CN102604986A - 一种提高农杆菌介导的甘蔗gus瞬时表达率方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种提高农杆菌介导的甘蔗GUS瞬时表达率方法，包括材料选择、转化菌液制备、侵染方法、共培养、选择培养和GUS活性组织化学染色。利用GUS瞬时表达率的高低作为指标，来衡量一种转基因技术方法的优劣，是国际社会所公认的方法。为此，本发明采用国际社会公认的指标，对所发明的技术方法进行评价。采用本发明方法，可使甘蔗GUS瞬时表达率提高335.8-1859.3%，能有效解决利用农杆菌介导途径高效获得转基因甘蔗植株的瓶颈问题，为利用转基因技术改良甘蔗品种提供了一种外源基因导入甘蔗的关键技术方法。同时，该方法也适用于其他植物基于农杆菌介导途径的遗传转化。

Description

一种提高农杆菌介导的甘蔗GUS瞬时表达率方法

技术领域

本发明涉及一种生物工程技术领域，具体涉及到一种提高农杆菌介导的甘蔗GUS瞬时表达率方法。 

背景技术

甘蔗（Saccharum Complex）是最主要的糖料作物，蔗糖占世界食糖总产的76%，占我国食糖总产的92%；甘蔗也是最重要的生物质能源作物之一，是迄今大田栽培作物中单位面积生物量和燃料乙醇产量最大的C4植物。甘蔗品种改良对产业科技进步贡献率高达60%，但由于甘蔗基因组大，遗传背景非常复杂，染色体数量达120条以上，现代甘蔗栽培种又为蔗属3个种或4个种的种间杂交复合体，属于异源多倍体植物，同时，甘蔗收获目标物为营养体——蔗茎，表型性状与环境的互作效应大，因此，常规有性杂交育种，从实生苗开始一般需要10-13年才能从10-30万株分离群体中培育出1个达到审（鉴）定要求的品种。因此，迄今甘蔗育种基本上还是属于“经验育种”。

现代分子生物学的发展和研究技术手段的进步，使品种的定向改良和目标性状育种成为可能。利用转基因技术改良甘蔗品种具有独特的优势，原因在于：（1）甘蔗属于转基因安全等级为I级的工业原料作物，批准转基因甘蔗产业化应用相对容易；（2）甘蔗又是无性繁殖作物，只要选到优良的单株就可以通过离体无性繁殖的方式，快速扩大群体并保持遗传上的稳定性。狭义的转基因技术主要有2个途径，一是基因枪轰击方法，二是农杆菌介导方法，前者在甘蔗上已经有较多的应用实例，但是，该技术有其固有的不足，除需要专门的昂贵设备，运行费用高，目的基因源插入位点不确定外，该技术途径获得的转基因株系几乎都是是多拷贝的，对性状的稳定遗传和转基因安全不利，容易产生基因沉默现象，导入的外源基因易丢失等问题；后者插入位点明确，获得单拷贝转基因后代频率高，性状遗传稳定性高，同时，由于该途径获得的转基因后代为单拷贝或低拷贝，转基因安全性相对比较高。虽然水稻等不多的几种单子叶植物的农杆菌介导方法已经比较成熟，但是，相对双子叶植物而言，单子叶植物农杆菌介导的转化率总体比较低，农杆菌介导转化甘蔗的效率仍然比较低，转化效率的提高是甘蔗转基因育种的“瓶颈”问题，因为，只有获得一定数量的转基因甘蔗群体，才有可能筛选到优良的单株。为此，在国家自然科学基金和现代农业产业技术体系建设资助下，我们探讨了农杆菌介导的甘蔗遗传转化的方法，目的是建立一种可实现甘蔗高效转化的技术方法，为甘蔗转基因改良提供关键技术。 

发明内容

鉴于现有技术的不足，本发明的目的是针对现有甘蔗农杆菌介导的遗传转化技术上存在的问题，提供一种提高农杆菌介导的甘蔗GUS瞬时表达率的方法。通过一种农杆菌介导法将外源基因导入受体细胞，提高甘蔗外源基因转化效率，从而建立由农杆菌介导的甘蔗外源基因转化体系。

