CN104480085B

CN104480085B - VdUDG基因及其在降低大丽轮枝菌致病性中的应用

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Publication number: CN104480085B
Application number: CN201410765421.3A
Authority: CN
Inventors: 高峰; 张燕玲; 张婷
Original assignee: Shihezi University
Current assignee: Shihezi University
Priority date: 2014-12-11
Filing date: 2014-12-11
Publication date: 2017-02-22
Anticipated expiration: 2034-12-11
Also published as: CN104480085A

Abstract

本发明公开了一种VdUDG基因及其在降低大丽轮枝菌致病性中的应用。本发明公开一种蛋白，为如下(1)或(2)所示：(1)SEQ ID No.15所示的蛋白；(2)将SEQ ID No.15所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且功能相同的蛋白质。本发明证明，VdUDG基因是微菌核形成过程中的必要因子，VdUDG基因在大丽轮枝菌致病、微菌核形成和产孢过程中起重要作用。本发明推动了棉花黄萎菌的致病机理的研究，最终为开发黄萎病的防治新策略提供理论依据。

Description

VdUDG基因及其在降低大丽轮枝菌致病性中的应用

技术领域

本发明涉及一种VdUDG基因及其在降低大丽轮枝菌致病性中的应用，属于生物技术领域。

背景技术

棉花黄萎病是一种土传的维管束系统病害，是由大丽轮枝菌引起的，其对棉花的生产造成了严重的危害。自1935年，棉花黄萎病随着棉花种子的引进，而传入我国，随后便开始逐渐蔓延全国。尤其从20世纪90年代以后，棉花黄萎病在我国扩展蔓延极为迅速，其中1993年棉花黄萎病最为严重，发病面积达266.67万hm2，随后在1995、1996、1999、2000、2002、2003年全国范围内连续爆发，损失十分严重，棉花黄萎病已对我国棉花生产以及可持续发展构成极大威胁。

棉花黄萎病是由半知菌亚门(Deutermycotina)淡色菌科(Mmonilaceae)轮枝菌属(Verticillium)真菌引起，属内有若干个种，其中危害棉花的有大丽轮枝菌(V.dahliae)、黑白轮枝菌(V.albo-atum)两个种。我国棉花黄萎病主要是由大丽轮枝菌引起的。大丽轮枝菌没有寄主专化性，可以危害多种植物，从一年生的草本植物到多年生的木本植物。大丽轮枝菌可以形成一种叫做黑色微菌核的休眠结构，可以在缺乏寄主的土壤中存活长达数年。

大丽轮枝菌主要以分生孢子、菌丝体和黑色微菌核越冬，微菌核作为其最主要的初侵染来源，在受到植物根部分泌物的刺激时便会萌发。菌丝一般从植物根部侵入，随着植物的蒸腾作用向植物的茎叶中扩展、定植，最终侵染整个植株。一般被大丽轮枝菌侵染过得植株都会表现出萎蔫，干枯，叶脉失色，坏死等症状，维管束变褐是黄萎病最典型的症状。

田黎等的研究认为棉花黄萎病的发生发展与土壤中微菌核的数量密切相关。大丽轮枝菌微菌核的多少通常与其致病力和抗逆性有关。有研究显示，土壤里面棉花黄萎菌微菌核一旦达到0.03个/g，就会导致棉花出现萎蔫症状，当土壤中微菌核含量达到0.3个/g～1.0个/g时，就会有20％～50％的棉花植株发病，当土壤中微菌核含量达到3.5个/g以上，棉花植株都会发病。另有研究表明，0.5个/g土为引起棉花发病的临界值。在田里面，当黄萎菌侵染莴苣后，土壤中的微菌核数量为至少50个/g，而病害很重的田块，微菌核数目高达2400个/g。

USER(Uracil Specific Excision Reagent)克隆使多片段直接克隆到载体上成为可能。USER体系依赖于USER酶，是一种尿嘧啶特异性切割酶，USER酶主要是靠尿嘧啶DNA糖基化酶(UDG)和核酸内切酶VII(DNA糖基化酶-裂解酶)共同起作用。经过USER酶处理过的载体正好3’端正好有一个缺口，与用In-Fusion克隆得到的PCR产物正好匹配，便会组装成一个重组分子。相对In-Fusion方法，USER克隆整合效率要高很多，大概为80％(In-Fusion整合效率为10-20％)。

棉花是目前世界上种植面积最大的工业原料作物，在我国是仅次于粮食的第二大农作物。棉花黄萎病是目前我国棉花生产过程中最具毁灭性的真菌病害。由于至今尚未研制出效果显著的防治药剂和抗病品种，被称为棉花的“癌症”，因此如何控制黄萎病的猖獗危害，已成为棉花生产可持续发展的关键问题。在这种情况下，研究大丽轮枝菌的致病机理,了解大丽轮枝菌与寄主的互作机理就显得更为重要。

