CN116103334A - 一种猕猴桃抗溃疡病基因功能筛选专用瞬时转化体系 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种猕猴桃抗溃疡病基因功能筛选专用瞬时转化体系。待筛选的猕猴桃抗溃疡病基因通过农杆菌导入猕猴桃叶盘，0.2Mpa真空处理条件下，农杆菌液浓度OD600为0.6，渗入处理30min，共培养3天；猕猴桃抗溃疡病基因表达量增加，且所述猕猴桃叶盘坏死率低。接猕猴桃溃疡病菌Psa时终浓度为1×10‑5cfu/ml，真空侵染20min，5天后观察为最优体系。猕猴桃抗溃疡病基因AcNAC44、AcCaS、AcTGA06适用于本发明所述瞬时转化体系。本发明所述瞬时转化体系简单高效、稳定安全、高通量，为抗病表型筛选、解析抗病转基因植株功能机制奠定基础。

Description

一种猕猴桃抗溃疡病基因功能筛选专用瞬时转化体系
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，涉及一种猕猴桃抗溃疡病基因功能鉴定，具体涉及一种猕猴桃抗溃疡病基因功能筛选专用瞬时转化体系。
背景技术
随着分子生物学、多组学技术和生物信息学研究的日新月异，越来越多与植物生长发育、抗病抗逆的候选基因被筛选鉴定，但是受遗传转化效率低的限制，这些基因的功能分析受到了很大阻碍。瞬时转化技术具有简便安全、稳定高效、高通量的优点，特别适用于植物自身或异源基因功能以及代谢途径的大规模遗传研究，并且使得利用同源系统植物的瞬时表达进行基因功能分析成为可能。
基因瞬时表达技术作为研究植物基因功能的重要手段之一，通过瞬时表达将外源基因导入宿主细胞，使目的基因短时间内获得高水平表达或者沉默。目前，瞬时转化的技术主要包括PEG法、电击法、基因枪法、原生质体转化法、植物病毒载体介导法、农杆菌介导法和新兴的纳米载体介导法等。其中，根瘤农杆菌介导的瞬时转化法因其高效、方便、易操作等特点已经在多种植物中得到应用。早期的园艺植物瞬时表达体系主要以原生质体作为受体，然而原生质体分离难度大，转化效率低，逐渐被其他更简便的方法替代，比如基于叶片、果实、花瓣、根、悬浮细胞、细胞胚和愈伤组织的瞬时表达体系。农杆菌介导的瞬时转化法已经成功在苹果、月季、葡萄、番茄、莴苣、荔枝、草莓、南瓜等园艺作物中建立。然而对于遗传背景复杂、多年生落叶类藤本植物猕猴桃，瞬时转化体系报道较少，特别是以取材方便的叶片为材料，在猕猴桃瞬时转化体系中尚未见报道。
发明内容
本发明的技术目的：以猕猴桃叶片为材料，建立一种由农杆菌介导的猕猴桃抗溃疡病基因功能筛选专用瞬时转化体系，用于猕猴桃抗病相关基因的筛选及功能鉴定。
为实现本发明的技术目的，本发明以猕猴桃叶片为试验材料，以SA信号通路的关键抗病因子AcTGA06作为供试基因，以AcNAC44和AcCaS抗病相关基因作为验证效果基因，利用真空渗透辅助农杆菌介导转化法，探讨不同真空渗入时间以及共培养时间对叶片转化效率、坏死率和基因表达的影响，从而明确用猕猴桃溃疡病菌丁香假单胞猕猴桃致病变种(Pseudomonas syringaepv.actinidiae，Psa)接种叶盘时的最佳侵染时间和二次抽真空条件下的最优体系。本发明建议的猕猴桃抗溃疡病基因功能筛选专用瞬时转化体系，是一种简便高效、安全稳定的高通量方法，为研究猕猴桃基因的功能、启动子的活性等提供最优叶片瞬时转化的技术思路。
具体地，本发明建立的猕猴桃抗溃疡病基因功能筛选专用瞬时转化体系，其是将待筛选的目的基因通过农杆菌导入猕猴桃叶盘，0.2Mpa真空处理条件下，所述农杆菌液浓度OD600为0.6，渗入处理30min，共培养3天；所述目的基因为猕猴桃抗溃疡病基因，采用所述瞬时转化体系，目的基因表达量增加，且所述猕猴桃叶盘坏死率低。
进一步地，所述的猕猴桃抗溃疡病基因功能筛选专用瞬时转化体系，还包括，用猕猴桃溃疡病菌丁香假单胞猕猴桃致病变种(Pseudomonas syringae pv.actinidiae)侵染所述猕猴桃叶盘，猕猴桃溃疡病菌终浓度为1×10-5cfu/ml，侵染20min，共培养5天。
作为所述瞬时转化体系建立的优选实施方式之一，所述瞬时转化体系的构建载体选用pART27-GUS。
作为所述瞬时转化体系建立的优选实施方式之一，所述农杆菌选用GV3101。
