CN105524150A - 大丽轮枝菌致病相关基因VdGFP的功能分析及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及植物病理学领域，从大丽轮枝菌V07DF2菌株中克隆了一个在致病性中起重要作用的VdGFP基因，提供了该基因的核苷酸序列及其编码蛋白质的氨基酸序列。具体而言，本发明公开了一种大丽轮枝菌致病相关基因VdGFP。该基因的核苷酸序列如SEQ？ID？NO：1或SEQ？ID？NO：2所示，该基因编码的蛋白质序列如SEQ？ID？NO：3所示。本发明的大丽轮枝菌的致病相关基因VdGFP可以用于降低大丽轮枝菌的致病性。

Description

大丽轮枝菌致病相关基因VdGFP的功能分析及其应用
技术领域
本发明涉及大丽轮枝菌(Verticilliumdahliae)致病相关基因VdGFP的功能分析及其潜在应用的研究，属于植物病理学研究领域。
背景技术
大丽轮枝菌(VerticilliumdahliaeKleb.)是引起植物黄萎病的重要土传病原真菌，寄主广泛，可危害多种重要的经济作物和园艺作物。传统的防治技术，如轮作、抗性品种选育、化学药剂等对黄萎病的防治有一定的效果，但是由于大丽轮枝菌具有丰富的遗传多样性，致病力易发生分化，且主要以抗逆性强的微菌核结构在土壤中存活，因而在世界范围内黄萎病的危害依然严重。
明确大丽轮枝菌的侵染和致病机制是有效防控该病害的关键。但是目前对于大丽轮枝菌从侵染、定殖到发病等方面的研究，仍存在诸多问题。首先，大丽轮枝菌侵染过程不明确研究表明，当生长环境适宜时，土壤中距离寄主根部较近或与根部直接接触的大丽轮枝菌的孢子或微菌核会受到根冠细胞分泌物的刺激，萌发形成芽管或菌丝，这些菌丝起初在根表面随机分布，随着生长开始聚集，仅有少许菌丝能从初始侵入位点成功侵入寄主植物的皮层，绝大部分菌丝不能建立系统侵染，最终逐渐死亡。菌丝侵入寄主根部后进入维管组织，随着蒸腾作用向植株的茎和叶片扩展，最终侵染整个植株。在这一系列过程中，菌丝聚集的调控、初始侵入位点的选择、哪些菌丝能侵染、侵染过程中是否产生附着孢等问题均存在争议。其次，大丽轮枝菌的致病机理未阐明。目前对于大丽轮枝菌所分泌的次级代谢物(细胞壁降解酶、蛋白酶和致病毒素)在致病中的作用，争议较大。Cander等研究表明，果胶酶活性与大丽轮枝菌毒性呈正相关，强致病力菌株果胶酶活性高，弱致病力菌株则几乎不产果胶酶。因而果胶酶曾一度被看作是黄萎病菌致病的主导生化因子。但是，Durrands等通过研究丧失了果胶酶分泌能力的大丽轮枝菌突变体菌株后发现，该突变体仍然对棉花具有定殖和侵染的能力，从而证明了胞外果胶降解酶是大丽轮枝菌侵染寄主植物的重要因素，但并不是决定性因素。章元寿等对病菌胞外蛋白-脂多糖复合物中的蛋白质、多糖、脂质成分的致萎作用作了鉴定，认为复合物中蛋白质成分起主要致萎作用，推测脂质和多糖成分可能在病菌、寄主互作时起识别作用。EI-Bebany等通过蛋白质组分析，发现大丽轮枝菌的致病作用很可能是由多种物质(因子)与寄主互作诱发寄主病变。所以，对病菌次级代谢物单组分的纯化与致病性鉴定很可能不够全面、深入地了解黄萎病菌的致病机制。而且，病菌分泌的毒素蛋白含量低，成分复杂且难于分离纯化，目前对该类物质的研究也仅仅停留在体外处理和生化分析层面上，其致病的分子机理尚不明了。有研究者借鉴在其他病原真菌如核盘菌(Sclerotiniasclerotiorum(Lib.)deBary)、立枯丝核菌(Rhizoctoniasolani)致病性方而的研究成果，来获得大丽轮枝菌中的同源致病基因，分析其生物学功能。例如，编码促分裂原活化蛋白激酶(mitogen-activatedproteinkinase，MAPK)的VMK1，编码cAMP依赖性蛋白激酶A一个催化亚基的VdPKAC1，编码sucrosenonfermenting1调控分解代谢阻遏的VdSNFL编码G蛋白β亚基的VGB，这些同源基因被敲除后的大丽轮枝菌突变体致病力均显著下降。Wang等通过同源克隆的方法获得了诱导棉花产生黄萎病的激发子VdNEP，可诱导烟草叶片的超敏反应以及棉花叶片的萎蔫。但是大丽轮枝菌生物学特性和遗传背景不同于其他的病原真菌，同源基因在大丽轮枝菌中的功能也可能有所不同。
