CN109988761A - 一种核苷酸序列及其在增强植物抗有害生物能力中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种核苷酸序列及其在增强植物抗有害生物能力中的应用。通过V‑ATPase subunit E基因片段和COO2基因片段构建双基因RNAi载体，转入植物，在植物中表达产生V‑ATPase subunit E和COO2双基因的dsRNA，从而达到抑制蚜虫生长的目的。本发明利用基因工程手段获得的抗虫转基因植物具有只对目标害虫有效，而对非危害生物没有影响的优点，植物表达产生的抗虫物质存在于植物体内，不会对环境造成污染，且成本低，利于推广。

Description

一种核苷酸序列及其在增强植物抗有害生物能力中的应用
技术领域
本发明涉及的是一种生物工程领域的技术，具体是一种基于V-ATPase subunit E和COO2双基因融合增强植物抗蚜性的方法。
背景技术
蚜虫是农业生产中的主要害虫之一。蚜虫属于同翅目，包括球蚜总科和蚜总科，体长在1-10mm之间，为刺吸式口器，常群集于叶片、顶芽、嫩茎、花蕾等部位。 蚜虫种类繁多，全世界目前己知约4700余种，中国分布约1100种。蚜虫在取食时， 通过口针刺破植物表皮、薄壁组织及叶肉进入到筛管，取食植物的汁液，口针能够 有效避开植物表皮组织的防御性物质，利于在组织间穿刺，顺利吸食植物组织中营 养丰富的汁液。蚜虫吸食植物汁液，使得植株营养恶化，生长发育不良甚至停滞， 导致减产；蚜虫分泌的蜜露聚集在叶片、茎秆等部位，严重影响农作物的光合作用 和呼吸作用；此外，蚜虫排泄的蜜露能够促进一些病原菌的孽生和传播多种植物病 毒。
蚜虫的寄主植物几乎包括被子植物和裸子植物的松柏纲所有的科，并且能在植物间传播病毒，危害性极广。诸如小麦、棉花、蔬果、花卉等经济农作物都深受其 害，给农林业和园艺业造成了巨大经济损失。特别是近年来受大气温室效应的影响， 我国小麦主要种植地区小麦生育期间气温升高，出现“暖冬”，致使蚜虫危害猖獗， 每年在小麦生产上因蚜虫及其传播的病毒所造成的经济损失十分严重。
由于目前我国小麦主栽品种对蚜虫的抗性都不强，如何有效防治蚜虫已成为小麦生产上的重大问题之一。农药在抵抗虫害中起着重要作用，然而害虫对农药逐渐 产生抗药性，此外，农药还容易污染环境。
目前植物介导的RNAi技术作为农作物抗虫研究的热点之一，应用前景十分广 阔。此技术就是通过在寄主植物中表达相应昆虫特异基因的dsRNA，昆虫食用寄 主植物后，其相应的基因被沉默而表达量下降，造成昆虫的死亡，从而起到控制害 虫危害的作用。因此利用植物介导的RNAi技术培育抗蚜品种能够达到安全、持久、 高效防治蚜虫的目的，具有重要的实际应用价值。
因此，本领域的技术人员致力于开发一种安全有效的抗蚜虫方法。
发明内容
有鉴于现有技术的上述缺陷，本发明所要解决的技术问题是提供一种安全有效的抗蚜虫方法。
本发明的一个方面提供了一种核苷酸序列，在一个优选的实施方式中，该核苷 酸序列选自如下序列：
1)SEQ ID NO:4-6中任一项所示的核苷酸序列；
2)SEQ ID NO:4-6中任一项所示的核苷酸序列通过一个或几个核苷酸的取代、 缺失、插入或添加衍生产生的核苷酸序列；
3)包含与SEQ ID NO:4-6中任一项具有至少80％以上同源性的核苷酸序列。
本发明的第二个方面提供了一种双链RNA，在一个优选的实施方式中，由如 上所述的核苷酸序列和其反向互补序列组成。
本发明的第三个方面提供了一种小干扰RNA，在一个优选的实施方式中，由 如上所述的双链RNA裂解产生的短片段双链RNA分子。优选地，所述小干扰RNA 的长度为19-25nt。
本发明的第四个方面提供了一种重组表达载体，在一个优选的实施方式中，含 有如上所述的核苷酸序列或如上所述的双链RNA分子。
可选地，上述重组表达载体还包括能在植物中转录的启动子。可选地，启动子 为玉米ubiquitin-1启动子。玉米ubiquitin-1启动子位于所述核苷酸序列或所述双链 RNA分子的上游。可选地，玉米ubiquitin-1启动子下游具有水稻内含子，玉米 ubiquitin-1启动子与水稻内含子(OSintron)融合后的核苷酸序列如SEQ ID NO:7 所示。其中SEQ ID NO:7的1-1080位为玉米ubiquitin-1启动子，SEQ ID NO:7的 1143-1621位为水稻内含子。
本发明的第五个方面提供了如上所述的核苷酸序列或如上所述的双链RNA在 增强植物抗有害生物能力中的应用。在一个优选的实施方式中，所述有害生物为蚜 虫。
