CN112888306A - 保护植物防御致病性细菌和/或促进共生和共栖细菌的有益作用的基于rna的生物防治方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及农业领域。本发明涉及抑制细菌中基因表达的方法，其在本文中称为抗菌基因沉默(Antibacterial Gene Silencing,AGS)。在具体实施方案中，该方法用于通过小非编码RNA以序列特异性的方式靶向致病性因子和/或必需基因来保护植物防御致病性细菌。该方法还可用于增强植物相关的共生或共栖细菌的有益作用和/或生长。本发明涉及产生组成性表达抗菌小RNA的稳定转基因植物，或者可选择地，这些小RNA实体以RNA提取物的形式、或包埋进植物细胞外囊泡(EV)的形式外源递送到植物上，发现其可有效减少细菌致病性。本发明还描述一种以快速、可靠和具有成本效益的方式鉴定具有抗菌活性的小RNA的方法，该小RNA可以进一步用于基于RNA的生物防治应用中以赋予植物防御致病性细菌。此外，后一种方法有助于快速表征任何细菌种类的任何基因。

Description

保护植物防御致病性细菌和/或促进共生和共栖细菌的有益 作用的基于RNA的生物防治方法
技术领域
发明概述
本发明涉及农业领域。本发明涉及抑制细菌中基因表达的方法，其在本文中称为抗菌基因沉默(Antibacterial Gene Silencing,AGS)。在特定的实施方案中，该方法用于通过小的非编码RNA以序列特异性的方式靶向致病性因子和/或必需基因来保护植物防御致病性细菌。该方法还可用于增强植物相关的共生或共栖细菌的有益作用和/或生长。本发明涉及产生组成性表达抗菌小RNA的稳定转基因植物，或者可选择地，这些小RNA实体以RNA提取物的形式、或包埋进植物的细胞外囊泡(EV)的形式外源递送到植物上，发现可有效减少细菌致病性。本发明还描述一种以快速、可靠和具有成本效益的方式鉴定具有抗菌活性的小RNA的方法，该小RNA可以进一步用于基于RNA的生物防治应用中以赋予植物防御致病性细菌。此外，后一种方法有助于快速表征任何细菌种类的任何基因。
背景技术
现有技术描述
植物免疫系统概述
植物免疫系统的第一层涉及与病原体或微生物相关的分子模式(Pathogen-或Microbe-Associated Molecular Pattern，PAMP或MAMP)的识别，这些分子模式是由表面定位的模式识别受体(PRR)感测到的保守微生物特征(1)。配体结合后，这些受体会在PRR复合物上引发复杂的磷酸化级联反应，从而导致PAMP触发的免疫(PTI)(1)。为使疾病发生，病原体分泌抑制PTI的效应子(2)。例如，革兰氏阴性细菌丁香假单胞菌番茄致病变种(Pseudomonas syringae pv.tomato)菌株DC3000(Pto DC3000)向植物细胞中注入36种III型分泌的效应子，以抑制PTI(3)。这种细菌还会产生冠菌素(Coranatine)(COR)，这是一种对其致病性至关重要的植物毒素(4)。植物已经进化出疾病抗性(R)蛋白，它们可以感知病原体效应子的存在，从而触发宿主的抗逆防御(counter-counter defense)(5)。大多数R蛋白都属于核苷酸结合结构域(NBD)，即富含亮氨酸的重复(NLR)超家族，它们也存在于动物体内(2，5)。他们直接或间接识别病原体效应子，并产生效应子触发的免疫(ETI)，这是一种有效的免疫反应，其与PTI明显重叠但幅度更大(6、7)。
转录后基因沉默(PTGS)控制宿主-病原体的相互作用
PTGS是一种保守的转录后基因调控机制，其已被广泛表征为通过靶向和降解病毒转录本而在植物中的天然抗病毒防御反应(8)。植物中RNA沉默或RNA干扰(RNAi)的核心机制涉及RNase III酶DICER-LIKE(DCL)蛋白对双链RNA(dsRNA)的识别和加工，从而导致产生20-25nt长的短干扰RNA(siRNA)双链体。这些siRNA双链体与Argonaute(AGO)蛋白结合，后者是RNA诱导的沉默复合物(RISC)的主要成分。随后，在AGO蛋白上的链分离形成一个成熟的RISC，其由AGO和单链RNA(引导链)组成，而随从链(passenger strand)则被降解。引导小RNA将AGO-RISC指导到序列互补的mRNA靶标上，导致它们的内切核酸裂解和/或翻译抑制。在过去十年中，还发现几种内源性短干扰RNA(siRNA)和微小RNA(miRNA)来协调针对非病毒病原体的PTI和ETI反应(9)，这暗示PTGS在调节植物免疫系统中的关键作用。
在植物中，可移动的小RNA可以触发邻近细胞以及远端组织中的非细胞自主沉默(10)。它们对于在感染之前启动抗病毒防御尤为重要(10)。非细胞自主沉默对于在植物细胞及与其相互作用的非病毒病原体、寄生性或共生性生物之间的沉默信号的转位也很关键，细菌除外，该方法尚未证明对细菌是靶向性的(11)。这种天然的跨界(cross-kingdom)调控机制最近在植物与真菌的相互作用中已经显著表征(12-17)。例如，发现特定植物miRNA被输出到真菌病原体黄萎病菌(Verticillium dahliae)的菌丝中以触发毒力因子的沉默(14、17)。另一方面，内源性灰霉病菌(B.cinerea)小RNA可以输出到植物细胞中，使植物防御基因沉默(16)，突出了植物和真菌病原体之间的双向跨界(bi-directional cross-kingdom)的RNAi。虽然对宿主细胞和真菌细胞之间小RNA/dsRNA转运的机制知之甚少，但在吸器外间质(extrahaustorial matrix)中大量囊泡的存在表明它们可能在两种生物之间传递沉默信号(18)。与此假说相一致的是，两项最新研究提供证据，证明植物细胞外囊泡(EV)对于将抗真菌小RNA递送到灰霉病菌细胞中以及将抗卵菌(antioomycete)小RNA递送到辣椒疫霉菌(Phytophthora capsici)细胞中是必不可少的(17，19)。
可以利用跨界RNAi提供对具有典型RNA沉默机制的病原体的防御
最初是通过表达与给定寄生虫或害虫的重要或致病性因子具有同源性的dsRNA来证明跨界RNAi的生物学相关性，前提是所述寄生虫或害虫具有典型的RNAi机制(例如，功能性DCL和AGO蛋白)。迄今为止，这种宿主诱导基因沉默(HIGS)技术已成功用于保护植物免受昆虫、线虫、卵菌、真菌和寄生植物的侵袭和捕食(WO 2012/155112、WO 2012/155109、CA2799 453、EP 2405013、US 2013/177539、15、20、21))。例如，HIGS赋予针对禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)和灰霉病菌的全面保护，通过在真菌感染之前将相关的外源dsRNA或siRNA喷洒到野生型植物上，这种现象得到充分的体现(15、20、21)。后一种现象称为喷洒诱导基因沉默(Spray-Induced Gene Silencing，SIGS)，让人联想到“环境RNAi”，其是涉及从环境摄取RNA的过程，最初描述见于秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegan)和某些昆虫中(15、21、22)。因此，HIGS/SIGS被认为是旨在将R基因或PAMP受体引入农业相关作物的常规育种或基因工程的有力补充、或甚至有时是替代(5、23、24)。此外，该技术提供更持久、更环境友好的植物保护解决方案，这可能有助于减少农药的使用，在某些情况下，农药的使用可能对人类健康和环境产生重大影响。
HIGS/SIGS技术的当前限制
HIGS/SIGS技术受到以下事实的限制，即，表明它们仅仅针对具有典型RNA沉默机制的植物病原体和寄生虫具有功能。例如，针对禾谷镰刀菌的SIGS至少部分依赖于dsRNA的摄取、以及真菌DICER-LIKE 1蛋白的进一步加工(21)。到目前为止，还没有针对不具有典型的RNAi机制的植物病原体的HIGS/SIGS实例，例如发明人在此处使用的细菌病原体，在其基因组中不包含典型的真核样RNA沉默因子，如S.Ghag在2017年的综述(22)中所述。这就是为什么至今尚未使用基于RNA的沉默技术保护植物免受细菌病原体侵害的原因。这是一个相当大的限制，因为细菌病原体会对农业食品的质量和生产产生重大影响，从而导致全球范围内的重大经济损失。例如，细菌病原体，例如假单胞菌(Pseudomonas)、雷尔氏菌(Ralstonia)、木杆菌(Xylella)、黄单胞菌(Xanthomonas)会引起多种栽培植物的感染(25)。
一些作者推测，通过使细菌细胞与长dsRNA接触，有可能影响细菌的生长。例如，WO2006/046148提出控制可摄取长dsRNA片段(＞80个碱基对)的害虫(据推测其中也包括细菌)的增殖。然而，WO 2006/046148的发明人没有提供任何细菌对如此长的RNA片段敏感的实验证据(他们的实施例仅公开dsRNA对线虫的作用)。相反，本文的发明人证明细菌对长的dsRNA不敏感，这表明WO 2006/046148的发明人提出的假设在靶向原核细胞时无效。
发明内容
发明目的
在本发明中，作者在此首次表明植物小RNA可以通过序列特异性方式有效抑制细菌性植物病原体的基因表达，这种现象在本文中称为“抗菌基因沉默”(AGS)。该调节机制特别显示在两种不同的革兰氏阴性细菌种中起作用，表明尽管存在包含复杂的双膜结构(细菌内膜和外膜)的细胞壁，细菌细胞仍可以有效地摄取植物的小RNA。这是出人意料的结果，因为过去从未显示过小RNA可以穿透细菌磷脂双层或在植物病原细菌细胞内被动或主动转运。
然而，尽管存在所有这些偏见，发明人的发现表明，通过使细菌细胞与携带与一个或多个细菌靶基因具有序列同源性的小RNA接触，实际上有可能直接沉默任何细菌基因，例如，毒力因子或必需基因。这些小RNA可以由所述植物细胞稳定表达，以保护它们免受一种或多种细菌病原体的侵害。或者，可以在将它们外源施用至将要遇到靶向的致植物病细菌的植物组织中，从而减弱所述致植物病细菌的致病性和生长。因此，与迄今为止所认为的相反，小RNA的定向沉默可用于有效地敲除植物细菌病原体的基因表达，所述植物细菌病原体不具有真核样RNA沉默机制并且甚至具有双层膜。
细菌细胞对这种外源递送的小RNA的出人意料的敏感性，可以有目的地用于抗菌应用，并且可以设想采用多种治疗来减少细菌性植物病原体的存活、致病性和/或生长。
最后，发明人采用一种基于体外的测定方法，以快速、可靠、和具有成本效益的方式鉴定具有抗菌活性的小RNA。因此，预期本发明将被广泛用于(i)赋予收获前和收获后的植物针对细菌病原体的防御，(ii)增强共生或共栖细菌的有益作用和/或生长，和(iii)表征基因在任何细菌物种中的功能。
发明的详细描述
概述
在下面的结果中，发明人表明AGS是一种有效的技术，可通过单独或同时靶向多种细菌致病性所需的关键基因来增强植物对细菌感染的防御。它们在拟南芥稳定的转基因植物中显著地组成性表达小RNA，这些小RNA与革兰氏阴性细菌Pto DC3000的两个主要毒力因子(称为Cfa6和HrpL)具有同源性，并且发现与表达这些小RNA的植物细胞接触时，这种细菌病原体的毒力和生长显著降低。在表达针对毒力因子HrpG、HrpX和RsmA的小RNA的拟南芥(Arabidopsis)转基因植物中也观察到增强的针对芸苔黄单胞菌芸苔致病变种(Xanthomonas campestrispv.campestris)(Xcc)的保护，该菌是黑腐病的致病细菌，而黑腐病是十字花科作物最具有破坏力的疾病之一。这些数据表明，AGS可用于保护植物免受不相关的农业相关植物病原体的侵害。
其还表明，在表达抗Cfa6和抗HrpL siRNA的拟南芥转基因植物中观察到的毒力降低与Pto DC3000中两个靶向毒力因子表达的特异性降低有关。发现这种体内细菌基因沉默现象不仅对这些内源性胁迫反应性毒力基因有效，而且对在Pto DC3000基因组中组成性表达的人工报告基因也有效。因此，这些发现突出表明，细菌细胞尽管缺乏典型的真核生物样RNA沉默机制，但其实际上对植物编码的小RNA的作用敏感。其还提供证据，证明植物中产生的人工小RNA可以诱导细胞外细菌病原体中的基因沉默，表明这些小RNA必须通过牵涉细胞外植物小RNA的不同种群的机制从宿主细胞输出至细菌细胞(见下文)。
令人惊讶的是，不仅在遗传修饰的植物上观察到这种沉默效果，以便稳定表达与Cfa6和HrpL基因具有同源性的小RNA，而且在用含有抗Cfa6和抗HrpL siRNA的总RNA预处理、然后接种Pto DC3000的WT植物上也观察到这种沉默效果。有趣的是，当在这些测定中使用体外合成的抗Cfa6和抗HrpL siRNA时，观察到相似的表型。后一个发现表明，AGS不仅可以由植物来源的小RNA触发，而且可以由合成的双链小RNA触发。
另外，通过产生表达小RNA的HrpL抗性版本的重组细菌，其在小RNA靶向的区域中包含尽可能多的沉默突变(这些突变旨在改变小RNA与HrpL mRNA的结合，但产生相同的蛋白质序列)，发明人表明沉默HrpL不再有效。此外，他们观察到，在外源应用含有有效抗HrpL小RNA的总RNA时，这种重组细菌的毒力保持不变。因此，这些发现提供令人信服的实验证据，表明针对HrpL基因的小RNA对AGS和细菌致病性的抑制均具有因果关系。
发明人继续进一步研究在响应外源性携带抗菌RNA的总RNA时，哪些RNA实体负责观察到的AGS现象。有趣的是，通过从表达靶向Cfa6和HrpL基因的嵌合发夹的转基因植物中提取的总RNA中分离出小RNA和长RNA物种，他们表明向植物外源递送小RNA级分触发抗菌作用，而用长的RNA级分处理是无效的。此外，发明人表明，来自IR-CFA6/HRPL参考品系的总RNA提取物对触发AGS或降低发病不够有效，该参考品系在DCL2、DCL3和DCL4基因中发生突变，因此抗Cfa6和抗HrpL siRNA的生物合成受到损害。总的来说，这些发现提供令人信服的证据，即小RNA而不是其长dsRNA前体(除非它们在植物原位被加工成小RNA)，是造成AGS的RNA实体。这与之前在秀丽隐杆线虫和植物食草动物中报告的专门依赖于长dsRNA(26-32)、或与在真核丝状病原体灰霉病菌和禾谷镰刀菌中报告的由dsRNA或siRNA触发(15、21)的环境RNAi有很大区别。
重要的是，发明人还证明，外源应用含有针对Cfa6和HrpL基因的有效小RNA的总RNA，可以在农业相关的植物番茄(Solanum lycopersicum)中有效降低Pto DC3000的生长和致病性，番茄是该细菌的天然宿主。因此，可以预见的是，可利用这种基于RNA的生物防治方法(以基于序列的高选择性)，为多种栽培植物提供抵抗细菌性植物病原体的保护。还可以预见，将携带与毒力因子和/或必需基因具有序列同源性的小RNA施用于水果、蔬菜、花朵和叶子表面上，将显著减少各种破坏性细菌病原体的感染。这种方法也适用于种子处理，以控制(对种子行业构成重大威胁的)种子传播的细菌病原体。此外，可以通过同时靶向来自各种细菌性植物病原体的必需基因、和/或毒力因子，容易地设计该方法来控制多种细菌性病原体。因此，AGS代表一种新的环境友好的基于RNA的技术，可以保护植物免受细菌侵害。
过去，Escobar等人(33)使用基于RNA沉默的方法靶向拟南芥和番茄中的两个根瘤农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)致癌基因iiaM和ipt。但是，在该报告中，作者靶向通过来自大肿瘤诱导(Ti)质粒的T-DNA转移并整合到植物基因组中的致癌基因。实际上，所显示的机制依赖于从植物细胞而非细菌细胞表达的靶向基因的经典RNA沉默方法。这是与本发明的主要区别，本发明实际上依赖于沉默细菌细胞内表达的基因。此外，在Escobar等人(33)的研究中，仅阻止了根瘤农杆菌细菌诱导的冠缨病(crown gall)肿瘤发生，因为RNA沉默效应抑制从植物细胞表达的致癌基因iiaM和ipt的表达。因此，这些结果只能转移到已知将其DNA整合到植物基因组中的其他诱导肿瘤发生的细菌上。因此，如该研究本身所强调的那样，该研究对植物保护的影响有限(第13442页，右栏；“在培养这些植物时需要保持良好的育苗实践，以最大程度地减少大量有毒根瘤农杆菌细菌传播进入田间”)。事实上，这些细菌的固有毒力不受本研究作者使用的小RNA的影响。