发明内容

本发明的目的是提供一种VdUDG基因及其在降低大丽轮枝菌致病性中的应用。

本发明提供一种蛋白，为如下(1)或(2)所示：

(1)SEQ ID No.15所示的蛋白；

(2)将SEQ ID No.15所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且功能相同的蛋白质。

上述蛋白的编码基因也属于本发明的保护范围。

上述编码基因中，所述编码基因为如下中至少一种：

1)SEQ ID No.14所示的DNA分子；

2)在严格条件下与1)限定的DNA分子杂交且编码所述蛋白质的DNA分子；

3)与1)或2)限定的DNA分子具有90％以上的同一性且编码所述蛋白质的DNA分子。

含有上述任一所述编码基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌也属于本发明的保护范围。

一种防治大丽轮枝菌导致的植物黄萎病的方法也属于本发明的保护范围，是将大丽轮枝菌的VdUDG蛋白的编码基因突变；

所述VdUDG蛋白为上述蛋白；

所述植物具体为棉花。

一种降低大丽轮枝菌致植物黄萎病能力或大丽轮枝菌微菌核形成能力的方法也属于本发明的保护范围，是将VdUDG蛋白的编码基因突变；

所述VdUDG蛋白为上述蛋白。

一种提高大丽轮枝菌产孢能力的方法也属于本发明的保护范围，是将VdUDG蛋白的编码基因突变；

所述VdUDG蛋白为上述蛋白。

上述任一所述的方法中，所述突变为敲除突变或插入突变。

上述蛋白、上述任一所述的编码基因在防治大丽轮枝菌导致的植物黄萎病中的应用也属于本发明的保护范围；

或，

上述蛋白、上述任一所述的编码基因在开发或筛选防治大丽轮枝菌导致的植物黄萎病的产品中的应用也属于本发明的保护范围；

所述产品能抑制上述蛋白的表达。

所述植物具体为棉花。

上述蛋白、上述任一所述的编码基因在降低大丽轮枝菌致植物黄萎病能力或大丽轮枝菌微菌核形成能力中的应用也属于本发明的保护范围；

所述植物具体为棉花。

或，

上述蛋白、上述任一所述的编码基因在提高大丽轮枝菌产孢能力中的应用也属于本发明的保护范围。

本发明证明VdUDG基因敲除的大丽轮枝菌即使在极端营养缺陷型培养基上也不产生黑色微菌核，但白色气生菌丝生长旺盛，产孢高于野生型大丽轮枝菌，并且与野生型大丽轮枝菌相比，对棉花的致病性下降。

进一步实验结果显示,VdUDG基因的突变导致微菌核形成过程中的重要阶段,泡囊形成受阻,从而造成大丽轮枝菌完全丧失微菌核的形成功能。通过对VdUDG的表达分析可以看出,该基因在微菌核中高表达,在孢子中表达量较少而在菌丝中不表达，进一步暗示了VdUDG基因在微菌核形成过程中发挥了至关重要的作用.

通过进一步构建互补载体VdUDG::pSULPH-mut-RG#PB，通过根癌农杆菌介导的遗传转化(ATMT)方法整合到VdUDG基因敲除突变体Vdudg中，成功的获得了互补转化子。经过培养性状观察，结果显示互补转化子与敲除突变体相比，气生菌丝不是很发达，产生了大量的黑色微菌核。这说明VdUDG基因在微菌核形成过程中确实发挥了至关重要的作用。

本发明证明，VdUDG基因是微菌核形成过程中的必要因子，VdUDG基因在大丽轮枝菌致病、微菌核形成和产孢过程中起重要作用。本发明推动了棉花黄萎菌的致病机理的研究，最终为开发黄萎病的防治新策略提供理论依据。

附图说明

图1为敲除载体PRF-HU2质粒示意图。

图2为互补载体双元质粒载体pSULPH-mut-RG#PB示意图。

图3为敲除载体的构建策略图。

图4为敲除突变体的验证。

图5为VdUDG基因在野生型V592各组织中的表达分析。

图6为敲除突变体生物学性状观察结果。

图7为敲除突变体在洋葱表皮上侵入过程。

图8为敲除突变体的致病性检测。

图9为Vdudg全长基因的琼脂糖凝胶电泳检测。

图10为互补转化子和敲除突变体的表型检测。

图11为T-DNA插入突变体菌株的表型及其致病性鉴定结果。

图12为插入突变体中T-DNA插入拷贝数分析。

图13为插入突变体d137中T-DNA在基因组中的插入位置分析。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

棉花黄萎病菌株大丽轮枝菌(V.dahliae)野生型菌株V592在文献“彭姗，吕学莲，高峰等.一种新的棉花黄、枯萎病快速接种方法的研究[J].棉花学报，2008，20(3):174～178.”中公开过，公众可从石河子大学获得。

pMD18-T为Takara产品。

敲除载体pRF-HU2在文献“Ronnie de Jonge，H.Peter van Esse，KarunakaranMaruthachalam，et al.Tomato immune receptor Ve1recognizes effector of multiplefungal pathogens uncovered by genome and RNA sequencing[J].PNAS,2012,4(27):5110～5115.”中公开过，公众可从石河子大学获得，该载体上有任何真菌生物基因组中没有的两个酶切位点PacI和Nt.BbvCI，还含有真菌选择性标记—潮霉素标记和细菌选择性标记—卡那霉素(Kan)标记，该载体的示意图如图1所示。

互补载体双元质粒载体pSULPH-mut-RG#PB的序列如SEQ ID No.1所示，该载体含氯嘧磺隆抗性基因和真菌的表达启动子ToxA和终止子NOS ter，且为卡那霉素抗性，该载体的示意图如图2所示。

根癌农杆菌EHA105在文献“Gao，Bang-Jun Zhou，Guo-Ying Li，et al.A GlutamicAcid-Rich Protein Identified in Verticillium dahliae from an InsertionalMutagenesis Affects icrosclerotial Formation and Pathogenicity[J].PLos One,2010,12(5).”中公开过，公众可从石河子大学获得。

