CN112521475B

CN112521475B - 小麦TaLAX1-A基因及其在提高小麦幼胚再生效率中的应用

Info

Publication number: CN112521475B
Application number: CN202011566106.XA
Authority: CN
Inventors: 苏英华; 张宪省; 张凤丽; 于海霞
Original assignee: Shandong Agricultural University
Current assignee: Shandong Agricultural University
Priority date: 2020-12-25
Filing date: 2020-12-25
Publication date: 2022-11-18
Anticipated expiration: 2040-12-25
Also published as: CN112521475A

Abstract

本发明公开的是小麦TaLAX1‑A基因及其在提高小麦幼胚再生效率中的应用，属于植物基因工程技术领域。本发明首次从小麦中克隆得到了一个新型小麦TaLAX1‑A基因，该TaLAX1‑A基因能够有效调控小麦幼胚的再生效率。经过对该基因的研究发现，该基因过量表达可以提高小麦幼胚的再生效率。因此，过量表达该基因并应用于再生困难的骨干种质，对于提高小麦的遗传转化效率，进而提高小麦的产量和品质具有重要的经济价值和社会效益。

Description

小麦TaLAX1-A基因及其在提高小麦幼胚再生效率中的应用

技术领域

本发明涉及植物基因工程技术领域，具体涉及一种小麦TaLAX1-A基因及其在提高小麦幼胚再生效率中的应用。

背景技术

小麦是世界上最重要的粮食作物之一，随着粮食需求的不断增大，增加小麦产量，提高小麦品质，增强抗逆性等成为日益迫切的育种要求。然而，产量和品质等重要农艺性状都是受多基因和环境互作影响的复杂性状，单纯依靠现有常规育种技术已经难以满足我国粮食安全和人民日益增长的美好生活需要。因此，加快对小麦基因组和分子遗传育种的研究势在必行(刘倩等，2018)。转基因育种技术和分子设计育种技术可打破物种界限，大幅度提高育种效率，在提高产量、改善品质、增强抗逆性等方面已显示出巨大潜力。

这两种技术都是以遗传转化技术为基础。但是，目前小麦中不同基因型材料的再生效率和遗传转化效率差异很大，很多在生产中广泛应用的小麦骨干种质材料再生效率非常低，严重限制了小麦的遗传转化，影响了作物生物技术改良。尽管近些年来许多科研工作者已经在小麦基因型、再生体系以及遗传转化体系取得了一定的进展，但是发现的能够提高再生效率的基因并不多，因此，挖掘提高小麦再生效率的基因对提高小麦遗传转化效率非常重要。

发明内容

针对上述现有技术，本发明经长期研究和探索，发现了能够提高小麦幼胚再生效率的基因TaLAX1-A，发明人利用包含上述基因的CDS全长片段的DNA序列构建过表达载体，然后导入农杆菌，并用农杆菌介导法转化小麦幼胚，最后得到转基因小麦株系。发明人在转化小麦幼胚的过程中发现，与转化pC186空载体对照相比，过表达TaLAX1-A能够促进愈伤组织分化出更多的绿芽，提高再生效率。而提高再生效率是提高小麦遗传转化效率必不可少的环节之一。因此，将该基因过量表达应用于再生困难的骨干种质小麦，对于提高小麦遗传转化效率，进而提高小麦品质和产量具有重要的经济价值和社会效益。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明的第一方面，提供一种小麦TaLAX1-A基因，为如下1)或2)任一项所述的核酸：

1)核酸，其碱基序列如SEQ ID NO.1所示；

2)核酸，其碱基序列为编码SEQ ID NO.2所示蛋白质的碱基序列。

本发明的第二方面，提供一种由上述小麦TaLAX1-A基因编码的蛋白，所述蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明的第三方面，提供携带上述小麦TaLAX1-A基因的重组表达载体、转基因细胞系或基因工程菌。