因此，希望通过分子生物学手段从大丽轮枝菌中直接挖掘更多参与侵染和致病相关的基因，探索其调控的信号网络途径和与寄主植物的互作机制，从分子层面来揭示大丽轮枝菌的致病机理，为作物抗病育种、新型杀菌剂的研发提供新的思路和靶标。对于一部分细菌和真菌，在构建载体时，将其基因组上靶标基因两侧一定长度的同源序列进行克隆，并且将抗生素抗性基因盒连接到两者当中。利用如原生质体转化或农杆菌介导的转化方法，将这一带有同源序列的质粒导入该微生物细胞内后，细胞会在一定比例上启动核酸修复机制，而原靶标基因的核酸序列将被载体上带有抗性基因盒的序列替换，从而产生不含有靶基因的敲除突变体。而通过对敲除突变体表型的观察和检测，可以确定该基因的生物学功能及其在相关领域的应用前景。
发明内容
从大丽轮枝菌V07DF2菌株中克隆了VdGFP基因，该基因全长为1264个碱基，核苷酸序列为SEQIDNO：1，该基因的ORF序列具有SEQIDNO：2所示的核苷酸序列。本发明同时提供了VdGFP基因编码的蛋白质序列，该蛋白质序列具有SEQIDNO：3所示的氨基酸序列。根据该基因及其侧翼的核酸序列，构建了针对该基因的敲除、回补载体。利用农杆菌介导的转化方法，获得了该基因的敲除突变体和回补突变体。通过对这些转基因材料的表型观察和分析，发现VdGFP基因影响病原菌对棉花的致病能力。
相关技术路线如下：
1.利用网上共享的生物信息资源，设计核酸引物，构建VdGFP基因的敲除载体，并将载体导入大肠杆菌和农杆菌菌株中。
2.利用网上共享的生物信息资源，设计核酸引物，构建VdGFP回补载体，并将载体导入大肠杆菌和农杆菌菌株中。
3.分别将敲除载体和回补载体利用农杆菌转化的方法导入到大丽轮枝菌V07DF2中，获得敲除和回补突变体。
4.观察野生型菌株以及敲除和回补突变体在侵染植物过程中的差异。
附图说明
图1.VdGFP敲除突变体荧光定量图(V07DF2为野生菌株；51A12为T-DNA筛选突变体；51A12敲3、51A12敲4、51A12敲5、51A12敲7、51A12敲9、51A12敲10为6个敲除VdGFP基因的突变体菌株)
图2.VdGFP回补突变体荧光定量图(V07DF2为野生菌株；51A12为T-DNA筛选突变体；51A12回1、51A12回2、51A12回3、51A12回7为4个回补VdGFP基因的突变体菌株)
图3.野生型菌株以及敲除和回补突变体对寄主棉花的致病力分析结果
具体实施方式
1.VdGFP基因的敲除载体和回补载体的构建，并将构建好的载体用化学转化法导入农杆菌AGL-1菌株中，分别获得具有VdGFP基因敲除功能以及回补功能的AGL-1农杆菌各一个，具体流程描述如下：
A.利用网上共享的生物信息资源(参见：http://www.broadinstitute.org/annotation/genome/verticillium_dahliae/MultiHome.html)，分别设计两对核酸引物，即5′侧翼扩增引物上游：GGGGACAGCTTTCTTGTACAAAGTGGAATCGGAACTGTGCGATGATGT；5′侧翼扩增引物下游：GGGGACTGCTTTTTTGTACAAACTTGTGTGGAGGCTGGTCGTGTCTT；3′侧翼扩增引物上游：GGGGACAACTTTGTATAGAAAAGTTGTTCCGCCTTTGTCATCCTCTTC；3′侧翼扩增引物下游：GGGGACAACTTTGTATAATAAAGTTGTTTTACCTCCTGCAACCCAGAT。利用它们对大丽轮枝菌V07DF2的基因组DNA进行聚合酶链式反应(PCR)扩增，得到VdGFP基因5′和3′两侧各约1kb的序列，然后将目的条带进行纯化。将纯化好的核酸片段各20ng与各60ng的pA-Hyg-OSCAR和pOSCAR质粒(购于FungalGeneticsStockCenter)混合，并加入1μlBPIIenzymemix(购于Invitrogen)，混匀后，25℃反应16小时，获得敲除质粒VdGFP-Del。将该质粒转化大肠杆菌，经核酸测序正确后，采用热激法将敲除质粒导入农杆菌AGL-1中，由此即得到带有VdGFP基因敲除功能的AGL-1农杆菌菌株。