在以下结果中，发明人还研究在植物来源的抗菌小RNA向细菌细胞的运输中EV的可能作用。他们发现至少有两个具有抗菌活性的EV群体，其中一个是大尺寸，在抑制细菌发病机理中具有充分的活性，另一个是较小的EV，具有中等较少的活性。此外，他们表明，将抗菌小RNA包埋进这些EV中保护抗菌小RNA免于微球菌核酸酶(Mnase)的消化，从而突出植物EV在田间条件下未来疾病管理策略中的潜力。有趣的是，发明人还发现，不与蛋白质结合的非原质体EV游离的抗菌小RNA，在抑制发病机理中也具有充分的活性。这些新颖的小RNA种类在这里被称为细胞外游离小RNA或“efsRNA”，并且对Mnase消化敏感。因此，发明人得出结论，IR-CFA6/HRPL转基因植物的非原质体由至少三个功能性抗菌小RNA群体组成，其是包埋在大EV中、包埋在较小EV中或以游离形式存在。
发明人还使用已经建立的农杆菌介导的烟草叶子的瞬时转化来瞬时表达小RNA，接着将相应的候选抗菌siRNA与细菌细胞一起孵育。这种方法尤其可用于确定针对HrpL基因的siRNA，与同时靶向Cfa6和HrpL基因的siRNA相比，可同样有效地预防Pto DC3000诱导的气孔重新打开。此外，发明人已经证明，小RNA的体外合成是筛选触发抗菌作用(例如，细菌基因沉默和抑制细菌诱导的气孔重新打开)的候选小RNA的简便、快速和可靠的方法。他们还将体外小RNA合成方法与基于液滴的微流体系统相结合，证明针对来自Pto DC3000的保守基因GyrB或FusA的siRNA可以在体外极大地改变细菌的生长，从而鉴定出新型杀菌剂。因此，可以预见的是，这种基于瞬时烟草或体外合成的候选小RNA，接着将相应的小RNA与细菌细胞在体外进行孵育，这将被工业界广泛采用，以鉴定对细菌基因表达和/或特定表型(例如，细菌生长、存活、代谢活动)具有强烈影响的小RNA。还可以预期，本文所述的AGS技术将通过基于新颖RNA的反向遗传方法广泛用于表征细菌基因的功能。例如，此方法可用于首次证明HrpL在Pto DC3000诱导的气孔重新打开中的作用，以及GyrB和FusA在Pto DC3000的存活中的作用。最后，由于工业界已经以经济有效的方式使用烟草植物以生产高产量的重组蛋白或囊泡样颗粒(参见Medicago Inc.的EP2610345)，因此它们将可能被用于生产候选小RNA，特别是在可以保护它们免受核酸酶降解的EV中生产候选小RNA，以用于未来基于RNA的生物防治应用。
基于所有这些发现，本发明人提出一种抑制细菌中至少一个基因表达的方法，所述方法包括：
i)向至少一个植物细胞引入至少一个特异性靶向至少一个细菌基因的功能性干扰RNA分子(iRNA)，所述iRNA能够在携带一个或多个所述基因的细菌中诱导一个或多个所述基因的序列特异性沉默，或者
ii)在细菌感染之前和/或之后在植物组织上递送小RNA或含有这些小RNA的植物提取物，或
iii)直接向细菌细胞上递送小RNA，这些小RNA在EV中、在非原质体的流体中存在或以细胞外游离RNA存在。
有趣的是，该方法允许通过在细菌感染之前和/或之后在植物细胞中表达干扰RNA分子(siRNA和miRNA的前体)或在植物组织上递送小RNA，靶向一个或多个细菌基因。这种方法将在植物的细菌感染管理中具有主要农业的、基于RNA的生物防治应用。
更准确地说，该技术将提供一种控制植物中的细菌感染的方法，由于该方法基于序列的高选择性，因此其减少了农业中的化学处理，而不会对有益细菌或环境产生负面影响。
此外，该策略将提供持久的抗病性，而旨在将单一抗病基因引入作物的常规或分子育种程序则不是这样。
最后，可以预期的是，本文描述的技术也将可用于控制来自有益细菌的基因的表达，以增强它们的增殖和/或对宿主植物的有益作用。
除这些优点之外，所提出的方法还具有成本效益并且相对易于工业化。实际上，设计和生产针对细菌基因的有效人工iRNA(例如，siRNA)的方法，当从本氏烟草叶子中瞬时表达时仅需要几周，而在体外合成时甚至只需一天。此外，在出现抗siRNA的细菌时，从头重新设计和生产人工iRNA相对容易。最后，有可能产生针对特定细菌种类、或针对广泛的致植物病的细菌菌株的iRNA，从而根据所需的基于RNA的生物防治应用，提供靶向的或广谱的植物处理方法。
本方法/用途可以在体内或体外进行。“体外”在本文中是指要求保护的方法或用途的步骤是使用生物组分(例如，细菌细胞)来进行，所述生物组分已经从其通常的宿主生物(植物或植物组织，例如叶子、果实、根等)中分离、或直接生长在体外介质中(在没有宿主生物的情况下)。当本发明的小RNA直接与细菌细胞接触时就是这种情况。
“体内”或“植物原位”在本文中是指所要求保护的方法或用途的步骤是使用完整的生物(例如，完整的植物)进行。当本发明的iRNA从植物稳定表达时，就是这种情况，其中它们被加工成小RNA(siRNA或miRNA)，然后释放到周围的培养基中以遇到细菌细胞。
当本发明的小RNA直接与细菌细胞接触，特别是触发细菌细胞内的毒力因子的基因沉默时，认为本发明的方法/用途在“半体内”测定中进行。
值得注意的是，本发明的所有方法都将在动物或人类生物以外进行。
RNA沉默元件
本发明涉及至少一种功能性干扰RNA(iRNA)用于抑制细菌细胞中至少一个基因表达的用途。
如本文所用，术语“功能性干扰RNA”(功能性iRNA)是指，能够诱导特别是细菌细胞中至少一个细菌基因序列特异性沉默过程的RNA分子。特别地，所述功能性干扰RNA分子可以是：i)小干扰RNA，其在本领域中公知为小或短干扰RNA(siRNA)分子(单链体或双链体)、或其前体，或ii)微RNA(miRNA)分子(单链体或双链体)、或其前体。
本文中的术语“siRNA的前体”或“siRNA前体”是指可以在植物(或植物提取物)中直接或间接加工成siRNA双链体的RNA分子。可以直接加工的siRNA前体的实例包括长双链RNA(长dsRNA)，而可以间接加工的siRNA前体的实例包括长单链RNA(长ssRNA)，可以将其用作生产可加工的长dsRNA的模板。
本文中的术语“miRNA的前体”或“miRNA前体”是指可在植物(或植物提取物)中加工成miRNA双链体的RNA分子。miRNA前体的实例包括主要的miRNA前体(pri-miRNA)和pre-miRNA，包含发夹环。
值得注意的是，编码所述前体分子的质粒、或载体、和其他DNA构建体或病毒载体也包括在“功能性干扰iRNA”的定义中。
为靶向细菌中的多个基因，本发明的方法可以使用i)同时靶向多个目的细菌基因的几种不同iRNA的混合物，或者ii)靶向几种不同目的细菌基因的嵌合iRNA，或者iii)这些嵌合iRNA中的任意的混合物。
在一个特定的实施方案中，本发明的方法/用途包括将一个或几个功能性iRNA作为前体引入植物细胞中，以在植物原位产生小RNA(例如，siRNA或miRNA)，所述小RNA可以被进一步配制并喷洒在植物田间。
在一个更具体的实施方案中，本发明的功能性iRNA是长单链RNA分子(此后称为“长ssRNA”)。这样的长ssRNA可以通过植物转基因产生，通过植物的RNA依赖性RNA聚合酶转化为长dsRNA分子，并通过植物DCL蛋白进一步加工为siRNA。或者，长ssRNA可由植物RNA病毒产生，并在病毒复制期间(作为复制中间体)和/或通过植物RNA依赖性RNA聚合酶的作用进一步转化为长dsRNA分子。产生的病毒dsRNA随后通过植物DCL蛋白加工成siRNA，其随后通过称为病毒诱导的基因沉默(VIGS)的方法触发序列特异性沉默(11)。
如本文所用，术语“长ssRNA”表示包含至少50个碱基，更优选80至7000个碱基的单链的单链结构。当由植物转基因产生时，长ssRNA可包含80至7000个碱基，但是当由植物重组RNA病毒产生时，优选包含80至2000个碱基。
在一个更具体的实施方案中，本发明的功能性iRNA是长双链RNA分子(以下称为“长dsRNA”)，其作为siRNA前体，并且可在植物原位由DCL蛋白和植物基因组编码的其他小RNA生物发生因子加工成siRNA。
如本文所用，术语“长dsRNA”表示包含至少50个碱基对、更优选80-7000个碱基对的第一(正义链)和第二(反义)链的双链结构。
在植物或植物细胞中，长dsRNA可以加工成小的RNA双链体。这样的长dsRNA有利地是嵌合dsRNA，即它们具有与多个细菌基因具有同源性的序列(参见下文)。
在一个实施方案中，本发明的功能性iRNA是长dsRNA，其可被植物细胞中的DCL蛋白切割以产生siRNA。
本发明的长dsRNA可以由发夹结构通过以下产生：通过正义反义转录构建体、通过进一步由植物RNA依赖性RNA聚合酶用作底物的人工正义转录本构建体、或通过VIGS产生。更精确地，它们可以包含凸起、环或摆动碱基对以调节dsRNA分子的活性，从而介导细菌细胞中有效的RNA干扰。本发明的长dsRNA分子的互补正义和反义区可以借助于基于核酸或基于非核酸的接头连接。本发明的长dsRNA还可包含一个双链体结构和一个环结构以形成对称或不对称的发夹二级结构。
因此，在一个实施方案中，本发明的功能性iRNA是包含发夹(例如，miRNA前体)的、长的(至少50个碱基对、更优选80至400个碱基对、100至200个碱基对、125至175个碱基对、特别是约150个碱基对)dsRNA。
如本申请的实施例所示，将dsRNA引入植物细胞，通过小RNA而不是长dsRNA的作用，在细菌细胞中诱导细菌基因的序列特异性沉默(实施例6和图7)。这意味着细菌细胞仅在与其小RNA实体直接接触时才对AGS敏感。使细菌与小RNA的前体接触将不会有作用，因为这些原核细胞不具有将其正确加工成功能性iRNA的典型的真核生物样机制。通过在参考转基因IR-CFA6/HRPL#4品系中使拟南芥DCL2、DCL3和DCL4基因失活，这已得到明显证明。来自这些植物的总RNA表达丰富的反向重复CFA6/HRPL转录本(即，未加工的CFA6/HRPL dsRNA)，这些转录本不能触发Pto DC3000 Cfa6和HrpL基因的AGS，也不能降低发病机理(图7)。
然而，通过使其与尺寸小于50个碱基对的小RNA种类接触，可以在细菌细胞中直接抑制细菌基因的表达(图8和图10)。
因此，在另一个优选的实施方案中，本发明的功能性iRNA是小RNA，例如，siRNA或miRNA。这些小RNA具有短的尺寸，其小于50个碱基对，优选地在15至30个碱基对之间，更优选地在19至27个碱基对之间，甚至更优选地在20至25个碱基对之间。
这些小RNA可以配制成植物检疫组合物，例如，配制成可喷洒的液体组合物(见下文)。在这种情况下，可以将含有所述小RNA的所述组合物直接施用于植物组织或细菌。
在一个特别优选的实施方案中，本发明的功能性iRNA是“siRNA”，其指“siRNA双链体”或“siRNA单链体”。
更具体地，术语“siRNA双链体”指包含至少15个碱基对、优选至少19个碱基对的第一(正义链)和第二(反义)链的双链结构或双链体分子；优选地，所述反义链包含与靶基因的转录本互补的至少15个连续核苷酸的区域。这些siRNA双链体由长dsRNA前体通过植物DCL蛋白加工产生。它们具有小于50个碱基对的短尺寸，优选地在15至30个碱基对之间，更优选地在19至27个碱基对之间，甚至更优选地在20至25个碱基对之间。
如以下实验部分(实施例9和图10)所示，当本发明的小RNA在双链结构中时，它们是有效的。用体外从头合成的siRNA双链体已经证明这一点，据认为，用植物提取物观察到的生物学作用至少部分是由于植物分泌的这些siRNA双链体。
如本文所用，术语“siRNA单链体”或“成熟siRNA”指这样的单链体分子(也称为“单链”分子)：源自siRNA双链体、但已在植物细胞的RISC机制中成熟、并被装载进AGO蛋白中和/或与其他RNA结合蛋白结合。它们具有小于50个碱基的短的尺寸，优选地在15和30个碱基之间、更优选地在19和27个碱基之间、甚至更优选地在20和25个碱基之间。
在另一个实施方案中，本发明的功能性iRNA是“miRNA”，其表示“miRNA双链体”或“miRNA单链体”。
更具体地，术语“miRNA双链体”指包含至少15个碱基对、优选至少19个碱基对的第一(正义链)和第二(反义)链的双链结构或双链体分子；优选地，所述反义链包含与靶基因的转录本互补的至少15个连续核苷酸的区域。这些miRNA双链体也可能含有凸起。这些miRNA双链体由长miRNA前体通过植物DCL蛋白加工产生。
如本文所用，术语“miRNA单链体”或“成熟miRNA”指这样的单链体分子(也称为“单链”分子)：源自miRNA双链体、但已在植物细胞的RISC机制中成熟、并被装载进AGO蛋白中和/或与其他RNA结合蛋白结合。
设计iRNA(例如，长dsRNA/siRNA/miRNA)的方法在本领域中是可获得的，并且可用于获得具有这些性质的长dsRNA、siRNA和miRNA的序列。
本发明人在本文中显示(实施例9，图10)，可能使用人工体外合成的双链siRNA，以(i)抑制细菌基因表达，(ii)抑制细菌致病性，和(iii)在体外触发杀菌作用(参见图10)。
因此，本发明包含合成、半合成或重组iRNA的用途，所述iRNA仅含有核糖核苷酸或既含有脱氧核糖核苷酸又含有核糖核苷酸。本发明还包括包含一个或多个修饰的修饰的iRNA分子的用途，所述修饰增加体内对核酸酶降解的抗性和/或改善细胞稳定性(例如，小RNA 3'末端甲基化、锁核酸(LNA)))、被细菌细胞摄取(例如，肽载体)或细菌细胞内的沉默效率。本发明的iRNA可以包括在糖、磷酸和/或碱基部分修饰的核苷酸，和/或5'或3'末端、或核苷酸间键的修饰。
本发明中定义的化学合成的dsRNA分子可以由分别合成的两个不同的寡核苷酸组装而成。或者，可以使用可裂解的接头(例如，基于琥珀酰基的接头)串联合成RNA双链体或RNA前体分子的两条链。可选择的，可以从插入到本领域技术人员已知的和商业上可获得的DNA或RNA载体中的转录单元(体外或在植物原位)表达本发明的RNA前体分子。值得注意的是，后一种方法可以包括转录表达长双链折回结构的转基因、通过位于转基因两端且方向相反的启动子的正义反义转录本、miRNA前体、初级miRNA转录本、或正义转录本，其可在某些情况下(例如，被内源性或外源性22nt长miRNA靶向)被植物RNA依赖性RNA聚合酶用作底物以生成dsRNA。
本发明的iRNA分子在携带一个或多个所述基因的细菌中优选使一个或多个靶细菌基因的表达水平降低至少30％、优选降低至少60％、更优选降低至少80％。可以通过本领域熟知的方法在RNA或蛋白质水平上评估一个或多个细菌基因的沉默，例如，通过实时定量RT-PCR(RT-qPCR)、Northern印迹、FACS、免疫组织学分析或Western印迹分析。
在本发明的上下文中，通过人工iRNA分子对一个或多个细菌基因的沉默(可能是部分的或全部的)，应足以对细菌产生所想要的作用，例如，在植物细胞或植物生物中降低所述细菌的细菌致病性或传染性。
靶细菌
本发明的用途/方法可用于使任何类型的细菌(致病或非致病；革兰氏阳性或革兰氏阴性)中的基因沉默，包括已知与植物生物体相关的有益细菌。
可以使用本发明的用途/方法靶向的病原性细菌的非限制性实例包括青枯雷尔氏菌(Ralstonia solanacearum)、水稻黄单胞菌致病变种(Xanthomonas oryzaepathovars)、芸苔黄单胞菌致病变种(Xanthomonas campestris pathovars)、地毯草黄单胞菌致病变种(Xanthomonas axonopodis pathovars)、Xanthomonas euvesicatoriapathovars、旅馆黄单胞菌致病变种(Xanthomonas hostorum pathovars)、丁香假单孢菌致病变种(Pseudomonas syringae pathovars)、浅绿假单胞菌致病变种(Pseudomonasviridiflava pathovars)、萨氏假单孢菌致病变种(Pseudomonas savastono pathovars)、柑橘黄龙病菌亚洲型(Candidatus liberibacter asiaticus)、土豆斑纹片病菌(Candidatus liberibacter solanacearum)、柠檬酸嗜酸杆菌(Acidovorax citrulli)、燕麦酸嗜酸杆菌致病变种(Acidovorax avenae pathovars)、特罗氏芽孢杆菌致病变种(Pectobacterium atrosepticum pathovars)、胡萝卜芽孢杆菌致病变种(Pectobacteriumcarotovorum pathovars)、果胶杆菌(pectobacterium sp.)、根瘤农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)、Dickeya(dadantii和solani)、小球藻欧文氏菌(Erwinia amylovora)、密歇根棒状杆菌(Clavibacter michiganensis)(michiganensis和sepedonicus)、苛养木杆菌(Xylella fastidiosa)、果胶杆菌(Pectobacterium)(胡萝卜果胶杆菌(carotovorum)和黑胫病果胶杆菌(atrosepticum))、疥疮链霉菌(Streptomyces scabies)、泡桐丛枝病菌(Phytoplasma sp)、螺原体(Spiroplasma sp)(25)。
