CN107460204B - OsSPL7调控水稻株型的上下游作用途径及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了OsSPL7调控水稻株型的上下游作用途径及其应用，具体地，本发明提供了一种物质的用途，所述物质为SPL7基因或其编码蛋白、或其促进剂或抑制剂，用于调控农作物的农艺性状，所述农艺性状选自下组的一种或多种：(i)根的性状；(ii)分蘖数；(iii)株高；(iv)穗表型；(v)可育性。本发明还提供一种复合物，所述复合物为(a)SPL7蛋白与(b)具有GTAC基序的启动子区域所形成的复合物，促进或抑制该复合物的形成可达到调控农作物的农艺性状的效果。

Description

OsSPL7调控水稻株型的上下游作用途径及其应用

技术领域

本发明涉及植物基因工程领域，具体地，涉及OsSPL7调控水稻株型的上下游作用途径及其应用。

背景技术

水稻是最重要的粮食作物，世界上三分之一以上的人口以水稻为主食。由于水稻具有基因组小、遗传和物理图谱精细、转基因技术相对容易及与其它禾本科作物的共线性的优点，水稻也一直作为优良的模式植物。随着水稻基因组测序的完成，人类开始进入后基因组时代，全面开展水稻功能基因组研究和基因注释己成为生命科学的前沿领域。因此水稻功能基因的研究对社会经济发展和生物学研究具有重大意义。

为解决人口增长与耕地面积减少的矛盾，提高水稻品质(如提高水稻抗旱能力，提高水稻单位面积产量)是人们面临的重大挑战。虽然20世纪50、60年代的矮化育种和70年代的杂交水稻培育是水稻科学的两次革命，但近几年来水稻的品质提高开始徘徊。

1994年国际水稻所(CIRRI)提出水稻理想株型育种，是基于减少分蘖总数、提高成穗率、塑造穗大粒多一类新株型(NPT)的指导思想。我国的“水稻超高产育种计划”也离不开提高水稻抗旱以及株型改造的问题。在水稻的抗旱方面，水稻根部改良主要着眼于根部加粗、根部分支增加等；而在株型改造方面，穗数、穗粒数和粒重中，穗数的多少在很大程度上受制于分蘖的发生量。因而根部性状和分孽是影响水稻等主要农作物品质的重要农艺性状。

因此，本领域迫切需要开展影响水稻根部和分蘖性状的相关基因的功能研究，以便用于提高作物的农艺性状。

发明内容

本发明的目的是提供影响水稻根部和分蘖性状的相关基因及其应用。

本发明第一方面提供了一种物质的用途，所述物质为SPL7基因或其编码蛋白、或其促进剂或抑制剂，用于调控农作物的农艺性状，所述农艺性状包括选自下组的一种或多种性状：

(i)根的性状；

(ii)分蘖数；

(iii)株高；

(iv)穗表型；

(v)可育性。

在另一优选例中，所述根的性状包括根的粗细和/或侧根数量。

在另一优选例中，所述可育性包括可育、育性降低和/或不育。

在另一优选例中，所述的物质为SPL7的抑制剂，并且所述调控农作物的农艺性状包括选自下组的一种或多种性状：

(i-1)使根变细；

(ii-1)增加分蘖数；

(iii-1)降低株高；

(iv-1)使穗呈现密穗表型；

(v-1)使农作物可育。

在另一优选例中，所述的物质为SPL7基因或其编码蛋白、或其促进剂，并且所述调控农作物的农艺性状包括选自下组的一种或多种性状：

(i-1)使根变粗，且侧根数量接近于0；

(ii-1)减少分蘖数；

(iii-1)提高株高；

(iv-1)使穗呈现稀穗表型；

(v-1)使农作物育性降低或不育。

在另一优选例中，当E1/E0≥10，较佳地≥20，更佳地≥30倍时，所述农作物的育性降低或不育，其中E1为所述农作物中SPL7蛋白的表达量；E0为野生型水稻中SPL7蛋白的表达量。

