CN104673826A

CN104673826A - 一种小麦的快速转化方法

Info

Publication number: CN104673826A
Application number: CN201310632721.XA
Authority: CN
Inventors: 种康; 牛遇达; 张景昱
Original assignee: Institute of Botany of CAS
Current assignee: Institute of Botany of CAS
Priority date: 2013-12-02
Filing date: 2013-12-02
Publication date: 2015-06-03
Anticipated expiration: 2033-12-02
Also published as: CN104673826B

Abstract

本发明公开了一种小麦的快速转化方法。该方法是根癌农杆菌介导的转化小麦的方法，包括用含有目的DNA的重组根癌农杆菌侵染小麦，完成小麦转化；所述用含有目的DNA的重组根癌农杆菌侵染小麦是将待侵染小麦幼苗体系在真空状态下放置5-15分钟，所述待侵染小麦幼苗体系由小麦幼苗和含有所述重组根癌农杆菌的侵染液组成，所述待侵染小麦幼苗体系中，所述小麦幼苗浸泡于所述侵染液中。本发明的根癌农杆菌介导的转化小麦的方法的转化效率为27-100%，转化后植株存活率为32-90%。本发明的根癌农杆菌介导的转化小麦的方法简单易行，周期短，转化后植株存活率高，转化效率高，无需特殊设备，从萌发种子到完成分析只需要5天左右。

Description

一种小麦的快速转化方法

技术领域

本发明涉及一种小麦的快速转化方法。

背景技术

小麦是我国人民赖以为生的重要农作物。随着我国人口的增长和人民生活水平的改善，对小麦的产量和品质的要求也日益增高。传统的常规育种虽然在小麦育种中做出过重要贡献，但现在已经远远不能满足改善小麦产量和品质的要求。分子育种将基因工程应用于育种工作中，通过基因导入培育出一定要求的新品种，创造了良好的经济效益和社会效益。分子育种对小麦基因功能的研究提出了较高的要求，而小麦的转化效率较低，转基因株系较难获得，这在很大程度上阻碍了小麦基因功能的研究。

瞬时基因表达是一种替代稳定转化的方法，即瞬时转染后的初期，质粒或DNA片段是游离在细胞中的，能够进行表达，并引起相应表型变化。瞬时基因表达系统有以下优点：(1)简单快速。瞬时基因表达可以在转化后短期内进行分析，避免了遗传转化的繁杂过程；(2)表达水平高。在瞬时基因表达时，多个拷贝的未整合到植物基因组中的游离外源基因可以同时表达，有效提高表达量。(3)安全有效。瞬时基因表达不受植物生长发育过程的影响，不产生可遗传的后代，结果可靠直观，不存在基因漂移的风险。基因瞬时转化法因为其操作简单而且转化效率很高，适于研究基因功能。

目前，小麦中常用的转化方法是基因枪轰击法、根癌农杆菌介导的转化方法及花粉管通道法。虽然经过多年研究小麦转化方法取得了一定的进展，但仍存在转化效率低，转化周期长和转化步骤繁琐等一系列缺陷（毕瑞明,陈立国，后猛，王洪刚.小麦的遗传转化.植物生理学通讯，2006，42：573-579；李根英,何中虎,夏先春,樊庆琦,黄承彦.小麦基因转化研究进展.麦类作物学报，2007,27:923–927；吕晓依,王竹林,奚亚军,任鹏,刘曙东.小麦遗传转化受体系统建立的研究,西北植物学报，2007,27:0859–0863；李鹏,张磊,胡琳,高崇,余大杰,许为钢1小麦遗传转化中优良受体基因型及L2PPT适宜浓度的筛选.麦类作物学报，2008,28:193-196；王顺利，王轲，韩晓峰，晏月明.小麦遗传转化方法研究进展.首都师范大学学报，2008，29：52–58）。基因枪转化费用较高，花粉管通道法技术不易掌握。虽然人们长期以来一直致力于农杆菌介导的小麦转化方法的研究，由于状态良好的小麦愈伤较难获得，进展一直缓慢（于惠敏,夏光敏,侯丙凯。提高农杆菌介导小麦遗传转化效率的几个因素。山东大学学报，2005，40：120-124）。迄今为止，获得相应的遗传材料依然是小麦研究过程中的限速步骤。