如果处理观赏植物，则可以靶向以下细菌：已知会感染菊花、天竺葵和凤仙花的菊苣假单胞菌(Pseudomonas cichorii)；已知会感染天竺葵的芸苔黄单孢天竺葵致病变种；已知会感染杭菊(Chrysanthemum morifolium)、天竺葵属植物、福禄考(Phlox)、甚至可能感染杜鹃花的法氏红球菌(Rhodococcus fascians)；已知会感染天竺葵、红掌属植物、玫瑰树、姜黄和红掌的青枯雷尔氏菌；地毯草黄单孢菌、旅馆黄单孢菌，已知可感染天竺葵、秋海棠、红掌和罗莎木槿(Hibiscus rosa-sinensis)；已知会感染孤挺花、秋海棠、马蹄莲、仙客来、龙血树和凤仙花的胡萝卜芽孢杆菌。
在一个特定的实施方案中，本发明的方法使用靶向有益细菌的一个或多个基因的功能性iRNA，通常将其称为促进植物生长的根际细菌(PGPR)。该特定实施方案的目的是促进所述PGPR的有益作用。在该特定实施方案中，靶细菌基因是这样的因子：其在沉默时促进靶细菌细胞的复制或对宿主有益的途径以及正性调节有益化合物(例如，植物激素)、次级代谢产物的产生，所述次级代谢产物(i)改变周围植物病原体的存活/致病性，(ii)激活植物防御反应(例如，诱导的系统抗性)，(iii)促进从环境中摄取养分(例如，通过增强对于豆科植物根瘤菌(Rhizobium-legume)共生必要的细菌因子的产生)(iv)增强宿主生物对非生物胁迫条件等的耐受性等。因此，此类细菌靶基因的沉默将导致宿主生物的生长速率增加和/或宿主生物的若干其他可能的有益效果。
在这样的实施方案中，本发明的iRNA应当具有与有益细菌基因的序列同源性，但是与致病细菌基因组、宿主基因组、或宿主定植者和/或与以宿主生物为食的哺乳动物的其他基因组没有序列同源性。
可以用本发明的方法靶向的有益细菌的非限制性实例包括：芽孢杆菌(例如，枯草芽孢杆菌)、假单胞菌(例如，恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)、斯氏假单胞菌(Pseudomonas stuzeri)、荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)、蛋白质假单胞菌(Pseudomonas protegens)、十字花科假单胞菌(Pseudomonas brassicacearum))、根瘤菌(例如，苜蓿根瘤菌(Rhizobium meliloti))、伯克霍尔德氏菌(例如，Burkholderiaphytofirmans)、固氮螺菌(例如，脂铁螺菌(Azospirillum lipoferum))、葡糖杆菌(例如，重氮糖杆菌(Gluconacetobacter diazotrophicus))、沙雷氏菌(例如，粘质沙雷氏菌(Serratia proteamaculans))、寡养单胞菌(例如，嗜麦芽寡养单胞菌(Stenotrophomonasmaltophilia))、肠杆菌(例如，阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae))。
靶细菌基因
本发明的iRNA应与至少一种细菌基因具有足够的序列同源性，以诱导所述至少一种基因的序列特异性沉默。另外，为防止不希望的脱靶效应，本发明的dsRNA、miRNA或小RNA种类与真核宿主基因组或有益细菌，宿主定植者和\或以宿主生物为食的哺乳动物的其他基因组的序列同源性应该几乎不存在(如果不是不存在)。
本发明的iRNA能够抑制至少一种细菌基因的表达。
根据本发明，术语“细菌基因”是指细菌中的任何基因，包括(天然)蛋白质编码基因或非编码基因，其天然存在于细菌中或通过重组DNA技术引入细菌中的人工基因。所述靶细菌基因或者对于给定的细菌种类是特异性的，或者在多种细菌种类之间是保守的。优选地，它与真核宿主基因组、宿主定植者和/或以宿主生物为食的哺乳动物的任何基因不具有同源性。这避免对植物宿主、与宿主相关的有益细菌、宿主定植者和/或以宿主生物为食的哺乳动物的附带影响。
在一个优选的实施方案中，所述至少一种细菌基因是细菌毒力因子或细菌的必需基因。
如本文所用，术语“细菌的必需基因”是指对于细菌细胞生存力必不可少的任何细菌基因。当前提是所有营养素均可获得时，这些基因是维持细菌存活绝对必需的。据认为，细菌必需基因的绝对需要的数量为约250-500。现在，通过使用转座子测序方法，从无关细菌中鉴定出这些必需基因变得相对容易。这些必需基因编码蛋白质以维持中央代谢、复制DNA、确保适当的细胞分裂和/或延伸，将基因翻译成蛋白质维持基本的细胞结构、并介导进出细胞的转运过程(34)。GyrB和FusA就是这种情况，发现它们的沉默极大地损害体外PtoDC3000的生长(图10D和图10E)。
如本文所用，术语“毒力基因”是指已显示出对以下至少一种活性起关键作用的任何细菌基因：致病性、疾病发展、特定宿主组织(例如，维管组织)或宿主细胞环境(例如，非原质体)的定植、抑制PTI和ETI反应、调节植物激素信号传导和/或生物合成以促进增殖和/或疾病发展、干扰保守的宿主调控过程以促进增殖和/或疾病发展等。尽管这些活动对于细菌在体外的存活不是必需的，所有这些活动有助于细菌在宿主中生长和/或促进宿主的疾病症状。众所周知的毒力因子是：粘附素、植物毒素(例如，冠菌素、syringoline A)、降解酶(例如，纤维素酶、纤维二糖苷酶、脂肪酶、木聚糖酶、内切葡聚糖酶、多半乳糖苷酶)、组装I/II/III/IV型或VI分泌系统所需的因子、效应蛋白、与植物细胞接触后促进Hrp基因表达所需的转录因子、正确表达毒力因子所需的机器(例如，群体感应、两组分系统)、控制毒力因子基因的mRNA的稳定性/翻译的转录后因子。
在下表中提供针对几种不同致植物病的细菌的公知细菌必需基因或毒力因子：
·对于大多数细菌：细胞分裂所需的中心因子，例如FtsZ、FtsA、FtsN、FtsK、FtsI、FtsW、ZipA、ZapA、TolA、TolB、TolQ、TolR、Pal、MinCD或肌动蛋白相关基因，例如，MreB和Mld。
·对于已知会感染普通豆类植物菜豆(Phaseolus vulgaris)并引起晕斑病的细菌丁香假单胞菌菜豆致病变种(Pseudomonas syringae pv.phaseolicola)(株Pph 1448A；Pph 1302A)：
Figure BDA0003024780770000141
·对于细菌丁香假单胞菌猕猴桃致病变种(Pseudomonas syringaepv.actinidiae),已知其会感染猕猴桃植物和水果(猕猴桃属)并引起猕猴桃溃烂：
必需基因 描述
fliR 鞭毛生物合成蛋白
flhA 鞭毛生物合成蛋白
flgC 鞭毛基体杆蛋白
flgH 鞭毛生物合成蛋白
FlgL 鞭毛倒刺相关蛋白
鞭毛基体杆修饰蛋白
·对于已知会感染大白菜并引起软腐病的细菌胡萝卜芽孢杆菌(Pectobacteriumcarotovorum)：
Figure BDA0003024780770000151
对于细菌青枯雷尔氏菌，已知其会感染例如番茄、土豆、烟草、香蕉和大豆，并引起细菌枯萎：
Figure BDA0003024780770000152
·对于细菌水稻黄单孢菌水稻致病变种，已知会感染水稻并引起水稻的细菌性叶条斑：
Figure BDA0003024780770000161
Figure BDA0003024780770000171
·对于芸苔黄单胞菌芸苔致病变种，已知会感染所有十字花科(卷心菜、西兰花、花椰菜、羽衣甘蓝、芜菁、油菜、芥菜、萝卜等)，并引起十字花科黑腐病：
必需基因 描述
B109F06(pilC) 菌毛组装蛋白
B205G02(pilB) 纤毛生源蛋白
B202G01(iroN) TonB依赖性受体
B302H04(wxcM) 双功能乙酰转移酶/异构酶
A404F11(wrcC) 糖基转移酶
C302F11(wxcA) 糖基转移酶
A105E01(nagA) N-乙酰氨基葡萄糖-6-磷酸脱乙酰酶
C110C10(rmlA) 葡萄糖-I-磷酸胸甘基转移酶
A202H06(xpsM) 通用分泌途径蛋白M
C406A04(xpsK) 通用分泌途径蛋白K
B502F09(xpsF) 通用分泌途径蛋白F
B405E02(xpsE) 通用分泌途径蛋白E
B401G05(virB8) VirB8蛋白
C109G03(engXCA) 纤维素酶
B101F11(rpfG) 反应调节子
B203D06 转导蛋白car
A308G04(trpE) 邻氨基苯甲酸合成酶组分I
B605H08(trpD) 邻氨基苯甲酸合成酶组分II
B504A10(metA) 高丝氨酸O-乙酰基转移酶
A506A08(hisF) 环化酶
C206E04 可能的限制性修饰系统特异性亚基
C111B03(cypC) 脂肪酸α羟化酶
A507C08(fadB) 对羟基肉桂酰CoA水合成酶/裂解酶
B302H05(uptB) 马来酸乙酰乙酸酯异构酶
C307G11(catB) 过氧化氢酶(前体)
B104E02(icd) 异柠檬酸脱氢酶
B106G06(ppsA) 磷酸烯醇丙酮酸合成酶
Figure BDA0003024780770000181
Figure BDA0003024780770000191
·对于细菌地毯草黄单胞菌致病变种(例如，柠檬变种和木薯变种)，已知其分别感染柑橘树和木薯并引起柑橘溃烂病和木薯细菌性枯萎病：
必需基因 描述
XAC1211(KatE) 单功能过氧化氢酶
Xac1815(XacFhaB) 推定的血球凝集素转运子蛋白
XAC3600(wzt) LPS生物合成
AvrBs2 三型分泌效应子
XopX 三型分泌效应子
XopZ 三型分泌效应子
XopAO1 三型分泌效应子
XopN 三型分泌效应子
XopQ 三型分泌效应子
·对于小球藻欧文氏菌，已知会感染苹果和梨树并引起火疫病的：
必需基因
A7/74SmSp-A20
Ea7/74SmSp-A29
Ea7/74Sm-A33
Ea7174SmSp-A38
Ea7/74Sm-A41
Ea7/74SmSp-A56
Ea7/74SmSp-A64
Ea7/74SmSp-A72
Ea7/74SmSp-A75
Ea7/74SmSp-A76
Ea7/74SmSp-A83
·对于Dickeya dadantii，已知可感染土豆、番茄、茄子、菊苣并引起软腐病：
Figure BDA0003024780770000201
·对于苛养木杆菌，已知其会感染葡萄藤和橄榄树并在葡萄藤上引起皮尔斯氏病、柑桔杂色性萎黄病、或橄榄快速衰退综合征：
必需基因 描述
rpfC 两个组分调节蛋白
(PD1709)MopB 主要外层膜蛋白
LesA 推定的脂酶/酯酶
PD1703(LipA) 脂酶
PD0928(Zot) 闭锁小带毒素
PD0986 血球凝集素样蛋白
gumD 胞外多糖生物合成基因
gumH 胞外多糖生物合成基因
xhpT 反应调节子
PD0528(XatA) 自动转运蛋白
PD0279(cgsA) 环双-GMP合成酶A
PD0062(FimA) 菌毛粘附蛋白
PD0058(FimF) 菌毛粘附蛋白
PD0731(XadA) 编码黄单胞菌粘附样蛋白A
PD1792(HxfB) 血球凝集素
·对于已知能感染土豆并引起斑马片病的土豆斑纹片病菌(CandidatusLiberibacter solanacearum)，以及已知能感染柑橘并引起柑橘绿化病的柑橘黄龙病菌亚洲型(或美洲型/非洲型)：
土豆斑纹片病菌
Figure BDA0003024780770000211
Figure BDA0003024780770000221
*指定为WP_XXXXXXXXX的基因对应于土豆斑纹片病菌
Clso-ZC1的基因的“蛋白_id”，其完整基因组在2017年4月17日具有Genebank登录号NC_014774.1
柑橘黄龙病菌亚洲型
WP_012778355 未知蛋白
WP_012778427 未知蛋白
WP_012778510 未知蛋白
WP_012778517 未知蛋白
ACT56857 serralysin
WP_012778607 含有VWA结构域的蛋白
WP_012778668 未知蛋白
WP_015452668 含有VWA结构域的蛋白
WP_015452678 未知蛋白
WP_015452727 未知蛋白
WP_015824938 未知蛋白
WP_015824940 未知蛋白
WP_015452765 含有VWA结构域的蛋白
WP_015452784 OmpA家族蛋白
WP_015452797 未知蛋白
WP_015452837 未知蛋白
WP_015824957 未知蛋白
WP_015452939 含有VWA结构域的蛋白
ACT56835 Na+/H+逆向转运NhaA
ACT56837 铁氧化还原蛋白-NADP+还原酶蛋白
*指定为WP_XXXXXXXXX的基因对应于柑橘黄龙病菌亚洲型
str.psy62的基因的“蛋白_id”，其完整基因组在2017年3月30日具有Genebank登录号NC_012985.3
这些基因中的任何一个都可以是本发明的iRNA的靶标。
在有益细菌中，要靶向的细菌基因例如为：噬菌体生产所需的负调控细菌存活的基因(例如，噬菌体底板装配蛋白GpV)、来自日本慢生根瘤菌(Bradyrhizobium japonicum)的NolA和NodD2基因，这些基因已知在高种群密度下会减少nod基因的表达，并因此降低Nod生产，共生入侵所必需的细菌信号(因此，从接种菌株中敲除这些基因应导致竞争性结瘤)，由spot42(spf)基因编码的小非编码RNA spot42,其控制碳水化合物代谢和摄取(从给定细菌中敲除该基因应导致细菌滴度增加)。在维管细菌中，要靶向的细菌基因是例如III型分泌基因。
当靶细菌是致植物病的细菌时，所述必需或毒力细菌基因可以是分泌系统的结构基因，包括III型分泌系统(例如HrcC)，
-VI型分泌系统正常运行所必需的基因(例如,TssB)，
-编码细菌效应子表达的主要调节子的基因(例如HrpL、HrpG、HrpX)，
-编码植物毒素生物合成所需因子的基因(例如，对某些丁香假单胞菌致病变种的冠菌素生物合成很重要的Cfa6)，
-毒力化合物生物合成所需的基因(例如，对于细胞外多糖EPS1的生物合成很重要的XpsR，两组分系统RavS/RavR)。
本发明的iRNA有利地与来自靶细菌病原体种类的任何这些必需基因或毒力基因具有序列同源性。
如本文所用，术语“序列同源性”是指具有序列相似性，即核酸序列之间具有足够程度的同一性或对应性的序列。在本发明的上下文中，当至少约80％、或者至少约81％、或者至少约82％、或者至少约83％、或者至少约84％、或者至少约85％、或者至少约86％、或者至少约87％、或者至少约88％、或者至少约89％、或者至少约90％、或者至少约91％、或者至少约92％、或者至少约93％、或者至少约94％、或者至少约95％、或者至少约96％、或者至少约97％、或者至少约98％、或者至少约99％的核苷酸是相似的时，两个核苷酸序列具有“序列同源性”。
相反，具有“无序列同源性”的核苷酸序列是具有小于约10％、或者小于约5％、或者小于2％的同一性程度的核苷酸序列。
优选地，通过使用Needleman和Wunsch的算法鉴定相似或同源的核苷酸序列。除非另有说明，否则本文提供的序列同一性/相似性值是指使用以下参数使用GAP版本10获得的值：使用50的GAP权重和3的长度权重以及nwsgapdna.cmp评分矩阵得出的核苷酸序列的％同一性和％相似性；使用8的GAP权重和2的长度权重以及BLOSUM62评分矩阵得出的氨基酸序列的％同一性和％相似性；或其任何等效程序。“等效程序”意指任何序列比较程序，当与由GAP 10版本产生的相应比对进行比较时，该序列比较程序针对所讨论的任何两个序列产生具有相同核苷酸残基匹配和相同序列百分比同一性的比对。
值得注意的是，本发明的iRNA不抑制在真核细胞、或真菌、昆虫、害虫或其他感染植物的病原体中表达的基因。具体而言，本发明的iRNA不抑制具有细菌起源并插入其他基因组的致癌基因的表达。更精确地，本发明的iRNA不抑制根瘤农杆菌细菌的致癌基因iiaM和ipt的表达。
嵌合沉默元件
为保护植物免受由几种细菌病原体引起的疾病的侵害，本发明的方法有利地使用与多于一个细菌基因具有序列同源性的功能性iRNA(以下称为“嵌合iRNA”)。这些嵌合iRNA优选与至少两个、三个、四个或更多个细菌必需基因和/或毒力因子(例如，上述那些)具有同源性。