在另一优选例中，所述野生型水稻选自下组：水稻ZH11。

在另一优选例中，所述的抑制剂选自下组：小分子化合物、反义核酸、microRNA、siRNA、RNAi、或其组合。

在另一优选例中，所述的促进剂选自下组：小分子化合物、核酸分子、或其组合。

在另一优选例中，所述的农作物包括禾本科农作物。

在另一优选例中，所述的农作物选自下组：水稻、玉米、小麦、大麦、大豆、或其组合。

在另一优选例中，所述的水稻选自下组：籼稻、粳稻、或其组合。

在另一优选例中，所述的SPL7基因选自下组：cDNA序列、基因组序列、或其组合。

在另一优选例中，所述SPL7基因来自禾本科作物。

在另一优选例中，所述的SPL7基因来自水稻或小麦。

在另一优选例中，所述SPL7基因选自下组：水稻的SPL7基因(OsSPL7)、玉米的SPL7基因(ZmaSPL7)，小麦的SPL7基因(GmaSPL7)、大豆的SPL7基因(GmSPL7)、或其组合。

在另一优选例中，所述SPL7基因的氨基酸序列选自下组：

(i)具有SEQ ID NO.:2所示氨基酸序列的多肽；

(ii)将如SEQ ID NO.:2所示的氨基酸序列经过一个或几个(如1-10个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，具有所述调控农艺性状功能的、由(i)衍生的多肽；或(iii)氨基酸序列与SEQ ID NO.:2所示氨基酸序列的同源性≥90％(较佳地≥95％，更佳地≥98％)，具有所述SPL7活性的多肽。

在另一优选例中，所述SPL7基因的核苷酸序列选自下组：

(a)编码如SEQ ID NO.:2所示多肽的多核苷酸；

(b)序列如SEQ ID NO.:1所示的多核苷酸；

(c)核苷酸序列与SEQ ID NO.:1所示序列的同源性≥95％(较佳地≥98％，更佳地≥99％)的多核苷酸；

(d)在SEQ ID NO.:1所示多核苷酸的5'端和/或3'端截短或添加1-60个(较佳地1-30，更佳地1-10个)核苷酸的多核苷酸；

(e)与(a)-(d)任一所述的多核苷酸互补的多核苷酸。

在另一优选例中，当所述物质为SPL7基因或其编码蛋白或其促进剂时，所述物质还用于：

(a)抑制GH3.8的功能；

(b)抑制LAX1和/或LAX2的功能。

在另一优选例中，当抑制GH3.8的功能时，所述农作物的性状表现为：减少分蘖数，和/或提高株高。

在另一优选例中，当抑制LAX1和/或LAX2的功能时，所述农作物的性状表现为：农作物可育，和/或植物的穗呈现稀穗表型。

本发明第二方面提供了一种复合物，所述复合物为(a)SPL7蛋白与(b)具有GTAC基序的启动子区域所形成的复合物。

在另一优选例中，所述的启动子区域选自下组：GH3.8、LAX1、或LAX2基因的具有GTAC基序的启动子区域。

在另一优选例中，所述GH3.8、LAX1、或LAX2基因来自水稻。

在另一优选例中，所述SPL7蛋白选自下组：水稻的SPL7蛋白(OsSPL7)、玉米的SPL7蛋白(ZmaSPL7)，小麦的SPL7蛋白(GmaSPL7)、大豆的SPL7蛋白(GmSPL7)、或其组合。

