CN114107365A - 研究载体农药韧皮部传导性的蓖麻瞬时表达体系构建方法 - Google Patents

研究载体农药韧皮部传导性的蓖麻瞬时表达体系构建方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及瞬时表达体系构建技术领域，公开了研究载体农药韧皮部传导性的蓖麻瞬时表达体系构建方法，包括蓖麻幼苗的培育、制备用于转化蓖麻幼苗的农杆菌侵染液和农杆菌侵染液转化蓖麻幼苗。本发明可简单高效且快速准确地在蓖麻幼苗中实现外源基因的瞬时表达，可用于研究植物转运蛋白对载体农药韧皮部传导效率的影响；结果显示瞬时表达RcLHT7后载体农药在蓖麻韧皮部的传导效率提升了近2.3倍。

Description

研究载体农药韧皮部传导性的蓖麻瞬时表达体系构建方法
技术领域
本发明涉及植物基因工程技术领域，具体涉及研究载体农药韧皮部传导性的蓖麻瞬时表达体系构建方法。
背景技术
将植物内源性营养物质(例如糖或氨基酸等)作为载体基团，耦合至不具备韧皮部传导能力的先导化合物上而得到的衍生物称为载体农药。由于载体基团可被植物细胞质膜上相应的转运载体识别和吸收，并跨膜转运至植物筛管，因此能够使不具备韧皮部传导性的先导化合物实现韧皮部传导，可提升药剂的内吸性，增强农药对有害生物的防控效果，同时降低用药量并减轻环境污染。目前，基于“利用植物载体实现外源化合物韧皮部传导”的设计思路，已经成功合成了多种载体农药，例如糖基-氟虫腈耦合物、糖基-鱼藤酮耦合物、氨基酸-氯虫苯甲酰胺耦合物和氨基酸-申嗪霉素耦合物。但是，以糖和氨基酸跨膜转运载体为例，植物基因组可编码多个转运载体，在载体农药特异识别和提高韧皮部传导效率中到底是哪些植物载体发挥关键作用尚不明确。因此，植物转运蛋白对载体农药的转运功能以及转运蛋白与载体农药间的相互对应关系受到越来越多的关注。
目前，有多个基因表达系统被成功应用于植物载体功能研究，例如爪蟾卵母细胞曾被用于研究单糖转运蛋白RcSTP1对葡萄糖-氟虫腈耦合物(GTF)的结合能力，此外，在拟南芥中也测试了过表达氨基酸渗透酶AtAAP1后，根部对丙氨酸-氯虫苯甲酰胺的吸收能力。然而，与这些系统相比，蓖麻是当前被广泛用于定性定量测试农药韧皮部传导性的模式系统，但是到目前为止，在蓖麻中尚缺乏高效的研究系统，可通过在蓖麻幼苗中瞬时表达植物转运蛋白的编码基因，直接研究植物转运蛋白对载体农药的韧皮部转运功能以及转运蛋白与载体农药间的对应关系。
发明内容
基于以上问题，本发明提供研究载体农药韧皮部传导性的蓖麻瞬时表达体系构建方法，本发明可简单高效且快速准确地在蓖麻幼苗中实现外源基因的瞬时表达，可用于研究植物转运蛋白对载体农药韧皮部传导效率的影响。
为解决以上技术问题，本发明提供了研究载体农药韧皮部传导性的蓖麻瞬时表达体系构建方法，包括如下步骤：
S1：蓖麻幼苗的培育
将蓖麻种子置于500mL烧杯中，加入适量清水没过种子，于27℃±1℃条件下浸泡24h，之后将蓖麻种子播种至蛭石上培育6d，培育温度为27℃±1℃，湿度为80％±5％，之后挑选长势一致的蓖麻幼苗，蓖麻幼苗的胚轴为3.5cm，轻轻剥去胚乳备用；
S2：制备用于转化蓖麻幼苗的农杆菌侵染液
采用冻融法将含有外源目的基因的植物表达载体pART27-eGFP转化至农杆菌GV3101中，将转化成功的农杆菌GV3101接种至LB培养基中，于28℃、 220rpm条件下震荡培养至OD600＝1.2，LB培养基含终浓度50μg/mL壮观霉素、 20μg/mL利福平和40μg/mL庆大霉素；然后将培养获得的菌液于5000rpm条件下离心5min，收集菌体，再使用MES缓冲液将菌体重悬至OD600＝1.2，室温静置2h，MES缓冲液含10mM MES、10mM MgCl2和200μM乙酰丁香酮，pH＝5.5；
S3：农杆菌侵染液转化蓖麻幼苗