可选地，蚜虫为桃蚜(Myzus persicae)、豆长管蚜(Acyrthosiphon pisum)、麦 双尾蚜(Diuraphis noxia)、高粱蚜(Melanaphis sacchari)、黄伪毛蚜(Sipha flava) 和棉蚜(Aphis gossypii)等中的一种或多种。
可选地，植物为双子叶植物、单子叶植物或裸子植物；可选地，双子叶植物包 括十字花科植物和茄科植物；可选地，所述植物为拟南芥、水稻、小麦、玉米、棉 花、大豆、油菜、高粱、烟草、菊花、青菜、白菜、萝卜或番茄等。
可选地，该应用包括如下步骤：
1)构建含有如上所述的核苷酸序列或如上所述的双链RNA分子的重组表达 载体；
2)将所述重组表达载体转入农杆菌，利用所述农杆菌侵染植物幼胚；
3)通过抗生素筛选得到抗性植物幼苗。
本发明的一个具体实施方式中，提供了一种双基因融合增强植物抗蚜性的方 法，利用了V-ATPase通过水解ATP产生能量从而为各种生命活动提供所需能量以 及蚜虫唾液腺酶类基因COO2在蚜虫合成酶过程上的重要特性，利用基因工程手 段获得的抗虫转基因植物具有只对目标害虫有效，而对非危害生物没有影响的优 点，植物表达产生的抗虫物质存在于植物体内，不会对环境造成污染，且成本低， 利于推广。
说明：本文中，SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3三条序列都包 含了正向序列部分和互补序列部分，文中出现SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3三条序列时，应理解为指代其中的正向序列部分。
SEQ ID NO:1的正向序列部分为1-60、121-180、241-300、361-420、481-540、 601-611位(即SEQ ID NO:4所示的序列)，其互补序列部分为61-120、181-240、 301-360、421-480、541-600、612-622位。
SEQ ID NO:2的正向序列部分1-60、121-180、241-300、361-420、481-540、 601-659位(即SEQ ID NO:5所示的序列)，其互补序列部分为61-120、181-240、 301-360、421-480、541-600、600-718位。
SEQ ID NO:3的正向序列部分为1-60、121-180、241-300、361-420、481-540、 601-660、721-780、841-900、961-1020、1081-1140、1201-1260、1321-1330位(即 SEQ ID NO:6所示的序列)，其互补序列部分为61-120、181-240、301-360、421-480、 541-600、661-720、781-840、901-960、1021-1080、1141-1200、1261-1320、1331-1340 位。
本发明是通过以下技术方案实现的：本发明涉及一种具有抗蚜虫功能的基因dsRNA，其具体融合自蚜虫的V-ATPasesubunit E和COO2基因片段，其核苷酸序 列如SEQ IDNO:3所示。
所述的SEQ ID NO:3，通过将蚜虫的V-ATPase subunit E(SEQ ID NO:1所示)、COO2基因(SEQ ID NO:2所示)以及V-ATPase subunit E和COO2基因部分片段融 合片段基因合成。
本发明涉及一种双基因融合增强植物抗蚜性的方法，用V-ATPase subunit E基因、COO2基因以及V-ATPase subunit E基因和COO2基因部分序列融合片段分别 构建得到具有抗蚜虫功能的基因，通过构建表达载体并将其分别转入农杆菌，以该 农杆菌侵染小麦幼胚，分别在小麦中表达产生V-ATPase subunit E、COO2基因以 及V-ATPase subunit E和COO2双基因的dsRNA，从而达到趋避蚜虫的目的。
所述的表达载体，通过构建玉米ubiquitin-1启动子驱动V-ATPase subunit E，COO2基因以及V-ATPase subunit E基因和COO2融合基因沉默载体，即RNAi载 体。
所述的ubiquitin-1启动子具体为：组成型启动子。
所述的侵染，即将小麦幼胚转移至农杆菌菌液中侵染后置于黑暗条件下的培养基上培养得到幼胚愈伤组织，进而经抗性再生植株筛选后得到小麦抗性苗。
本发明涉及一种重组表达载体，即RNAi载体，其基于dsRNA构建得到。
所述的dsRNA包括：
1)由SEQ ID NO:1所示的在植物中表达的核苷酸和其反向互补序列；