在另一优选例中，所述SPL7蛋白包括OsSPL7蛋白。

本发明第三方面提供了一种本发明第二方面所述复合物的调控剂，用于调控植物中SPL7蛋白与具有GTAC基序的启动子区域的结合。

在另一优选例中，所述调控包括促进SPL7蛋白与具有GTAC基序的启动子区域的结合。

在另一优选例中，所述调控包括抑制SPL7蛋白与具有GTAC基序的启动子区域的结合。

在另一优选例中，所述调控剂包括促进剂、抑制剂。

在另一优选例中，所述调控剂包括SPL7蛋白与GH3.8基因的具有GTAC基序的启动子区域结合所形成复合物的调控剂。

在另一优选例中，所述调控剂包括SPL7蛋白与LAX1或LAX2基因的具有GTAC基序的启动子区域结合所形成复合物的调控剂。

本发明第四方面提供了一种本发明第二方面所述复合物或本发明第三方面所述调控剂的用途，用于调控农作物的农艺性状，所述农艺性状包括选自下组的一种或多种性状：

(i)分蘖数；

(ii)株高；

(iii)穗表型；

(iv)可育性。

在另一优选例中，所述调控剂为促进剂，并且所述促进剂促进SPL7蛋白与GH3.8基因的具有GTAC基序的启动子区域结合，所述调控农作物的农艺性状选自下组：

(i-1)减少分蘖数；

(ii-1)提高株高。

在另一优选例中，所述调控剂为抑制剂，并且所述抑制剂抑制SPL7蛋白与GH3.8基因的具有GTAC基序的启动子区域结合，所述调控农作物的农艺性状选自下组：

(i-1)增加分蘖数；

(ii-1)降低株高。

在另一优选例中，所述调控剂为促进剂，并且所述促进剂促进SPL7蛋白与LAX1或LAX2基因的具有GTAC基序的启动子区域结合，所述调控农作物的农艺性状选自下组：

(i-1)使农作物可育；

(ii-1)使穗呈现稀穗表型。

在另一优选例中，所述调控剂为抑制剂，并且所述抑制剂抑制SPL7蛋白与LAX1或LAX2基因的具有GTAC基序的启动子区域结合，所述调控农作物的农艺性状包括使穗呈现密穗表型。

本发明第五方面提供了一种确定测试物质是否是促进或抑制本发明第二方面所述复合物形成的促进剂或抑制剂的方法，包括步骤：

(i)在对照组中，在适合形成所述复合物的条件下，将SPL7蛋白或其活性片段与GH3.8或LAX1或LAX2基因的启动子区域的GTAC基序进行孵育，从而形成所述复合物，测定所述复合物的数量，记为C0；并且在测试组中，在与对照组相同的条件下，在添加了测试物质的情况下，测定测试组中所述复合物的数量，记为C1；

(ii)比较所述C0和C1，如果C1显著高于C0，则表明所述测试物质为促进所述复合物形成的促进剂；如果C1显著低于C0，则表明所述测试物质为抑制所述复合物形成的抑制剂。

在另一优选例中，所述“显著高于”指C1/C0≥2，较佳地≥3，更佳地≥4。

在另一优选例中，所述“显著高于”指C1/C0≤1/2，较佳地≤1/3，更佳地≤1/4。

本发明第六方面提供了一种改良作物农艺性状的方法，包括步骤：

降低所述作物中SPL7基因的表达量或活性，从而改良作物的农艺性状。

在另一优选例中，所述的改良作物的农艺性状包括选自下组的一种或多种性状：

(i-1)增加分蘖数；

(ii-1)降低株高；

(iii-1)使穗呈现密穗表型；

(iv-1)使农作物可育。

在另一优选例中，所述的方法还包括：提高所述作物中GH3.8或LAX1或lAX2蛋白的表达量或活性，从而改良作物的农艺性状。

在另一优选例中，所述的方法还包括：降低所述作物中所述复合物的形成数量，从而改良作物的农艺性状。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1显示了OsSPL7基因超表达转基因植株的表型。其中，A：OsSPL7的上游抑制基因竞争性下调的转基因植株，左：野生型ZH11，右：OsSPL7上游抑制基因的功能下调的转基因植株；B：OsSPL7基因超表达的转基因植株对根的影响，左：野生型ZH11，右：OsSPL7OE转基因植株；C：OsSPL7基因超表达转基因植株对分蘖的影响，左：OsSPL7OE，右：野生型ZH11。

图2显示了OsSPL7的上游抑制基因的功能上调转基因植株，SPL7FLAG转基因植株以及SPL7RNAi转基因植株的株高和分蘖数统计。

图3显示了OsSPL7基因在OsSPL7的上游抑制基因的功能下调和上调的转基因植株中的表达检测情况。

图4显示了SPL7GLAG转基因植株和SPL7RNAi转基因植株中OsGH3.8基因的表达检测情况。

图5显示了OsSPL7对OsGH3.8启动子的结合情况。其中，A：OsGH3.8启动子区OsSPL7结合位点的示意图，locus1位置含有一个OsSPL7的结合基序(浅绿色的竖线)，locus2中含有两个基序；B：酵母单杂交显示OsSPL7对OsGH3.8启动子区的基序的结合，motif位正常的含有基序的片段，mumotif是将motif中的GTAC发生突变成GAAC之后的片段；C：CHIP结果显示OsSPL7基因对OsGH3.8基因启动子区的基序的结合。