将经步骤S1处理之后的蓖麻幼苗置于250mL烧杯中，蓖麻幼苗的根部朝上、子叶朝下，向250mL烧杯中倒入经步骤S2处理之后的农杆菌重悬液，再将250mL 烧杯置于真空抽滤仪中于0.09MPa条件下抽滤20min+20min，即先真空抽滤 20min，然后释放真空再抽滤20min，倒掉农杆菌重悬液后再将蓖麻幼苗重新置于250mL烧杯中，蓖麻幼苗的根部朝下、子叶朝上，向250mL烧杯中加入霍格兰氏营养液，将250mL烧杯转移至植物冷光源培养箱中于18℃条件下培养72h，每隔24h更换一次霍格兰氏营养液，即获得蓖麻瞬时表达体系。
进一步的，步骤S2中的外源目的基因为蓖麻氨基酸转运蛋白RcLHT7的 CDS序列。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明可简单高效且快速准确地在蓖麻幼苗中实现外源基因的瞬时表达，可用于研究植物转运蛋白对载体农药韧皮部传导效率的影响；结果显示瞬时表达RcLHT7后载体农药在蓖麻韧皮部的传导效率提升了近2.3倍。
附图说明
图1为本发明的蓖麻瞬时表达体系的构建过程图；
图2为本发明的实施例利用1％琼脂糖凝胶电泳检测目的基因PCR检测结果图；
图3为本发明的实施例采用HPLC法测定氨基酸转运蛋白编码基因RcLHT7 瞬时表达72h后对载体农药韧皮部传导的影响。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下面结合实施例和附图，对本发明作进一步的详细说明，本发明的示意性实施方式及其说明仅用于解释本发明，并不作为对本发明的限定。
实施例：
见附图1，本实施例提供了研究载体农药韧皮部传导性的蓖麻瞬时表达体系构建方法，其中A：蓖麻种子浸泡，B-C：蓖麻种子播种，D-E：蓖麻种子培养， F：蓖麻幼苗挑选，G：真空抽滤，H：瞬时过表达蓖麻幼苗低温培养，I：绿色荧光蛋白在整株蓖麻幼苗中的表达情况，J-K：在荧光场、明场和叠加场中绿色荧光蛋白在蓖麻叶片中的表达情况；具体包括如下步骤：
S1：蓖麻幼苗的培育
将蓖麻种子置于500mL烧杯中，加入适量清水没过种子，于27℃±1℃条件下浸泡24h，之后将蓖麻种子播种至蛭石上培育6d，培育温度为27℃±1℃，湿度为80％±5％，之后挑选长势一致的蓖麻幼苗，蓖麻幼苗的胚轴为3.5cm，轻轻剥去胚乳备用，本实施例使用的蓖麻种子为淄9号，山东省淄博市农科院；
S2：制备用于转化蓖麻幼苗的农杆菌侵染液
采用冻融法将含有外源目的基因的植物表达载体pART27-eGFP转化至农杆菌GV3101中，将转化成功的农杆菌GV3101接种至LB培养基中，于28℃、 220rpm条件下震荡培养至OD600＝1.2，LB培养基含终浓度50μg/mL壮观霉素、 20μg/mL利福平和40μg/mL庆大霉素；然后将培养获得的菌液于5000rpm条件下离心5min，收集菌体，再使用MES缓冲液将菌体重悬至OD600＝1.2，室温静置2h，MES缓冲液含10mM MES、10mM MgCl2和200μM乙酰丁香酮，pH＝5.5；
S3：农杆菌侵染液转化蓖麻幼苗
将经步骤S1处理之后的蓖麻幼苗置于250mL烧杯中，蓖麻幼苗的根部朝上、子叶朝下，向250mL烧杯中倒入经步骤S2处理之后的农杆菌重悬液，再将250mL 烧杯置于真空抽滤仪(JX820D-1,SMAF,China)中于0.09MPa条件下抽滤 20min+20min(抽滤20min+20min的意思为：在第一次抽滤20min后将打开真空抽滤仪放气阀让气压降为0，然后关闭放气阀让气压上升至0.09MPa后再抽滤 20min)，倒掉农杆菌重悬液后再将蓖麻幼苗重新置于250mL烧杯中，蓖麻幼苗的根部朝下、子叶朝上，向250mL烧杯中加入霍格兰氏营养液，将250mL烧杯转移至植物冷光源培养箱中于18℃条件下培养72h，每隔24h更换一次霍格兰氏营养液，即获得蓖麻瞬时表达体系；获得蓖麻瞬时表达体系后使用紫外强光灯 (B-100AP，UVP，USA)观看整株蓖麻绿色荧光信号，并使用激光共聚焦显微镜(TCS-SP8，Leica，Germany)观看蓖麻叶片中的绿色荧光信号。
本实施例的外源目的基因为蓖麻氨基酸转运蛋白RcLHT7的CDS序列， RcLHT7的CDS序列如下：