本发明以抗病因子AcTGA06作为供试基因，其编码区核苷酸序列如SEQ IDNO：3所示。本发明选用抗病基因AcNAC44和AcCaS验证所述瞬时转化体系的效果，基因AcNAC44编码区核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，基因AcCaS编码区核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。
采用本发明所述猕猴桃抗溃疡病基因功能筛选专用瞬时转化体系，将基因AcTGA06、AcNAC44、AcCaS分别瞬时转化到猕猴桃叶盘中，可以显著地增强猕猴桃叶片对细菌性溃疡病菌Psa的抗性，显著地减少了细菌性溃疡病菌Psa的定殖数量。与对照组相比，这3个基因在猕猴桃叶盘中的过表达量均有显著差异，且3个抗性相关基因处理的过表达猕猴桃叶盘中细菌性溃疡病菌Psa显著被抑制。这充分说明本发明所述瞬时转化体系对猕猴桃抗病相关基因的筛选及功能鉴定行之有效。基于此，本发明请求保护所述瞬时转化体系在猕猴桃抗溃疡病基因筛选和功能鉴定中的应用。
作为所述瞬时转化体系的应用举例之一，所述瞬时转化体系用于抗病表型鉴定。
经验证，所述瞬时转化体系用于筛选和功能鉴定的猕猴桃抗溃疡病基因包括编码区核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示的基因AcNAC44，编码区核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示的基因AcCaS，编码区核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示的基因AcTGA06。
还有，本发明还进一步保护适用所述瞬时转化体系的猕猴桃抗溃疡病基因AcNAC44、AcCaS、AcTGA06。所述基因AcNAC44编码区核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，所述基因AcCaS编码区核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示，所述基因AcTGA06编码区核苷酸序列如SEQID NO：3所示。
经验证，所述猕猴桃抗溃疡病基因AcNAC44、AcCaS、AcTGA06在猕猴桃叶盘中过表达并提高猕猴桃叶盘的抗病性，减少丁香假单胞猕猴桃致病变种(Pseudomonassyringaepv.actinidiae)在猕猴桃叶盘中的定殖含量。
与现有技术相比，本发明“一种猕猴桃抗溃疡病基因功能筛选专用瞬时转化体系”具有下述的有益效果或优点。
(1)本发明建立了猕猴桃抗溃疡病基因功能筛选专用瞬时转化体系，具体为0.2Mpa真空处理条件下，农杆菌液浓度OD600为0.6，渗入30min，共培养3天后目的基因表达较高且叶盘坏死率最低；接猕猴桃溃疡病菌Psa时终浓度为1×10-5cfu/ml，真空侵染20min，5天后观察为最优体系。
(2)本发明所述瞬时转化体系可以最大限度地减少叶盘坏死率。经验证，本发明中不同的抗性相关基因在猕猴桃叶片中成功瞬时转化和高效表达，并且抗溃疡病效果显著。
(3)与稳定遗传转化体系相比，本发明所述瞬时转化体系不需要将外源基因与目标受体进行染色体整合，只要将目的基因导入叶盘内快速表达以分析基因功能，是细胞水平的表达分析，不涉及再生过程，可在转化之后直接进行抗病表型鉴定，周期短且转化效率高。
(4)本发明所述瞬时转化体系简单高效，稳定安全，高通量，应用广泛。本发明可以对将来获得稳定遗传转化抗病转基因植株解析功能机制奠定基础，最终服务于抗病育种以及生产中。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将本发明实施例中所涉及附图做简单的说明，显而易见地，所列出的附图仅仅是本发明实施例的一部分内容的呈现。
图1是本发明基于pART27-GUS的融合表达载体的构建模式图。图1中，EcoRⅠ和XhoⅠ为酶切位点。
图2是本发明所述AcTGA06基因转化叶盘后对丁香假单胞菌猕猴桃致病变种(Pseudomonas syringae pv.Actinidiae，Psa)M228菌株的抗性表型。图2中左侧3列叶片为转化后接种Psa 0天的抗性表型，右侧3列叶片为转化后接种Psa 5天的抗性表型。OX表示过表达；MMA表示农杆菌菌悬液，所述农杆菌菌悬液中含有10mM MgCl2，pH5.6(NaOH调pH)的10mM MES，0.2mM AS(乙酰丁香酮)；OX:pART27-GUS为阴性对照，OX:pART27-GUS+AcTGA06为携带目的基因AcTGA06的农杆菌，MMA为空白对照。