本发明的第四方面，提供如下a)-d)中任一项所述的DNA片段在提高小麦幼胚再生效率或者培育幼胚再生效率提高的小麦品种中的应用；

a)SEQ ID NO.1所示的DNA片段；

b)编码SEQ ID NO.2所示氨基酸序列的DNA片段；

c)与a)或b)限定的DNA片段具有75％或75％以上同一性，且编码的蛋白在功能上与SEQ ID NO.2所示的蛋白等价的DNA片段；

d)cDNA片段或DNA片段，其在严格条件下与a)或b)的DNA片段杂交，且编码SEQ IDNO.2所示的蛋白。

本发明的第五方面，提供如下1)或2)所述的DNA片段通过调控上述小麦TaLAX1-A基因表达在提高小麦幼胚再生效率中的应用；

1)DNA片段，其转录产物在植物细胞中上调小麦TaLAX1-A基因的表达；

2)DNA片段，其翻译产物在植物细胞中上调小麦TaLAX1-A基因的表达。

本发明的第六方面，提供携带上述小麦TaLAX1-A基因的重组表达载体、转基因细胞系或基因工程菌或小麦TaLAX1-A基因编码的蛋白在如下(1)或(2)中的应用：

(1)提高小麦幼胚再生效率；

(2)培育幼胚再生效率提高的小麦品种。

本发明的第七方面，提供一种提高小麦幼胚再生效率的方法，包括用如下a)-d)任一项所述的多核苷酸转化植物并使所述多核苷酸在所述植物中表达的步骤；

a)SEQ ID NO.1所示的DNA片段；

b)编码SEQ ID NO.2所示氨基酸序列的DNA片段；

本发明的第八方面，提供一种培育幼胚再生效率提高的转基因小麦的方法，是将如下a)-d)任一项所述的多核苷酸导入出发小麦得到幼胚再生效率提高的转基因小麦；

a)SEQ ID NO.1所示的DNA片段；

b)编码SEQ ID NO.2所示氨基酸序列的DNA片段；

上述方法中，将所述的多核苷酸导入出发小麦的方法包括：聚乙二醇法、农杆菌介导法或基因枪轰击法。

上述方法中，所述幼胚再生效率提高是如下1)-4)中的至少一种：

1)所述转基因小麦的幼胚在转化过程中愈伤组织分化绿色芽点的时间早于所述出发小麦；

2)所述转基因小麦的幼胚在转化过程中绿芽分化率高于所述出发小麦；

3)所述转基因小麦的幼胚在转化过程中抗性苗率高于所述出发小麦；

4)所述转基因小麦T1代转基因植株幼胚再生效率高于所述出发小麦。

本发明的有益效果：

本发明首次从小麦中克隆得到了一个新型小麦TaLAX1-A基因，该TaLAX1-A基因能够有效调控小麦幼胚的再生效率。经过对该基因的研究发现，该基因过量表达可以提高小麦幼胚的再生效率。因此，过量表达该基因并应用于再生困难的骨干种质，对于提高小麦的遗传转化效率，进而提高小麦的产量和品质具有重要的经济价值和社会效益。

附图说明

图1：TaLAX1与水稻LAX1的氨基酸序列比对图。

图2：TaLAX1同源蛋白进化树分析。

图3：小麦过表达载体pUbi::TaLAX1-A载体结构示意图。

图4：pUbi::TaLAX1-A与对照pC186空载体转化Fielder过程对比图；图中，图A-图D为pC186空载体转化Fielder小麦幼胚的组织培养过程，图E-图H为pUbi::TaLAX1-A转化Fielder小麦幼胚的组织培养过程。CIM：愈伤诱导培养基，SIM：分化培养基。

图5：过表达TaLAX1-A转化Fielder数据统计分析。

图6：pUbi::TaLAX1-A与对照pC186空载体转化山农28过程对比图；图A-图D为pC186空载体转化山农28小麦幼胚的组织培养过程，图E-图H为pUbi::TaLAX1-A转化山农28小麦幼胚的组织培养过程。

图7：过表达TaLAX1-A转化山农28数据统计分析。

图8：过表达TaLAX1-A转化Fielder T0代转基因阳性植株检测结果图。

F1-F32表示的转基因植株的编号，NC表示Fielder野生型基因组阴性对照，PC表示表达载体质粒阳性对照，M表示Marker指示条带。

图9：过表达TaLAX1-A转化山农28T0代转基因阳性植株检测结果图。

S1-S14表示的转基因植株的编号，NC表示山农28野生型基因组阴性对照，PC表示表达载体质粒阳性对照，M表示Marker指示条带。

图10：过表达TaLAX1-A转化Fielder T1代转基因植株表达水平检测结果图。

图11：过表达TaLAX1-A转化Fielder T1代与野生型再生对比图；图A-图D为野生型Fielder小麦幼胚的组织培养过程，图E-图H为pUbi::TaLAX1-A转化Fielder T1代转基因阳性植株幼胚的组织培养过程。