2)由SEQ ID NO:1所示的在植物中表达的核苷酸和其反向互补序列；
3)由SEQ ID NO:3所示的在植物中表达的核苷酸和其反向互补序列，由SeqIDNo.1所示的核苷酸和SEQ ID NO:2所示的核苷酸组成。
所述的抗蚜性包括：
1)在防治蚜虫中的应用或在制备防治蚜虫产品中的应用；
2)在促进蚜虫死亡中的应用或在制备促进蚜虫死亡产品中的应用；
3)在抑制蚜虫生长中的应用或在制备抑制蚜虫生长产品中的应用。
技术效果
本发明的实验证明所得在小麦中表达蚜虫相关基因V-ATPase subunit E、COO2以及V-ATPase subunit E和COO2融合片段表达cDNA的序列的dsRNA，导致麦蚜 产生致死效应，并且V-ATPase subunit E和COO2融合片段表达cDNA的序列的 dsRNA抑制蚜虫效果最佳。
与化学防治相比，利用基因工程手段获得的抗虫转基因植物具有只对目标害虫有效，而对非危害生物没有影响的优点，植物表达产生的抗虫物质存在于植物体内， 不会对环境造成污染，且成本低，利于推广。
与现有技术相比，本发明对于适用于本发明的植物没有特别的限制，只要其适 合进行基因的转化操作，如各种农作物、花卉植物或林业植物等。
附图说明
图1为本发明pDE1005:proUBI:V-ATPase subunit E+COO2载体构建示意图； 其中，图1a是pDE1005载体的示意图；图1b是构建V-ATPase subunit E+COO2 发卡结构的示意图；图1c是将图1b中的发卡结构连接到载体上后的部分结构示意 图；
图2为实施例中转ubiquitin-1启动子驱动V-ATPase subunit E+COO2基因T1 代小麦PCR鉴定示意图；
图中：Marker III：DNA分子量标准；+：pDE1005:proUBI:V-ATPase subunit E+COO2质粒；CK：野生型Fileder春小麦；1-1，1-3，1-6，2-2，2-3，2-6，3-2， 3-4，3-6，4-1，4-3，4-4，5-3，5-5，5-8：转ubiquitin-1启动子驱动V-ATPase subunit E+COO2基因T1代小麦植株，简称VC。
图3为实施例中转ubiquitin-1启动子驱动V-ATPase subunit E+COO2基因T1 代小麦V-ATPase subunit E+COO2基因半定量结果示意图；
图中：DL2000：DNA分子量标准；CK：野生型Fileder春小麦；1-1，1-3， 1-6，2-2，2-3，2-6，3-2，3-4，3-6，4-1，4-3，4-4，5-3，5-5，5-8：转ubiquitin-1 启动子驱动V-ATPasesubunit E+COO2基因T1代小麦植株，简称VC。
具体实施方式
下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook 等分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所 述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。所采用的试剂，若无特殊说明，均为市 售或公开渠道可以获得的试剂。
在蚜虫的生长发育过程中，V-ATPase通过水解ATP产生能量从而为各种生命 活动提供所需能量，唾液腺酶类基因COO2在蚜虫合成酶过程中也非常重要。因 此，本发明的一个具体实施方式中，采用V-ATPase和COO2基因的片段进行基因 融合，构建用于基因沉默的元件，通过该元件降低蚜虫体内的V-ATPase和COO2 基因表达水平，影响蚜虫的正常生长发育，达到抑制蚜虫生长的目的。
在一个具体实施方式中，采用V-ATPase subunit E和COO2基因非保守区域的 片段基因融合，构建用于基因沉默的元件。选择非保守区域可以防止干扰除蚜虫 V-ATPasesubunit E和COO2外的其他同源序列。
在一个具体实施方式中，用于基因沉默的元件是双链RNA。
在一个具体实施方式中，通过将蚜虫的V-ATPase subunit E和COO2基因非保 守区域的片段进行融合，并构建带有该融合基因的正向和反向序列的重组表达载 体。该重组表达载体被转入植物(例如，可以通过农杆菌介导的侵染的方式)，在 植物中表达产生V-ATPase subunit E和COO2双基因的dsRNA，蚜虫取食产生同时 包括V-ATP和COO2基因的siRNA的转基因植物后，使其体内的V-ATPase subunit E和COO2基因表达水平同时下降。通过上述RNA干扰的方式影响蚜虫正常的生 长发育，从而达到抑制蚜虫生长的目的。