图6显示了OsSPL7基因对LAX1和LAX2基因的结合情况。其中，A：LAX1基因的启动子区19个OsSPL7蛋白的结合基序的位置示意图；B：酵母单杂交显示OsSPL7蛋白对LAX1基因启动子区第18和19位的基序的结合，2(18+19)表示将18和19号基序所在的片段以两个拷贝重复的方式连接到载体p178中，2(m18+19)表示将2(18+19)中18位的基序进行了单个碱基的突变，2m(18+19)表示将2(18+19)中18和19位的基序分别进行了单碱基的突变，2mm(18+19)表示将18和19位的基序分别进行了多个碱基的突变；C：CHIP结果显示OsSPL7蛋白对LAX1基因启动子区相关基序的结合；D：CHIP结果显示OsSPL7蛋白对LAX2基因启动子区相关基序的结合；E：幼穗发育时期OsSPL7基因的原位杂交；F：颖花发育时期OsSPL7基因的原位杂交；G：原位杂交的正义探针没有显示出杂交信号。

具体实施方式

经过广泛而深入的研究，本发明人通过对大量的禾本科植物农艺性状位点的研究，首次揭示了一种SPL7基因或其编码蛋白、或其促进剂或抑制剂，用于调控农作物的农艺性状，所述农艺性状选自下组的一种或多种：(i)根的性状；(ii)分蘖数；(iii)株高；(iv)穗表型；(v)可育性。

并且，本发明人还首次发现一种复合物，所述复合物为SPL7蛋白与具有GTAC基序的启动子区域所形成的复合物，促进或抑制该复合物的形成可达到调控农作物的农艺性状的效果。在此基础上，本发明人完成了本发明。

术语

如本文所用，术语“上游调控基因”、“上游功能基因”、“上游基因”、“上游抑制剂基因”可互换使用，均指位于本发明所述SPL7基因(如OsSPL7)的调控途径(pathway)的上游的基因。例如，某一基因A或某一microRNA可调控另一基因B时，则可将所述基因A(或该microRNA)视为位于所述基因B上游的调控基因。

如本文所用，术语“包括”可以是开放式或封闭式的，因此，该术语也包括“由…构成”，“基本由…构成”。

SPL7基因

如本文所用，术语“SPL7基因”、“本发明基因”可以互换使用，都是指来源于农作物(如水稻、小麦)的SPL7基因及其变体。本发明的SPL7基因典型的核苷酸序列如SEQ ID NO.:1所示。

SPL基因的全称是SQUAMOSA PROMOTER BINDING PROTEIN-LIKE(SPL)基因，是植物中比较大的一个家族，SPL7基因是其中的一个成员，编码转录因子。

本发明还包括与本发明的优选基因序列(SEQ ID NO.:1)具有50％或以上(优选60％以上，70％以上，80％以上，更优选90％以上，更优选95％以上，最优选98％以上，如99％)同源性的核酸，所述核酸也能有效地调控农作物(如水稻)的农艺性状。“同源性”是指按照位置相同的百分比，两条或多条核酸之间的相似水平(即序列相似性或同一性)。在本文中，所述基因的变体可以通过插入或删除调控区域，进行随机或定点突变等来获得。

在本发明中，SEQ ID NO.:l中的核苷酸序列可以经过取代、缺失或添加一个或多个，生成SEQ ID NO.:1的衍生序列，由于密码子的简并性，即使与SEQ ID NO.:l的同源性较低，也能基本编码出如SEQ ID NO.:2所示的氨基酸序列。另外，“在SEQ ID NO.:l中的核苷酸序列经过取代、缺失或添加至少一个核苷酸衍生序列”的含义还包括能在中度严谨条件下，更佳的在高度严谨条件下与SEQ ID NO.:l所示的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。这些变异形式包括(但并小限于)：若干个(通常为1-90个，较佳地1-60个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5'和/或3'端添加数个(通常为60个以内，较佳地为30个以内，更佳地为10个以内，最佳地为5个以内)核苷酸。

应理解，虽然本发明的SPL7基因优选来自水稻，但是来自其它植物的与水稻SPL7基因高度同源(如具有80％以上，如85％,90％,95％甚至98％序列相同性)的其它基因也在本发明考虑的范围之内。比对序列相同性的方法和工具也是本领域周知的，例如BLAST。

本发明的SPL7核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的DNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。

此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。

术语“编码多肽的多核苷酸”可以是包括编码此多肽的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。

本发明还涉及上述多核苷酸的变异体，其编码与本发明有相同的氨基酸序列的多肽或多肽的片段、类似物和衍生物。此多核苷酸的变异体可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码的多肽的功能。