图12：过表达TaLAX1-A转化山农28T1代转基因植株表达水平检测结果图。

图13：过表达TaLAX1-A转化山农28T1代与野生型再生对比图；图A-图D为野生型山农28小麦幼胚的组织培养过程，图E-图H为pUbi::TaLAX1-A转化山农28T1代转基因阳性植株幼胚的组织培养过程。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

正如背景技术部分所介绍的，转基因育种技术和分子设计育种技术可打破物种界限，大幅度提高育种效率，在提高产量、改善品质、增强抗逆性等方面已显示出巨大潜力。但是，小麦的遗传转化效率远远低于同为禾本科植物的水稻和玉米；而且不同基因型小麦材料的再生效率和遗传转化效率差异很大，很多在生产中广泛应用的小麦骨干种质材料再生效率非常低，严重限制了小麦的遗传转化，影响了作物生物技术改良。

在建立小麦植株再生体系时，幼胚是常用的外植体来源。基因型、培养基、幼胚材料是影响小麦幼胚培养植株再生的三个主要影响因素。目前对于提高小麦幼胚再生效率的研究主要集中于培养基和幼胚材料，而能够提高小麦幼胚再生效率的基因还很少见有报道。

基于此，本发明对能够调控小麦幼胚再生效率的基因进行了深入研究，本发明研究发现，基因TraesCS3A02G350600在小麦幼胚再生过程中具有较高表达水平。通过比对氨基酸序列发现，该基因编码的蛋白与水稻中的LAX PANICLE 1(LAX1)蛋白序列相似性高达80.74％，因此发明人将该基因命名为TaLAX1-A，其核苷酸序列如SED ID NO.1所示，该基因编码序列全长为639bp，氨基酸序列如SED ID NO.2所示，编码212个氨基酸。LAX1(LAXPANICLE 1)在水稻中的作用主要是编码bHLH转录因子，对于侧生分化组织的发生与维持至关重要，能够影响水稻的分蘖、小穗分枝以及小花的形成。而TaLAX1-A基因在小麦中的生物学功能未有报道。

TaLAX1-A基因在小麦中有另外2个等位基因(TaLAX1-B和TaLAX1-D)，在小麦中的功能均不清楚。发明人通过分析TaLAX1在小麦幼胚再生过程中的表达水平发现，TaLAX1-A基因的表达水平高于TaLAX1-B和TaLAX1-D基因。因此，本发明主要以TaLAX1-A基因为研究对象。

本发明从中国春小麦茎尖cDNA中扩增得到TaLAX1-A基因，用包含该TaLAX1-A基因的CDS全长片段的DNA序列构建过表达载体，然后将过表达载体导入农杆菌，并用农杆菌介导法侵染小麦幼胚，然后进行继代培养，直至得到转基因阳性株系。在继代培养过程中，发明人发现过量表达TaLAX1-A能够促进绿芽分化率，而提高绿芽分化率是提高小麦遗传转化效率的重要途径，能够为转化其他优良基因奠定良好的基础，能够产生重要的经济价值和社会效益。

基于上述发现的TaLAX1-A基因，本发明的保护范围还包括与上述基因同源的DNA片段，以及编码的蛋白与SEQ ID NO.2所示的蛋白功能等价的DNA片段。本文所指的“与SEQID NO.2所示的蛋白功能等价”意味着目标DNA片段所编码的蛋白在生物学功能和生理生化特征等方面与本发明中SEQ ID NO.2所示的蛋白相同或相近。本发明发现，SEQ ID NO.2所示的蛋白的典型生物学功能是促使小麦幼胚再生效率提高，通过上调SEQ ID NO.2所示的蛋白的表达量和/或活性，可以用于提高小麦的再生效率。

这些与TaLAX1-A基因同源的DNA片段包括本发明核苷酸序列(SEQ ID NO.1)对应的等位基因、同源基因、突变基因和衍生基因；它们编码的蛋白类似于本发明SEQ ID NO.2所示的蛋白，或存在一个、数个或数十个氨基酸的替换、删除或插入现象，都属于本发明内容。