图3是以目的基因AcTGA06为阳性参照，本发明所述AcTGA06、AcNAC44、AcCaS基因转化叶盘后对丁香假单胞菌猕猴桃致病变种(Pseudomonas syringae pv.Actinidiae，Psa)M228菌株的抗性表型。图3中左侧3列叶片为转化后接种Psa 0天的抗性表型，右侧3列叶片为转化后接种Psa 5天的抗性表型。OX表示过表达；MMA表示农杆菌菌悬液，所述农杆菌菌悬液中含有10mM MgCl2，pH5.6(NaOH调pH)的10mM MES，0.2mM AS(乙酰丁香酮)；OX:pART27-GUS为阴性对照，OX:pART27-GUS+AcTGA06为携带目的基因AcTGA06的农杆菌，OX:pART27-GUS+AcNAC44为携带目的基因AcNAC44的农杆菌，OX:pART27-GUS+AcCaS为携带目的基因AcCaS的农杆菌，MMA为空白对照。
图4是本发明所述AcTGA06、AcNAC44、AcCaS基因的相对表达量。图4中，MMA为空白对照，OX:pART27-GUS为阴性对照，OX:pART27-GUS+AcTGA06为携带目的基因AcTGA06的农杆菌，OX:pART27-GUS+AcNAC44为携带目的基因AcNAC44的农杆菌，OX:pART27-GUS+AcCaS为携带目的基因AcCaS的农杆菌。
图5是本发明所述病原菌Psa在猕猴桃叶盘中的生物含量。图5中，MMA为空白对照，OX:pART27-GUS为阴性对照，OX:pART27-GUS+AcTGA06为携带目的基因AcTGA06的农杆菌，OX:pART27-GUS+AcNAC44为携带目的基因AcNAC44的农杆菌，OX:pART27-GUS+AcCaS为携带目的基因AcCaS的农杆菌。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本发明做进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明的保护范围。
实施例1
本实施例对猕猴桃抗溃疡病基因功能筛选专用瞬时转化体系的建立进行阐述。
1.基于pART27-GUS载体的重组表达载体的构建
根据pART27-GUS载体的功能，将目的基因插入到35S启动子之后具有基因超表达的功能。pART27-GUS载体可供选择的酶切位点为Xho I和HindIII。
表1重组载体构建引物序列
Figure BDA0003946150810000061
注：下划线标注的部分为对应的酶切位点。
以供试基因AcTGA06(编码区核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示)为例，使用表1相应的引物PCR扩增目的基因片段，片段纯化并测其浓度，其余两个基因(AcNAC44，编码区核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；AcCaS，编码区核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示)除引物不同外各组分均相同。
PCR扩增体系如下：
Figure BDA0003946150810000062
同时，对pART27-GUS空载大肠杆菌进行活化后摇菌提取质粒，检测浓度对其进行双酶切操作：
Figure BDA0003946150810000063
     
Figure BDA0003946150810000071
在水浴锅中37℃酶切1h，酶切结束后置于85℃、10min使酶失活。1.0％琼脂糖凝胶电泳进行检测，纯化回收目的片段(上海迈跟生物科技有限公司，货号：D2111-03)。融合表达载体构建示意图见图1，其连接体系如下：
Figure BDA0003946150810000072
注：Exnase 5×CEII Buffer购自南京诺唯赞生物科技有限公司，货号：C112。