根癌农杆菌介导的烟草叶片瞬时转化虽然已经广泛应用，但在研究小麦基因时，烟草作为一个异源系统可能无法如实反映所研究蛋白的功能或定位。人们一直以来都试图在小麦等粮食作物中建立其自身对基因瞬时转化体系，但成功率较低且不稳定。

发明内容

本发明的目的是提供一种成活率高、转化效率高的根癌农杆菌介导的转化小麦的方法。

本发明所提供的根癌农杆菌介导的转化小麦的方法，包括用含有目的DNA的重组根癌农杆菌侵染小麦，完成小麦转化；所述用含有目的DNA的重组根癌农杆菌侵染小麦是将待侵染小麦幼苗体系在真空状态下放置5-15分钟，所述待侵染小麦幼苗体系由小麦幼苗和含有所述重组根癌农杆菌的侵染液组成，所述待侵染小麦幼苗体系中，所述小麦幼苗浸泡于所述侵染液中。

上述方法中，所述真空状态的压强可为690mmHg-710mmHg（如700mmHg）。

上述方法中，所述小麦幼苗没有伤口。所述小麦幼苗为包括根、茎和叶的整株小麦幼苗。所述小麦幼苗可为2叶期的幼苗。

上述方法中，所述待侵染小麦幼苗体系在真空状态下可放置10分钟、15分钟、5分钟、5-10分钟或10-15分钟。

上述方法中，所述侵染液可由所述重组根癌农杆菌和空白侵染液组成，所述空白侵染液由蔗糖、乙酰丁香酮和水组成；所述空白侵染液中，蔗糖的质量含量为3%-6%（如5%），所述乙酰丁香酮的含量为17mg·L^-1-22mg·L^-1（如20mg·L^-1）。

上述方法中，以所述空白侵染液为空白对照，所述侵染液的OD_600nm为0.75-0.85（如0.80）。

在本发明的一个具体实施方式中，所述小麦的品种为京冬1号。

本发明的根癌农杆菌介导的转化小麦的方法可用于在小麦中瞬时表达外源基因（如来源于小麦的基因），可用于植物基因功能验证。所述植物基因可为小麦基因。

本发明的根癌农杆菌介导的转化小麦的方法的转化效率为27-100%，转化后植株存活率为32-90%。本发明的根癌农杆菌介导的转化小麦的方法简单易行，周期短，转化后植株存活率高，转化效率高，无需特殊设备，从萌发种子到完成分析只需要5天左右，为小麦基因提供强有力的新型研究工具。

附图说明

图1为pBI121-GFP的图谱。

图2为待转化小麦幼苗的照片。

图3为提供真空状态进行真空处理的照片。

图4为真空转化后小麦幼苗和未转化小麦幼苗照片。

图5A为经EHA105/pBI121-GFP转化存活植株中的阳性植株根部的GFP荧光显微镜照片。

图5B为经EHA105/pBI121-GFP转化存活植株中的阴性植株根部的GFP荧光显微镜照片。

图5C为未转化小麦幼苗根部的GFP荧光显微镜照片。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，具体步骤可参见：《Molecular Cloning:ALaboratory Manual》(Smabrook,J.,Ressule L.,David W.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,3^rd edition,2001,NY,Cold Spring Harbor)。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

小麦品种“京冬1号”（翟惠.冬小麦新品种——京冬1号.新农业.2003年09期.44页）公众可从中国科学院植物研究所获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。

实施例1、小麦的遗传转化

1.1、含有目的DNA的重组根癌农杆菌的制备

含有目的DNA（GFP基因）的重组载体为pBI121-GFP（图1）。pBI121-GFP是将pBI121载体（北京鼎国昌盛生物技术有限公司，产品目录号MCV032）的SacI和XbaI酶切位点之间的片段替换为序列表的序列1所示的GFP基因得到的GFP基因表达载体。