本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本发明的TaLAX1-A基因的非关键位置的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明TaLAX1-A基因的核苷酸序列75％或者更高同一性的核苷酸，只要编码的蛋白与SEQ ID NO.2所示的蛋白功能等价，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。

这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本发明SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列具有75％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。氨基酸或核苷酸序列的等同率可采用BLAST算法测定(Altschul et al.,1990；Karlin and Altschul,1993)。

上述75％或75％以上同一性，可为80％、85％、90％或95％以上的同一性。

从应用角度出发，本发明TaLAX1-A基因或其同源基因的DNA片段，当导入出发小麦植株后，很可能创制出幼胚再生效率提高的小麦表型。本发明对用于开展植物细胞转化的质粒载体没有限制，只要它们在植物细胞中能够表达承载基因。对于本领域的技术人员，可以使用各种手段将质粒载体导入植物细胞，比如聚乙二醇(polyethylene glycol，PEG)法、电穿孔(electroporation)法、农杆菌介导方法、基因枪轰击法等，并将转化细胞发展成为转基因植株。在植物领域，各种转基因技术趋向成熟，并得到广泛应用。以上这些方法和其他类似方法均适用于本发明领域。

在本发明的一个实施方案中，是从中国春小麦茎尖cDNA中扩增获得该基因，其具体步骤如下：

(1)提取中国春小麦茎尖RNA并反转录。

(2)TaLAX1-A基因的克隆。

以茎尖cDNA为模板，采用以下引物对进行PCR扩增：

上游引物：5'-ATGGATCCATATCACTACGAAAAC-3'，如SEQ ID NO.3所示；

下游引物：5'-CTAATAAGATCCGTGAGCGTGA-3'，如SEQ ID NO.4所示；

PCR扩增体系为2μL上游引物(50pmol/μL)，2μL下游引物(50pmol/μL)，5μL10×PCRbuffer，2μL dNTP混合液(10mmol/L)，0.5μL EVO DNA聚合酶(5U)，1μL cDNA模板，加DEPC·H₂O将总体积补充至25μL。

扩增条件为：95℃预变性3min；95℃变性15s，60℃退火15s，72℃延伸1min，循环32次；72℃延伸7min。

取4μL PCR扩增产物与pENTR^TM/D-TOPO Vector载体连接，操作步骤按照pENTR^TM/D-TOPO Vector产品说明书进行。然后连接产物转化大肠杆菌Top10，在含有卡那霉素(100mg/L)的LB固体培养基上培养过夜。挑取单菌落，在含有卡那霉素(100mg/L)的LB液体培养基中培养过夜。碱法提取质粒DNA，进行序列测定。扩增产物经测序分析，其序列如SEQID NO.1所示，表明TaLAX1-A基因已经连接到pENTR^TM/D-TOPO Vector载体上，表明克隆载体构建完成。然后将克隆载体用ApaI进行酶切，经电泳检测正确后进行回收。然后将1μL酶切的克隆载体与pC186空表达载体利用LR Mix进行连接，然后连接产物转化大肠杆菌Top10，在含有卡那霉素(100mg/L)的LB固体培养基上培养过夜。挑取单菌落，在含有卡那霉素(100mg/L)的LB液体培养基中培养过夜。碱法提取质粒DNA，进行序列测定。扩增产物经测序分析，其序列如SEQ ID NO.1所示，表明TaLAX1-A已经连接到pC186载体上，表示过表达载体pUbi::TaLAX1-A构建完成。发明人进一步利用获得的pUbi::TaLAX1-A过表达载体转化农杆菌。

最后发明人利用农杆菌介导法转化小麦授粉后12d-15d的幼胚，然后经过组培得到抗性苗，并最终筛选获得了具有抗性的转基因阳性植株。在转化过程中发现TaLAX1-A能够促进绿芽的分化率，从而提高了抗性苗率。将该基因应用于生产，用于转化再生困难的骨干种质，可以提高骨干种质的遗传转化效率。