将混合物置于PCR仪中37℃连接30min，后转化到大肠杆菌感受态细胞DH5α(北京擎科生物公司，货号：TSC-C14)，并进行重组子筛选和测序验证。对经测序验证正确的质粒吸取0.5μL在5mL LB/Kan+液体培养基中37℃、200rpm过夜震荡培养，使用质粒回收试剂盒(北京庄盟国际生物基因科技有限公司，货号：ZPK101-3)提取大肠杆菌中的质粒。将重组质粒pART27-GUS-35S:AcTGA06转化到农杆菌GV3101(上海唯地生物技术有限公司，货号：AC1001)中。
培养至48h左右，经PCR验证正确后，挑取单菌落置于LB液体培养基(含卡那霉素和利福平)中28℃、220rpm摇菌检测，摇菌至OD600＝0.6-0.8；对菌液进行检测，引物见表2。重组质粒检测片段大小780bp扩增检测程序：94℃预变性3min；94℃变性30s，62℃退火30s，72℃延伸3min，32次循环；72℃延伸5min。检测体系如下：
Figure BDA0003946150810000073
注：Green Taq Mix购自南京诺唯赞生物科技有限公司，货号P131-01。
表2重组质粒检测引物
Figure BDA0003946150810000081
2.瞬时转化体系的优化
(1)消毒
取生长正常、大小一致且无病斑的‘红阳’猕猴桃叶片，‘红阳’猕猴桃栽培于西北农林科技大学温室。将采集来的猕猴桃叶片置于泡沫箱中，首先用0.06％的次氯酸钠避光浸泡5min，紧接着用75％酒精清洗两遍，每遍清洗前浸泡1min，再用无菌水清洗两遍，然后用无菌滤纸吸干叶片表面多余水分。
(2)叶盘打取
将上述处理好的叶片置于无菌滤纸上，用孔径为1cm的无菌打孔器打取叶盘，打叶盘时注意避开叶片的主叶脉以及侧叶脉。
(3)农杆菌侵染
收集摇培好的携带有GUS和TGA基因的农杆菌，用10mM MgCl2清洗两遍，再用农杆菌侵染液MMA(0.2mM AS(乙酰丁香酮)，10mM MgCl2，pH5.6(NaOH调pH)的10mM MES)重悬，然后将OD600浓度分别调至0.4、0.6、0.8，暗培养3h。
将打好的猕猴桃叶盘分别置于含有农杆菌菌悬液的50mL离心管中，混匀，使叶盘充分接触菌悬液。采用真空法(0.2Mpa)，设置不同时间梯度(10min，20min，30min)进行真空渗透，使得菌悬液充分浸入叶盘中。然后取出猕猴桃叶盘，吸干表面水分，置于0.8％的水琼脂上，于28℃培养箱中进行共培养，统计发黑的叶盘的个数，用于计算叶盘坏死率a(表3)。取各个处理和时间点的样品，迅速置于-80℃冰箱保存，提取RNA进行定量分析。
叶盘坏死率a的计算公式：
叶盘坏死率a＝叶片中心部位发黑或褐色/总叶盘数×100％
表3瞬时转化农杆菌正交分析
Figure BDA0003946150810000091
通过0.2Mpa真空条件下采用农杆菌对猕猴桃叶盘进行瞬时转化，实验主要从农杆菌液浓度、真空处理时间和共培养天数三个维度进行正交分析，结果表明(表3)，处理8基因相对表达量最高，但叶盘坏死率也最高；处理组9，叶盘坏死较高，故上述结果排除。处理组1和6叶盘坏死率处于同一水平，但处理组1基因相对表达值低。综上，处理组6结果最优，即0.2Mpa真空处理条件下，农杆菌液浓度OD600为0.6，渗入30min，共培养3天后目的基因表达较高且叶盘坏死率最低。
(4)接种细菌性溃疡病菌Psa
用LB培养液将细菌性溃疡病菌丁香假单胞菌猕猴桃致病变种(Pseudomonassyringaepv.Actinidiae，Psa)M228菌株摇培(28℃，220r/min)至OD600＝0.6，8000r/min离心5min，然后用10mM MgCl2将农杆菌菌体清洗两遍，调整至OD600＝0.1，然后在20mL的菌悬液(10mM MgCl2)中分别加入PSA至终浓度分别为0.5×10-5cfu/mL、1×10-5cfu/mL、3×10- 5cfu/mL。同样采用真空法(0.2Mpa，15min)，使得Psa侵染至猕猴桃叶片中。置于16℃培养箱培养，分别于1、3、5天拍照观察。并统计坏死叶片的数目，计算叶盘坏死率b(叶片边缘发黄变褐不作计数)。叶盘坏死率b的计算公式同叶盘坏死率a。
(5)叶盘中病原菌生物含量的计算