本发明还涉及与上述的序列杂交且两个序列之间具有至少50％，较佳地至少70％，更佳地至少80％相同性的多核苷酸。本发明特别涉及在严格条件下与本发明所述多核苷酸可杂交的多核苷酸。在本发明中，“严格条件”是指:(1)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0.2×SSC,0.1％SDS,60℃；或(2)杂交时加有变性剂,如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％Ficoll，42℃等；或(3)仅在两条序列之间的相同性至少在90％以上,更好是95％以上时才发生杂交。并且,可杂交的多核苷酸编码的多肽与SEQ ID NO.:2所示的成熟多肽有相同的生物学功能和活性。

本发明还涉及与上述的序列杂交的核酸片段。如本文所用，“核酸片段”的长度至少含15个核苷酸，较好是至少30个核苷酸，更好是至少50个核苷酸，最好是至少100个核苷酸以上。核酸片段可用于核酸的扩增技术(如PCR)以确定和/或分离编码调控农艺性状相关多肽的多聚核苷酸。

本发明的复合物

在本发明中，提供了一种蛋白复合物，该复合物是SPL7蛋白(或其活性片段)结合于GH3.8、LAX1、或LAX2基因的启动子区域的GTAC基序而形成的

利用本发明的复合物，不仅可以在植物体内中调控农作物(如水稻、小麦)的农艺性状，还可以在体外高效地筛选(a)促进所述复合物形成的促进剂；和(b)抑制所述复合物形成的抑制剂。

典型地，一种典型地确定测试物质是否是促进或抑制本发明复合物的促进剂或抑制剂的方法包括步骤：

(i)在对照组，在适合形成所述复合物的条件下，SPL7蛋白或其活性片段与GH3.8或LAX1或LAX2基因的启动子区域的GTAC基序进行孵育，从而形成本发明的复合物，测定所述复合物的数量，记为C0；并且在测试组中，在与对照组相同的条件下，在添加了测试物质的情况下，测定测试组中所述复合物的数量，记为C1；

(ii)比较所述C0和C1，如果C1显著高于C0，则表明所述测试物质为促进所述复合物形成的促进剂；如果如果C1显著低于C0，则表明所述测试物质为抑制所述复合物形成的抑制剂。

在另一优选例中，所述“显著高于”指C1/C0≥2，较佳地≥3，更佳地≥4。

在另一优选例中，所述“显著高于”指C1/C0≤1/2，较佳地≤1/3，更佳地≤1/4。

优选地，所述的测试物质包括(但并不限于)：小分子化合物、激素、蛋白、糖类、核酸等。

SPL7基因编码的多肽

如本文所用，术语“本发明多肽”、“SPL7基因的编码蛋白”可以互换使用，都是指来源于水稻的SPL7的多肽及其变体。本发明多肽的一种典型的氨基酸序列如SEQ ID NO.:2所示。

在本发明中，SPL7蛋白为本发明复合物的核心元件之一。

本发明涉及一种调控农艺性状的SPL7多肽及其变体，在本发明的一个优选例中，所述多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.:2所示。本发明的多肽能够有效调控农作物(如水稻)的农艺性状。

本发明还包括与本发明的SEQ ID NO.:2所示序列具有50％或以上(优选60％以上，70％以上，80％以上，更优选90％以上，更优选95％以上，最优选98％以上，如99％)同源性的具有相同或相似功能的多肽或蛋白。

所述“相同或相似功能”主要是指：“调控农作物(如水稻)的农艺性状”。

本发明的多肽可以是重组多肽、天然多肽、合成多肽。本发明的多肽可以是天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞)中产生。根据重组生产方案所用的宿主，本发明的多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。本发明的多肽还可包括或不包括起始的甲硫氨酸残基。

本发明还包括具有SPL7蛋白活性的SPL7蛋白片段和类似物。如本文所用，术语“片段”和“类似物”是指基本上保持本发明的天然SPL7蛋白相同的生物学功能或活性的多肽。

本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是：(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的；或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽；或(iii)成熟多肽与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽；或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列或蛋白原序列，或融合蛋白)。根据本文的定义这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。

本发明中，所述的多肽变体是如SEQ ID NO.:2所示的氨基酸序列，经过若干个(通常为1-60个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)取代、缺失或添加至少一个氨基酸所得的衍生序列，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在所述蛋白中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能，在C末端和/或\末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。这些保守性变异最好根据表1进行替换而产生。

表1

在优选例中，本发明多肽指可调控农作物(如水稻、小麦)农艺性状的SEQ ID NO.:2序列的多肽。还包括具有与SPL7多肽相同功能的、SEQ ID NO.:2序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：一个或多个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括SPL多肽的活性片段和活性衍生物。