此类嵌合iRNA的实例包括：
(1)与来自青枯雷尔氏菌编码因子的HrpB、HrcC、XpsR和TssB基因具有至少80％序列同源性的嵌合dsRNA，所述基因参与细菌效应子的转录活化(即，HrpB)、TTSS的装配(即，HrcC)、细胞外多糖EPS1的生物合成(即，XpsR)、以及VI型分泌系统的正常功能(即，TssB)。特别是具有序列SEQ ID NO：20(正义链)和21(反义链)的dsRNA，优选发夹RNA，其中两条链通过对应于SEQ ID NO：2的环连接；
(2)嵌合dsRNA，其与来自芸苔黄单胞菌或水稻黄单胞菌，特别是来自芸苔黄单胞菌芸苔致病变种或水稻黄单胞菌水稻致病变种的HrpG、HrpX和RsmA基因具有至少80％的序列同源性：HrpG编码HrpX的调节子，这是黄单孢菌效应子转录活化所必需的，而RsmA编码RNA结合蛋白，在黄单胞菌的致病性和毒力因子的正确表达中起关键作用。特别是具有序列SEQ ID NO：22(正义链)和23(反义链)的dsRNA，优选发夹RNA，其中两条链通过对应于SEQID NO：2的环连接；
(3)与来自不同丁香假单孢菌致病变种(包括pto DC3000和丁香假单孢菌致病变种CC440)的必需基因RpoB、RpoC和FusA具有至少80％序列同源性的嵌合dsRNA。特别是具有序列SEQ ID NO：24(正义链)和25(反义链)的dsRNA，优选发夹RNA，其中两条链通过对应于SEQ ID NO：2的环连接；
(4)与来自不同丁香假单孢菌致病变种(包括pto DC3000和丁香假单孢菌致病变种CC440)的必需基因SecE、RpoA和RplQ具有至少80％序列同源性的嵌合dsRNA。特别是具有序列SEQ ID NO：26(正义链)和27(反义链)的dsRNA：优选发夹RNA，其中两条链通过对应于SEQ ID NO：2的环连接；
(5)与来自不同黄单胞菌致病变种的必需基因NadHb、NadHd和NadHe具有至少80％序列同源性的嵌合dsRNA。特别是具有序列SEQ ID NO：28(正义链)和29(反义链)的dsRNA，优选发夹RNA，其中两条链通过对应于SEQ ID NO：2的环连接；
(6)与来自不同黄单胞菌病致病变种的必需基因DnaA、DnaE1和DnaE2具有至少80％序列同源性的嵌合dsRNA。特别是具有序列SEQ ID NO：30(正义链)和31(反义链)的dsRNA，优选发夹RNA，其中两条链通过对应于SEQ ID NO：2的环连接；
靶向这些基因的嵌合iRNA的其他例子包括：
-同时靶向青枯雷尔氏菌的HrpG、HrpB和HrcC基因的dsRNA，特别是具有序列SEQID NO：18(正义链)和19(反义链)的dsRNA，优选发夹RNA，其中两条链通过对应于SEQ IDNO：2的环连接；
-同时靶向Pto DC3000的HrpL和Cfa6基因的dsRNA，特别是具有序列SEQ ID NO：1(正义链)和3(反义链)的dsRNA，优选发夹RNA，其中两条链通过对应于SEQ ID NO：2的环连接；
-同时靶向Pto DC3000的AvrPto和AvrPtoB基因的dsRNA，特别是具有序列SEQ IDNO：14(正义链)和15(反义链)的dsRNA，优选发夹RNA，其中两条链通过对应于SEQ ID NO：2的环连接；
-同时靶向带有lux标签的Pto DC3000的LuxA和LuxB基因的dsRNA，特别是具有序列SEQ ID NO：108(正义链)和109(反义链)的dsRNA，优选发夹RNA，其中两条链通过对应于SEQ ID NO：2的环连接；
在一个优选的实施方案中，本发明的iRNA是嵌合iRNA，其抑制至少一个编码如上所定义的细菌细胞的毒力因子或必需基因的基因，以及至少一个编码已知对HIGS敏感的其他病原体或寄生虫的毒力因子或必需基因的其他基因。它也可以是来自非细菌性病原体或植物寄生虫的毒性次级代谢产物的生物合成所需的基因。
所述其他基因，例如，选自：已知杀真菌剂靶标(例如，来自镰刀菌枯萎病(FHB)的致病原的禾谷镰刀菌的细胞色素P450羊毛甾醇C-14α-脱甲基酶(CYP51)(20)；来自无关真菌的必需基因或致病性因子(例如，坏死性真菌葡萄孢菌(Botrytis cinerea)和大黄萎病菌(Verticilium dahliae)的DCL1和DCL2(15))；来自禾谷镰刀菌的几丁质合酶Ch3b(35)；来自大刀镰刀菌(Fusarium culmorum)的β-1，3-葡聚糖合酶(FcGls1)、促分裂原活化蛋白激酶1(FsFmk1)、含mysosin motor结构域的几丁质合酶V(FsChsV)(36)；来自小麦黄锈病(Puccinia triticina)的MAP激酶(PtMAPK1)或亲环蛋白1(PtCYC1)(37)；来自导致小麦条锈病的小麦条锈菌(Puccinia striiformis)的小麦叶锈病的致病原和PsCPK1(38))；来自卵菌病原体的必需基因或致病因子(例如，来自导致莴苣霜霉病的莴苣霜霉菌(Bremialactucae)的高丰度的信使34(HAM34)或纤维素合酶(CES1)(39))；关键的毒性次级代谢产物的生物合成所需的基因，例如AflC基因，其是曲霉菌(Aspergillus)中黄曲霉毒素生物合成所必需的，并且对转基因玉米中的HIGS技术敏感(40)。
在另一个优选的实施方案中，本发明的方法使用：(i)一种或多种靶向在大量细菌病原体中保守的必需基因或毒力基因的广泛序列区域的iRNA，或(ii)一种或多种靶向来自无关细菌病原体的必需的基因或毒力因子的iRNA。该方法的这种特定实施方案赋予针对多种细菌病原体的广谱保护。本发明的iRNA有利地是如上所述的长dsRNA、miRNA和/或siRNA。
在一个特定的实施方案中，本发明的方法还包括向植物引入一个或多个dsRNA；其靶向非细菌的寄生物(诸如病毒、真菌、卵菌、昆虫或线虫)的一个或多个基因。在该实施方案中，iRNA针对寄生物的必需基因或毒力基因。靶向寄生物的基因的一个或多个iRNA有利地与靶向细菌基因的iRNA同时递送或共表达。这种方法对于同时预防或治疗由细菌病原体和其他寄生物导致的疾病有用。可以使用如上所述的与细菌以及其他病原体/寄生物基因具有序列同源性的嵌合iRNA、或iRNA分子的混合物(其中一些与细菌基因具有同源性、而另一些与来自其他病原体/寄生物的基因具有同源性)进行该方法。
本发明的载体
在一个优选的实施方案中，本发明的长RNA和小RNA是分离的、裸RNA分子，其分别直接用于生产者植物细胞和靶细菌细胞。
在另一个优选的实施方案中，本发明的长RNA由重组DNA构建体编码，所述重组DNA构建体促进导入植物细胞和/或促进长RNA在所述植物细胞中的表达。所述重组构建体可以是可商业上可获得的质粒或载体。优选地，其是如下所述的植物表达载体。
因此，本发明还涉及植物重组DNA载体(或“植物DNA构建体”)或植物病毒载体，其包含编码至少一种抑制至少一种细菌基因表达的功能性干扰RNA(iRNA)的多核苷酸序列，其中所述多核苷酸序列可在真核细胞中表达。
所述功能性iRNA如上文所定义，为短或长的dsRNA、长的ssRNA、siRNA或miRNA，优选地，所述功能性iRNA为长的dsRNA、长的ssRNA、siRNA或miRNA。
所述至少一种细菌基因优选是如上定义的必需或毒力细菌基因。
在一个实施方案中，载体是DNA载体。所述DNA载体有利地包含转录单元，所述转录单元包含：转录起始区、转录终止区、和编码本发明的iRNA的多核苷酸，其中所述多核苷酸序列以允许iRNA分子在真核细胞中表达的方式可操作地连接至所述起始和终止区。
在一个优选的实施方案中，所述真核细胞是能够表达大量iRNA的植物细胞，例如，非常适合农杆菌介导的瞬时转化的本氏烟草(N.benthamiana)叶子。
本发明的DNA载体可以编码本发明的iRNA分子的一条或两条链，或编码自身杂交成dsRNA双链体的单个自身互补链。转录起始区域可能来自针对真核RNA聚合酶II或III(pol II或III)的启动子，包括在植物细胞中有活性的病毒启动子，例如，CaMV 35S启动子，因为这些启动子的转录本在植物生物的所有细胞中都高水平表达。适用于在植物细胞中表达异源基因的多种启动子是本领域可获得的。它们可以例如从植物病毒获得。它们包括组成型启动子，即，大多数环境条件下在大多数组织和细胞中均具有活性的启动子，以及仅在或主要在某些组织或某些细胞类型中具有活性的组织特异性或细胞特异性启动子，以及响应化学刺激而活化的可诱导启动子。另外，可在本发明中使用用于从细菌病原体保护植物的器官或组织特异性启动子包括，特别是，在与细菌病原体的进入和增殖有关的组织/细胞类型(例如，在hydrothodes、防御细胞、木质部薄壁组织细胞、和毛状体基部周围的细胞)中有活性的启动子。
所述转录终止区优选被真核RNA聚合酶识别，更优选被Pol II或Pol III识别。例如，所述转录终止子可以是TTTTT序列。
适于dsRNA分子表达的大量DNA载体是本领域技术人员已知的并且是商业上可获得的。合适载体的选择和在其中插入DNA构建体的方法是众所周知的。能够稳定表达dsRNA分子的重组载体可以转化进入植物原位，并在靶细胞中持续存在。载体的选择取决于预期的宿主和所述宿主的预期转化方法。
在一个实施方案中，载体是病毒载体。所述病毒载体优选选自各种重组植物RNA病毒(例如，烟草花叶病毒、烟草拨浪鼓病毒、土豆X病毒、大麦条纹花叶病毒、番茄丛矮病毒)，其可用于植物细胞通过VIGS产生大量小RNA(11)。在此，病毒载体的选择还取决于预期的宿主和所述宿主的预期感染方法。这些重组植物病毒触发植物原位小RNA的产生，这些小RNA可以抑制至少一种细菌基因靶标的表达。
本发明还包含含有一种或多种标记基因的重组DNA载体或病毒载体，其允许选择转化的宿主细胞。
在一个优选的实施方案中，本发明的DNA或病毒载体包含编码如上所定义的两个、三个、或四个功能性干扰RNA(iRNA)基因的多核苷酸序列，因此能够抑制两个、三个、或四个不同的细菌基因。技术人员可以通过常规方法鉴定iRNA的最佳组合。超过四个靶基因的组合也包括在本发明内。
在一个实施方案中，本发明的DNA载体包含序列SEQ ID NO：1-31和108-109中的至少一个，特别是序列SEQ ID NO：1-31中的至少一个，以及优选序列系统：SEQ ID NO：1-2-3；14-2-15；18-2-19；20-2-21；22-2-23；24-2-25；26-2-27；28-2-29；30-2-31、108-2-109，更优选的是序列系统：SEQ ID NO：1-2-3；14-2-15；18-2-19；20-2-21；22-2-23；24-2-25；26-2-27；28-2-29；30-2-31。
在另一个实施方案中，本发明的DNA载体包含序列SEQ ID NO：88-97中的至少一个，优选是序列系统：SEQ ID NO：88-89、90-91、92-93、94-95、96-97。
本发明的DNA载体可以通过本领域已知的常规方法制备。例如，它可以通过PCR或RT-PCR扩增核酸序列，通过与同源探针杂交筛选基因组DNA文库，或通过全部或部分化学合成来产生。可以通过本领域已知的常规技术将重组载体引入宿主细胞。
本发明的抗菌方法和用途
在另一方面，本发明涉及抑制靶细菌细胞中至少一个基因表达的体外方法，所述方法包括使所述靶细菌细胞与本发明的一个或多个小RNA或者包含其的组合物接触的步骤。对于在植物细胞接触中被转录活化的毒力因子，将使用特定的培养基(例如，已知激活植物毒素和Hrp基因表达所需的表转录因子的表达的基本培养基，或如在本发明的半体内气孔重新打开测定中，存在叶子)。
换句话说，本发明涉及小RNA或包含小RNA的组合物在体外用于抑制靶细菌细胞中至少一个基因表达的用途，其中所述靶细菌细胞与所述小RNA或所述组合物直接接触。
优选地，所述小RNA是单链或双链siRNA、或单链或双链miRNA双链体。更优选地，如果所述细菌细胞是致病性的，则所述小RNA抑制至少一种编码毒力因子的基因或必需基因或抗细菌抗性基因的表达，如果所述细菌细胞是有益的，或抑制至少一种编码生长抑制因子的基因或对于宿主有用的途径的负性调节子的基因的表达。
优选地，所述组合物包含从生产者植物细胞获得的植物提取物，所述植物细胞表达至少一种长dsRNA，其对所述细菌细胞的至少一种基因具有特异性。更优选地，所述组合物包含从所述植物细胞回收的总RNA、或总小RNA、或非原质体流体、或细胞外囊泡，或细胞外游离小RNA。所述生产者植物细胞例如选自：烟草(例如，本氏烟草、红花烟草(Nicotianatobaccum))；芋头(槟榔芋(Colocasia esculenta))；姜(Zingiber officinale)，拟南芥(例如，Arabidopsis thaliana)；番茄(例如，栽培番茄(Lycopersicon esculentum)或Solanum lycopersicum)；土豆(Solanum tuberosum)；水稻(Oryza sativa)；玉米(Zeamays)；大麦(Hordeum vulgare)；小麦(例如，普通小麦(Triticum aestivum)、硬质小麦(Triticum durum))、棉籽、棉花、豆、香蕉/车前草、高粱、豌豆、甘薯、大豆、卷心菜、木薯、洋葱、甜瓜、燕麦、花生、向日葵、棕榈油、黑麦、柑橘、小麦、胡椒、山药、橄榄、葡萄、芝麻、甘蔗、甜菜、豌豆和咖啡、橘树、苹果树、柑桔树、橄榄树等。
观赏植物也可以用于产生本发明的所述小RNA。这些观赏植物是例如菊花(例如杭菊(Chrysanthemum morifolium))、凤仙花、天竺葵、天竺葵属植物、福禄考、杜鹃花红掌属(Rhododendron anthurium spp)、玫瑰树、姜黄、红掌、秋海棠、罗莎木槿、孤挺花、马蹄莲、马蹄莲、仙客来、龙血树等。
“抑制至少一个基因的表达”，在本文中是指所述基因的表达降低，即，靶序列的mRNA或蛋白质水平在统计学上低于在暴露于靶向无关基因(例如真菌基因)的对照小RNA的合适对照细菌中相同靶序列的mRNA或蛋白质水平。特别地，降低根据本发明的细菌中靶基因的mRNA多核苷酸水平和/或多肽水平，导致实现相较于合适的对照细菌中相同靶序列的mRNA多核苷酸水平或由其编码的多肽水平，小于60％、小于50％、小于40％、小于30％、小于20％、小于10％、或小于5％的mRNA多核苷酸水平或由其编码的多肽水平、。评估RNA转录本的表达水平、由靶基因编码的多肽的表达水平、或所述多核苷酸或多肽的活性的方法是本领域众所周知的。
在一个实施方案中，本发明的小RNA包含序列SEQ ID NO：1-31和108-109中的至少一个；尤其是序列SEQ ID NO：1-31中的至少一个，优选序列系统：SEQ ID NO：1-2-3；14-2-15；18-2-19；20-2-21；22-2-23；24-2-25；26-2-27；28-2-29；30-2-31、108-2-109，更优选的是序列系统：SEQ ID NO：1-2-3；14-2-15；18-2-19；20-2-21；22-2-23；24-2-25；26-2-27；28-2-29；30-2-31。
在另一个实施方案中，本发明的小RNA包含序列SEQ ID NO：88-97中的至少一个，优选是序列系统：SEQ ID NO：88-89、90-91、92-93、94-95、96-97。
在这方面，可以靶向任何类型的细菌。如上所述，可以靶向致病细菌或有益细菌。
在一个实施方案中，该方法对于抑制或限制样本中的致病细菌的致病性和生长特别有意义。它也可用于杀死样本中的病原细菌细胞。
在另一个实施方案中，如上所述，该方法还可用于通过抑制直接或间接地负调节细菌生长的基因，来促进有益细菌的复制。
在另一个实施方案中，还可以通过靶向参与对所述抗菌化合物的细菌抗性的基因，来使用该方法来恢复细菌细胞对抗菌化合物的敏感性。
“抗菌化合物”，是指用于或提议用于杀死细菌的化合物。在植物检疫领域中使用的经典抗菌化合物是，例如，铜基杀菌剂或衍生自大-和微-生物的次级代谢产物。
小RNA的使用量通常取决于细菌的数量和所靶向细菌的类型。该量可以是10到30ng/μl的总RNA，其中包含有效的小RNA。
本发明的植物疗法的方法和用途
根据本发明，通过使用上述用于表达核酸的标准方法将本发明的一种或多种iRNA引入植物细胞。在本领域中可获得的用于真核细胞遗传转化的多种方法可用于许多植物物种。作为非限制性实例，可以提及弹丸轰击、病毒介导的转化、农杆菌介导的转化等。不包括电穿孔。
在将核酸插入细胞中的上下文中的术语“引入”，指“转染”、或“转化”、或“转导”以及包括提及将核酸掺入到真核细胞中，其中所述核酸可以稳定的掺入到细胞基因组(例如，染色体、质粒)中、或瞬时表达(例如，通过根瘤农杆菌瞬时递送基因构建体)。