1.2、用含有目的DNA的重组根癌农杆菌侵染小麦，完成小麦转化

1.2.1、小麦幼苗的制备

取小麦品种“京冬1号”的种子，置于70%（体积比）酒精水溶液中浸泡30秒，用无菌蒸馏水冲洗2次，转入0.1%升汞溶液消10min，再用无菌蒸馏水冲洗4～5次，放入培养皿中，并加入蒸馏水饱和的滤纸保持湿润，于25℃，每天12小时光照12小时黑暗的条件下培养4天，得到2叶期的包括根、茎和叶的整株小麦幼苗（图2）。该小麦幼苗不制作任何伤口，直接用于根癌农杆菌的侵染。

1.2.2、含有目的DNA的重组根癌农杆菌的侵染液的制备

参照电激仪（EasyJecT Plus电激仪，英国EquiBio公司）操作指南，将pBI121-GFP用电击法转化根癌农杆菌EHA105（Biovector Co.,LTD公司目录号Biovec-11），经含卡那霉素的抗性平板筛选得到转入pBI121-GFP的重组菌，即含有目的DNA的重组根癌农杆菌，命名为EHA105/pBI121-GFP。

将EHA105/pBI121-GFP在5ml YEB培养液于28℃震荡培养（转速200rpm）过夜，而后将其加入30ml LB培养液于28℃震荡培养（转速200rpm）过夜，当OD₆₀₀为0.8时，6000rpm离心10min，收集菌体并重悬于空白侵染液中得到含有EHA105/pBI121-GFP的侵染液。以空白侵染液为空白对照，该含有EHA105/pBI121-GFP的侵染液的OD600nm为0.80。其中，空白侵染液由蔗糖、乙酰丁香酮和水组成；所述空白侵染液中，蔗糖的质量含量为5%，所述乙酰丁香酮的含量为20mg·L^-1。

1.2.3、真空渗透转化小麦幼苗

在培养皿中，将1.2.1制备的小麦幼苗完全浸泡于1.2.2制备的含有EHA105/pBI121-GFP的侵染液中得到EHA105/pBI121-GFP待侵染小麦幼苗体系（由小麦幼苗和含有EHA105/pBI121-GFP的侵染液组成），一个培养皿中一个EHA105/pBI121-GFP待侵染小麦幼苗体系。试验设三次重复，每次重复同时进行下述六种处理。

EHA105/pBI121-GFP真空5分钟处理（处理一）：将5个EHA105/pBI121-GFP待侵染小麦幼苗体系（每个EHA105/pBI121-GFP待侵染小麦幼苗体系含有10株小麦幼苗）在大气压为700mmHg的真空状态下静置5分钟完成转化，将小麦幼苗取出转入标准大气压下放入另外的培养皿中，并放入蒸馏水饱和的滤纸片保持湿度，通过荧光显微镜观察转化后的小麦幼苗根部，显示绿色荧光的植株为阳性植株，无绿色荧光的植株为阴性植株。图3为提供真空状态进行真空处理的照片。

EHA105/pBI121-GFP真空10分钟处理（处理二）：将5个EHA105/pBI121-GFP待侵染小麦幼苗体系（每个EHA105/pBI121-GFP待侵染小麦幼苗体系含有10株小麦幼苗）在大气压为700mmHg的真空状态下静置10分钟完成转化，将小麦幼苗取出转入标准大气压下放入另外的培养皿中并放入蒸馏水饱和的滤纸片保持湿度，通过荧光显微镜观察转化后的小麦幼苗根部，显示绿色荧光的植株为阳性植株，无绿色荧光的植株为阴性植株。图4中，左侧照片为完成该转化的照片。

EHA105/pBI121-GFP真空15分钟处理（处理三）：将5个EHA105/pBI121-GFP待侵染小麦幼苗体系（每个EHA105/pBI121-GFP待侵染小麦幼苗体系含有10株小麦幼苗）在大气压为700mmHg的真空状态下静置15分钟完成转化，将小麦幼苗取出转入标准大气压下放入另外的培养皿中，并放入蒸馏水饱和的滤纸片保持湿度，通过荧光显微镜观察转化后的小麦幼苗根部，显示绿色荧光的植株为阳性植株，无绿色荧光的植株为阴性植株。

EHA105/pBI121-GFP不抽真空条件下5分钟处理（处理四）：将5个EHA105/pBI121-GFP待侵染小麦幼苗体系（每个EHA105/pBI121-GFP待侵染小麦幼苗体系含有10株小麦幼苗）在标准大气压下静置5分钟完成转化，将小麦幼苗取出转入标准大气压下放入另外的培养皿中，并放入蒸馏水饱和的滤纸片保持湿度，通过荧光显微镜观察转化后的小麦幼苗根部，显示绿色荧光的植株为阳性植株，无绿色荧光的植株为阴性植株。