该多肽的变异形式包括：同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严紧度条件下能与SPL多肽的DNA杂交的DNA所编码的蛋白、以及利用抗SPL多肽的抗血清获得的多肽或蛋白。本发明还提供了其他多肽，如包含SPL多肽或其片段的融合蛋白。除了几乎全长的多肽外，本发明还包括了SPL多肽的可溶性片段。通常，该片段具有SPL多肽序列的至少约10个连续氨基酸，通常至少约30个连续氨基酸，较佳地至少约50个连续氨基酸，更佳地至少约80个连续氨基酸，最佳地至少约100个连续氨基酸。

本发明还包括所要求保护的蛋白的类似物。这些类似物与天然SEQ ID NO.:2差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些蛋白的类似物包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可通过定点诱变法或其他已知分了生物学的技术。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的类似物。应理解，本发明的蛋白并不限于上述例举的代表性的蛋白。

修饰(通常不改变一级结构)形式包括：体内或体外蛋白的化学衍生形式如乙酸化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在蛋白质合成和加工中进行糖基化修饰。这种修饰可以通过将蛋白暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。

GH3.8基因及其启动子

如本文所用，术语“GH3.8基因”指生长素快速响应基因之一，通过将IAA转变成IAA-氨基酸而调节植物体内自由生长素的含量，是GH3家族基因中的一个成员。

在本发明的复合物中，一种核心元件可以是GH3.8基因的启动子区域的GTAC基序。

在本发明中，GH3.8基因可来自水稻，并且GH3.8基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.:3所示；GH3.8蛋白的序列如SEQ ID NO.:6所示。

在本发明中，本发明的SPL7蛋白与GH3.8基因的启动子区域的GTAC基序相结合，从而抑制GH3.8基因的表达，从而调控农作物(如水稻)的农艺性状。

LAX1、LAX2基因及其启动子

如本文所用，术语“LAX1基因”指调控水稻穗部侧生分生组织发育的基因，突变后因侧生分生组织发育异常而呈现稀穗的表型。

如本文所用，术语“LAX2基因”指调控水稻穗部侧生分生组织发育的基因，突变后同样造成稀穗的表型。LAX1和LAX2基因在蛋白水平具有相互作用。

在本发明的复合物中，一种核心元件可以是LAX1或LAX2基因的启动子区域的GTAC基序。

在本发明中，LAX1基因可来自水稻，并且LAX1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.:4所示；LAX1蛋白的序列如SEQ ID NO.:7所示。

在本发明中，LAX2基因可来自水稻，并且LAX2基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.:5所示；LAX2蛋白的序列如SEQ ID NO.:8所示。

在本发明中，本发明的SPL7蛋白与LAX1或LAX2基因的启动子区域的GTAC基序相结合，从而抑制LAX1或LAX2基因的表达，从而调控农作物(如水稻)的农艺性状。

本发明的主要优点包括：

(1)本发明首次发现与作物(如水稻)农艺性状(如根部和分蘖发育)相关的SPL7基因。

(2)本发明提供了SPL7基因在作物(如水稻)品质改良中的应用。

(3)本发明首次发现SPL7蛋白可与启动子区域的GTAC基序结合形成复合物，调控作物(如水稻)的农艺性状。

(4)利用本发明首次发现的复合物，可在体外筛选调控作物(如水稻)的农艺性状的促进剂或抑制剂。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor LaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

所用材料如无特别说明，均为市售产品。

实施例中的所有载体均购自pcambia公司。

材料

实施例中的所用引物如表2所示。

表2实验中用到的引物的信息

通用方法

1、OsSPL7基因超表达质粒的构建：OsSPL7的全长cDNA通过PCR引物进行扩增，随后通过BamHI和KpnI的酶切连接到超表达载体p130135SNOS中。引物信息见表2。

2、OsSPL7RNAi载体的构建：通过PCR扩增得到OsSPL7基因的一段466bp的cDNA，通过BamHI和KpnI的酶切正向连接到p1301RNAi载体中，然后通过SacI和SpeI酶切反向连接到同一载体中。引物信息见表2。

3、酵母单杂交实验：GH3.8以及LAX1和LAX2基因启动子区含有SPL蛋白的结合基序的DNA片段，以及含有突变的结合基序的DNA片段，分别以XhoI为酶切位点，克隆到载体p178中。同时，OsSPL7基因克隆到载体pPC86中。酵母单杂的程序按照Clontech MatchmakerOne-hybrid System的说明书进行。引物信息见表2。