在本发明的另一实施方案中，观察了TaLAX1-A转化Fielder、山农28两种小麦愈伤组织的生长状况，步骤如下：

取授粉约12-15天的小麦，剥去颖壳，放入无菌50mL离心管中，在超净工作台中进行灭菌消毒处理，在显微镜下剥取小麦幼胚，然后利用农杆菌侵染小麦幼胚并进行组织培养。发明人观察了组织培养过程中愈伤组织的生长状况，发现幼胚经过21天左右的诱导，膨大形成3-5mm左右的圆球状初级愈伤组织，去除未诱导成功的幼胚，并统计初级愈伤组织诱导率。诱导成功的初级愈伤组织继续经过21天的暗培养会形成结构紧密、颜色淡黄的成熟愈伤组织，去除未诱导成功的愈伤组织并统计成熟愈伤组织诱导率。将成熟愈伤组织继代到分化培养基上进行光照培养，统计绿芽分化率以及抗性苗率(表7-表12)。发现转化过程中的绿芽分化率、抗性苗率较空载体对照都有较大程度的提高，且转化TaLAX1-A能够更早的分化出绿色芽点并产生更多的抗性苗(图4-图7)。发明人通过设计嵌套引物鉴定了T0代转基因植株，获得了转基因阳性植株(图8和图9)。

在本发明的又一实施方案中，发现Fielder和山农28T1代转基因阳性植株再生能力较野生型增强。具体步骤如下：

发明人将Fielder和山农28T1代转基因阳性植株与野生型Fielder和山农28种植于人工气候室，并检测转基因植株中TaLAX1-A基因的表达量，发现转基因植株中TaLAX1-A基因的表达水平均有不同水平的上调(图10和图12)，表明已经获得稳定遗传的T1代转基因植株。待T1代转基因阳性植株开花后12-14天，取转基因阳性植株和野生型幼胚进行组织培养，比较再生情况，并统计初级愈伤组织诱导率、成熟愈伤组织诱导率、绿芽分化率以及再生苗率。发现在不进行侵染的情况下，Fielder和山农28T1代转基因阳性植株较野生型对照能够分化出更多的绿芽，培养至后期能够产生更多的再生苗(图11和图13)。统计数据显示，T1代转基因阳性植株的绿芽分化率和再生苗率都明显高于野生型对照(表13和表14)。表明TaLAX1-A具有促进小麦幼胚再生的能力。

为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本申请的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本申请的技术方案。

本发明实施例中所用的试验材料均为本领域常规的试验材料，均可通过商业渠道购买得到。未注明详细条件的实验方法是按照常规试验方法或按照供应商所建议的操作说明书进行的。

实施例1：TaLAX1-A基因克隆及植物过表达载体的构建

1.小麦总RNA的提取和纯化

本实验中所用的RNA提取试剂盒为北京康为试剂生物科技有限公司提供的UltraPure RNA Extraction Kit，具体实验步骤如下：

(1)样品处理：称取30-50mg小麦茎尖组织材料，在液氮中充分研磨，将研磨后的粉末转移至含有1mL TRIzon Reagent的离心管中，充分震荡混匀，使组织样本充分裂解，室温放置5min，使蛋白核酸复合物完全分离。

(2)以每1mL TRIzon Reagent加入200μL氯仿的比例加入氯仿，盖好离心管盖，剧烈震荡混匀15s，随后室温静置2min。

(3)提前预冷4℃离心机，12000rpm/min离心10min，离心结束后，将含有三层分层的离心管中的上层水相转移到一个新的RNase-Free离心管中，RNA主要集中在上层水相。

(4)向离心管中加入等体积的70％乙醇，乙醇需现用现配，且配制所用水为无RNase水，颠倒混匀，使其充分混合。

(5)将上步所得的溶液分一次或多次转移到已经装有收集管的吸附柱中，12000rpm/min室温离心30s，倒掉收集管中的废液，并将吸附柱重新放回收集管中。

(6)向吸附柱中加入700μL Buffer RW1，12000rpm/min室温离心30s，弃掉废液，将吸附柱重新放回收集管。

(7)向吸附柱中加入500μL含有无水乙醇的Buffer RW2，12000rpm室温离心30s，弃掉收集管中的废液，并将吸附柱重新放回收集管中。

(8)重复步骤(7)。

(9)将空吸附柱12000rpm/min室温离心2min，倒掉收集管中液体，真空干燥泵干燥处理约5min。此步的目的是将吸附柱中残余乙醇去除，以免影响后续酶促反应(酶切、PCR等)。