ATGGAGGAAAGGCCAGAAACGGAGCTAATATCCATTCCAGCCACGCCACG TGTGTCGACGCCAGAGATTCTAACTCCGTCAGGTCAGCGATCACCTAGACC CCCTTCTAAGGAAGCGAAATCATCGACGGGGTGGACACCAACGTCGTTTAT TTCCCCTCGGTTCTTGAGTCCCATAGGAACGCCGATGAAGAGGGTATTGATT AACATGAAAGGGTATTTAGAGGAAATGGGTCATCTCACTAAGCTCAACCCA CAAGATGCTTGGCTTCCTATCACTGAGTCTCGTAATGGAAATGCTCATTACG CTGCCTTTCATAATCTTAATGCTGGTGTTGGCTTTCAAGCCCTTGTTTTGCCT GTTGCTTTTGCTTTCCTTGGCTGGAGTTGGGGAATACTGTCTTTGACCATAG CCTACTGCTGGCAACTCTATACTTTATGGATTCTTGTTCAGCTACATGAAGC AGTTCCTGGGAAGAGGTATAACAGATATGTGGAGCTTGCACAAGCTGCATTCGGGGAACGATTAGGTGTTTGGCTTGCTCTATTTCCAACCGTTTATTTGTCA GCTGGAACTGCAACAGCCTTGATACTTATAGGAGGAGAGACCATGAAACTC TTCTTCCAGATAGTTTGTGGGCCTCTCTGTTCATCTAATCCCCTAACAACAG TTGAGTGGTACCTGGTGTTCACTTCTCTGTGTATTGTTTTGTCTCAGCTCCC AAACCTTAATTCAATTGCAGGGCTTTCCCTTATCGGTGCCATAACAGCTATA ACTTATTCCACTATGGTATGGGTTCTCTCTGTTAGTCAAGAAAGGCCACCTT CAATCTCCTATGAACCCCTTTCACTGCCATCCTTTACTGCTTCTGTCTTTTCA GCACTGAATGCTCTTGGTATTGTAGCCTTTGCTTTCAGAGGGCATAATCTAG TCCTGGAGATTCAGGCAACAATGCCGTCAACCTTTAAGCACCCAGCTCATG TACCCATGTGGAAAGGAGCCAAAGTTGCTTATTTCTTTATTGCTATGTGCTT GTTCCCTGTTGCCATTGGAGGCTTCTGGGCTTACGGAAATCTAATGCCTACA GGAGGAATCCTCAATGCTTTATATGGTTTCCACAGCCACGATATTCCTCGAG GACTTCTTGCAATGACTTTCCTTCTAGTCGTGTTCAATTGCTTAAGCAGTTT TCAAATATATTCAATGCCTGTATTTGACAGTTTTGAAGCTGGCTATACAAGC CGTACCAACCGCCCGTGCTCAATCTGGGTTCGCTCAGGATTTCGAGTATTCT ATGGATTCATCTCTTTCTTCATAGGGGTTGCACTTCCTTTCTTGTCCAGTCTT GCTGGTCTACTGGGTGGACTTACCCTTCCAGTCACATTTGCTTACCCTTGCT TCATGTGGGTTCTCATTAAAAGACCTTCCAAGTACAGCTTCAATTGGTATTT CAACTGGATTCTGGGCTGGTTAGGCATTGCATTTAGCCTAGCCTTTTCCATT GGAGGCGTGTGGAGTATGGTAAACAGTGGACTTAGGTTAAAATTCTTCAAACCGCCCAATTAA。
本实施例从NCBI数据库下载蓖麻氨基酸转运蛋白RcLHT7的CDS序列，利用PrimerPremier5设计基因全长扩增引物，含In-Fusion克隆所用的酶切位点 XhoI和同源臂，引物序列具体如下：
F：TTTGGAGAGGACACGCTCGAGATGGAGGAAAGGCCAGAAAC
R：GCCCTTGCTCACCATCTCGAGATTGGGCGGTTTGAAGAATT；