抗生素溶液的配制：

①潮霉素(Hyg，罗氏公司)工作浓度为100μg/mL，头孢霉素(Cef)工作浓度为300μg/mL，卡那霉素(Kan)工作浓度为50μg/mL，利福平(Rif)工作浓度为10μg/mL；

②乙酰丁香酮(AS，10mM)10mL：称取19.62mg乙酰丁香酮，用10mL蒸馏水溶解，大约要搅拌一小时，全部溶解以后，用5M KOH调节pH到8，过滤灭菌以后保存到-20℃。

③2-N-玛琳乙磺酸(MES，1M)100mL：称取19.52g MES用80mL蒸馏水溶解完全以后，用5M KOH调节pH到5.3，然后定容至100mL并用过滤器过滤灭菌最后-20℃保存。

10％的甘油(v/v)100mL：10mL纯甘油，90mL蒸馏水混匀。

20％甘油(v/v)100mL：20mL纯甘油，80mL蒸馏水混匀。

50mM的L-天冬酰胺1L：溶解6.6g L-天冬酰胺到1L蒸馏水中，过滤灭菌。

200×Trace solution for Vogels salts，1L:5g柠檬酸，5g ZnSO₄·7H₂O，1g Fe(NH₄)₂(SO₄)₂·6H₂O，0.25g CuSO₄·5H₂O，0.05g MgSO₄·H₂O，0.05g H₃BO₃，0.05g Na₂MoO₄·2H₂O，1000mL蒸馏水，过滤灭菌。

50×Vogels salts，1L：125g C₆H₉Na₃O₉，250g KH₂PO₄，9.3g MgSO₄·6H₂O，5gCaCl₂·2H₂O，5mL 200×Trace solution 1000mL蒸馏水，过滤灭菌。

1,000×Trace elements for DFM medium，1L：40mg Na₂B₄O₇·10H₂O，400mgCuSO₄·5H₂O，1.2g FeSO₄·7H₂O，700mg MnSO₄·H₂O，800mg Na₂MoO₄·2H₂O，10g ZnSO ₄·7H₂O，1000mL蒸馏水，过滤灭菌。

2.5×Salt solution 1L：3.625g KH₂PO₄，5.125g K₂HPO₄，0.375g NaCl，1.160gMgSO₄·6H₂O，0.165g CaCl₂·2H₂O，0.0062g FeSO₄·7H₂O，1.250g(NH₄)₂SO₄，1,000mL蒸馏水，过滤灭菌。称取以上物质需称取一个溶解一个避免形成不溶物。

RA培养基1L：50g丁二酸钠(C₄H₄O₄Na₂·6H₂O)，12.1g NaNO₃，20mL 50×Vogelssalts(–N,–C)，950mL蒸馏水，高压灭菌，在用之前加上50mL灭过菌的20g/100ml的葡萄糖水溶液。

水琼脂IMAS培养基300mL：将6g琼脂粉和146mL蒸馏水混合在300mL瓶子里，高压灭菌保存。用的时候微波炉融化后加入IMAS培养基的其他成分。

IMAS固体培养基300mL：120.0mL 2.5×Salt solution(60℃预热),7mL20g/100ml的葡萄糖水溶液，7.5mL 20％甘油(v/v)混合到融化的水琼脂IMAS中(最终琼脂粉的浓度为2g/100ml).待混合液冷却至55℃加入12.0mL MES(1M)，6.0mL乙酰丁香酮(10mM)。

IMAS液体培养基的配制152.5mL：120.0mL 2.5×Salt solution(60℃预热),7mL20g/100ml的葡萄糖水溶液，7.5mL 20％甘油(v/v),12.0mL MES(1M)，6.0mL乙酰丁香酮(10mM)。

水琼脂DFM培养基500mL：将10g琼脂粉和358mL蒸馏水混合在500mL瓶子中，高压灭菌保存。用的时候微波炉融化后加入DFM培养基的其他成分。

DFM固体培养基500mL：31.25mL 20g/100ml的葡萄糖水溶液，100.0mL 50mM L-天冬酰胺(60℃预热)，5.0mL 210mM MgSO4，5.0mL 1.12M KH2PO4+0.7M KCL(pH 6)，0.5mL 1,000×Trace elements混合到融化的水琼脂DFM中(琼脂的终浓度为2g/100ml).待冷却到55℃加入所要求的抗生素。

供试棉花品种108夫(Gossypium hirsutum L.)在文献“彭姗，吕学莲，高峰等.一种新的棉花黄、枯萎病快速接种方法的研究[J].棉花学报，2008，20(3):174～178.”中公开过，公众可从石河子大学获得，该品种棉花为高感黄萎病棉花品种。

1％水琼脂培养基100mL:将1g的琼脂粉和99mL的蒸馏水混匀在200mL的三角瓶中，高压灭菌保存。

实施例1、农杆菌pRF-HU2::Dgene的制备

一、质粒的线性化

PacI和Nt.BbvCI双酶切pRF-HU2得到载体pRF-HU2的两个线性化片段。

二、敲除同源臂的获得

(一)引物设计和合成

设计和合成如表1所示的引物。

表1引物序列

(二)PCR扩增

以棉花黄萎病菌株大丽轮枝菌(V.dahliae)野生型菌株V592的基因组DNA为模板，VdUDGup-s和VdUDGup-a为引物进行PCR扩增，得到PCR扩增产物，将其命名为左同源臂片段；

以棉花黄萎病菌株大丽轮枝菌(V.dahliae)野生型菌株V592的基因组DNA为模板，VdUDGdown-s和VdUDGdown-a为引物进行PCR扩增，得到PCR扩增产物，将其命名为右同源臂片段。