为了实现上述目的，本发明的技术方案包括材料选择、转化菌液制备、侵染方法、共培养、选择培养和GUS活性组织化学染色，其特征在于：

1、材料选择：选择携带GUS(β-glucuronidase ）基因的植物表达载体pCAMBIA2301，导入根癌农杆菌（Agrobacteriumtumefaciens）菌株EHA105中，获得A菌液，A菌液为含有植物表达载体pCAMBIA2301的阳性菌液；选择的甘蔗品种为ROC22或福农95-1702；所述携带GUS基因的植物表达载体pCAMBIA2301和根癌农杆菌菌株EHA105由商业购买获得；所述导入方法，参照余云舟等在吉林农业大学学报上发表的文章《重组质粒导入根癌农杆菌冻融法的研究》，2003,25（3）：257-259,262；

    2、转化菌液制备：吸取100μl  A菌液转至含有利福平35 mg/L和卡那霉素 50 mg/L浓度的50 mL LB液体培养基中，在25～28℃、120～150 r/min振荡培养至OD₆₀₀=1.0～1.2，菌体于5000 rpm 离心5～10 min 后重悬于侵染液中，再次用5000rpm 离心5～10 min 后，用侵染液稀释至OD₆₀₀=0.8～1.6，此菌液即为转化菌液；所述MS培养基为1962年，Murhige和Skoog公开的MS培养基；所述LB培养基为：10g/L胰蛋白胨、5g/L酵母提取物和10g/L 氯化钠，pH7.0；所述侵染液即M1为：1/2MS＋100μmol/L乙酰丁香酮+20.0 g/L蔗糖，pH5.8；

3、侵染方法：在甘蔗植株顶端部分，取白色心叶的肥厚带中生长点以上10 cm内的幼嫩心叶，用体积比为75 %的乙醇消毒后，并将其切成不大于3 mm厚度的圆片，然后浸入步骤2的转化菌液中，放入真空干燥器中，用真空泵使内外压强差为0.05～0.08 Mpa下侵染30～50 min；

 4、共培养：将步骤3侵染后的材料从转化菌液中取出后，用灭菌滤纸吸干表面的转化菌液，然后转至含有1/2MS＋3.0 mg/L 2.4-D＋100μmol/L 乙酰丁香酮+20.0 g/L蔗糖+6.0 g/L琼脂粉 pH 5.8的培养基中，在22℃黑暗条件下共培养3d；

5、选择培养：将共培养后的材料移至MS＋3.0 mg/L 2.4-D＋300 mg/L Timentin+30.0 g/L蔗糖+ 6.0 g/L琼脂粉，pH 5.8选择培养基中，在28℃黑暗条件下选择培养4d；

6、GUS活性组织化学染色：将选择培养4d后的心叶放入GUS染色液中，37℃静置保温16h，体积比为75%酒精脱色即可。所述GUS染色液为：pH=7.0的100 mmol/L磷酸钠缓冲液、10 mmol/L EDTA ，1 mmol/L铁氰化钾 ，0.1% Triton X-100， 2mmol/L X-Gluc 。      

凡是外源基因成功导入甘蔗组织细胞并在其中成功实现基因表达的，就会被染成蓝色。为此，染上蓝色的材料表示GUS基因已经转入到植物的细胞之中。表１的试验结果表明，不同品种间没有太大差异。转化菌液浓度之间，高OD值比低OD值的GUS瞬时表达率来的高，多数差异达到显著性水平，只有在品种ROC２２的常压（设常压为对照，下同）条件下，两者之间的GUS瞬时表达率差异未达到显著性水平；在侵染方法上，常压和抽真空之间的差异达到极显著差异，说明甘蔗心叶采用转化菌液OD值为１.2，抽真空的办法，可以促进菌液的侵透，大大提高侵染效果。 

表1   不同侵染方法、转化菌液的浓度对GUS瞬时表达率的影响

采用以上农杆菌介导的甘蔗外源基因转化方法，GUS的瞬时表达率不低于５０%。本发明已经在农杆菌介导的抗虫、抗病基因转化甘蔗上得到了应用。

本发明具有以下优点：

1、在材料选择上是以心叶为受体直接侵染，不仅报告基因（GUS）的瞬时表达率显著提高，达到５０%以上，同时还可以克服采用愈伤组织作为受体而存在转基因株系为嵌合体的风险。