“RNA干扰(RNA interference，RNAi)”是指一些小的双链RNA可以高效、特异 地阻断体内特定靶基因的表达，促使成熟mRNA降解，使生物个体表现出特定基 因缺失的表型。RNA干扰是高度特异的mRNA水平上的基因沉默抑制。
“小干扰RNA(small interfering RNA，siRNA)”是指一种短片段双链RNA分子， 能够以同源互补序列的mRNA为靶目标，降解特定的mRNA，这个过程就是RNA 干扰途径(RNAinterference pathway)。
通过比对已经测序的不同种类蚜虫V-ATPase subunit E和COO2基因序列，可 知这两个基因序列非常的保守，虽然其他双子叶、单子叶等植物的蚜虫没有被测序， 但是可以推测出这两个基因不同物种蚜虫同源性非常的高，在小麦中能实现RNAi， 就能在其他植物(单子叶、双子叶、裸子植物)实现。
实施例1V-ATPase subunit E和COO2基因序列同源性比对
利用NCBI数据库，将选择的V-ATPase subunit E基因片段(SEQ ID NO:4) 进行核酸序列比对，结果显示，该段序列与豆长管蚜(Acyrthosiphon pisum)V-type protonATPase subunit E-like序列(NCBI登录号：NM_001162178.2)同源性100％； 与桃蚜(Myzuspersicae)V-type proton ATPase subunit E序列(NCBI登录号： XM_022312248.1)同源性95％；与麦双尾蚜(Diuraphis noxia)V-type proton ATPase subunit E序列(NCBI登录号：XM_015522279.1)同源性92％；与高粱蚜(Melanaphis sacchari)V-type protonATPase subunit E序列(NCBI登录号：XM_025342771.1) 同源性94％；与黄伪毛蚜(Siphaflava)V-type proton ATPase subunit E序列(NCBI 登录号：XM_025565024.1)同源性86％。
将选择的COO2基因片段(SEQ ID NO:5)进行核酸序列比对，结果显示，该 段序列与豆长管蚜(Acyrthosiphon pisum)序列(NCBI登录号：XM_001948323.3) 同源性99％；桃蚜(Myzus persicae)序列(NCBI登录号：XM_022310905.1)同 源性89％；与棉蚜(Aphisgossypii)序列(NCBI登录号：KJ451424.1)同源性89％； 与高粱蚜(Melanaphis sacchari)序列(NCBI登录号：XM_025338353.1)同源性 80％。
根据RNAi技术原理，与本发明中V-ATPase subunit E和COO2基因序列同源 性为80％以上均会有抗蚜虫效果。
实施例2含V-ATPase subunit E和COO2双基因的RNAi载体的合成
分别合成V-ATPase subunit E基因片段，COO2基因片段以及V-ATPase subunit E和COO2双基因片段，分别构建发夹结构的正向基因，内含子序列和反向的基因， 构建到pDE1005载体(购自北京拜尔迪生物技术有限公司)的多克隆位点上，分 别获得pDE1005:proUBI:V-ATPase subunit E，pDE1005:proUBI:COO2和 pDE1005:proUBI:V-ATPasesubunit E+COO2基因沉默载体，基因由上海生工生物工 程公司合成。构建V-ATPasesubunit E和COO2双基因片段的RNAi载体的示意图 如图1所示。
在一个可选的实施例中，pDE1005载体上自带水稻内含子，玉米ubiquitin-1 启动子位于水稻内含子的上游，玉米ubiquitin-1启动子和水稻内含子构建融合之后 的序列如SEQ ID NO:7所示。构建的三种RNAi载体的发夹结构的正向基因序列 如SEQ ID NO:4、SEQID NO:5和SEQ ID NO:6所示，内含子序列如SEQ ID NO: 8所示，反向互补序列为SEQ IDNO:4、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6的反向互 补序列。
实施例3根癌农杆菌介导V-ATPase subunit E，COO2以及V-ATPase subunit E+COO2双基因RNAi载体转化Fielder春小麦