三、USER克隆

将左同源臂片段和右同源臂片段与步骤一得到的线性化的载体pRF-HU2连接，其中USER enzyme mix为NEB公司产品，体系如表2所示。

表2 USER克隆体系

将表2的体系于37℃孵育20min，25℃孵育20min，获得重组质粒，将重组质粒送测序，结果正确，左同源臂片段和右同源臂片段分别插入了pRF-HU2的LB和RB位点。

四、将步骤三得到的重组质粒转化根癌农杆菌EHA105，得到重组农杆菌，将其命名为农杆菌pRF-HU2::Dgene。

实施例2、大丽轮枝菌VdUDG敲除突变体的功能验证

敲除载体的构建策略图如图3所示。

一、大丽轮枝菌分生孢子的获得

首先，将培养好的棉花黄萎菌野生型菌株V592打菌饼若干，并接种于含有250mLRA培养基的1L三角瓶中于200r·min^-1、26℃水平摇床上摇培5d，用灭过菌的微孔滤布过滤培养物至无菌的50mL离心管中；14000Xg、4℃离心40min；弃上清；用10mLddH₂0重新悬浮，14000Xg、4℃离心40min；弃上清；用5mL ddH₂0重新悬浮；使用光学显微镜和血球计数板测定孢子浓度；然后14000Xg，8℃离心30min后；再用10％的甘油重新悬浮沉淀的孢子，最终得到的孢子浓度为1×10⁸cfu·mL^-1；孢子以每份1mL-80℃保存，可保存1年，待用时用IMAS液体培养基将分生孢子浓度调至1×10⁷cfu·mL^-1。

二、重组农杆菌的培养

将农杆菌pRF-HU2::Dgene单菌落接种于含有50μg/mL Kan(卡那霉素)和10μg/mLRif(利福平)的10mL LB液体培养基的50mL三角瓶中，28℃、100r·min^-1培养1-2d；将培养后的100μL农杆菌pRF-HU2::D gene接种于10mL含有50μg/mL Kan的IMAS液体培养基的50mL锥形瓶中，28℃、100r·min^-1摇培至OD₆₀₀达到0.5-0.7(一般到第二天即可)。

三、将步骤二培养的重组农杆菌pRF-HU2::Dgene与步骤一调好浓度的分生孢子悬浮液等体积混合均匀后，得到混合液，吸取200μl混合液并使用涂布器将其均匀的涂布于铺有NC膜的IMAS固体培养基上，然后26℃，黑暗条件下，培养36小时，然后在无菌条件下将NC膜从IMAS固体培养基上转移到DFM(含有潮霉素150mg/mL，头孢霉素300mg/mL)固体培养基上培养6-8天待长出转化子，再将转化子转移至PDA(含有潮霉素150mg/mL，头孢霉素300mg/mL)培养基中，挑选4个转化子分别命名为Vdudg-1、Vdudg-2、Vdudg-3、Vdudg-4，其表型如图4中A所示。

四、敲除突变体的验证

(一)DNA水平的检测

分别以步骤三得到的转化子(Vdudg-1、Vdudg-2、Vdudg-3、Vdudg-4)的基因组DNA为模板，以基因内部引物VdUDG-knockout-s和VdUDG-knockout-a为引物，进行PCR扩增，检测转化子的VdUDG基因是否被敲除；同时以步骤三得到的转化子的基因组DNA为模板，用载体中引入的同源臂两侧紧挨潮霉素边界引物VdUDGup-a和VdUDGup-s为引物，进行PCR扩增，检测VdUDG基因是否被潮霉素基因盒取代。分别以水和野生型菌株V592的基因组DNA为模板，进行上述实验，其中水为阴性对照。

以基因内部引物VdUDG-knockout-s和VdUDG-knockout-a为引物进行PCR扩增的结果如图4中B所示。

以VdUDGup-a和VdUDGup-s为引物进行PCR扩增的结果如图4中D所示。

图4B和4D中，泳道1为阴性对照，泳道2为野生型菌株V592，泳道3至6分别为4株敲除突变体菌株(Vdudg-1、Vdudg-2、Vdudg-3、Vdudg-4)。

结果表明,敲除突变体(Vdudg-1、Vdudg-2、Vdudg-3、Vdudg-4)中均可以扩增到2.5kb左右的片段，即潮霉素加启动子的大小，没有VdUDG基因的目的扩增片段；而野生型菌株V592中只能扩增到约1.2kb大小的条带，即VdUDG基因的目的扩增片段,此结果说明敲除突变体(Vdudg-1、Vdudg-2、Vdudg-3、Vdudg-4)中VdUDG基因确实被潮霉素片段发生双交换代替。

(二)RNA水平的检测

提取步骤三得到的转化子的RNA，并反转录为cDNA，以其为模板，以VdUDGrt-s和VdUDGrt-a为引物，进行半定量RT-PCR，同时以Actin作为内参基因，引物为Actin-F和Actin-R。

结果如图4中C所示。

图4C中，泳道1为阴性对照，泳道2为野生型菌株V592，泳道3至6分别为4株敲除突变体菌株(Vdudg-1、Vdudg-2、Vdudg-3、Vdudg-4)。

结果表明，在4株敲除突变体(Vdudg-1、Vdudg-2、Vdudg-3、Vdudg-4)中均不能检测到VdUDG基因的表达。

五、目标基因VdUDG在野生型V592中的表达分析

分别提取野生型菌株V592的菌核、菌丝、孢子和菌丝+孢子的的RNA，并反转录为cDNA，分别以其为模板，以VdUDGrt-s和VdUDGrt-a为引物，进行半定量RT-PCR，同时以Actin作为内参基因，引物为Actin-F和Actin-R。