EHA105/pBI121-GFP不抽真空条件下10分钟处理（处理五）：将5个EHA105/pBI121-GFP待侵染小麦幼苗体系（每个EHA105/pBI121-GFP待侵染小麦幼苗体系含有10株小麦幼苗）在标准大气压下静置10分钟完成转化，将小麦幼苗取出转入标准大气压下放入另外的培养皿中，并放入蒸馏水饱和的滤纸片保持湿度，通过荧光显微镜观察转化后的小麦幼苗根部，显示绿色荧光的植株为阳性植株，无绿色荧光的植株为阴性植株。

EHA105/pBI121-GFP不抽真空条件下15分钟处理（处理六）：将5个EHA105/pBI121-GFP待侵染小麦幼苗体系（每个EHA105/pBI121-GFP待侵染小麦幼苗体系含有10株小麦幼苗）在标准大气压下静置15分钟完成转化，将小麦幼苗取出转入标准大气压下放入另外的培养皿中，并放入蒸馏水饱和的滤纸片保持湿度，通过荧光显微镜观察转化后的小麦幼苗根部，显示绿色荧光的植株为阳性植株，无绿色荧光的植株为阴性植株。

同时通过荧光显微镜观察50株未转化小麦幼苗（图4中，右侧照片）根部，作为对照。

结果表明50株未转化小麦幼苗根部均未显示绿色荧光，均不显示GFP活性，均为阴性植株，处理一至处理六存活植株中的阳性植株数如表1所示，其余存活植株均为阴性植株。EHA105/pBI121-GFP真空5分钟处理（处理一）的成活率为90%，转化率为27%；EHA105/pBI121-GFP真空10分钟处理（处理二）的成活率为84%，转化率为100%；EHA105/pBI121-GFP真空15分钟处理（处理三）的成活率为32%，转化率为100%；EHA105/pBI121-GFP标准大气压5分钟处理（处理四）成活率为98%，转化率为0%，EHA105/pBI121-GFP标准大气压10分钟处理（处理五）成活率为99%，转化率为0%，EHA105/pBI121-GFP标准大气压15分钟处理（处理六）成活率为99%，转化率为0%。图5A-图5C显示了经EHA105/pBI121-GFP转化存活植株中的阳性植株（图5A）、经EHA105/pBI121-GFP转化存活植株中的阴性植株（图5B）和未转化小麦幼苗根部的GFP荧光显微镜照片（图5C）。

表1、各处理的成活率和转化率

Claims

1.根癌农杆菌介导的转化小麦的方法，包括用含有目的DNA的重组根癌农杆菌侵染小麦，完成小麦转化；所述用含有目的DNA的重组根癌农杆菌侵染小麦是将待侵染小麦幼苗体系在真空状态下放置5-15分钟，所述待侵染小麦幼苗体系由小麦幼苗和含有所述重组根癌农杆菌的侵染液组成，所述待侵染小麦幼苗体系中，所述小麦幼苗浸泡于所述侵染液中。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述真空状态的压强为690mmHg-710mmHg。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述真空状态的压强为700mmHg。

4.根据权利要求1或2或3所述的方法，其特征在于：所述待侵染小麦幼苗体系在真空状态下放置10分钟、15分钟、5分钟、5-10分钟或10-15分钟。

5.根据权利要求1至4中任一所述的方法，其特征在于：所述侵染液由所述重组根癌农杆菌和空白侵染液组成，所述空白侵染液由蔗糖、乙酰丁香酮和水组成；所述空白侵染液中，蔗糖的质量含量为3%-6%，所述乙酰丁香酮的含量为17mg·L^-1-22mg·L^-1。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：以所述空白侵染液为空白对照，所述侵染液的OD600nm为0.75-0.85。

7.权利要求1-6中任一所述的方法在小麦中瞬时表达外源基因中的应用。

8.权利要求1-6中任一所述的方法在植物基因功能验证中的应用。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：所述植物基因为小麦基因。