(10)将干燥后的吸附柱置于一个新的无RNase离心管中，向吸附柱中间加入30-50μL RNase-Free Water，室温静置1-2min，12000rpm/min离心2min，所得到的溶液即为RNA溶液，吸取少量RNA溶液以备浓度测定以及电泳检测。其余RNA溶液用液氮速冻后存于-80℃冰箱，防止RNA降解。

为确保RNA质量达到要求，分别使用分光光度计和琼脂糖凝胶电泳检测纯化后的RNA样品纯度和浓度，其中纯度和浓度标准为：RNA纯度为OD_260/280和OD_260/230均在1.8-2.0范围内，RNA浓度在1.0-2.0μg/μL范围内。

2.cDNA第一链的合成

本实验中所用的cDNA第一条链的合成试剂盒由天根生物技术有限公司的FastQuantRT Kit(with gDNase)完成。具体实验操作步骤如下：

(1)将模板RNA从-80℃冰箱取出，放置于冰上解冻，将试剂盒提前拿出室温解冻，解冻后迅速置于冰上。配制基因组DNA去除体系反应液，配制方法见下表所示：

(2)按照上表所示加好各种组分，彻底混匀，短暂离心，放置于提前预热的42℃金属浴，孵育3min。

(3)配制反转录反应混合液(10μL体系)，配制方法见下表所示：

(4)按上表所示将各组分加入离心管，混匀，短暂离心后，加入到基因组DNA去除体系反应液中，充分震荡混匀。

(5)置于42℃金属浴上，孵育15min。

(6)95℃孵育3min，随后放于冰上，放入-20℃冰箱保存，以便进行下一步实验操作。

1.3TaLAX1-A基因的克隆

以反转录的cDNA为模板，采用以下引物对进行PCR扩增：

上游引物:5'-ATGGATCCATATCACTACGAAAAC-3'，如SEQ ID NO.3所示；

下游引物:5'-CTAATAAGATCCGTGAGCGTGA-3'，如SEQ ID NO.4所示；

PCR扩增体系为2μL上游引物(50pmol/μL)，2μL下游引物(50pmol/μL)，5μL10×PCRbuffer，2μL dNTP混合液(10mmol/L)，0.5μL EVO DNA聚合酶(5U)，1μL cDNA模板，加DEPC·H₂O将总体积补充至25μL；

扩增条件为：94℃预变性3min，95℃变性15s，60℃退火15s，72℃延伸1min，循环32次，72℃延伸7min。

3.植物表达载体pUbi::TaLAX1-A的构建

(1)取4μL PCR产物与pENTR^TM/D-TOPO Vector载体连接，操作步骤按照pENTR^TM/D-TOPO Vector产品说明书进行。

(2)连接产物转化大肠杆菌Top10，在含有卡那霉素(100mg/L)的LB固体培养基上培养过夜。

(3)挑取单菌落，在含有卡那霉素(100mg/L)的LB液体培养基中培养过夜。碱法提取质粒DNA，进行序列测定。

(4)扩增产物经测序分析，其序列如SEQ ID NO.1所示，表明TaLAX1-A基因已经连接到pENTR^TM/D-TOPO Vector载体上，克隆载体构建完成。