结果如图5所示。

图5表明，VdUDG基因在野生型菌株V592微菌核中的转录水平明显高于在分生孢子中的转录水平，在菌丝中没有检测到VdUDG基因的表达。表明该基因在大丽轮枝菌野生型菌株V592中的表达具有组织特异性。

六、敲除突变体生物学性状的观察

首先将筛选并验证过的敲除突变体(Vdudg)移植到普通PDA培养基上，26℃培养10天，然后分别对各菌株进行下述生物学特性的观察和测定，以野生型菌株V592为对照。

(一)培养性状观察

用打孔器在菌株菌落边缘打取直径为1cm的菌饼，将菌饼接种于PDA培养基平板中央，26℃暗培养10天，根据突变菌株的菌落形态和黑色微菌核的多少等特征对突变菌株进行表型类型分类，分类标准参考文献“彭姗，吕学莲，高峰等.一种新的棉花黄、枯萎病快速接种方法的研究[J].棉花学报，2008，20(3):174～178.”

结果如图6中A所示。

图6A表明，与野生型菌株V592相比，敲除突变体(Vdudg)中部菌丝质地致密，菌丝白色,生长旺盛，培养10天仍然不产生黑色微菌核，敲除突变体表型属于菌丝型。

(二)菌落生长速度测定

用打孔器在菌株菌落边缘打取直径为1cm的菌饼，将菌饼接种于PDA培养基平板中央，26℃暗培养，用十字交叉法测量各菌株的菌落直径，从第三天到第十三天每二天测量一次菌落直径，共测6次，每个菌株设三个重复，每种菌株每次的菌落直径是其三个重复的平均值，菌落生长速度＝(第十三天直径-第三天直径)÷10。

菌落生长速度测定结果显示：

A.在普通PDA培养基平板上，V592菌株的生长速度为3.667mm·d^-1，Vdudg菌株的为3.8mm·d^-1，与V592菌株差异不显著。

B.V592菌株在第13天时的菌落直径为49mm，Vdudg菌株的为52.33mm，与V592菌株差异不显著。

(三)产孢量测定

用打孔器在菌株菌落边缘打取10个直径为1cm的菌饼，将菌饼接种于察氏液体培养基中，26℃，200r·min^-1，摇培5天，要用无菌的微孔滤布过滤培养物至无菌的离心管中；用250mL超纯水洗锥形瓶并用微孔滤布过滤至新的无菌离心管中；将收集的孢子1200rpm、4℃离心30分钟，弃上清；用10ml超纯水重新悬浮，转移至无菌离心管并按上面的方法离心孢子，弃上清；此时完成孢子收集。用无菌水将收集的分生孢子浓度调至1×10⁶cfu·mL^-1，然后准确吸取1mL孢子悬浮液，接种至装有100mL察氏液体培养基的150mL的三角瓶中，26℃，200r·min^-1，暗培养。在显微镜下用血球计数板测量孢子浓度，从第二天到第九天每24h测量1次孢子浓度，共测8次，每个菌株设三个重复，每种菌株每次的孢子浓度是其三个重复的平均值。

结果如图6中C所示。

产孢量测定结果显示，从第二天开始，敲除突变体的产孢量就明显高于野生型菌株V592，这表明VdUDG基因参与了分生孢子的形成。

(四)孢子和菌丝形态观察

孢子形态观察：收集同一时期相同培养条件下敲除突变体和野生型菌株V592的孢子在显微镜下观察，以野生型菌株为对照，观察敲除突变体孢子与其之间的差异。

孢子形态观察结果：敲除突变体孢子形态多为椭圆形，大多数里面有油滴，与野生型菌株V592相比没有差异。

菌丝形态观察：采用小室培养的方法(载玻片培养法)，对菌株菌丝的形态进行观察，即取直径为90mm的滤纸，铺在直径为90mm的培养皿底部，放一U形玻璃棒与滤纸上，其上放一个洁净的载玻片，盖好培养皿后灭菌。吸取10mL加热融化的PDA培养基，倒入另一灭过菌的培养皿。待凝固成薄层后，用无菌解剖刀将其切成1cm²大小的菌块，并将其移植到已准备好的载玻片中央，用接种针将待观察菌株接种在琼脂边缘，然后盖上盖玻片。以防琼脂干燥，可向培养皿中加入无菌水适量，放置培养箱中，26℃，暗培养48小时候在显微镜下观察菌丝形态。

菌丝形态观察结果如图6中D的普通培养基(PDA培养基)所示，在普通PDA上培养相同时间，敲除突变体与野生型菌株的菌丝形态没有差异。

(五)微菌核诱导形成实验

按照上述步骤(三)中产孢量测定中的方法收集孢子，将其浓度分别调至1×10⁷cfu·mL^-1,均匀涂布于铺有NC膜的PDA平板(铺有NC膜的PDA为极端营养缺陷型培养基)上,26℃培养10天观察微菌核的形成情况并且观察菌丝。

微菌核诱导形成结果如图6中B所示。

图6B表明，在极端营养缺陷型培养基上，野生型菌株V592产生了大量黑色微菌核，而敲除突变体Vdudg不形成微菌核，且菌丝生长旺盛，结果表明VdUDG基因与微菌核的形成有关。