超净工作台紫外照射20min，取9个处理的猕猴桃叶盘，每个处理3个生物学重复。猕猴桃叶盘叶片放入75％乙醇表面消毒30s，使用无菌水漂洗2-3次，每次约1min，然后将叶盘置于无菌的吸水纸上晾干。随后，将叶盘放入无菌的研钵中，加入10mM的MgSO4溶液500μL，用研磨棒磨碎。研磨匀浆后，进行10倍梯度稀释。取100μL稀释液涂布于含有50μg/mL卡那霉素的LB固体培养基上，然后放入28℃培养箱中。2d后置于紫外灯观察荧光菌落，统计计数，并且换算成猕猴桃叶片中Psa的总数量。
菌落数按以下计算公式换算成cfu/g：
cfu/g＝(菌落数×稀释倍数×10)/叶盘重量，取cfu/cm2对处理时间作图。每个实验至少重复3次。
(6)基因瞬时过表达分析
提取9个处理的叶盘的RNA，其中MMA和空载OX:pART27-GUS作为对照，每个处理分别取3个生物学重复，根据RNA的浓度反转成终浓度为2.0μg/μl的cDNA，将反转得到cDNA稀释50倍，用于后续RT-qPCR测定。根据Primer3plus设计各个基因的特异性引物，引物由西安擎科生物科技公司合成。
Figure BDA0003946150810000101
用于qPCR的反应体系为：
Figure BDA0003946150810000102
Figure BDA0003946150810000111
注：ChamQ SYBR qPCR Master Mix(Q311)购自于南京诺唯赞生物科技有限公司。
按照反应体系进行qPCR(瑞士，Roche，货号：LightCycler96)，设置程序预变性95℃，30sec；循环反应，40个循环，95℃，8sec，60℃，15sec；熔解曲线，95℃，15sec，60℃，60sec，95℃，15sec。最终数据由Graphpad prism8.0软件统计并分析，分析结果见表4。
表4接菌溃疡病菌瞬时转化正交分析
Figure BDA0003946150810000112
在0.2Mpa真空处理条件下，用猕猴桃溃疡病Psa侵染处理6(表3)的叶盘。本实验主要从Psa菌液浓度、真空处理时间和共培养天数三个维度进行正交分析，发现处理组2和处理组4虽然叶盘坏死率最低，但病原菌含量和发病率较高，与实验预期AcTGA06抗病基因的功能不符，故排除。处理组7发病率最低，但坏死率较高，影响对Psa侵染结果的判断，故排除。通过比较分析确定，处理组5为农杆菌瞬时转化后Psa再侵染最优体系，即接溃疡病菌Psa时终浓度为1×10-5cfu/ml，侵染20min，5天后观察，见图2。如图2所示，对猕猴桃叶盘进行过表达处理，分别设置阴性对照(OX:pART27-GUS)，空白对照(MMA)，以及携带目的基因的农杆菌(OX:pART27-GUS+AcTGA06)猕猴桃叶片，然后真空接种Psa后观察表型，发现AcTGA06基因可以显著提高猕猴桃叶片的抗性，符合实验预期，故将此基因设为后续转化的参考基因。
实施例2
采用实施例1所述的猕猴桃抗溃疡病基因功能筛选专用瞬时转化体系，对其他抗病基因进行验证，以评估瞬时转化体系的可靠性。
供试基因AcCaS：该基因编码区核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。
供试基因AcNAC44：该基因编码区核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。
供试基因AcCaS和AcNAC44全长cDNA序列的获得：使用RNA试剂盒(北京华越洋生物科技有限公司，货号：0416-50)提取‘红阳’猕猴桃叶片的RNA；使用反转录试剂盒(赛默飞，货号：K1162)获得cNDA。根据最新猕猴桃基因组(V3.0)获取猕猴桃CDS(编码区)完整序列，用Primerplus 3.0软件设计全长扩增引物。根据表1分别扩增基因AcNAC44和AcCaS的编码区全长。
供试基因AcCaS和AcNAC44的瞬时转化方法参照实施例1。
本实施例设置了严谨的对照实验，其中以OX:pART27-GUS为阴性对照，OX:pART27-GUS+AcTGA06为携带目的基因的农杆菌为阳性对照，MMA(农杆菌菌悬液)为空白对照。利用其余两个(OX:pART27-GUS+AcNAC44和OX:pART27-GUS+AcCaS)携带有抗溃疡病基因的农杆菌对本实验方法进行验证，参照处理6(表3)和处理5(表4)的处理方法。
图3是以目的基因AcTGA06为阳性参照，本发明所述AcTGA06、AcNAC44、AcCaS基因转化叶盘后对丁香假单胞菌猕猴桃致病变种(Pseudomonas syringae pv.Actinidiae，Psa)M228菌株的抗性表型。