B.利用网上共享的生物信息资源(参见：http://www.broadinstitute.org/annotation/genome/verticillium_dahliae/MultiHome.html)，分别设计两条核酸引物，即上游：GACCTGCAGGCATGCAAGCTTGTCGAACGACTACTGTAAGTACCA；下游：ACGACGGCCAGTGCCAAGCTTCGAGATACATCTGCAAGAAGCAAG。利用该引物对大丽轮枝菌基因组DNA进行PCR扩增，获得包括VdGFP基因启动子，ORF以及终止子在内的约2600bp的核酸片段。将该序列纯化，利用ClonExpressTMII重组反应体系(购于Vazyme生物技术公司)将该片段连接至用HindIII线性化的1300-ble载体(经本实验室改造)上，获得VdGFP回补质粒。测序验证正确后，将该质粒导入农杆菌AGL-1中，获得具有回补功能的农杆菌菌株。
2.VdGFP基因的敲除突变体和回补突变体的获得
利用上一步骤中获得的具有VdGFP基因敲除功能以及回补功能的AGL-1农杆菌菌株分别对野生型V07DF2菌株和T-DNA突变体库筛选出来的51A12突变体进行转化，具体的转化步骤如下：大丽轮枝菌转接至液体PDA中，28℃，150rpm培养3天；含有T-DNA双元载体的农杆菌AGL-1挑取单克隆接至液体MM培养基当中(现配现用，1升超纯水中溶解：2.05gK2HPO4，1.45gKH2PO4，0.15gNaCl，0.5gMgSO4·7H2O，0.1gCaCl2·6H2O，0.0025gFeSO4·7H2O，0.5g(NH4)2SO4和2.0gglucose)，28℃，150rpm培养2天。之后将农杆菌用IM培养基(在90mlMM培养基中加入0.5ml甘油和0.7808gMES，pH值调至5.3-5.5，并用MM定容至100ml)稀释到OD600＝0.15，预培养6小时，然后与等体积的、浓度为1.0×105孢子/ml的大丽轮枝菌孢子液混合。将混合物取适量涂布于灭菌的、置于CM固体培养基(与IM培养基相似，但葡萄糖浓度为IM培养基的一半，另外还包含200μM乙酰丁香酮)上的硝酸纤维素膜(0.45μm孔径)上，于28℃共培养48小时。之后，硝酸纤维素膜被转移至PDA固体培养基上【200μMcefotaxime和50μg/mlhygromycinB(筛选VdNUC-2敲除突变体)或25μg/mlBleomycin(筛选VdNUC-2回补突变体)】。相同条件培养5-7天后，可见小的转化子菌落，用接种针分别挑取其孢子进行培养，经过单孢分离后以终浓度25％甘油-70℃保存。
3.大丽轮枝菌V07DF2野生菌株以及VdGFP敲除和回补突变体侵染植物过程中的差异观察
获得敲除突变体和回补突变体后，将上述各菌株用液体PDB进行培养，摇床温度25℃，转速150rpm，一周后取其孢子，并将孢子浓度稀释至1.0×107个/ml，分别对棉花苗进行灌根处理。处理后的棉花培养于25℃，12h/12h(昼/夜)周期的温室中，7-8周后分别对各处理进行病情指数调查、统计并拍照。

Claims (4)

1.大丽轮枝菌(Verticilliumdahliae)的致病相关蛋白，其特征在于，其氨基酸序列如SEQIDNO：3所示。
2.大丽轮枝菌的致病相关基因VdGFP，其特征在于，编码权利要求1所述的大丽轮枝菌的致病相关蛋白。
3.根据权利要求2所述的大丽轮枝菌的致病相关基因VdGFP，其特征在于，其核苷酸序列如SEQIDNO：1或SEQIDNO：2所示。
4.根据权利要求2所述的基因核苷酸序列构建的VdGFP回补质粒。
1)利用引物对大丽轮枝菌基因组DNA进行PCR扩增，获得包括VdGFP基因启动子，外显子、内含子以及终止子在内的约2600bp的核酸片段。将该片段纯化，并连接至线性化的1300-ble载体上，获得VdGFP回补质粒。
2)经测序验证正确后，将该质粒导入农杆菌AGL-1中。
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