菌丝的观察结果如图6中D的诱导培养基所示，结果表明在营养缺陷型培养基上，野生型菌株V592和敲除突变体Vdudg菌丝形态差异较大，在营养缺陷型培养基上野生型V592菌株的菌丝可形成囊泡(箭头标记)，而敲除突变体Vdudg则没有观察到有囊泡的形成。

(六)敲除突变体在洋葱表皮上侵入过程的观察

取1cm²大小的洋葱内表皮光面向上贴于1.0％水琼脂培养基平板上，每个皿3-5块。按照上述步骤(三)中产孢量测定中的方法收集孢子，用0.025％的Tween20调至5×10⁴个孢子/mL均匀密集喷洒到洋葱表皮上面，26℃暗培养，分别于2、4、8、12、24、36、48h取样，在显微镜下观察孢子萌发与菌丝侵入情况。

分别在12、20、24h取样观察分生孢子在洋葱表皮上的萌发、菌丝扩展情况，结果如图7所示。

图7表明，野生型菌株V592与敲除突变体Vdudg的孢子萌发并没有明显差异，但在后期菌丝扩展情况可以看出，敲除突变体Vdudg的菌丝只是纵向延伸，而野生型菌株V592则形成膨大菌丝，且野生型菌株V592与敲除突变体Vdudg在整个孢子萌发菌丝扩展过程中，始终没有观察到侵染钉、附着孢的形成。

(七)致病性测定

敲除突变体Vdudg的致病性测定按照文献“彭姗，吕学莲，高峰等.一种新的棉花黄、枯萎病快速接种方法的研究[J].棉花学报，2008，20(3):174～178.”的方法，mock为无菌水。

结果如图8所示。

结果表明，在接种2个星期后,接种野生型菌株V592的棉花叶片开始出现萎蔫、焦枯，大约接种4个星期后接种野生型菌株V592的棉花萎蔫枯死，而接种敲除突变体Vdudg的植株生长旺盛，表明VdUDG基因是大丽轮枝菌菌株V592致病的一个关键因子。

实施例3、互补突变体的表型

一、互补载体的构建

(一)以野生型菌株V592的基因组DNA为模板，VdUDG-s和VdUDG-a为引物进行PCR扩增，得到PCR扩增产物，即Vdudg全长基因，从起始密码子ATG到终止密码子GAG，大小为1243bp。以水为模板，进行上述实验，作为阴性对照。

该PCR扩增片段的琼脂糖凝胶电泳如图9所示。

图9中，M:marker2000；1：Vdudg全长基因；2：阴性对照。

(二)SmaI和XmaI双酶切PCR扩增产物，得到目的基因片段；SmaI和XmaI双酶切pSULPH-mut-RG#PB，得到载体大片段；将基因片段与载体大片段连接，得到重组质粒，将其命名为VdUDG::pSULPH-mut-RG#PB。将VdUDG::pSULPH-mut-RG#PB送测序，结果正确。

VdUDG::pSULPH-mut-RG#PB质粒上自5’末端起第12623bp至第13866bp位为VdUDG的全基因序列，该基因位于ToxA启动子和其终止子之间。

VdUDG的全基因序列如SEQ ID No.14所示，VdUDG蛋白序列如SEQ ID No.15所示。

二、互补突变体的获得及表型鉴定

将构建好的互补载体VdUDG::pSULPH-mut-RG#PB电击转化导入农杆菌EHA105，通过ATMT导入敲除突变体Vdudg，经过共培养，初步得到了互补转化子。将互补转化子和敲除突变体Vdudg在PDA固体培养基上进行培养，进行表型观察，结果如图10所示。

图10表明，与敲除突变体相比，互补转化子的气生菌丝没那么旺盛，且产生大量的微菌核，与野生型菌株V592的表型基本一致。

实施例4、大丽轮枝菌致病性减弱突变体的获得以及突变体中T-DNA插入位点的确定

一、构建大丽轮枝菌V592的突变体库

大丽轮枝菌V592的突变体库构建方法参考文献“贾培松，丁丽丽，高峰等.棉花黄萎病菌T-DNA插入突变体库的构建及其表型分析[J].棉花学报，2012,24(1)：62～70.”。

二、突变体菌株的表型及其致病性鉴定

从大丽轮枝菌V592的突变体库中随机挑突变体菌株若干，在普通PDA培养基上活化培养，26℃暗培养10天，接着使用室内水培棉花品种108夫，孢子悬浮液浸根接种法测定各黄萎菌株的致病性水平。棉花播种、接种、病情指数计算参考文献“彭姗，吕学莲，高峰等.一种新的棉花黄、枯萎病快速接种方法的研究[J].棉花学报，2008，20(3):174～178.”。

实验中以接种野生型菌株V592孢子悬浮液为阳性对照、阴性对照(CK)则接种无菌水。

(一)棉苗的接种

将野生型菌株V592和步骤二挑选的T-DNA插入突变体菌株在普通PDA培养基上，26℃培养10天，然后在菌落边缘取10个直径为1cm的菌饼接种于装有100mL查氏液体培养基(含Kan)的100mL三角瓶中，于26℃，200r·min^-1振荡培养3天，用4层纱布将分生孢子过滤至50mL离心管，然后4000r·min^-1离心10min收集孢子，倒掉上清，用蒸馏水将孢子重新悬浮，再用血球计数板计数，将孢子浓度调至1×10⁷cfu·mL^-1。在水培棉苗第1片真叶展平第二片真叶长出时接种。接种前倒掉培养盒中的水，然后将调好浓度的孢子悬浮液倒入培养盒中，进行棉苗浸根接种；接种12小时后倒去孢子悬浮液，换用MS培养液培养棉苗，之后每14天换一次MS培养液。每盒中种12株棉苗，每个菌株设3个重复。培养条件为：26℃，湿度为60～70％，光照16hr，黑暗8hr。