本发明的iRNA在宿主植物细胞中的表达可以是瞬时的或稳定的。稳定表达特别指使用常规技术制备转基因植物。
通过使用植物Dicer-样酶和其他小RNA加工因子将所述iRNA加工成siRNA或miRNA双链体。然后，将所述小RNA双链体和/或成熟的小RNA向导(即，载入AGO中)转位至细胞外培养基中或植物细胞表面，在此它们可能会遇到细菌细胞。
如以下实施例(实施例4、5和图4-6)所示，当在本发明的成熟iRNA分泌的条件下，当放置细菌细胞与本发明的植物细胞接触时，细菌细胞的生长和毒力均降低。
在一个方面，本发明涉及一种用于处理靶植物抵抗细菌感染的方法，所述方法包括以下步骤：向所述靶植物的至少一个细胞中引入特异性靶向毒力细菌基因、或必需细菌基因、或抗菌抗性基因的长dsRNA分子。
在另一方面，本发明涉及用于处理植物抵抗细菌感染的基于RNAi的生物防治方法，所述方法包括，在细菌感染之前和/或之后，将小RNA、或包含此类小RNA的植物提取物、或包含这些小RNA(例如，稳定或瞬时表达这些小RNA实体的植物细胞或组织中提取的总RNA)的组合物递送到植物组织上的步骤。
优选地，所述组合物包含从植物细胞获得的植物提取物，所述植物细胞表达至少一种对所述至少一种毒力或必需或抗菌抗性细菌基因具有特异性的长dsRNA。更优选地，所述组合物包含从所述植物提取物中回收的EV，或由所述植物细胞分泌并在所述植物提取物中回收的细胞外游离小RNA，或从所述植物提取物中回收的非原质体流体。甚至更优选地，所述组合物是液体可喷洒组合物。
在这方面，细菌细胞最终直接与小RNA(即，siRNA或miRNA)接触，在革兰氏阴性细菌的情况下，小RNA能够穿过细菌的双膜并到达细菌细胞的胞浆中，在这里将以序列特异性的方式沉默靶基因，从而导致细菌致病性的减弱(参见实施例5-7和图4-图6以及图9-图10)。
如本文所用，术语“小RNA”指具有本发明的iRNA的抑制活性的小RNA。具体而言，它们是与至少一种细菌基因，优选地与至少一种细菌毒力或必需基因，更优选地与至少一种以上引用的基因具有至少80％的序列同源性的siRNA或miRNA(双链体或单链体)。这些小RNA通常包含不超过40个碱基对。优选地，它们包含18至30个之间，更优选地18至25个之间的碱基对。更优选地，所述小RNA特异性抑制以上定义的细菌必需或毒力基因中的至少一种。
优选地，如上所述，这些小RNA是双链siRNA。这些双链RNA可以包埋进细胞外囊泡中和/或与RNA结合蛋白结合。
本发明的另一方面涉及如上定义的至少一种iRNA或包含该iRNA的载体作为植物治疗剂的用途。优选地，所述iRNA或载体用于治疗由植物中致病细菌引起的疾病、或用于预防植物中的细菌感染。
在一个实施方案中，该植物治疗性iRNA是短或长的dsRNA、siRNA双链体、或miRNA双链体、siRNA单链体或miRNA单链体，如上文所定义。在又一个实施方案中，iRNA靶向细菌基因和如上所定义的其他非细菌病原体或寄生虫的基因，用于同时预防或治疗植物中细菌病原体和其他病原体/寄生物引起的疾病。本文涵盖针对iRNA、载体和转化方法提出的所有实施方案，并且不需要重复。
在植物检疫技术问题的情况下，可以通过各种方式(例如通过喷洒)将所述小RNA递送至植物组织。它们可以包埋在微球、纳米颗粒、脂质体、或天然外泌体中。优选的制剂在下面公开。
本发明的转基因植物
在下文中，将用本发明的iRNA转化并能够产生本发明的小RNA的植物细胞称为“本发明的植物细胞”或“本发明的宿主细胞”。它们含有至少一种iRNA(优选长RNA)或如上所定义的DNA构建体或载体，所述iRNA含有至少一种特异性靶向细菌基因(例如，毒力、或必需细菌基因)的序列。本发明的植物细胞能够产生和分泌抑制细菌毒力、致病性和增殖的小RNA。
用编码长RNA的转基因稳定转化的植物可以作为种子、生殖材料、增殖材料、或细胞培养材料提供，其不主动表达长RNA但具有这样做的能力。
如果它们仅用于产生本发明的小RNA，则可以将它们称为“生产者植物细胞”。如果它们将从产生的小RNA赋予的抗菌作用中受益，它们也可以称为“靶植物”。两种类型的植物(生产者和靶植物)都是表达和产生本发明小RNA的重组细胞。
本文中的术语“植物”涵盖植物细胞、植物组织、植物部分、整株植物、其祖先及其后代。植物部分可以是植物的任何部分或器官，并且包括例如种子、果实、茎、叶子、枝、花、花药、根、块茎和叶柄。术语“植物”还涵盖悬浮培养物、胚胎、分生组织、区域、愈伤组织、配子体、孢子体、花粉和小孢子。其指所有植物，包括蕨类和树木。
在另一方面，本发明涉及稳定或瞬时表达至少一种本发明的功能性iRNA的分离的植物细胞或转基因植物。其还涉及含有本发明的DNA、或病毒载体的分离的植物细胞。所述植物细胞可以是通过用所述DNA载体转化而获得的遗传修饰的细胞。转化方法的实例是农杆菌介导的转化或鸟枪介导的转化。
所述植物细胞也可以是用所述病毒载体通过感染或通过农杆菌介导的转化而获得的修饰的细胞。
编码iRNA的DNA可以在植物细胞染色体中瞬时表达或稳定整合。
本文涵盖以上针对植物细胞、iRNA、载体和转化方法提出的所有实施方案，并且不需要重复。
在下面的实施例部分中公开产生这种转基因植物的方法。其包括以下步骤：
i)用表达本发明的至少一种功能性干扰RNA的DNA载体转化植物细胞，或
ii)用表达本发明的至少一种功能性干扰RNA的植物病毒，优选植物RNA病毒感染植物细胞，
持续足够的时间(对于烟草植物通常为3-4天)，使植物细胞稳定或瞬时表达大量的小RNA。
“显著量”在本文中是指在如上所述的测试中已显示具有抗菌作用的量。该显著量优选可以包含10到30ng/μl的表达有效小RNA的总RNA。
特别地，所述转基因植物能够宿主诱导细菌的基因沉默，并且包含能够下调或抑制细菌的至少一个基因表达的可表达的成熟小RNA。如发明人所证明，所述小RNA能够跨越或跨过靶细菌的双膜传播。
在另一方面，本发明涉及稳定或瞬时表达本发明的成熟小RNA的靶转基因植物。在一个实施方案中，所述靶转基因植物包含本发明的DNA载体。在一个优选的实施方案中，所述靶植物是水稻、玉米、大麦、棉籽、棉花、豆、香蕉/车前草、高粱、豌豆、甘薯、大豆、卷心菜、木薯、土豆、番茄、洋葱、甜瓜、燕麦、花生、向日葵、棕榈油、黑麦、柑橘、小麦、胡椒、山药、橄榄、葡萄、芋头、烟草、芝麻、甘蔗、甜菜、豌豆和咖啡、橘树、苹果树、柑桔树和橄榄树。本文涵盖针对iRNA、载体和转化技术提出的所有实施方案，并且不需要重复。
观赏植物也可以用作本发明小RNA的靶标。这些观赏植物是例如，菊花(例如，杭菊(Chrysanthemum morifolium))、凤仙花、天竺葵、天竺葵属植物、福禄考、杜鹃花红掌属、玫瑰树、姜黄、红掌、秋海棠、罗莎木槿(Hibiscus rosa-sinensis)、孤挺花、马蹄莲、龙血树等。
另一方面、稳定或瞬时表达本发明的成熟小RNA的“生产者植物”选自：烟草(例如本氏烟草、红花烟草)；芋头(槟榔芋)；姜(Zingiber officinale)、拟南芥(例如，Arabidopsis thaliana)；番茄(例如，栽培番茄或Solanum lycopersicum)；土豆(Solanumtuberosum)；水稻(Oryza sativa)；玉米(Zea mays)；大麦(Hordeum vulgare)；小麦(例如，普通小麦、硬质小麦)。优选的生产者植物是烟草、芋头和姜。
包含本发明的沉默元件的组合物
在另一方面，本发明涉及含有本发明的小RNA和任选地生理或农学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂的植物治疗组合物。特别地，本发明涉及植物治疗组合物，其包含显著量的siRNA或miRNA、以及任选地生理或农学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂和/或杀菌化合物，所述siRNA或miRNA抑制至少一种细菌基因表达，优选抑制一种必需或毒力细菌基因或抗菌抗性基因。
本发明的植物治疗组合物中包含的小RNA可以是合成的、或者可以从稳定或瞬时表达所述小RNA的植物、植物组织或植物细胞获得。特别地，被本发明的DNA载体稳定或瞬时转化、或被本发明的病毒载体感染的植物、植物组织或植物细胞将产生小RNA。因此，本发明的植物治疗组合物可以包含稳定或瞬时表达目的小RNA的植物、植物组织或植物细胞的总RNA、或包含通过常规方法产生的总RNA或合成RNA的纯化的小RNA级分。
如上文在节段“转基因植物”中所述，为了产生稳定或瞬时表达本发明的小RNA的植物、植物组织或植物细胞的总RNA，本发明的DNA或病毒载体可用于转化所述植物、植物组织或植物细胞。然后，通过本领域已知的方法提取总RNA。
因此，在一个特定方面，本发明还涉及包含如上所述的本发明的DNA或病毒载体的组合物，其可用于在植物中产生本发明的小RNA，从而最终产生本发明的植物治疗组合物。
这些组合物优选用于制备植物治疗组合物的方法，包括以下步骤：
a)如上所述，生成产生siRNA或miRNA的重组转基因植物细胞，所述siRNA或miRNA特异性抑制致植物病的细菌的细菌必需基因或细菌毒力基因或抗生素抗性基因，
b)从所述重组植物细胞中回收含有大量所述siRNA或miRNA的细胞植物提取物、或细胞外囊泡、或非原质体流体、或细胞外游离小RNA，
c)任选地，在所述植物治疗组合物中添加赋形剂或另一种活性成分。
“显著量”在本文中是指，如上所述在测试中已显示具有抗菌作用的量。该量优选地为10至30ng/μl总RNA，其表达有效小RNA。
如上所述，可以使用含有dsRNA前体(短或长，取决于生成的小RNA种类)、或其他小RNA前体的植物治疗组合物，这些小RNA前体可能会被加工、并可能通过植物RNA依赖性RNA聚合酶与DCL指导的dsRNA加工作用而扩增，产生有效的抗菌小RNA。
因此，本发明还涉及植物治疗组合物，其含有大量抑制必需细菌基因、或毒力细菌基因、或抗菌抗性细菌基因的表达的小RNA。
这些小RNA优选地包含在来自本发明的转基因植物的总RNA提取物、或细胞外囊泡、或非原质体流体或细胞外游离小RNA级分中。
本发明涉及这些组合物用于抑制或预防靶植物上细菌的生长或致病性的用途。
在一个实施方案中，本发明的沉默元件可以作为外部组合物(例如，喷洒剂)提供给植物、植物部分、种子或栽培区域。在另一个实施方案中，直接用DNA构建体或表达盒稳定或瞬时转化植物，或用病毒载体感染植物，以表达至少一个沉默元件。但是，优选将稳定或瞬时转化的植物用于产生本发明的小RNA，然后将本发明的小RNA提供给目的植物以针对一种或多种病原细菌进行保护。
如(41)中所公开的，本发明的沉默元件也可以通过躯干注射和叶柄吸收来施加。
本发明的植物治疗组合物还可包含细胞(例如，粗的植物细胞提取物)，在所述细胞中编码本发明的iRNA的多核苷酸稳定地整合到基因组中并且可操作地连接到细胞中的活性启动子中。还涵盖组合物，其包含细胞提取物的混合物，一些细胞提取物来自表达至少一种本发明的iRNA的植物细胞。在其他实施方案中，本发明的植物治疗组合物不包含任何细胞。
在一个实施方案中，将组合物外部施用于植物上(即，通过喷洒栽培田间或区域)以保护植物免受细菌感染。在另一个实施方案中，通过躯干注射和叶柄吸收来施加。
可以将本发明的植物治疗组合物配制成农业上合适的和/或环境可接受的载体。这样的载体可以是待处理植物可以耐受的任何材料。此外，载体必须使得组合物在控制细菌感染方面保持有效，并且对以处理植物为食的动物或昆虫无毒。这样的载体的实例包括水、盐水、林格氏溶液、右旋葡萄糖或其他糖溶液、汉克氏溶液和其他水性生理平衡的盐溶液、磷酸盐缓冲液、碳酸氢盐缓冲液和Tris缓冲液。
本发明的组合物可以浓缩形式(例如，浓缩水溶液)提供。它甚至可以冷冻形式或冷冻干燥或冻干粉末形式提供。后者对于长期存储而言可能更稳定，并且可以在使用前立即解冻和/或用合适的稀释剂复溶。
这些组合物还可包含表面活性剂、惰性载体、防腐剂、湿润剂、进料刺激剂、引诱剂、包囊剂、粘合剂、乳化剂、染料剂、紫外线保护剂、缓冲剂、流动剂或肥料、微量营养素供体、或其他影响植物生长的制剂。一种或多种农用化学品，包括但不限于除草剂、杀虫剂、杀真菌剂、杀菌剂、杀线虫剂、软体动物杀灭剂、杀螨剂、植物生长调节剂、收割助剂和肥料，可以与在制剂领域习惯上使用的载体、表面活性剂或助剂、或其他组分结合使用，以促进产品处理和针对特定靶细菌的应用。合适的载体和助剂可以是固体或液体，并且对应于制剂技术中通常使用的物质，例如，天然或再生的矿物质、溶剂、分散剂、湿润剂、增粘剂、粘合剂、或肥料。
本发明的组合物可以是固体缓慢释放制剂、用于杀虫用途的干散布颗粒形式的表面活性硅藻土制剂、由固体疏水核形成的水不溶性脂球、微胶囊等，所述固体疏水核具有在核表面上包埋进一层磷脂。
赋形剂的性质和组合物的物理形式可以根据需要治疗的植物部分的性质而变化。
本发明的活性成分(即，沉默元件)通常可以施用于将要被感染或已经被感染的作物区域、植物、生殖器官、水果、种子和根。
施用包含至少一种沉默元件的活性成分或组合物的方法包括、但不限于，叶柄吸收、叶子施用、种子包衣和土壤施用。施用次数和施用率取决于细菌感染的强度。
具体地，本发明的组合物可以通过例如喷洒、雾化、撒粉、散布(scattering)、包衣或倾倒，引入土壤中或土壤上、引入灌溉水中，在细菌感染开始时或在细菌感染之前作为保护措施通过种子处理或一般施用或撒粉而施用。
本发明还涉及所述植物治疗组合物在抑制或预防靶植物上细菌的生长或致病性中的用途。
换句话说，本发明的组合物可用于：
-处理和/或预防和/或控制细菌致病性，
-处理和/或预防和/或控制细菌生长，
从而提高植物产量。
包含本发明小RNA的细胞外囊泡
在一个优选的实施方案中，本发明的小RNA或其前体被包含在其将得到保护以免受RNA酶作用的天然细胞外囊泡(EV)中或人工囊泡中。无毒且可降解的层状双氢氧化物(LDH)粘土纳米片也可用于携带抗菌iRNA。它们已经被成功地用于递送抗病毒dsRNA，并且被发现可以提供至少20天的病毒保护(42)。
现在已经发表许多研究，强调EV在将小RNA递送到植物真核病原体中重要的保护作用(17、19)。
本文的本发明人表明，从植物向细菌递送小RNA，也至少部分地通过转基因植物分泌的EV发生(图9B)。
因此，本发明的组合物优选包含已经由本发明的转基因植物分泌的EV。
EV具有不同的尺寸直径(43、44)。它们包含源自亲本细胞的胞质和膜蛋白(43-46)。它们还包含功能性mRNA、长非编码RNA、miRNA前体以及成熟的miRNA和siRNA(17、19、47、48)。
EV的纯化可通过多种方法进行，最常见和最优选的方法是差速超速离心(43、44)。
更特别地，有可能通过如先前所述的过滤和差速离心步骤从植物细胞中获得EV(43，44)。简而言之，将用于收集非原质体洗涤流体的经典缓冲液(例如，pH 6MES缓冲液)对叶子进行真空浸润，然后进一步低速离心(44)。如最近所述(44)，进一步成功收集、过滤和离心非原质体洗涤流体。可以从非原质体流体中以40,000g的离心速度从拟南芥中回收大约50到300nm尺寸的植物EV群体(中位数在150nm)(44)。拟南芥中约10-20nm尺寸范围的较小EV也可以通过以下方法回收：通过以40,000g的离心速度从非原质体流体中进行差速超速离心，然后在上一步获得的上清液中以100,000g的速度进行另一次离心(44)。也可以使用专用柱(例如，Amicon Ultra-15 Centrifugal Filters Ultracel 30K)浓缩植物EV，并将其重新悬浮在专用缓冲液中，以便随后将其用于细菌细胞孵育(体外测定)或在细菌感染之前或之后进行外源施用于植物表面(植物测定)。
本发明的组合物还可包含由本发明的转基因植物分泌的、与蛋白质不结合的非原质体EV游离小RNA。这些小RNA种类在此处称为细胞外游离小RNA或“efsRNA”。这些小RNA种类可通过从以下回收获得：从涉及以100,000g的离心速度进行的非原质体流体的差速超速离心所得的上清液，或从以40,000g、接着以100,000g离心速度进行的非原质体流体的差速超速离心的上清液。所得上清液可在专用缓冲液中混合，或直接用于与细菌细胞孵育(体外测定)，或在细菌感染之前或之后外源施用于植物表面(在植物原位测定中)。
这些EV级分有利地以冷冻形式、或以冷冻干燥、或冻干粉末形式保存或提供，在这些形式中它们保持其高功能性。
具有杀菌化合物的试剂盒
所述组合物可以与其他化合物同时或连续施用。
在一个优选的实施方案中，本发明的植物治疗组合物除包含本发明的沉默元件之外，还包含杀菌化合物。当本发明的沉默元件抑制触发对所述杀菌化合物抗性的基因的表达时，这是特别合适的。