(5)用限制性内切酶Apa I酶切克隆载体，通过电泳检测并回收目的片段。

(6)通过LR反应将酶切后的克隆载体与pC186载体进行连接，操作步骤按照lifetechnologies公司产品LR说明书进行。

(7)将连接产物转化大肠杆菌Top10，在含有卡那霉素(50mg/L)的LB固体培养基上培养过夜。

(8)挑取单菌落，在含有卡那霉素(50mg/L)的LB液体培养基中培养过夜。碱法提取质粒DNA，并进行测序分析。

(9)将测序分析正确的表达载体pUbi::TaLAX1-A转化农杆菌EHA105并获得可供转化使用的农杆菌菌株。

实施例2：农杆菌介导的小麦幼胚的转化及阳性植株的获得

1.小麦遗传转化

小麦遗传转化采用的是农杆菌介导法，农杆菌侵染步骤如下：

(1)将制备好的农杆菌(实施例1制备)侵染液吸入盛有小麦幼胚的2mL离心管中，轻轻颠倒混匀45s，使幼胚浸入菌液中，若幼胚无法浸入菌液中，可短暂离心。

(2)静置5min，将菌液与幼胚倒入无菌一次性培养皿中，吸去一半菌液。

(3)用消毒冷却的手术刀挑取幼胚置于共培养培养基上，期间手术刀要消毒灭菌几次，以免染菌影响后续实验。

(4)将培养皿用封口膜封口，放入23℃暗培养箱中进行共培养。

(5)共培养2天后，切掉幼胚胚轴，置于恢复培养基上，25℃暗培养。

(6)5天后，幼胚愈伤组织开始膨大，愈伤组织开始产生，将膨大的愈伤组织移入筛选培养基A中，弃掉褐化死亡的幼胚组织，继续25℃暗培养。

(7)14天后，形成较大的愈伤组织，将愈伤组织切成两半，切面接触培养基移入筛选培养基B中，继续25℃暗培养。

(8)21天后将愈伤组织移入分化培养基中，愈伤组织开始分化出芽，置于温度为25℃，光照强度为2000lx的光照培养箱中培养。

(9)愈伤组织分化出绿苗后移入生根培养基中，直至绿苗生长出4-5片叶子，移栽至温室或人工气候室壮苗培养。

培养基成分见表1-表6。

表1：共培养培养基(1L)

表2：恢复培养基(1L)

表3：筛选培养基A(1L)

表4：筛选培养基B(1L)

表5：分化培养基(1L)

表6：生根培养基(1L)

2.转化数据统计分析

2.1转化TaLAX1-A对幼胚再生效率的影响

为了实验数据的可靠性，我们每一种小麦品种均重复转化了3次，并统计了3次实验数据，结果显示，转化TaLAX1-A能够明显提高绿芽分化率以及抗性苗率(图4-图7和表7-表12)。