1.1.幼胚的预培养
开花授粉后13～14d的未成熟种子(幼胚大小1.0～1.2mm)，用70％酒精表面 消毒1～2min，15％的次氯酸钠灭菌15min，无菌水冲洗4～5次。
1.2.农杆菌与幼胚愈伤组织的共培养
室温下，3500rpm离心10min收集农杆菌菌体，尽去上清，用1/10WCC重悬 液(即MS基本培养基)以1：2比例重悬。将小麦幼胚转移至农杆菌菌液中侵染 30min，将愈伤组织转移至灭菌培养皿中的无菌滤纸上，25℃黑暗条件下共培养 2d(幼胚)。
共培养2d的幼胚愈伤组织转移到IESX1筛选培养基(MS基本培养基(含MS 维生素)+30gL-1蔗糖+2.0mg L-1麦草畏dicamba+250mg L-1羧苄青霉素Cb+5mg L-1草丁膦PPT，pH5.8)，25℃黑暗培养2周，然后转移到IESX2筛选培养基(MS基 本培养基(含MS维生素)+30gL-1蔗糖+2.0mg L-1麦草畏dicamba+250mg L-1羧苄青 霉素Cb+10mg L-1草丁膦PPT，pH 5.8)，25℃黑暗培养2-3周。
1.3.抗性再生植株的筛选
筛选后的幼胚愈伤组织转移到IEFH培养基(MS基本培养基(含MS维生 素)+20g L-1蔗糖+0.2mg L-1 2,4-D+250mg L-1Cb+5mg L-1PPT，pH＝5.8)，25℃、 光照培养3～4周。其中MS维生素购自Sigma。
筛选后的成熟胚愈伤组织转移到XCFH分化培养基(MS基本培养基(不含MS 维生素)+20g L-1蔗糖+10.0mg L-1B1维生素+1.0mg L-1B3维生素+1.0mg L-1B6维 生素+2.0mgL-1甘氨酸+5.0mg L-1谷氨酰胺+0.2mg L-1IAA+250mg L-1Cb+5mg L-1 PPT，pH 5.8)上，25℃光照培养3～4周，分化植株。
将长至2～3cm的幼苗移至生根壮苗培养基(1/2MS培养基(含MS维生素)+20g L-1蔗糖+250mg L-1Cb+5mg L-1PPT，pH 5.8)上，25℃、光照条件下培养3～4周。 移栽生长健壮的抗性植株到花盆中。
其中，使用的农杆菌为农杆菌EHA105。MS基本培养基成分为：4.4g/L MS， 30g/L蔗糖，pH 5.8，其中MS培养基购于sigma公司。
转基因小麦的PCR检测
利用阳性鉴定的PCR引物(pDE1005–FP： ATGACAGTTCCACGGCAGTAGATA(SEQ ID NO:9)和intron-RP： TTTCTTGGTTAGGACCCTTTTCTCTT(SEQ ID NO:10))对目的基因进行检测。结果表明，利用所设计的PCR特异引物，能扩增出特异DNA片段。而以非转化 小麦基因组DNA为模板时，没有扩增出任何片段。
本实施例将所述的植物表达载体转化根癌农杆菌，分别获得用于转化小麦的含V-ATPase subunit E、COO2以及V-ATPase subunit E+COO2基因植物过量表达载体 的根癌农杆菌菌株，利用所构建的根癌农杆菌菌株转化小麦幼胚，获得经PCR检 测的转基因小麦植株。
其中，使用的根癌农杆菌为根癌农杆菌EHA105，感受态细胞买自上海唯地生 物技术有限公司。
实施例4V-ATPase subunit E、COO2以及V-ATPase subunit E+COO2双基因 RNAi载体T1代小麦进行抗蚜虫性鉴定。
将同一虫龄的麦蚜分别接于待测转基因植株和3株野生型小麦展开的嫩叶上， 每株接10头，培养10天后，统计叶片上蚜虫数量。结果如表1-3所示，与野生型 对照相比，V-ATPase subunit E、COO2以及V-ATPase subunit E+COO2双基因RNAi 转基因小麦植株获得了显著提高的抗蚜性。
V-ATPase subunit E，COO2以及V-ATPase subunit E+COO2双基因RNAi转基 因小麦植株抗虫效果比较，V-ATPase subunit E+COO2双基因RNAi转基因小麦植 株抗虫效果最佳。
表1 V-ATPase subunit E转基因小麦对蚜虫的抗性鉴定
表2 COO2转基因小麦对蚜虫的抗性鉴定
表3 V-ATPase subunit E+COO2双基因转基因小麦对蚜虫的抗性鉴定
结果显示，五个转V-ATPase subunit E和COO2双基因RNAi载体T1代小麦 植株上蚜虫数量显著低于野生型对照，并且与V-ATPase subunit E和COO2RNAi 载体T1代小麦植株抗虫效果相比，效果更佳。