4、RT-PCR和定量RT-PCR的分析

来自叶片和幼穗的总RNA通过TRIzol(Invitrogen)进行提取，反转录按照说明书进行ReverAce(TOYOBO)。cDNA从经过DnaseI(Toyobo)酶处理的2μg RNA反转录得到，用作RT-PCR的模板。水稻Actin基因被用作内参基因。

原位杂交：

不同发育阶段的幼穗被固定在4％paraformaldehyde PBS缓冲液中(0.1％Triton-X-100,0.1％Tween-20,4％formaldehyde,25％glutaraldehyde)，4放置4℃过夜。然后通过里写酒精梯度脱水、二甲苯透明、渗蜡(Sigma-Aldrich)，最后60℃包埋成蜡块。蜡块纵切成7μm厚的条带铺展在RNase-free glass的载玻片上。OsSPL7基因特异性的探针克隆到pBSK(-)载体上,线性化后用作地高辛标记的正义和反义RNA探针的模板。原位杂交按照文献进行。

5、CHIP实验

CHIP实验根据EpiQuik^TMPlant ChIP Kit进行展开。主要如下：水稻叶片在1％甲醛中交联20分钟，然后用0.125M甘氨酸溶液淬灭5分钟，用双蒸水洗两次。剩余的产物用超声波打断(4×10sec burst/5min rest,280v)，产生出片段化的DNA，然后14000rpm离心10分钟。用FLAG抗体对片段化的DNA进行免疫沉淀，老鼠的IgG作为负对照，anti-dimethyl H3-K9作为正对照。最后，免疫的样品和全细胞老远的样品(input)在65℃温育以便释放交联的DNA，通过酒精沉淀获得DNAA。ChIP DNA和input作为模板进行定量PCR反应，扩增启动子区的片段。

OsGH3.8promoter

5′-AGCTAGCTAACCTCCCCCAA-3′(SEQ ID NO.:25)

5′-ATGGATAGATGCAGCGCACA-3′(SEQ ID NO.:26)

实施例1OsSPL7基因的克隆

OsSPL7基因的序列号为LOC_Os04g46580(http://rice.plantbiology.msu.edu/)。在本发明中，OsSPL7基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.:1所示。在本发明中，克隆了OsSPL7基因并分别构建到超表达质粒p1301-35SNos中，带有tag的载体p1305-3*FLAGNOS中，以及RNAi载体DS1301中。

实施例2OsSPL7基因超表达和RNAi的表型

发明人克隆了水稻OsSPL7基因，并且将该基因的编码区构建到超表达质粒p1301-35SNos中，形成OsSPL7OE质粒，并将该质粒遗传转化到野生型水稻ZH11中。转基因植株呈现出明显的表型，主要体现在：①转基因植株的根变粗，并且几乎没有侧根(图1B)；②转基因植株几乎没有分蘖(图1C)；③转基因植株不育(图1C)。

随后构建了OsSPL7基因的RNAi质粒，并将其遗传转化到野生型水稻ZH11中。转基因植株呈现出明显的株高变矮化和分蘖数变多的表型(图2)。

综合OsSPL7基因超表达和RNAi的转基因植株的表型，结果表明，OsSPL7基因是影响水稻株高和分蘖数的重要基因。

实施例3OsSPL7基因受到一个上游功能基因的调控

该上游调控基因的功能下调的转基因植株，呈现出与OsSPL7OE非常相似的表型，体现在根变粗并且分蘖减少(图1A)；而该上游调控基因的超表达的转基因植株，呈现出跟OsSPL7RNAi非常相似的表型，株高变矮，分蘖数增多(图2)。同时，在上游调控基因的功能下调的转基因植株中，OsSPL7的表达被明显上调，而在该上游调控基因的功能上调的转基因植株中，OsSPL7的表达被明显下调(图3)。因此，从功能角度证明了OsSPL7基因是受到了该上游基因的负向调控，具有调控水稻株高和分蘖数的功能。

实施例4OsPL7基因在不同启动子驱动下的转基因植株的表型变化

鉴于OsSPL7基因在35S启动子驱动下的转基因植株不育，进一步构建了以OsSPL7自身启动子驱动的OsSPL7基因融合Flag的转基因植株(SPL7-FLAG)，该转基因植株中OsSPL7基因也被上调表达，但是上调的程度可能没有35S驱动的转基因植株强大，因此SPL7-FLAG转基因植株的株型没有受到太多影响(图2)，而且可育性良好。