表7：Fielder第一批转化数据

表8：Fielder第二批转化数据

表9：Fielder第三批转化数据

表10：山农28第一批转化数据

表11：山农28第二批转化数据

表12：山农28第三批转化数据

表7-表12中：

初级愈伤组织诱导率＝初级愈伤组织数/接种幼胚数×100％；

成熟愈伤组织诱导率＝成熟愈伤组织数/接种幼胚数×100％；

绿芽分化率＝出现绿芽的愈伤组织数/接种幼胚数×100％；

抗性苗率＝抗性苗数量/接种幼胚数×100％。

发明人通过设计嵌套引物鉴定了T0代转基因植株，获得了转基因阳性植株(图8和图9)。

阳性植株的嵌套引物序列如下：

嵌套引物上游引物：5'-ATGGATCCATATCACTACGAAAAC-3'，如SEQ ID NO.3所示。

嵌套引物下游引物：5'-CTGTGGGTTAGCATTCTTTCTG-3'，如SEQ ID NO.5所示。

2.2T1代转基因植株再生能力增强

选取Fielder和山农28T1代转基因植株幼胚，以野生型Fielder和山农28幼胚为对照，比较两者的再生能力。结果见图11、13和表13、14。

表13：Fielder转基因T1代组织培养数据统计

表14：山农28转基因T1代组织培养数据统计

表13和表14中：

初级愈伤组织诱导率＝初级愈伤组织数/接种幼胚数×100％；

成熟愈伤组织诱导率＝成熟愈伤组织数/接种幼胚数×100％；

绿芽分化率＝出现绿芽的愈伤组织数/接种幼胚数×100％；

再生苗率＝再生苗数量/接种幼胚数×100％。

结果显示，过表达TaLAX1-A T1代转基因植株的再生能力明显强于野生型(图11、13和表13、14)。

以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 山东农业大学

<120> 小麦TaLAX1-A基因及其在提高小麦幼胚再生效率中的应用

<130> 2020

<160> 5

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 639

<212> DNA

<213> TaLAX1-A

<400> 1

atggatccat atcactacga aaacatccat gacccacacg gctgcagctt ccccatccac 60

ccgcagccgc ctctcctcct ccaccactac ccggccgccg cgctcgcgga gagccgggtc 120

agcaggggcg gtgccggacg gcgccgcccc ggcgcgaagc tctcgactga cccccagagc 180

gttgcggcgc gggagcgccg gcaccggatc agcgaccgct tccgcgtgct ccgcagcctc 240

gtgcccggcg gcagcaagat ggacaccgtc tccatgctgg agcaggccat ccactacgtc 300

aagttcctca aggcgcaggt cagcctgcac caggccgcgc tcatacagca cgaggagggc 360

tgcggcggcg tcgtccatgg cgagttcgcc ggcgccgctg gcgaggtgac ggcgatggag 420

cttccggcag cgcaggcgct gcaggaggtg atgagccgct actacgctgc agctcatcag 480

gtggaagagc ttgatctatg cgcggggcag atgagcagta gttctcacga tctgcctccg 540

ctgccttcct gcatcttgga tgaggagtct gcggccgcgt gctactccgg gtgcagcctc 600

caagccgagg agatcgctca cgctcacgga tcttattag 639

<210> 2

<211> 212

<212> PRT

<213> TaLAX1-A

<400> 2

Met Asp Pro Tyr His Tyr Glu Asn Ile His Asp Pro His Gly Cys Ser

1 5 10 15

Phe Pro Ile His Pro Gln Pro Pro Leu Leu Leu His His Tyr Pro Ala

20 25 30

Ala Ala Leu Ala Glu Ser Arg Val Ser Arg Gly Gly Ala Gly Arg Arg

35 40 45

Arg Pro Gly Ala Lys Leu Ser Thr Asp Pro Gln Ser Val Ala Ala Arg

50 55 60

Glu Arg Arg His Arg Ile Ser Asp Arg Phe Arg Val Leu Arg Ser Leu

65 70 75 80

Val Pro Gly Gly Ser Lys Met Asp Thr Val Ser Met Leu Glu Gln Ala

85 90 95

Ile His Tyr Val Lys Phe Leu Lys Ala Gln Val Ser Leu His Gln Ala

100 105 110

Ala Leu Ile Gln His Glu Glu Gly Cys Gly Gly Val Val His Gly Glu

115 120 125

Phe Ala Gly Ala Ala Gly Glu Val Thr Ala Met Glu Leu Pro Ala Ala

130 135 140

Gln Ala Leu Gln Glu Val Met Ser Arg Tyr Tyr Ala Ala Ala His Gln

145 150 155 160

Val Glu Glu Leu Asp Leu Cys Ala Gly Gln Met Ser Ser Ser Ser His

165 170 175

Asp Leu Pro Pro Leu Pro Ser Cys Ile Leu Asp Glu Glu Ser Ala Ala

180 185 190

Ala Cys Tyr Ser Gly Cys Ser Leu Gln Ala Glu Glu Ile Ala His Ala

195 200 205

His Gly Ser Tyr

210

<210> 3

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

atggatccat atcactacga aaac 24

<210> 4

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

ctaataagat ccgtgagcgt ga 22

<210> 5

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

ctgtgggtta gcattctttc tg 22

Claims

1.如下a)或b)所述的DNA片段在提高小麦幼胚再生效率或者培育幼胚再生效率提高的小麦品种中的应用；

a)SEQ ID NO.1所示的DNA片段；

b)编码SEQ ID NO.2所示氨基酸序列的DNA片段。

2.携带小麦TaLAX1-A基因的重组表达载体或基因工程菌在如下(1)或(2)中的应用：

(1)提高小麦幼胚再生效率；

(2)培育幼胚再生效率提高的小麦品种；

所述小麦TaLAX1-A基因为如下a)或b)所述的DNA片段：

a)SEQ ID NO.1所示的DNA片段；

b)编码SEQ ID NO.2所示氨基酸序列的DNA片段。

3.小麦TaLAX1-A基因编码的蛋白在提高小麦幼胚再生效率中的应用；

所述小麦TaLAX1-A基因编码的蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

4.一种提高小麦幼胚再生效率的方法，其特征在于，包括用如下a)或b)所述的多核苷酸转化植物并使所述多核苷酸在所述植物中表达的步骤；

a)SEQ ID NO.1所示的DNA片段；

b)编码SEQ ID NO.2所示氨基酸序列的DNA片段。

5.一种培育幼胚再生效率提高的转基因小麦的方法，其特征在于，是将如下a)或b)所述的多核苷酸导入出发小麦得到幼胚再生效率提高的转基因小麦；

a)SEQ ID NO.1所示的DNA片段；

b)编码SEQ ID NO.2所示氨基酸序列的DNA片段；

所述幼胚再生效率提高是如下1)-4)中的至少一种：

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，将所述的多核苷酸导入出发小麦的方法包括：聚乙二醇法、农杆菌介导法或基因枪轰击法。