在这种情况下，本发明的组合物可以作为“试剂盒”提供，其在分开的容器中包含本发明的沉默元件(上文定义的小RNA)和相应的杀菌化合物。
所述试剂盒优选包含本发明的植物治疗组合物，其含有携带小RNA的EV和相应的杀菌化合物。
本发明还涉及所述组合产物用于抑制、或预防细菌在靶植物上的生长或致病性的用途。
在其他方面，本发明涉及一种用于处理靶植物抵抗细菌感染的方法，所述方法包括以下步骤：向所述靶植物的细胞中引入靶向至少一个抗菌抗性基因的长dsRNA分子，并将相应的抗菌化合物递送至所述植物。
本发明还涉及处理靶植物以抵抗细菌感染的方法，所述方法包括以下步骤：在细菌感染之前和/或之后，向靶植物组织递送抑制至少一个抗菌抗性细菌基因的小RNA、或含有这种小RNA的组合物、以及相应的杀菌化合物。
优选地，在杀菌化合物之前(例如，若干小时前，通常两小时之前)施用小RNA或含有其的EV。
本发明的筛选系统
在一个特定的实施方案中，本发明的方法还可以用作实验研究的工具，特别是在功能基因组学领域。事实上，使用小分子RNA下调细菌基因可以用于以类似于线虫类蠕虫秀丽隐杆线虫(C.elegans)以及黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)领域中描述的类似方法来研究基因功能。这种方法对于不能在体外培养的细菌特别有用。
基于靶向特定细菌基因的下调或上调(导致可测量的表型)的测定，为鉴定抗菌剂提供了新的工具。
发明人确实已经进一步开发了在植物原位测定之前鉴定具有抗菌活性的候选小RNA的测定法(对于实验者而言，植物原位测定更为耗时)。如图8C/D所示，该系统可依赖于使用成熟的农杆菌介导的烟草叶子瞬时转化的小RNA的瞬时表达。随后可以将相应的候选siRNA与细菌细胞一起孵育(在细菌细胞附近存在植物组织/提取物的情况下，或在体外培养基中，例如，模拟宿主环境的基本培养基，已知其触发毒力因子的表达)。
在另一方面，本发明涉及允许快速、可靠和成本有效地鉴定具有抗菌活性的功能性iRNA的体外筛选方法，所述方法包括以下步骤：
a)在植物细胞中表达抑制至少一种细菌基因的小RNA，收集所述植物细胞分泌的植物提取物或总RNA，
b)将所述植物细胞、或所述小RNA、或所述提取物与细菌细胞(在体外培养基中生长或在其邻近的植物组织/提取物的存在下生长)一起孵育，以及
c)评估所述细菌细胞的报告子(例如，细菌复制、一般胁迫反应、细胞分裂等的报告子)的表达/活性、代谢活性(例如，常用于监测细菌呼吸活性、氧化还原平衡指标和生存力的荧光标记刃天青的外源递送)、生长(例如，染色体整合的或由质粒编码的组成型启动子驱动的荧光报告子的表达)、小RNA靶向的基因的表达(例如，RT-qPCR分析、蛋白质印迹分析，与小RNA靶向的靶向基因或基因区域融合的报告基因的表达)。
如上所述，可以使用抗菌小RNA的稳定或瞬时表达。对于瞬时表达，所述植物细胞优选是烟草叶子细胞，其可以通过农杆菌介导的瞬时转化用外源构建体容易且有效地转化。上文提出的用于产生iRNA、载体、宿主细胞、靶向基因、细菌的所有实施方案和转化技术均包含在本文中，并且不需要重复。
在步骤b)中，也可能使用含有分泌的分子和EV(与有效小RNA结合)的植物细胞的非原质体流体来接触细菌细胞。可以通过本领域技术人员通常使用的任何常规方式，例如真空渗透和离心来回收非原质体流体。根据制造商的说明，也可以使用专用色谱柱(例如，Amicon Ultra-15 Centrifugal Filters Ultracel 30K)进一步进行EV的浓缩。
本发明的方法可以包含最后步骤d)，将与所述非原质体流体或所述小RNA一起孵育的细菌细胞的活力、生长、代谢或基因报告子活性，与不存在非原质体洗涤流体或所述小RNA的相同细菌细胞进行比较，或优选地，与存在来自表达对照小RNA的植物的非原质体洗涤流体、或靶向不相关基因(例如，本发明所用的禾谷镰刀菌的真菌基因CYP51)的对照小RNA的相同细菌细胞进行比较。
本发明人还开发了系统，其与植物产生小RNA无关而是使用靶向细菌基因的双链小RNA的快速体外合成(图10)。作为概念验证实验，发明人已经证明，体外合成的抗Cfa6和抗HrpL siRNA触发细菌基因沉默以及抑制Pto DC3000诱导的气孔重新打开，其程度与源自IR-CFA6/HRPL转基因植物的总RNA相同(图10B/C，图6A)。此外，他们已经表明，体外合成的抗FusA和抗gyrB siRNA具有很强的杀菌作用，从而在体外条件下阻止Pto DC3000的生长(图10D/E)。
因此，他们还提出一种鉴定具有抗菌作用的候选人造小RNA的体外方法，所述方法包括以下步骤：
a)进行抑制至少一种细菌基因的小RNA(优选为双链)的体外合成，
b)将所述小RNA与细菌细胞一起孵育，以及
c)如上所述，评估所述细菌细胞的活力、生长、代谢活性。
或者，本发明的体外筛选方法可包括以下步骤：
a)在植物细胞中表达抑制至少一种细菌基因的至少一种长dsRNA，
b)使所述植物细胞与裂解缓冲液接触，
c)将所述植物细胞裂解物与细菌细胞一起孵育，以及
d)评估所述细菌细胞的活力、生长、代谢活性。
在这些筛选方法中，可以靶向任何细菌基因，目的是鉴定所述基因是否与细菌生长、毒力、致病性、细菌抗性等有关。技术人员可以为步骤c)或d)进行适当的设置以鉴定此类活性。
预期将来将使用这些筛选系统来选择、并最终产生有效的抗菌小RNA，可以将其掺入植物治疗组合物或试剂中，以进一步保护植物免受植物原位和田间环境的细菌性疾病侵害。
可以使用高通量自动程序将它们与微流体装置或其他筛选方法结合，以多重读取表型行为。
除上述布置之外，本发明还包括其他布置，其将从以下描述中参照本发明主题的示例性实施例并参考附图和序列表而出现，其中：
表一：在实施例中使用的工具的序列详情
Figure BDA0003024780770000381
Figure BDA0003024780770000391
Figure BDA0003024780770000401
Figure BDA0003024780770000411
Figure BDA0003024780770000421
附图说明
图1.在未经处理和细菌攻击条件下表达反向重复IR-CFA6/HRPL的拟南芥转基因植物的表型和分子表征
A.Pto DC3000基因Cfa6和HrpL的示意图。Cfa6(1-250nt)和HrpL(99-348nt)基因的250bp区域用于在组成型35S启动子的控制下产生嵌合发夹结构。
B.五周龄的Col-0植物和表达35Spro:IR-CYP51(对照载体：CV)或35Spro:IR-CFA6/HRPL构建体的独立纯合转基因植物的代表性图片。
C.通过B中描绘拟南芥植物的低分子量Northern印迹分析检测到的抗Cfa6和抗HrpL siRNA的积累水平。U6用作上样对照。
D.与Col-0和CV感染的植物相比，在IR-CFA6/HRPL感染的植物上，Pto DC3000HrpL mRNA的积累显著降低。用Pto DC3000 WT菌株浸入接种(dip-inoculate)图B中描述的拟南芥植物，并在感染后(dpi)3天，通过定量RT-PCR分析监测ProC、Cfa6和HrpL的细菌转录水平。相对于细菌GyrA转录本的水平，定量这些mRNA水平。误差棒表示在三个独立实验中获得的mRNA值的标准偏差。使用ANOVA检验评估统计学上的显著差异(ns：p值>0.05；*：p值<0.05，**：p值<0.01，***：p值<0.001)。
图2.在未经处理和细菌攻击条件下表达反向重复IR-LuxA/LuxB的拟南芥转基因植物的表型和分子表征
A.插入Pto DC3000 WT基因组的luxCDABE操纵子的示意图。LuxA(1-250nt)和LuxB(1-250nt)基因的250bp区域用于在组成型35S启动子的控制下产生嵌合发夹结构。
B.通过拟南芥转基因植物的低分子量Northern印迹分析检测到的抗LuxA/LuxB的积累水平。U6用作上样对照。
C.与Col-0相比，感染后在表达IR-LuxA/LuxB的转基因品系中观察到对PtoDC3000荧光素酶(Pto Luc)发光的显著影响。IR-LuxA/LuxB#18和#20的两个独立的转基因品系、以及Col-0分别以106cfu/ml浓度的Pto Luc进行注射浸润，并在浸润后24小时测量发光。
D.与Col-0植物相比，IR-LuxA/LuxB转基因植物中Pto DC3000的植物原位生长未改变。将来自图C使用的植物的叶盘研磨并以系列稀释液铺板，以计数感染后24小时每种条件的Pto Luc。
图3.表达IR-CFA6/HRPL构建体的拟南芥转基因植物抑制Pto DC3000诱导的气孔重新打开
A.PtoΔcfa6和ΔhrpL菌株(而不是ΔhrcC菌株)的气孔重新打开能力受损，在添加外源COR后可以拯救这些表型。将Col-0植物的未去皮叶子切片与模拟溶液(水)、或PtoDC3000 WT、Δcfa6、ΔhrpL、或ΔhrcC菌株孵育3小时。通过使用ImageJ软件测量宽度和长度来评估气孔孔径。
B.Pto DC3000 WT不再诱导过表达IR-CFA6/HRPL发夹的拟南芥转基因品系中的气孔重新打开。如A中所述，在用Pto WT菌株感染的Col-0和35Spro:IR-CFA6/HRPL#4、#5、#10转基因品系中进行气孔孔径测量。
C.与Col-0植物相比，CV中Pto DC3000诱导的气孔重新打开反应没有改变。如A中所述，在感染Pto WT菌株的Col-0和CV植物中进行气孔孔径测量。
注意：对于所有这些实验，n＝每个条件下分析的气孔数量，并使用ANOVA检验评估统计学显著性(ns：p值>0.05；****：p值<0.0001)。
图4.表达IR-CFA6/HRPL构建体的拟南芥转基因植物在成年叶子中表现出降低的Pto DC3000的维管传播和生长
A.与Col-0和CV感染的植物相比，IR-CFA6/HRPL#4、#5和#10感染的植物表现出PtoWT的维管传播减少。将植物用Pto WT-GFP通过伤口接种在中脉中，并将Col-0用PtoΔcfa6-GFP进行伤口接种。在紫外线下观察GFP荧光信号，并在感染后3天(dpi)拍摄照片。为指示细菌从接种部位的传播，在紫外光下观察GFP荧光。当细菌从三个接种位点的任何一个传播出去时，它被指示(index)为传播，其中4个对应于最高的传播指数。考虑来自三个生物学重复的图片。
B.描绘在A中所用条件的被感染叶子的代表性图片。白色圆圈指示叶子中脉中的伤口接种位点。
C.与Col-0和CV感染的植物相比，IR-CFA6/HRPL#4、#5和#10转基因品系显示出显著降低的Pto WT滴度。将Col-0、CV和IR-CFA6/HRPL#4、#5和#10植物用Pto WT浸入接种，并将Col-0植物用PtoΔcfa6-GFP菌株浸入接种。在感染后2天(dpi)监测细菌滴度。考虑来自每种条件下的三个植物和来自三个独立实验(n)的四个叶子，用于比较分析。
D.与Col-0和CV植物相比，IR-CFA6/HRPL#4、#5和#10转基因植物的浸水症状减轻。浸入接种后24小时拍摄有代表性的浸水症状叶子照片。
注意：对于上述所有实验，使用双向ANOVA检验评估统计学显著性(ns：p值>0.05；*：p值<0.05；**：p值<0.01；***：p值<0.001；****：p值<0.0001)。
图5.在未经处理和芸苔黄单孢菌芸苔致病变种攻击条件下表达反向重复IR-HRPG/HRPX/RSMA的拟南芥转基因植物的表型表征
A.与Col-0感染的植物相比，IR-HRPG/HRPX/RSMA#1-和#6感染的植物表现出降低的毒力XccΔXopAC(GUS/GFP)菌株的维管传播。将植物用XccΔXopAC(GUS/GFP)在中脉中伤口接种，OD＝0.01。在紫外线下观察到GFP荧光信号，并在感染后3天(dpi)拍摄照片。如4A中所述完成指示。
B.描绘在B中所用条件的被感染叶子的代表性图片。白色圆圈指示叶子中脉中的伤口接种位点。
图6.当将来自IR-CFA6/HRPL转基因植物的外源递送的总RNA施加至野生型拟南芥和番茄叶子的表面时，降低Pto DC3000的致病性。
A.体外AGS分析显示，CFA6/HRPL#4植物的总RNA提取物触发Cfa6和HrpL基因的沉默。将Pto WT细胞与来自CV或IR-CFA6/HRPL#4植物的20ng/μl总RNA体外孵育4和8小时。通过RT-qPCR在两个时间点观察到细菌转录本Cfa6和HrpL显著减少，而ProC和RpoB转录本的积累仍然不受影响。GyrA用作内部对照来量化细菌转录本的积累。误差棒指示来自三个独立实验的值的标准差。
B.与CV植物相比，外源施加IR-CFA6/HRPL植物的总RNA提取物后，Pto WT重新打开气孔的能力发生改变。将Col-0叶子用水处理1小时，或用从CV或IR-CFA6/HRPL#4植物中提取的20ng/μl总RNA处理1小时，然后与Pto WT孵育3小时。如图3A所示，测量并分析气孔孔径。
C.用IR-CFA6/HRPL处理而不是CV处理，与用CV总RNA预处理相比，总RNA损害PtoDC3000在叶子的非原质体中增殖的能力。将Col-0叶子用来自CV或IR-CFA6/HRPL#4植物的20ng/μl的总RNA处理1小时，然后用Pto WT浸入接种。在2dpi监测细菌滴度。叶子数(n)对应于三个独立实验的集合值。
D.与用IR-CFA6/HRPL#4总RNA处理的叶子相比，用CV总RNA处理的叶子表现出更多的坏死症状。实验与在C中一样进行，但是使用5周龄的番茄(Solanum lycopersicumMoneymaker)植物。描绘在两个条件下被感染叶子的代表性图片。
E.与CV植物相比，用IR-CFA6/HRPL#4的总RNA提取物处理的番茄叶子中观察到的Pto DC3000-GFP基因座数量减少。在紫外线下在3dpi时观察感染的叶子，以估计GFP基因座的数量。在左边：点图代表使用ImageJ软件从每种条件的3-4张不同叶子中以及每片叶子至少有4张图片分析的GFP基因座数量。用于分析的值来自两个不同的独立实验。进行学生t检验以进行比较分析。在右边：在D中描述的番茄叶子的代表性图片。
F.与CV植物相比，用IR-CFA6/HRPL#4的总RNA提取物处理的番茄叶子中Pto WT-GFP DNA含量降低。使用番茄泛素作为对照，通过qPCR分析细菌DNA含量的水平。进行学生t检验以进行比较分析。
注意：对于A，B和C，使用ANOVA检验评估统计学上显著差异(ns：p值>0.05；**：p值<0.01，***：p值<0.001)。
图7.负责AGS和抑制气孔重新打开的RNA实体是DCL依赖性抗菌siRNA，而不是相应的未加工的dsRNA前体。
A.上图：通过RT-qPCR进行Col-0、dcl2-1 dcl3-1 dcl4-2(dcl234)、IR-CFA6/HRPL#4(#4)和dcl234突变体背景中(#4×dcl234)IR-CFA6/HRPL#4中的IR-CFA6/HRPL转录本的积累水平。泛素用作对照。该图代表三个独立实验的平均值和标准偏差。下图：抗Cfa6和抗HrpL siRNA的积累水平通过相同基因型的低分子量的Northern印迹分析进行。U6用作上样对照。
B.来自#4x dcl234植物的总RNA提取物不会改变Cfa6和HrpL的转录本积累水平。将Pto WT细胞与从A中描述的相同基因型提取的20ng/μl总RNA一起体外孵育8小时。使用GyrA作为对照，通过RT-qPCR分析评估Cfa6和HrpL转录本的积累水平。误差棒指示来自三个独立实验值的标准偏差。使用ANOVA检验评估统计学上的显著差异(ns：p值>0.05；*：p值<0.05，**：p值<0.01)。
C.来自#4x dcl234植物的总RNA提取物不能抑制Pto DC3000诱导的气孔重新打开反应。将Col-0叶子用水处理1小时或使用20ng/μl来与A.中使用的相同基因型的总RNA提取物处理1小时，然后与Pto WT孵育3小时。如图2A所示，测量并分析气孔孔径。补充图4B给出另外两个生物学复制。
D.上图：电泳图谱表示使用配备RNA Nano芯片的安捷伦Bioanalyzer 2100测定的来自IR-CFA6/HRPL#4植物的总RNA、长RNA和小RNA的RNA尺寸分布。每个样本均包括低分子量RNA级分。突出显示18S和25S核糖体峰。下图：溴化乙锭染色的在A中使用的总RNA、长RNA和小RNA的琼脂糖凝胶图片。
E.来自IR-CFA6/HRPL植物的小RNA种类、而不是相应的长RNA种类，抑制气孔重新打开的程度与总RNA提取物相同。如在D中所述进行实验，但使用总RNA级分、长(>200nt)RNA级分、或小(<200nt)RNA级分，其分离自IR-CFA6/HRPL#4植物的总RNA。