之后通过PCR扩增目的条带，利用1％琼脂糖凝胶电泳纯化回收PCR产物，再采用In-Fusion克隆技术将目的片段连接至线性化植物表达载体pART27-eGFP 中。具体见附图2，其中A：PCR扩增氨基酸转运蛋白RcLHT7的CDS序列，B：单菌落PCR鉴定重组质粒pART27-RcLHT7-eGFP转化大肠杆菌DH5α后的阳性克隆，C：单菌落PCR鉴定重组质粒pART27-RcLHT7-eGFP转化农杆菌GV3101 后的阳性克隆。
本实施例在利用RcLHT7获得蓖麻瞬时表达体系后使用子叶培养缓冲液 (20mMMES，0.25mM MgCl2和0.5mM CaCl2，pH＝5.5)孵育蓖麻幼苗子叶，利用根部培养液(0.5mMCaCl2)孵育蓖麻幼苗根部，孵育时间2h；在蓖麻幼苗胚轴弯钩处使用刀片切断下胚轴，向子叶培养缓冲液中补充L型缬氨酸-申嗪霉素耦合物(L-Val-PCA)(终浓度100μM)，每隔1h收集蓖麻幼苗上胚轴韧皮部渗出液(弃第1小时渗出液)，共收集6h，使用双蒸水将所收集的韧皮部渗出液稀释10倍，并使用0.22μm过滤器进行纯化，利用HPLC分析韧皮部渗出液，测试L-Val-PCA的韧皮部传导量。供试化合物L-Val-PCA进行HPLC法检测其在过表达蓖麻幼苗中的韧皮部传导效率之前所建立的标准曲线为y＝ 0.11747x+2.33291，R2＝0.99754141。
附图3中由上至下的3张谱图分别展示了蓖麻氨基酸转运蛋白的编码基因 RcLHT7瞬时表达后利用HPLC测定的L-Val-PCA标准品、对照样品和处理样品的韧皮部渗出液浓度，出峰时间在7.7s左右。结果显示RcLHT7瞬时表达后韧皮部渗出液浓为36.82μM，而对照是16.04μM，L-Val-PCA的韧皮部传导效率提升了近2.3倍。
如上即为本发明的实施例。上述实施例以及实施例中的具体参数仅是为了清楚表述发明验证过程，并非用以限制本发明的专利保护范围，本发明的专利保护范围仍然以其权利要求书为准，凡是运用本发明的说明书及附图内容所作的等同结构变化，同理均应包含在本发明的保护范围内。

Claims (2)

1.研究载体农药韧皮部传导性的蓖麻瞬时表达体系构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1：蓖麻幼苗的培育
将蓖麻种子置于500mL烧杯中，加入适量清水没过种子，于27℃±1℃条件下浸泡24h，之后将蓖麻种子播种至蛭石上培育6d，培育温度为27℃±1℃，湿度为80％±5％，之后挑选长势一致的蓖麻幼苗，蓖麻幼苗的胚轴为3.5cm，轻轻剥去胚乳备用；
S2：制备用于转化蓖麻幼苗的农杆菌侵染液
采用冻融法将含有外源目的基因的植物表达载体pART27-eGFP转化至农杆菌GV3101中，将转化成功的农杆菌GV3101接种至LB培养基中，于28℃、220rpm条件下震荡培养至OD600＝1.2，LB培养基含终浓度50μg/mL壮观霉素、20μg/mL利福平和40μg/mL庆大霉素；然后将培养获得的菌液于5000rpm条件下离心5min，收集菌体，再使用MES缓冲液将菌体重悬至OD600＝1.2，室温静置2h，MES缓冲液含10mM MES、10mM MgCl2和200μM乙酰丁香酮，pH＝5.5；
S3：农杆菌侵染液转化蓖麻幼苗
将经步骤S1处理之后的蓖麻幼苗置于250mL烧杯中，蓖麻幼苗的根部朝上、子叶朝下，向250mL烧杯中倒入经步骤S2处理之后的农杆菌重悬液，再将250mL烧杯置于真空抽滤仪中于0.09MPa条件下抽滤20min+20min，即先真空抽滤20min，然后释放真空再抽滤20min，倒掉农杆菌重悬液后再将蓖麻幼苗重新置于250mL烧杯中，蓖麻幼苗的根部朝下、子叶朝上，向250mL烧杯中加入霍格兰氏营养液，将250mL烧杯转移至植物冷光源培养箱中于18℃条件下培养72h，每隔24h更换一次霍格兰氏营养液，即获得蓖麻瞬时表达体系。
2.根据权利要求1所述的研究载体农药韧皮部传导性的蓖麻瞬时表达体系构建方法，其特征在于，步骤S2中的外源目的基因为蓖麻氨基酸转运蛋白RcLHT7的CDS序列。
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