2、在农杆菌侵染心叶时，采用抽真空侵染的方法，可以提高GUS瞬时表达率335.8～1859.3 %，可用该方法高效培育转基因甘蔗。

3、本发明操作简单，实用性强，推广性好。

4、本发明不仅适用于甘蔗，也适用于其他植物。  

附图说明    

图1为A菌液的PCR检测图；M表示Marker；a表示水空白对照；b表示A菌液；c表示阳性对照。

具体实施方式    

下面结合实施例对本发明做进一步的阐述。

实施例一、一种提高农杆菌介导的甘蔗GUS瞬时表达率方法

一种提高农杆菌介导的甘蔗GUS瞬时表达率方法，包括以下步骤：

1、材料选择：选择的菌液为A菌液；选择的甘蔗品种为ROC22；

验证A菌液为阳性菌液：引物是GUSF - 5’- TCAGCGCGAAGTCTTTATAC- 3’ GUSR -5’- TTCAGTTCGTTGTTCACACA- 3’；程序是95℃预变性5min，95℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸30s，30个循环，最后延伸10min；A菌液的PCR检测结果如附图1所示，b与c泳道在210bp的位置扩增出大小一致的目的条带，A菌液为阳性菌液；

　　2、转化菌液制备　吸取100 μl  A菌液转至于50 mL 含利福平35 mg/L和50 mg/L卡那霉素的LB液体培养基中，在28℃下，120 r/min振荡培养至OD₆₀₀=1.0，菌体于5 000 r/min 离心10 min 后悬于M1中，离心后，再次用M1重悬，稀释至OD₆₀₀=0.8，即为转化菌液；

3、侵染方法：取甘蔗品种ROC22的健壮无病虫害的植株顶端部分，从最高肥厚带下30 cm处切下，去掉已展开的老叶，表面用体积比为75 %的乙醇喷洒消毒后，在超净台上，剥去外层叶片，直至可见幼嫩的白色心叶的肥厚带，切取生长点以上10 cm幼嫩心叶，并将其切成3 mm厚度的圆片后直接浸入制备好的转化菌液中，在0.08 Mpa的压力下侵染50 min；

4、共培养：将侵染后的材料从转化菌液中取出后，用灭菌滤纸吸干表面的转化菌液，然后转至含有1/2MS+3.0 mg/L 2.4-D＋100μmol/L乙酰丁香酮+20.0 g/L蔗糖+6.0 g/L琼脂粉 pH 5.8的培养基上，在22℃黑暗条件下共培养3d；

5、选择培养：将共培养后的材料移至MS＋3.0 mg/L 2.4-D＋300 mg/L Timentin+30.0 g/L蔗糖+6.0 g/L琼脂，pH5.8选择培养基中，在28℃黑暗条件下培养4d；

6、GUS活性组织化学染色：将选择培养4d后的心叶放入GUS染色液中，37℃静置保温16 h，经体积比为75 %酒精脱色后，染上蓝色的材料表示GUS基因已经转入到植物的细胞之中。

经统计，GUS瞬时表达率的结果见表2。   

 表2　不同侵染方法对GUS瞬时表达的影响

 

试验结果表明，在农杆菌侵染心叶时，采用抽真空侵染的方法，最高可以提高GUS瞬时表达率1859.3 %，经显著性测验，二者之间呈极显著差异。

实施例二、一种提高农杆菌介导的甘蔗GUS瞬时表达率方法

一种提高农杆菌介导的甘蔗GUS瞬时表达率方法，包括以下步骤：

1、材料选择：选择的菌液为A菌液；选择的甘蔗品种为福农95-1702；

　　2、转化菌液制备：吸取100 μl  A菌液转至于50 mL 含利福平35 mg/L和50 mg/L卡那霉素的LB液体培养基中，在28℃下，150 r/min振荡培养至OD₆₀₀=1.2，菌体于5000 r/min 离心10 min 后悬于M1中，离心后，再次用M1重悬，稀释至OD₆₀₀=1.2，即为转化菌液；

3、侵染方法：取甘蔗品种福农95-1702的健壮无病虫害的植株顶端部分，从最高肥厚带下30 cm处切下，去掉已展开的老叶，表面用75 %的乙醇喷洒消毒后，在超净台上，剥去外层叶片，直至可见幼嫩的白色心叶的肥厚带，切取生长点以上10 cm内的幼嫩心叶，并将其切成小于3 mm厚度的圆片后直接浸入制备好的转化菌液中，在0.05 Mpa的压力下侵染30 min；