注意：对于所有气孔实验，使用ANOVA检验评估统计学显著性(ns：p值>0.05；****：p值<0.0001)。
图8.细菌表达的HrpL小RNA弹性(resilient)形式对由抗HrpL siRNA指导的基因沉默是难治的，并且通过外源施加抗HrpL siRNA时表现出正常的气孔重新打开表型
A.分别在组成性启动子NptII的控制下，用编码WT HrpL或突变HrpL的质粒转化后产生的PtoΔhrpL菌株以及互补菌株的示意图。
B.体外AGS分析显示，PtoΔhrpL WT HrpL菌株对抗菌RNA敏感，而PtoΔhrpL突变体HrpL对这些RNA实体是难治性的。将细菌PtoΔhrpL WT HrpL和PtoΔhrpL突变体HrpL菌株与来自CV或IR-CFA6/HRPL#4植物中提取的总RNA孵育8小时。通过RT-qPCR分析WT HrpL和突变体HrpL转录本的积累水平(mRNA水平相对于GyrA转录本水平)。误差棒指示来自三个独立实验值的标准偏差。使用ANOVA检验评估统计学上的显著差异(ns：p值>0.05；*：p值<0.05，**：p值<0.01)。
C.通过使用瞬时表达35Spro：IR-HRPL、35Spro：IR-CFA6/HRPL的本氏烟草植物和未转化的本氏烟草叶子(Nb)的总RNA提取物通过低分子量Northern分析评估抗Cfa6和抗HrpLsiRNA的积累。U6用作上样对照。
D.PtoΔhrpL突变体HrpL菌株对抗HrpL siRNA作用是难治性的。用仅仅从本氏烟草中提取的总RNA、或从表达反向重复IR-HRPL的本氏烟草提取的总RNA处理Col-0叶子。如前所述评估气孔重新打开反应。
注意：对于所有气孔实验，使用ANOVA检验评估统计学显著性(ns：p值>0.05；****：p值<0.0001)。
图9.IR-CFA6/HRPL植物的非原质体流体由功能性抗菌siRNA组成，这些功能性抗菌siRNA可以包埋进EV中以免受微球菌核酸酶的作用、或呈对微球菌核酸酶消化敏感的游离形式
A.与源自IR-CFA6/HRPL植物中的总RNA相比，外源施加非原质体流体(APF)提取物后，Pto WT重新打开气孔的能力也以相似的水平被改变。从CV植物中提取的总RNA和APF用作阴性对照。将Col-0叶子用水处理1小时(模拟)，或使用从CV或IR-CFA6/HRPL#4植物中提取的20ng/μl总RNA或500μl的APF处理1小时，然后与Pto WT孵育3小时。如之前实验所述，测量并分析气孔孔径。
B.两种不同的囊泡级分P40和P100，以及上清液(SN)中存在的游离RNA群体携带抗菌siRNA，因此参与AGS中。从CV和IR-CFA6/HRPL#4植物中提取的非原质体流体在40,000g下进行超速离心以沉淀较大的EV(P40)群体，余下的上清液在100,000g下进一步超速离心以在沉淀较小的EV(P100)。SN也已恢复。将Col-0叶子用水(模拟)、或从CV或IR-CFA6/HRPL#4植物中提取的P40、P100和SN处理1小时，然后与Pto WT孵育3小时。#4的P40、P100和SN用20单位的Mnase处理，#4的SN也用20单位的蛋白酶K处理。如先前实验所述，对气孔孔径进行测量和分析。
注意：对于所有气孔实验，使用ANOVA检验评估统计学显著性(ns：p值>0.05；****：p值<0.0001)。
图10.外源递送体外合成的抗菌siRNA降低Pto DC3000的致病性和活力
A.描绘了体外合成的长dsRNA和RNase III消化的siRNA(对应于IR-CYP51和IR-CFA6/HRPL)的溴化乙锭染色的2％琼脂糖凝胶。
B.外源施加体外合成的对应于IR-CFA6/HRPL的siRNA而不是长dsRNA改变Pto WT重新打开气孔的能力。来自IR-CYP51的长dsRNA和siRNA被用作阴性对照。将Col-0叶子用水(模拟)处理1小时，或用A中所述的RNA处理1小时，然后与Pto WT孵育3小时。如之前实验所述，测量并分析气孔孔径。
C.在体外AGS测定中，使用体外合成的来自IR-CFA6/HRPL的siRNA触发Cfa6和HrpL基因的沉默。将Pto WT细胞与来自IR-CYP51或IR-CFA6/HRPL#4植物的2ng/μl体外合成的siRNA体外孵育8小时。通过RT-qPCR观察到细菌转录本Cfa6和HrpL的显著减少，而ProC和RpoB转录本的积累未受影响。GyrA用作内部对照来量化细菌转录本的积累。误差棒指示来自三个独立实验值的标准偏差。
D.和E.体外合成的针对Pto DC3000的fusA或gyrB的siRNA对Pto DC3000-GFP菌株的生长具有显著影响。通过体外转录，然后RNaseIII消化合成针对Pto DC3000的secE、gyrB和fusA基因的siRNA。将Pto DC3000-GFP菌株与指定浓度的体外合成siRNA孵育。将96孔板放置在机器上，以通过基于液滴的微流体系统(Millidrop)将样本分级成液滴。对于每个孔，形成各约500nl的10个液滴，并在仪器内部孵育。对于每个液滴，每约30分钟获取生物质和GFP荧光的测量值。
具体实施方式
实施例
实施例1：材料和方法
携带反向重复构建体的转基因品系的产生
IR-CFA6/HRPL嵌合发夹经设计可产生靶向Cfa6的250bp区域(从1到250位核苷酸)和HrpL的250bp区域(从99到348位核苷酸)的人工siRNA(SEQ ID NO：1、2和3)。IR-CFA6-A和IR-CFA6-B是两个独立的反向重复，分别特异性靶向Cfa6基因的核苷酸1到250(SEQ ID NO：4、2和5)以及从核苷酸1到472(SEQ ID NO：6、2和7)。IR-HRPL-A和IR-HRPL-B是两个独立的反向重复，分别特异性靶向HrpL基因的从核苷酸99到348(SEQ ID NO：8、2和9)以及从核苷酸1到348(SEQ ID NO：10、2和11)。IR-HRCC发夹设计为特异性靶向HrcC基因(SEQ ID NO：12、2和13)和IR-AvrPto/AvrPtoB，以同时靶向III型效应子AvrPto和AvrPtoB基因(SEQ IDNO：14、2和15)。如之前进行地，IR-CYP51发夹设计用于产生针对真菌禾谷镰刀菌三个细胞色素P450羊毛甾醇C-14α-脱甲基酶基因(即，FgCYP51A、FgCYP51B和FgCYP51C)的siRNA(SEQID NO：16、2和17)(19)。该发夹用作本发明所有植物原位测定的阴性对照。设计并克隆其他反向重复序列作为本研究的一部分，以靶向来自假单胞菌、黄单胞菌和雷尔氏菌的不同菌株的毒力因子或必需基因。这些发夹描述如下：IR-HrpG/HrpB/HrcC发夹设计为同时靶向来自雷尔氏菌属的HrpG、HrpB和HrcC基因(SEQ ID NO：18、2和19)，IR-HrpB/HrcC/TssB/XpsR发夹设计为同时靶向来自雷尔氏菌属的HrpB、HrcC、TssB和XpsR基因(SEQ ID NO：20、2和21)，IR-HrpG/HrpX/RsmA发夹设计为同时靶向来自芸苔黄单胞菌芸苔致病变种的HrpG、HrpX和Rsma基因(SEQ ID NO:22、2和23)，IR-RpoB/RpoC/FusA发夹设计为同时靶向来自PtoDC3000和丁香假单胞菌株CC440的必需基因RpoB、RpoC和FusA(SEQ ID NO：24、2和25)，IR-SecE-RpoA-RplQ发夹设计为同时靶向来自Pto DC3000和丁香假单胞菌CC440的必需基因SecE、RpoA和RplQ(SEQ ID NO：26、2和27)，IR-NadHb/NadHd/NadHe发夹设计为同时靶向来自不同黄单孢菌属(包括芸苔黄单孢菌芸苔致病变种)的必需基因NadHb、NadHd和NadHe(SEQ ID NO：28、2和29)，IR-DnaA/DnaE1/DnaE2发夹设计为同时靶向来自不同黄单孢菌属(包括芸苔黄单孢菌芸苔致病变种)的必需基因NadHb、NadHd和NadHe(SEQ ID NO：30、2和31)。此外，作为本研究的一部分，设计并克隆嵌合的反向重复序列以靶向在Pto DC3000中在组成型卡那霉素启动子下以染色体表达的发光杆菌(Photorhabdus luminescens)luxCDABE操纵子：IR-LuxA/LuxB发夹，旨在同时靶向来自Pto DC3000荧光素酶菌株LuxA和LuxB基因(SEQ ID NO：108、2和109)。所有上述发夹含有来自矮牵牛查耳酮合酶基因CHSA的特定内含子序列(SEQ ID NO：2)，并将其克隆到携带花椰菜花叶病毒(CaMV)35S组成型启动子的载体中。更具体地说，以下发夹序列：IR-CFA6/HRPL、IR-CYP51、IR-CFA6-B、IR-HRPL-B、IR-HrpG/HrpB/HrcC、IR-HrpB/HrcC/TssB/XpsR、IR-AvrPto/AvrPtoB、IR-HRCC、IR-HrpG/HrpX/RsmA和IR-LuxA/LuxB克隆到带有其他EcoRI和SalI限制性酶切位点的修饰pDON221-P5-P2载体中，以利于将这些长的反向重复序列插入该载体中。在pB7WG GATEWAY兼容最终载体(携带BAR选择标记物和门控重组位点的双元载体)中进行携带发夹序列的pDON221-P5-P2和携带组成型35S启动子序列的pDON221-P1-P5r(Life Technologies，12537-32)之间的双重组。其余发夹，即，IR-CFA6-A、IR-HRPL-A、IR-RpoB/RpoC/FusA、IR-SecE-RpoA-RplQ、IR-NadHb/NadHd/NadHe和IR-DnaA/DnaE1/DnaE2序列通过以下产生：使用细菌基因组DNA作为模板，通过PCR扩增靶基因的正义和反义区域，然后生成克隆到最终GreenGate最终载体pGGZ003中所需的模块。然后将所有质粒引入根瘤农杆菌菌株GV3101或C58C1，并进一步用于在本氏烟草中的瞬时表达或在拟南芥Columbia-0(Col-0)参考登记中的稳定表达。
植物材料和生长条件
通过使用农杆菌介导的花卉浸入法转化拟南芥WT(登记Col-0)植物而产生IR-CFA6/HRPL和CV的稳定转基因品系。选择表达相等量的抗Cfa6和抗HrpL siRNA的三个独立的转基因品系#4、#5和#10，并增殖直至T4代。类似地，选择的CV纯合系表达丰度水平的针对禾谷镰刀菌CYP51A/B/C基因的siRNA，对其进行增殖直到T4代，用于实验。类似地，基于siRNA的产生选择表达IR-LuxA/LuxB和IR-HrpG/HrpX/RsmA的转基因品系并进一步增殖。为进行遗传分析，将dcl2 dcl3dcl4(dcl234)三突变体植物与参考IR-CFA6/HRPL#4品系杂交，并对F3植物进行基因分型，以选择含有纯合IR-CFA6/HRPL转基因的纯合dcl234突变体。拟南芥Col-0的灭菌种子和选择的纯合转基因品系首先在含有1/2x MS培养基(Duchefa)、1％蔗糖和0.8％琼脂(有或没有抗生素选择)的平板上、在22℃下、在8小时的光照周期中、生长12-14天。然后，挑选幼苗种入土壤罐中，并在环境可控的条件下于22℃/19℃以8h光照周期在100μE/m2/s的光强度下生长。所有实验均使用4至5周龄的植物。将番茄(Solanumlycopersicum‘Moneymaker’)和本氏烟草的种子直接播种在土壤罐中，并在环境控制条件下于22℃/19℃(白天/夜晚)16h光照周期、在100μE/m2/s的光照强度下生长。所有实验均使用4至5周龄的植物。
细菌菌株
表达GFP的Pto DC3000-GFP和Pto DC3000Δcfa6-GFP(Pto DC3118)菌株是S.Y.He博士的礼物。而Pto DC3000ΔhrpL菌株是Cayo Ramos博士的礼物。Pto DC3000荧光素酶菌株是Chris Lamb博士的礼物。通过电穿孔使用与Pto DC3000-GFP中相同的质粒转化PtoDC3000ΔhrpL和Pto DC3000ΔhrcC菌株，来产生表达GFP报告基因的Pto DC3000ΔhrpL和Pto DC3000ΔhrcC菌株，然后在28℃接种于NYGB培养基(5g/l细菌蛋白胨、3g/l酵母提取物、20ml/l甘油)，其中含有庆大霉素(1μg/ml)用于选择。使用质粒NPTIIpro:WT-HrpL和NPTIIpro:mut-HrpL通过电穿孔分别转化Pto DC3000ΔhrpL菌株，以产生Pto DC3000-WT-HrpL和-mut-HrpL菌株，然后将其接种在含有庆大霉素的NYGB培养基中。
RNA凝胶印迹分析
为进行低分子量RNA的Northern印迹分析，使用TriZOL试剂提取总RNA，并用50％甲酰胺稳定。如前所述(49)，使用特定条件下约30μg的总RNA进行Northern印迹分析。使用基因特异性引物从质粒中扩增出150bp至300bp的区域，并将扩增子进一步用于生成通过随机引物合成的特异性32P放射性标记的探针。U6探针用作小RNA同等上样的对照。
分离长RNA和小RNA级分
根据制造商的说明，使用Tri-Reagent(Sigma，St.Louis，MO)从IR-CFA6/HRPL#4的拟南芥叶子中提取总RNA。根据制造商的说明，使用mirVana miRNA分离试剂盒(Ambion，Life Technologies)使用100μg的总RNA，分离长RNA和小RNA级分。使用琼脂糖凝胶电泳可视化从总RNA分离的长RNA和小RNA，并使用基于微流体的方法(Bioanalyzer 2100；AgilentTechnologies,http://www.agilent.com)进一步分析。总RNA、长RNA和小RNA进一步用于进行气孔重新打开测定。
植物中的细菌感染测定
(a)细菌生长测定：用于该实验的植物特别用于在生长区室中夜间周期开始三个小时后。在每种条件下，用5x107cfu/ml的细菌使用0.02％Silwet L-77(Lehle种子)将三个植物进行浸入接种。将经过细菌浸入的植物立即置于高湿度的区室内，以促进适当的感染。在感染后24小时观察到浸入接种后的浸水症状，对每种条件下来自三个植物的叶子进行拍照。接种后两天，按照(49)所述的方法对每种感染叶子的每种条件下的细菌滴度进行测量。为量化感染植物中的细菌转录本，在接种后三天收集合并的感染的叶子样本。
(b)伤口接种测定：为监测细菌在中脉中的增殖，用浸入5x106cfu/ml浓度带GFP标签的细菌的牙签手动接种来自每种条件的三个植物的约15片叶子，然后将植物置于高湿度的区室中3天。然后，通过使用Olympus MV 10×宏观变焦在紫外光下监测GFP信号来分析细菌增殖，并使用带有GFP滤片的CCD相机AxioCam Mrc Zeiss拍摄照片。
(c)植物保护测定：在细菌感染之前，通过反复用模拟溶液或浓度为20ng/μl的特定总RNA的RNA溶液(二者均补充有Silwett L-77(0.02％))反复浸泡，单独处理每种条件下三种拟南芥植物的四片莲座叶。预处理一小时后，以与RNA相似的方式，将叶子浸润接种到5x107cfu/ml浓度的Pto DC3000 WT或Pto DC3000Δcfa6。如前所述，接种后两天监测细菌滴度。在番茄中，每种条件下三个植物的两片叶子用含有20ng/μl的特定总RNA的悬浮液(补充有Silwett L-77(0.02％))预处理，然后在1个小时后浸入到5x107cfu/ml的带有GFP标签的Pto DC3000中。然后，将植物置于24℃/19℃(白天/夜晚)具有16小时光照周期中无盖情况下持续3天的可控条件中。然后，通过使用Olympus MV 10x宏观变焦在紫外光下监测GFP信号来分析细菌感染，并拍摄照片。收集单个叶子样本以使用ImageJ软件定量每种条件下的细菌数量。
细菌发光定量
在每种条件下，用1x106cfu/ml的Pto DC3000荧光素酶(Pto Luc)菌株注射浸润三个植物。将植物放置在高湿度的区室内，以促进适当的感染。将叶盘放置在96孔板的各个孔中，以使用Berthold Centro LB 960微孔板光度计定量发光。考虑到每个植物四片叶子。如上所述，进行细菌滴度定量之后，合并来自单个叶子的叶盘。
番茄感染定量
(a)GFP基因座定量：通过使用Olympus MV 10x宏观变焦在紫外光下对PtoDC3000-GFP菌株感染的番茄叶子进行GFP定量，并使用带有GFP滤片的CCD相机AxioCam MrcZeiss拍摄照片。使用ImageJ软件对每种条件下至少10张图片定量GFP基因座的数量。
(b)细菌基因组DNA定量