(二)病害的调查和统计

棉苗接种后每天观察病害的发生情况，待棉苗发病(大约接种1个星期后发病)后每天调查(到接种30天时截止)其发病率并按以下标准记载发病级别，0级：没有叶片发病的植株；1级：0.1％-25％的叶片发病；2级：25％-50％的叶片发病，不包括25％的叶片发病；3级：50％-75％叶片的发病，不包括50％的叶片发病；4级：大于75％的叶片发病。

计算病情指数的公式：病情指数＝[Σ各级病株数×级数/(总株数×最高病级)]×100。

T-DNA插入突变体菌株的表型及其致病性鉴定结果如图11所示。

图11中，d137和d122为两株T-DNA插入突变体菌株。

图11表明，d137和d122为两株从大丽轮枝菌V592的突变体库中筛选到表型有变化差异，致病性都减弱的突变体。与野生型菌株V592相比，两株突变体菌株均为白色菌丝，气生菌丝发达，生长旺盛，不产生黑色微菌核。该表型与实施例2构建的敲除突变体的表型一致。

三、插入突变体中T-DNA插入拷贝数分析

(一)提取d137和d122的基因组DNA，进行如下检测：

1、DNA浓度测定：将提取的基因组DNA用RNAase 37℃水浴消化1小时，然后使用浓度测定仪测其浓度，并其260/280的值应在1.8～2.0之间。

2、DNA质量检测：取2μg基因组DNA，与适量loading buffer混合均匀，0.9％琼脂糖凝胶、0.5×TBE电泳缓冲液电泳，然后将凝胶EB染色10分钟，用紫外成像仪观察基因组DNA条带的亮度均一情况并拍照。

DNA质量检测凝胶电泳示意图如图12中A所示。

(二)Southern印迹杂交

Southern印记杂交步骤如下：

1、基因组DNA的酶切电泳

首先，用适当的限制性内切酶(BamHI、XbaI或EcoRI)按以下体系对基因组DNA在37℃酶切过夜处理。

然后将酶切产物进行以下处理：

沉淀：向酶切产物中加入相同体积的-20℃条件下预冷的异丙醇，将其混合均匀后在-20℃冰箱中沉淀30分钟；然后4℃离心机、12000r·min^-1离心10分钟；接着用70％的乙醇(800μL)洗涤2次，然后无水乙醇(800μL)洗涤1次，并在4℃、12000r·min^-1条件下离心2分钟后，弃去多余的酒精，放在空气里室温凉置10min。

溶解：每管加40μLTE溶液，室温溶解gDNA沉淀10分钟，然后65℃水浴促溶扩散10分钟。

最后电泳：0.9％琼脂糖凝胶，25V(根据电泳槽长短不同而不同)电泳过夜，次日电压升至60V待loading至边缘1cm处时，调换正负极电泳5分钟。最后EB染色并使用紫外成像仪观察及拍照。

DNA酶切凝胶电泳示意图如图12中B中除从左到右第一个泳道所示。

2、琼脂糖凝胶处理

电泳过夜后，待溴酚蓝跑至距底边2cm时，将正负极调换倒跑5min后，将凝胶于紫外成像仪中拍照，然后用0.2mol/L HCI对凝胶进行脱色处理(约20min)，脱色彻底的标志为溴酚蓝由蓝变成黄色；其次用变性液(0.5M NaOH，1.5M NaCl)对凝胶进行DNA变性处理(约30min)，等溴酚蓝由黄色再变回蓝色，则处理完毕；最后用中和液(0.5M Tris-HCl，1.5MNaCl，浓盐酸调pH＝7.2)对凝胶进行中和处理(约30min)。

3、DNA印迹的转移

以20倍的SSC溶液作为DNA转移缓冲液，通过向上毛细管转移法将琼脂糖凝胶上的DNA印迹转移至Hybond N+尼龙膜上，具体方法参考《分子克隆》中的操作。

4、预杂交

通过紫外交联(紫外强度从1200自动降到0即可，反正面各交联一次)将DNA固定在尼龙膜上，然后将膜正面朝里平铺在杂交管管壁上，赶走气泡，加入2mL65℃预热的预杂交缓冲溶液(100mL体系配方为：5mL Denhart’s100倍液，25mL SSPE 20倍液，2.5mL百分之二十的SDS，200μL ssDNA，67.5mL双蒸水)，于65℃杂交炉中旋转预杂至少1h；

5、DNA探针标记

取25ng DNA探针，DNA探针为T-DNA上的EGFP基因序列片段，长度为720bp，探针序列如SEQ ID No.16所示。

参照Riboprobe Systtem-SP6探针标记试剂盒(为Promega产品，产品目录号为P1420)的说明书，使用α-[³²P]dCTP进行探针DNA的标记。

6、Southern杂交

把已用α-[³²P]dCTP标记好的探针加到预杂交缓冲液中，于42℃杂交炉进行杂交过夜(一般12小时即可)；

7、洗杂交膜

倒掉杂交液，在42℃条件下，依次使用以下洗膜液洗去杂交膜上游离的放射信号：2×SSC/0.1％SDS，15分钟/次，洗二次；0.2×SSC/0.1％SDS，洗膜5分钟；