图4是本所述AcTGA06、AcNAC44、AcCaS基因的相对表达量。
图5是本所述病原菌Psa在猕猴桃叶盘中的生物含量。
由图3-图5可以得出，基因AcNAC44、AcCaS与基因AcTGA06均可以在猕猴桃叶盘中过表达并提高猕猴桃叶盘的抗病性，减少了猕猴桃叶盘中病原菌Psa的定殖含量。由此说明了本专利中处理6(表3)和处理5(表4)的处理方法可靠，体系最佳。即0.2Mpa真空处理条件下，农杆菌液浓度OD600为0.6，渗入30min,共培养3天后目的基因表达较高且叶盘坏死率最低。接溃疡病菌Psa时终浓度为1×10-5cfu/ml，侵染20min，5天后观察为最优体系。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种猕猴桃抗溃疡病基因功能筛选专用瞬时转化体系，其特征在于，待筛选的目的基因通过农杆菌导入猕猴桃叶盘，0.2Mpa真空处理条件下，所述农杆菌液浓度OD600为0.6，渗入处理30min，共培养3天；所述目的基因为猕猴桃抗溃疡病基因，采用所述瞬时转化体系，目的基因表达量增加，且所述猕猴桃叶盘坏死率低。
2.根据权利要求1所述的猕猴桃抗溃疡病基因功能筛选专用瞬时转化体系，其特征在于，用猕猴桃溃疡病菌丁香假单胞猕猴桃致病变种(Pseudomonassyringaepv.actinidiae)侵染所述猕猴桃叶盘，猕猴桃溃疡病菌终浓度为1×10-5cfu/ml，侵染20min，共培养5天。
3.根据权利要求1所述的猕猴桃抗溃疡病基因功能筛选专用瞬时转化体系，其特征在于，所述瞬时转化体系的构建载体选用pART27-GUS。
4.根据权利要求1所述的猕猴桃抗溃疡病基因功能筛选专用瞬时转化体系，其特征在于，所述农杆菌选用GV3101。
5.根据权利要求1所述的猕猴桃抗溃疡病基因功能筛选专用瞬时转化体系，其特征在于，所述猕猴桃抗溃疡病基因为AcNAC44，编码区核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；或为AcCaS，编码区核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示；或为AcTGA06，编码区核苷酸序列如SEQ IDNO：3所示。
6.权利要求1所述瞬时转化体系在猕猴桃抗溃疡病基因筛选和功能鉴定中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述瞬时转化体系用于抗病表型鉴定。
8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述瞬时转化体系用于筛选和功能鉴定的猕猴桃抗溃疡病基因包括编码区核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示的基因AcNAC44，编码区核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示的基因AcCaS，编码区核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示的基因AcTGA06。
9.适用权利要求1所述瞬时转化体系的猕猴桃抗溃疡病基因AcNAC44、AcCaS、AcTGA06；所述基因AcNAC44编码区核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，所述基因AcCaS编码区核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示，所述基因AcTGA06编码区核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。
10.根据权利要求9所述的猕猴桃抗溃疡病基因，其特征在于，所述猕猴桃抗溃疡病基因AcNAC44、AcCaS、AcTGA06在猕猴桃叶盘中过表达并提高猕猴桃叶盘的抗病性，减少丁香假单胞猕猴桃致病变种(Pseudomonas syringae pv.actinidiae)在猕猴桃叶盘中的定殖含量。
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