　　4、共培养：参照实施例一的共培养；

　　5、选择培养：参照实施例一的选择培养；

6、GUS活性组织化学染色：参照实施例一的GUS活性组织化学染色。

甘蔗品种福农95-1702在农杆菌侵染心叶时，采用抽真空侵染的方法，可以提高GUS瞬时表达率335.8 %，经显著性测验，二者之间呈极显著差异，试验结果见表3。

表3　不同侵染方法对GUS瞬时表达的影响

表1、表２和表3采用字母标记方法来表示多重比较结果，按照统计分析平均数多重比较标记字母法规定，用小写拉丁字母a、b、c、d......表示差异显著水平α＝0.05，用大写拉丁字母A、B、C、D......表示差异显著水平α＝0.01。先将各处理平均数由大到小排列，最大平均数后标记a或A，并将该平均数与以下各平均数相比，差异显著的依次标记b或B。依次类推，不显著的标记同一字母。两平均数之间凡有相同字母的即为差异不显著，否则为差异显著。

利用GUS瞬时表达率的高低作为指标，来衡量一种转基因技术方法的优劣，是国际社会所公认的方法。为此，本发明采用国际社会公认的指标，对所发明的技术方法进行评价。采用本发明方法，可使甘蔗GUS瞬时表达率提高335.8-1859.3%，能有效解决利用农杆菌介导途径高效获得转基因甘蔗植株的瓶颈问题，为利用转基因技术改良甘蔗品种提供了一种外源基因导入甘蔗的关键技术方法。同时，该方法也适用于其他植物基于农杆菌介导途径的遗传转化。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

Claims (3)

1.一种提高农杆菌介导的甘蔗GUS瞬时表达率方法，包括材料选择、转化菌液制备、侵染方法、共培养、选择培养和GUS活性组织化学染色，其特征在于：

（1）材料选择：选择携带GUS(β-glucuronidase ）基因的植物表达载体pCAMBIA2301，导入根癌农杆菌（Agrobacteriumtumefaciens）菌株EHA105中，获得A菌液，A菌液为含有植物表达载体pCAMBIA2301的阳性菌液；选择的甘蔗品种为ROC22或福农95-1702；所述导入方法，参照余云舟等在吉林农业大学学报上发表的文章《重组质粒导入根癌农杆菌冻融法的研究》，2003,25（3）：257-259,262；

    （2）转化菌液制备：吸取100 μl  A菌液转至含有利福平35 mg/L和卡那霉素 50 mg/L浓度的50 mL LB液体培养基中，在25～28℃、120～150 r/min振荡培养至OD₆₀₀=1.0～1.2，菌体于5000 rpm 离心5～10 min 后重悬于侵染液中，再次用5000rpm 离心5～10 min 后，用侵染液稀释至OD₆₀₀=0.8～1.6，此菌液即为转化菌液；所述MS培养基为1962年，Murhige和Skoog公开的MS培养基；所述LB培养基为：10g/L胰蛋白胨、5g/L酵母提取物和10g/L 氯化钠，pH7.0；所述侵染液即M1为：1/2MS＋100μmol/L乙酰丁香酮+20.0 g/L蔗糖，pH5.8；

（3）侵染方法：在甘蔗植株顶端部分，取白色心叶的肥厚带中生长点以上10 cm内的幼嫩心叶，用体积比为75 %的乙醇消毒后，并将其切成不大于3 mm厚度的圆片，然后浸入步骤2的转化菌液中，放入真空干燥器中，用真空泵使内外压强差为0.05～0.08 Mpa下侵染30～50 min；

 （4）共培养：将步骤3侵染后的材料从转化菌液中取出后，用灭菌滤纸吸干表面的转化菌液，然后转至含有1/2MS＋3.0 mg/L 2.4-D＋100μmol/L 乙酰丁香酮+20.0 g/L蔗糖+6.0 g/L琼脂粉 pH 5.8的培养基中，在22℃黑暗条件下共培养3d；

（5）选择培养：将共培养后的材料移至MS＋3.0 mg/L 2.4-D＋300 mg/L Timentin+30.0 g/L蔗糖+ 6.0 g/L琼脂粉，pH 5.8选择培养基中，在28℃黑暗条件下选择培养4d；