8、扫描成像

杂交膜洗干净后，用玻璃纸将其包好，然后将膜正面朝向磷屏放入磷屏暗夹中，过夜曝光(一般12小时即可)，最后将磷屏上面的杂交结果通过扫描仪扫描即可。

d137和d122的Southern blot杂交结果如图12中C所示，

图12表明，d137和d122的T-DNA为单拷贝插入。

四、T-DNA插入位置的确定

(一)Tail-PCR

热不对称交错PCR(Thermal Asmmetric Interlaced PCR)，简称Tail-PCR。目前通常用其分离由农杆菌介导的T-DNA插入突变基因。本实验以d137的基因组DNA为模板，通过Tail-PCR扩增获得T-DNA插入的侧翼序列。然后根据侧翼序列分析和BLAST同源性序列比对，获得T-DNA插入的位置和可能突变的基因，接下来以野生型菌株V592的基因组DNA为模板进行PCR扩增得到目标基因。

1、Tail-PCR所用引物及其反应条件

随机引物序列(AD1～AD11)和特异性引物序列(LB1、LB2、LB3；RB1、RB2、RB3)如表3和表4所示。

表3 Tail-PCR随机引物序列

(表3中，S＝C/G，W＝A/T，N＝A/C/G/T，I为次黄嘌呤)

表4 Tail-PCR特异性引物序列

Tail-PCR反应：共分三轮反应，每轮PCR的产物作为下轮的模板。

每轮的反应体系(20μL)如表5所示。

表5反应体系

表5中，每个反应体系中加入的LB和RB为LB1和RB1，LB2和RB2或LB3和RB3，加入的AD为AD1-AD11中的任一种。

Tail-PCR三轮的详细扩增条件如表6所示。

表6 Tail-PCR反应程序

注：“＊”“＊＊”“＊＊”分别代表×5，×15，×30循环

2、Tail-PCR扩增产物的回收、测序和侧翼序列分析

将Tail-PCR扩增的三轮产物按次序点样，同时进行琼脂糖凝胶电泳，理想的条带应该是三轮呈阶梯状。将第二、三轮PCR产物中出现的特异性条带(最好选取大小在400～800间的片段)进行回收，然后对回收产物进行连接、转化和测序。

测序所得到的结果使用Sequencher 4.7Demo等软件对其进行序列比对与分析，经过进一步的筛选从而得到T-DNA插入位点侧翼序列，与大丽轮枝菌全基因组库(http://www.broadinstitute.org/annotation/genome/verticillium_dahliae/Bla st.htmL？sp＝Sblastn)，进行BLAST同源性序列比对，从而获得T-DNA插入的位置和可能突变的基因等信息。

插入突变体d137中T-DNA在基因组中的插入位置示意图如图13中A所示。

通过Tail-PCR克隆得到突变体d137的目标基因为VDAG-00947,经过比对分析，从而发现突变菌株d137基因组中T-DNA插入位置位于大丽轮枝菌UDG基因(命名为VdUDG)终止密码子下游155bp处。

(二)RT-PCR

提取插入突变体d137的基因组RNA并反转录为cDNA，以cDNA为模板，以VdUDGrt-s和VdUDGrt-a为引物进行PCR扩增,检测VdUDG的转录水平，以Actin作为内参基因，其引物为Actin-F和Actin-R。同时以V592的cDNA为模板，进行上述实验，作为对照。

基因VdUDG在插入突变体中的转录水平如图13中B所示。

图13B表明，在插入突变体d137中检测不到VdUDG基因在转录水平上的表达，说明该基因由于T-DNA的插入而导致转录失活。

Claims

1.一种防治大丽轮枝菌导致的植物黄萎病的方法，是将大丽轮枝菌的VdUDG蛋白的编码基因突变；

所述VdUDG蛋白为SEQ ID No.15所示的蛋白；

所述突变为敲除突变；

所述植物为棉花。

2.一种降低大丽轮枝菌致植物黄萎病能力或大丽轮枝菌微菌核形成能力的方法，是将VdUDG蛋白的编码基因突变；

所述突变为敲除突变；

所述VdUDG蛋白为SEQ ID No.15所示的蛋白。

3.一种提高大丽轮枝菌产孢能力的方法，是将VdUDG蛋白的编码基因突变；

所述突变为敲除突变；

所述VdUDG蛋白为SEQ ID No.15所示的蛋白。

4.根据权利要求1-3任一所述的方法，其特征在于：VdUDG蛋白的编码基因为SEQ IDNo.14所示的DNA分子。

5.SEQ ID No.15所示的蛋白或其编码基因在防治大丽轮枝菌导致的植物黄萎病中的应用；所述植物为棉花。

6.SEQ ID No.15所示的蛋白或其编码基因在开发或筛选防治大丽轮枝菌导致的植物黄萎病的产品中的应用；

所述产品能抑制SEQ ID No.15所示的蛋白的表达；

所述植物为棉花。

7.SEQ ID No.15所示的蛋白或其编码基因在降低大丽轮枝菌致植物黄萎病能力或大丽轮枝菌微菌核形成能力中的应用；

所述植物为棉花。

8.SEQ ID No.15所示的蛋白或其编码基因在提高大丽轮枝菌产孢能力中的应用。

9.根据权利要求5-8任一所述的应用，其特征在于：所述编码基因为SEQ ID No.14所示的DNA分子。