2000，1000，750，500，250，100bp；泳道1为CRISPR/Cas9突变后的样本PCR产物经Nde I酶切后；泳道2为非突变样本PCR产物酶切后，泳道3为突变样本PCR产物酶切前。图2B为回收A图泳道1中未被消化条带，即突变后产物经TA克隆后随机选择阳性菌落测序的部分峰图。峰图在箭头所指的位置发生了突变。图3为突变后TA克隆产物的测序结果。其中加粗的为PAM，灰色阴影标出为设计靶位点序列，方框标出的为发生突变碱基，“-”短线为缺失碱基，双下划线标出的为插入碱基，下划线标出的为Nde I限制性酶切位点。结果表明在我们预期的位点上，CRISPR/Cas9介导了基因组定点突变。从图2A泳道1的抗酶切条带可以看到，相当数量的DNA片段没有被消化，说明本发明的方法外源蛋白表达效率较高。

SEQUENCE LISTING

<110> 扬州大学

<120> 一种基于真空渗入的甘蓝和甘蓝型油菜叶片瞬时表达的方法

<130>

<160> 8

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

attgaggcct ccagtacccc ata 23

<210> 2

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

aaactatggg gtactggagg cct 23

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

ctccgtttta cctgtggaat cg 22

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

cggaggaaaa ttccatccac 20

<210> 5

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

ttcagaggtc tctctcgact agtggaatcg gcagcaaagg 40

<210> 6

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

agcgtgggtc tcgaccgacg cgtccatcca ctccaagctc 40

<210> 7

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

ctggtggtaa tctgtatctt tcga 24

<210> 8

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

tgtcggaaac acataatgga ga 22

Claims (9)

1.一种基于真空渗入的甘蓝和甘蓝型油菜叶片瞬时表达的方法，其特征在于包括以下步骤：

1)用农杆菌侵染液悬浮活化后的农杆菌；

2)将甘蓝或甘蓝型油菜幼苗叶片切割成小块；

3)将叶片小块置于农杆菌侵染液中，抽真空处理促进农杆菌对植物组织的渗入；

4)将农杆菌侵染后的叶片小块暗培养。

2.根据权利要求1所述基于真空渗入的甘蓝和甘蓝型油菜叶片瞬时表达方法，其特征在于所述步骤1)中，农杆菌指根癌农杆菌为GV3101或EHA105等常用于甘蓝和甘蓝型油菜侵染的菌株。

3.根据权利要求1或2所述基于真空渗入的甘蓝和甘蓝型油菜叶片瞬时表达方法，其特征在于所述步骤1)中，农杆菌在含有相应抗生素的LB液体培养至OD600约为0.7，将农杆菌离心富集后2倍培养基体积的农杆菌重悬液重悬菌体。

4.根据权利要求1所述基于真空渗入的甘蓝和甘蓝型油菜叶片瞬时表达方法，其特征在于所述农杆菌侵染液的组成成分为：1×MS，20g/L蔗糖，100μM乙酰丁香酮，10mM 2-(N-吗啡啉)乙磺酸，1.5mM MgSO₄，20μM FeSO₄，100μM CaCl₂，20mM NH₄Cl，pH 5.5；配制完成后用0.02μm规格的滤头过滤除菌。

5.根据权利要求1所述基于真空渗入的甘蓝和甘蓝型油菜叶片瞬时表达方法，其特征在于所述步骤2)中，将生长1～4周的甘蓝或甘蓝型油菜幼苗叶片去除边缘，切成面积约0.5cm²大小的小块。

6.根据权利要求1或4所述基于真空渗入的甘蓝和甘蓝型油菜叶片瞬时表达方法，其特征在于所述步骤2)中，甘蓝或甘蓝型油菜幼苗的叶片可以为子叶、真叶或叶柄。

7.根据权利要求1或4所述基于真空渗入的甘蓝和甘蓝型油菜叶片瞬时表达方法，其特征在于所述步骤2)中，甘蓝或甘蓝型油菜幼苗生长周期为1～4周。

8.根据权利要求1所述基于真空渗入的甘蓝和甘蓝型油菜叶片瞬时表达方法，其特征在于所述步骤3)中，将浸没于农杆菌侵染液中的叶片切块置于真空干燥器中，抽真空至0.05MPa，维持5min。

9.根据权利要求1所述基于真空渗入的甘蓝和甘蓝型油菜叶片瞬时表达方法，其特征在于所述步骤4)中，将侵染后的叶片在室温下的黑暗中放置1～5天。