上述具体实施可由本领域技术人员在不背离本发明原理和宗旨的前提下以不 同的方式对其进行局部调整，本发明的保护范围以权利要求书为准且不由上述具体 实施所限，在其范围内的各个实现方案均受本发明之约束。
序列表
<110> 上海交通大学
<120> 一种核苷酸序列及其在增强植物抗有害生物能力中的应用
<150> CN201711082638.4
<151> 2017-11-07
<160> 10
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 622
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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t 1621
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<400> 9
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
tttcttggtt aggacccttt tctctt 26

Claims (10)

1.一种核苷酸序列，其特征在于，所述核苷酸序列选自如下序列：
1)SEQ ID NO:4-6中任一项所示的核苷酸序列；
2)SEQ ID NO:4-6中任一项所示的核苷酸序列通过一个或几个核苷酸的取代、缺失、插入或添加衍生产生的核苷酸序列；
3)包含与SEQ ID NO:4-6中任一项具有至少80％以上同源性的核苷酸序列。
2.一种双链RNA，其特征在于，由如权利要求1所述的核苷酸序列和其反向互补序列组成。
3.含有如权利要求1所述的核苷酸序列或如权利要求2所述的双链RNA分子的重组表达载体。
4.如权利要求3所述的重组表达载体，其特征在于，还包括能在植物中转录的启动子。
5.如权利要求1所述的核苷酸序列或如权利要求2所述的双链RNA在增强植物抗有害生物能力中的应用。
6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述有害生物为蚜虫。
7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述蚜虫为桃蚜(Myzus persicae)、豆长管蚜(Acyrthosiphon pisum)、麦双尾蚜(Diuraphis noxia)、高粱蚜(Melanaphissacchari)、黄伪毛蚜(Sipha flava)和棉蚜(Aphis gossypii)中的一种或多种。
8.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述植物为双子叶植物、单子叶植物或裸子植物；可选地，所述植物为拟南芥、水稻、小麦、玉米、棉花、大豆、油菜、高粱、烟草、菊花、青菜、白菜、萝卜或番茄。
9.如权利要求5所述的应用，其特征在于，包括如下步骤：
1)构建含有如权利要求1所述的核苷酸序列或如权利要求2所述的双链RNA分子的重组表达载体；
2)将所述重组表达载体转入农杆菌，利用所述农杆菌侵染植物幼胚；
3)通过抗生素筛选得到抗性植物幼苗。
10.一种双基因融合增强植物抗蚜性的方法，其特征在于，用V-ATPase subunit E基因、COO2基因以及V-ATPase subunit E基因和COO2基因部分序列融合片段分别构建得到具有抗蚜虫功能的基因，通过构建表达载体并将其分别转入农杆菌，以该农杆菌侵染小麦幼胚，分别在小麦中表达产生V-ATPase subunit E、COO2基因以及V-ATPase subunit E和COO2双基因的dsRNA，从而达到趋避蚜虫的目的；可选地，所述的表达载体，通过构建玉米ubiquitin-1启动子驱动V-ATPase subunit E，COO2基因以及V-ATPase subunit E基因和COO2融合基因沉默载体，即RNAi载体；可选地，所述的ubiquitin-1启动子具体为：组成型启动子；可选地，所述的侵染，即将小麦幼胚转移至农杆菌菌液中侵染后置于黑暗条件下的培养基上培养得到幼胚愈伤组织，进而经抗性再生植株筛选后得到小麦抗性苗；可选地，所述的抗蚜性包括：1)在防治蚜虫中的应用或在制备防治蚜虫产品中的应用；2)在促进蚜虫死亡中的应用或在制备促进蚜虫死亡产品中的应用；3)在抑制蚜虫生长中的应用或在制备抑制蚜虫生长产品中的应用。
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