（6）GUS活性组织化学染色：将选择培养4d后的心叶放入GUS染色液中，37℃静置保温16h，体积比为75%酒精脱色即可；所述GUS染色液为：pH=7.0的100 mmol/L磷酸钠缓冲液、10 mmol/L EDTA ，1 mmol/L铁氰化钾 ，0.1% Triton X-100， 2mmol/L X-Gluc 。

2.根据权利要求1所述的一种提高农杆菌介导的甘蔗GUS瞬时表达率方法，其特征在于：

（1）材料选择：选择的菌液为A菌液；选择的甘蔗品种为ROC22；

　　（2）转化菌液制备：吸取100 μl  A菌液转至于50 mL 含利福平35 mg/L和50 mg/L卡那霉素的LB液体培养基中，在28℃下，120 r/min振荡培养至OD₆₀₀=1.0，菌体于5 000 r/min 离心10 min 后悬于M1中，离心后，再次用M1重悬，稀释至OD₆₀₀=0.8，即为转化菌液；

（3）侵染方法：取甘蔗品种ROC22的健壮无病虫害的植株顶端部分，从最高肥厚带下30 cm处切下，去掉已展开的老叶，表面用体积比为75 %的乙醇喷洒消毒后，在超净台上，剥去外层叶片，直至可见幼嫩的白色心叶的肥厚带，切取生长点以上10 cm幼嫩心叶，并将其切成3 mm厚度的圆片后直接浸入制备好的转化菌液中，在0.08 Mpa的压力下侵染50 min；

（4）共培养：将侵染后的材料从转化菌液中取出后，用灭菌滤纸吸干表面的转化菌液，然后转至含有1/2MS+3.0 mg/L 2.4-D＋100μmol/L乙酰丁香酮+20.0 g/L蔗糖+6.0 g/L琼脂粉 pH 5.8的培养基上，在22℃黑暗条件下共培养3d；

（5）选择培养：将共培养后的材料移至MS＋3.0 mg/L 2.4-D＋300 mg/L Timentin+30.0 g/L蔗糖+6.0 g/L琼脂，pH5.8选择培养基中，在28℃黑暗条件下培养4d；

（6）GUS活性组织化学染色：将选择培养4d后的心叶放入GUS染色液中，37℃静置保温16 h，经体积比为75 %酒精脱色后，染上蓝色的材料表示GUS基因已经转入到植物的细胞之中。

3.根据权利要求1所述的一种提高农杆菌介导的甘蔗GUS瞬时表达率方法，其特征在于：

（1）材料选择：选择的菌液为A菌液；选择的甘蔗品种为福农95-1702；

　　（2）转化菌液制备：吸取100 μl  A菌液转至于50 mL 含利福平35 mg/L和50 mg/L卡那霉素的LB液体培养基中，在28℃下，150 r/min振荡培养至OD₆₀₀=1.2，菌体于5000 r/min 离心10 min 后悬于M1中，离心后，再次用M1重悬，稀释至OD₆₀₀=1.2，即为转化菌液；

（3）侵染方法：取甘蔗品种福农95-1702的健壮无病虫害的植株顶端部分，从最高肥厚带下30 cm处切下，去掉已展开的老叶，表面用75 %的乙醇喷洒消毒后，在超净台上，剥去外层叶片，直至可见幼嫩的白色心叶的肥厚带，切取生长点以上10 cm内的幼嫩心叶，并将其切成小于3 mm厚度的圆片后直接浸入制备好的转化菌液中，在0.05 Mpa的压力下侵染30 min；

　　（4）共培养：将侵染后的材料从转化菌液中取出后，用灭菌滤纸吸干表面的转化菌液，然后转至含有1/2MS+3.0 mg/L 2.4-D＋100μmol/L乙酰丁香酮+20.0 g/L蔗糖+6.0 g/L琼脂粉 pH 5.8的培养基上，在22℃黑暗条件下共培养3d；

（5）选择培养：将共培养后的材料移至MS＋3.0 mg/L 2.4-D＋300 mg/L Timentin+30.0 g/L蔗糖+6.0 g/L琼脂，pH5.8选择培养基中，在28℃黑暗条件下培养4d；

（6）GUS活性组织化学染色：将选择培养4d后的心叶放入GUS染色液中，37℃静置保温16 h，经体积比为75 %酒精脱色后，染上蓝色的材料表示GUS基因已经转入到植物的细胞之中。