实施例5OsPL7基因对OsGH3.8基因的调控

有文章报道，OsGH3.8超表达造成株高变矮、分蘖数增多的表型(Ding et al.,2008,Fu et al.,2011)，说明OsGH3.8也具有调控水稻株型的作用。据此，我们探讨了OsSPL7和OsGH3.8之间是否存在调控关系。首先，分析了OsSPL7上调和下调的转基因植株中OsGH3.8的表达变化，发现在SPL7FLAG转基因植株中，OsGH3.8基因被下调表达，而在OsSPL7RNAi的转基因植株中，OsGH3.8基因被明显上调(图4)。说明OsSPL7可能对OsGH3.8基因具有调控作用。

之后，分析了OsGH3.8基因的启动子，发现OsGH3.8基因的启动子区含有3个OsSPL7蛋白的结合基序(motif)GTAC(图5A)，通过酵母单杂交的方法，证明OsSPL7蛋白对这些基序具有结合作用(图5B)；同时，以SPL7-FLAG材料进行了CHIP验证，也证明OsSPL7对这些位点的结合作用(图5C)。因此，OsSPL7基因能够结合到OsGH3.8基因的启动子区对其进行直接调控，抑制OsGH3.8基因的表达，从而造成株高变高、分蘖数减少的表型。

实施例6以及对LAX1基因和LAX2基因的调控

发明人还检测了OsSPL7结合到LAX1基因(序列号：LOC_Os01g61480,http://rice.plantbiology.msu.edu/)启动子的可能性。首先分析了LAX1的启动子，在4Kb的启动子序列中，发现其中有19个“GTAC”基序(图6A)。用酵母单杂交的方法发现OsSPL7蛋白能够结合到LAX1基因的启动子区的18和19个基序(图6B)；以SPL7FLAG为材料进行的CHIP实验验证了OsSPL7对LAX1启动子的结合(图6C)。同时，CHIP结果也验证出OsSPL7蛋白对LAX2(序列号：LOC_Os04g32510，http://rice.plantbiology.msu.edu/)基因启动子的结合(图6D)，鉴于LAX1基因和LAX2基因都是水稻穗发育的重要调控基因，而且OsSPL7基因在水稻幼穗中具有明显表达(图6E、6F)，OsSPL7基因通过对LAX1和LAX2基因进行调控，对水稻穗的发育发挥调节功能。

综上，从图6A－6G可知，OsSPL7基因能够结合到LAX1或LAX2基因的启动子区对其进行直接调控，抑制LAX1或LAX2基因的表达，从而造成稀穗的表型。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (8)

1.一种物质的用途，所述物质为SPL7基因或其编码蛋白、或其促进剂或抑制剂，其特征在于，用于调控农作物的农艺性状，所述农艺性状包括选自下组的一种或多种性状：

(i) 株高；

(ii) 可育性；

所述SPL7基因为水稻的SPL7基因(OsSPL7)，所述的农作物为水稻，所述SPL7的氨基酸序列为如SEQ ID NO.:2所示的氨基酸序列；

其中所述物质为SPL7的抑制剂，所述调控农作物的农艺性状为如下性状：降低株高；

所述的物质为SPL7基因或其编码蛋白、或其促进剂，所述调控农作物的农艺性状为如下性状：使农作物育性降低或不育。

2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的抑制剂为反义核酸。

3.如权利要求2所述的用途，其特征在于，所述反义核酸包括siRNA、microRNA。

4.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的促进剂为核酸分子。

5.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述SPL7基因的核苷酸序列选自下组：

(a) 编码如SEQ ID NO.:2所示多肽的多核苷酸；

(b) 序列如SEQ ID NO.:1所示的多核苷酸。

6.如权利要求1所述的用途，其特征在于，当所述物质为SPL7基因或其编码蛋白或其促进剂时，所述物质具有如下功能：

(a) 抑制GH3.8的功能；或

(b) 抑制LAX1和/或LAX2的功能。

7.一种改良作物农艺性状的方法，其特征在于，包括步骤：

降低所述作物中SPL7基因的表达量或活性，从而改良作物的农艺性状，所述的改良作物的农艺性状为如下性状：降低株高，所述SPL7基因为编码如SEQ ID NO.:2所示多肽的多核苷酸，所述作物为水稻。

8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，降低所述作物中SPL7基因的表达量或活性是通过提高所述作物中GH3.8或LAX1或lAX2蛋白的表达量或活性，从而改良作物的农艺性状。

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