为量化在感染的番茄植物中的细菌感染(Ross等人，2006)，相对于植物gDNA，测量细菌基因组DNA(gDNA)的量。根据制造商的说明，使用DNeasy plant mini试剂盒(QIAGEN，德国)从感染Pto DC3000-GFP的番茄叶子样本中分离基因组DNA。使用1ng的gDNA，使用Takyon SYBR Green Supermix
Figure BDA0003024780770000511
和GFP基因特异性引物进行qPCR。使用泛素特异性引物将细菌gDNA的量相对于番茄进行标准化。
本氏烟草中农杆菌介导的反向重复的瞬时表达
为产生单个发夹(IR-CFA6和IR-HRPL)以及嵌合发夹(IR-CFA6/HRPL)，将携带质粒的根瘤农杆菌菌株在LB培养基中于28℃过夜生长。通过离心收集细胞，并以0.5OD600的最终密度将其重悬于含有10mM MES、pH 5.6、10mM MgCl2和200μM乙酰丁香酮的溶液中。将培养物在室温下于黑暗中孵育5-6小时，然后在四周龄的本氏烟草中进行农杆菌介导的浸润。浸润3天后，收获叶组织并进行Northern印迹分析以确认抗Cfa6和抗HrpL siRNA的产生。然后，将叶子样本用于总RNA提取。
体外抗菌基因沉默测定
为评估细菌转录本Cfa6和HrpL是否可以直接被发夹IR-CFA6/HRPL所生成的dsRNA和/或siRNA靶向，使用在六孔板中的CV或IR-CFA6/HRPL#4转基因植物提取的20ng/μl的特定总RNA分别处理107cfu/ml的Pto DC3000 WT、Pto DC3000-WT-HrpL和Pto DC3000-mut-HrpL的2ml培养物4小时和/或8小时。同样地，为定量细菌基因经体外合成的siRNA处理的沉默，在6孔板中，分别使用2ng/μl的体外合成的IR-CYP51 siRNA或IR-CFA6/HRPL siRNA处理2ml的1x107cfu/ml的Pto DC3000-GFP。针对每种情况收集细菌，然后进一步处理以进行分子分析。
非原质体流体(AF)和细胞外囊泡(EV)提取
如先前所述(44)进行提取。用无针头的注射器用囊泡分离缓冲液(VesicleIsolation Buffer)(VIB；20mM MES，2mM 324CaCl2、0.01M NaCl，pH 6.0)浸润5周龄CV或IR-CFA6/HRPL植物的60片叶子。然后将叶子置于20ml无针头的注射器中。然后将注射器置于50ml Falcon中，并以900g离心15分钟。收集非原质体流体(APF)，然后分别以2,000g和10,000g离心30分钟以除去任何细胞碎片，然后通过0.45μm的过滤器。将APF进一步以40,000g进行超速离心步骤以沉淀EV级分(P40)。将沉淀重悬于2ml的pH＝7.5的20μM Tris缓冲液中。然后，将上清液以100,000g进行超速离心步骤以沉淀EV级分(P100)。恢复来自该步骤的上清液(SN)。
气孔孔径测量
在进行任何处理之前，将植物在光照下(100μE/m2/s)保持至少3小时以确保气孔完全膨胀。切片来自三四周龄植物的完整叶子切片，并将其浸入浓度为1x108cfu/ml的水(模拟)或细菌悬浮液中。处理3小时后，在SP5激光扫描共聚焦显微镜下观察未剥皮的叶子远轴表面，并从不同区域拍摄照片。使用ImageJ软件测量在每种情况下的30-70个气孔的气孔孔径(宽度/长度)。在进行RNA预处理的情况下，将叶子切片与从特定基因型提取的总RNA一起孵育一小时，然后再与细菌孵育。在特定实验中需要时，向细菌悬浮液中补充1μM的外源性冠菌素(COR)(Sigma)(50)。
实时RT-PCR分析
为监测植物编码的转录本，使用RNeasy Plant Mini试剂盒(Qiagen)从植物样本中提取总RNA。使用qScript cDNA Supermix(Quanta Biosciences)反转录0.5μg的无DNA的RNA。然后，使用Takyon SYBR Green Supermix
Figure BDA0003024780770000521
和转录本特异性引物通过实时PCR反应扩增cDNA。将表达针对泛素进行标准化。为监测细菌转录本，如前所述，从细菌感染的植物样本或体外处理的细菌中提取总RNA。在DNAse处理之后，使用随机六聚体引物和qScript Flex cDNA试剂盒(Quanta Biosciences)反转录250ng的总RNA。然后，使用TakyonSYBR Green Supermix
Figure BDA0003024780770000522
和转录本特异性引物通过实时PCR反应扩增cDNA。将表达针对GyrA进行标准化。在384孔光学反应板中进行PCR，该板在95℃加热10分钟，然后在95℃变性15s，在60℃退火20s，并在72℃延伸40s，45循环。在扩增结束时以1℃的梯级(从95℃至50℃)进行熔解曲线。
体外合成反向重复(IR)RNA
按照
Figure BDA0003024780770000524
RNAi试剂盒(Life Technologies,Carlsbad,CA)的指导进行RNA的体外合成。通过PCR通过扩增类似的模板，在序列的5'和3'端引入T7启动子。在两个不同的退火温度下分两步进行PCR扩增，以提高引物退火的特异性。扩增步骤后，借助
Figure BDA0003024780770000525
凝胶和PCR Clean-up试剂盒(Macherey-Nagel)，通过凝胶提取纯化PCR产物，以消除任何寄生(parasite)扩增。然后，将这些纯化的PCR产物用作体外转录的模板：2μg与2μL的T7聚合酶(T7酶Mix)、2μL的10X T7反应缓冲液和75mM ATP、CTP、GTP和UTP各2μL一起在37℃下孵育五小时。用无核酸酶的水将总体积调节至20μL。转录反应后，用2μL的DNaseI、2μL RNase、5μL 10X反应缓冲液处理dsRNA，以去除DNA模板和单链RNA。然后，用试剂盒提供的滤芯纯化dsRNA。在此步骤中获得的长dsRNA可用于以下实验(图1)。通过
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RNaseIII(NEB,Ipswich,MA)获得siRNA。DsRNA用RNaseIII消化20分钟，然后借助mirVanaTMmiRNA分离试剂盒(Life Technologies,Carlsbad,CA)进行纯化。纯化后，将siRNA用于以下实验(图1)。在该方法的每个步骤之后，进行凝胶电泳(TAE 1X，1％琼脂糖凝胶用于DNA扩增以及2％琼脂糖凝胶用于RNA)以检查RNA的质量。
基于液滴的微流体测定法，用于监测体外Pto DC3000的生长
基于液滴的微流体实验是在温度为28℃的NYGB培养基中进行的。通过直接在96孔板中移液200μl不同的最终溶液来制备RNAi测定液：100μl培养基、20μl的107cfu/ml的带有GFP标签的Pto DC3000(Pto DC3000-GFP)、20μl最终浓度2ng/μl的体外合成的候选siRNA或作为对照样本的无菌水、以及60μl培养基。在混合不同RNA的情况下，制备不同v/v比的RNA，并将20μl的混合物添加到相应的孔中。将96孔板放置在机器上，以通过MillidropAnalyzer(http://www.millidrop.com)将样本以液滴的形式分级。对于每个孔，形成各约500nl的10个液滴，并在仪器内部孵育24小时。对于每个液滴，每约30分钟获取生物质和GFP荧光的测量值。
实施例2.针对Pto DC3000的内源毒力因子或人工报告基因的拟南芥编码siRNA在细菌感染的情况下触发其沉默
为检验宿主编码的小RNA是否可以改变细菌基因表达，我们已经生成拟南芥稳定的转基因植物，该植物组成性地表达嵌合的反向重复序列，其与ECF家族σ因子HrpL基因和冠菌素(COR)生物合成Cfa6基因具有序列同源性，上述两种基因均编码Pto DC3000的关键毒力决定因素(图1A，(51、52))。作为阴性对照，我们还生成过表达反向重复序列的转基因品系，其与真菌禾谷镰刀菌的三个细胞色素P450羊毛甾醇C-14α-脱甲基酶(CYP51)基因具有序列同源性，之前已证明在拟南芥和大麦中可针对这种真菌性植物病原体提供全面保护(20,21)。这些稳定的转基因品系分别称为IR-CFA6/HRPL和IR-CYP51(或CV，对照载体植物)；虽然人工siRNA的积累很高(图1C)，但没有表现出任何发育缺陷(图1B)。为研究针对Cfa6和HrpL的人工siRNA是否能在细菌感染期间干扰这些毒力因子的表达，我们用PtoDC3000浸入接种上述转基因植物，并通过RT-qPCR分析进一步监测Cfa6和HrpL mRNA的水平。与Col-0植物相比，在三个独立的IR-CFA6/HRPL品系中的两个在Cfa6 mRNA水平有中等程度的变化，与Col-0植物相比，在这个时间点上所有三个IR-CFA6/HRPL品系中HrpL转录本均可再现地降低(图1D)。相比之下，-相对于Col-0感染的植物，在IR-CYP51中未观察到Cfa6或HrpL mRNA的下调(图1D)，支持这些抗菌RNA在该调节方法中的特异性作用。同样，与Col-0感染的植物相比，在IR-CFA6/HRPL和IR-CYP51感染的品系中，非靶向ProC基因的mRNA水平均未改变(图1D)。总体而言，这些数据表明，在感染的情况下，拟南芥编码的IR-CFA6/HRPL反向重复序列至少可以触发细菌HrpL转录本的序列特异性沉默。
由于已知HrpL和Cfa6毒力因子的表达受多种环境因素的调节(52、53)，因此我们还测试AGS是否可以有效地针对在Pto DC3000中在组成型卡那霉素启动子下以染色体表达的发光杆菌(Photorhabdus luminescens)luxCDABE操纵子(54)。这种带lux标签的PtoDC3000菌株自发发射光，因为它共表达萤光素酶催化组分luxA和luxB基因以及底物生产所需的基因(即，luxC、luxD和luxE)(55)。选择两个独立的过表达抗-luxA和抗-luxB siRNA的拟南芥转基因品系，IR-LuxA/LuxB品系，并用带有lux-标签的Pto DC3000菌株进行注射浸润(图2A/B)。在接种后24小时(hpi)进一步监测luxA和luxB mRNA的水平以及发光活性。通过这样做，我们发现与Col-0感染的植物相比，luxA和luxB mRNA的丰度以及发光活性在IR-LuxA/LuxB-中均显著降低(图2C)。相比之下，在那些条件下，与Col-0植物相比，IR-LuxA/LuxB品系中细菌报告菌株的生长没有改变(图2D)，这表明上述作用并非由于这些转基因植物中细菌滴度的降低而引起的。总而言之，这些数据表明，AGS有效针对Pto DC3000感染过程中的内源性胁迫反应的细菌基因和外源性组成型细菌报告基因。
实施例3.针对Cfa6和HrpL的宿主编码的siRNA通过抑制冠菌素的生物合成来防止Pto DC3000诱导的气孔重新打开
因为已知Cfa6和HrpL相互调节以及因为HrpL和Cfa6都是冠菌素(COR)生物合成所必需的(52，53)，所以我们接下来研究IR-CFA6/HRPL植物是否可以被保护以免受COR依赖的毒力反应。为此，我们在接种后3小时(3hpi)监测Pto DC3000触发的气孔重新打开，该表型完全依赖于COR生物合成，因此用Pto DC3000突变体(缺失Cfa6或HrpL基因)接种后消失(图3A，(50))。值得注意的是，此表型在感染的该时间点不依赖于III型效应子，因为在用PtoDC3000hrcC突变体(该突变体的III型分泌系统组装受损)处理后观察到正常的气孔重新打开反应(图3A，(50))。重要的是，我们发现与Col-0感染的叶子相比，在毒性Pto DC3000菌株感染的三个独立的IR-CFA6/HRPL转基因品系中，Pto DC3000诱导的气孔重新打开完全消除(图3B)，从而模拟在用Pto DC3000 cfa6-或hrpl缺失菌株接种的Col-0叶子上观察到的表型(图3A)。相比之下，在IR-CYP51感染的植物中观察到正常的Pto DC3000诱导的气孔重新打开(图3C)，这表明观察到的作用是特异于针对Cfa6和HrpL基因的siRNA。此外，在外源应用COR后，在IR-CFA6/HRPL感染的转基因植物中检测到的受损气孔重新打开表型得以完全拯救(图3B)。因此，这些数据提供的药理学证据，表明感染的IR-CFA6/HRPL气孔表现出的Pto Dc3000发病机理降低，可能是由相关和/或周围细菌细胞产生COR的能力发生改变引起的。
实施例4.表达针对来自Pto DC3000或芸苔黄单孢菌芸苔变种的关键毒力因子的小RNA的拟南芥稳定转基因植物受到保护免于细菌感染
为进一步监测抗Cfa6和抗HrpL siRNA对Pto DC3000致病性的可能影响，我们接下来监测该细菌在拟南芥IR-CFA6/HRPL转基因植物的叶子维管结构中传播的能力。为此，我们对发生在伤口接种性的带有GFP标签的Pto DC3000(Pto DC3000-GFP)菌株的单个叶子中脉的三个部位的细菌传播数量进行评分。使用这种定量方法，我们观察到与Col-0植物相比，在三个独立的IR-CFA6/HRPL转基因品系中细菌增殖指数显著降低(图4A)。这表明针对Cfa6和HrpL的siRNA可以到达木质部维管，并进一步抑制拟南芥叶子维管结构中PtoDC3000的毒力活性。相比之下，与Col-0感染的叶子相比，在IR-CYP51转基因品系中观察到正常的Pto DC3000维管传播(图4A)，这表明在此方法中抗Cfa6和抗HrpL siRNA具有特异性作用。总体而言，这些结果表明，针对致病性决定子Cfa6和HrpL的siRNA可以特异性限制PtoDC3000在拟南芥叶子维管结构中的传播。在过表达针对毒力因子HrpX、HrpG和RsmA的siRNA的拟南芥转基因植物中也发现对革兰氏阴性细菌芸苔黄单孢菌芸苔致病变种(Xcc)的增强的维管疾病保护作用(图5，数据未显示，(56-60))。这表明，AGS还可用于保护植物免受这种充分表征的拟南芥维管细菌病原体的侵害，其是世界范围内十字花科作物最致命的疾病之一，黑腐病的致病因子(25、61)。
接下来，我们研究针对Cfa6和HrpL的siRNA的稳定表达是否会在植物原位影响PtoDC3000的生长，该表型已知既依赖于COR也依赖于功能性III型分泌系统(52)。为此，我们用Pto DC3000浸入接种IR-CFA6/HRPL、IR-CYP51和WT植物，并进一步在48hpi时监测细菌滴度。使用此测定法，我们发现与Col-0感染植物相比，三个独立的IR-CFA6/HRPL转基因品系中Pto DC3000滴度显著降低，并且该表型让人联想到在感染Cfa6缺失菌株的WT植物中观察到的表型(图4C)。有趣的是，我们还观察到在24hpi时，与WT感染植物相比，三个独立的IR-CFA6/HRPL植物中Pto DC3000诱导的水浸疾病症状减轻，类似于在用cfa6突变菌株浸入接种的WT叶子中观察到的表型(图4D)。相比之下，用Pto DC3000浸入接种IR-CYP51转基因植物中细菌生长和水浸疾病症状没有改变(图4C/D)，这表明上述作用是针对Cfa6和HrpL基因的siRNA特异性的。总之，这些数据进一步支持在感染背景中，抗Cfa6和抗HrpL siRNA在减弱Pto DC3000的毒力活性方面的主要作用。他们还提供令人信服的证据，证明AGS是可用于控制稳定转基因植物中细菌致病性的有效策略。
实施例5.外源递送IR-CFA6/HRPL植物来源的总RNA可保护WT拟南芥和番茄植物防御Pto DC3000
环境RNAi是一种现象，通过其(微)生物可以从环境中摄取外部RNA，从而导致触发与RNA具有序列同源性的基因的沉默(24)。这种基于RNA的方法最初已在秀丽隐杆线虫中表征(26-29)，并进一步发现在其他线虫中，以及在昆虫、植物和真菌中起作用(26、30)。但是，这种方法从未用于缺乏典型的真核样RNAi机制的细菌植物病原体(如Pto DC3000)中。为测试这种可能性，我们首先评估IR-CFA6/HRPL植物表达的RNA是否可以在体外条件下触发Cfa6和HrpL基因的沉默。为此，我们从CV和IR-CFA6/HRPL植物中提取总RNA，将它们与PtoDC3000细胞一起孵育，并通过RT-qPCR进一步分析RNA处理后4小时和8小时Cfa6和HrpLmRNA的水平。这些分析的结果表明，用IR-CFA6/HRPL植物的RNA提取物处理后，两种毒力因子mRNA的积累都减少，这种分子效应在源自CV植物的RNA提取物中未观察到(图6A)。相反，在相同条件下，未靶向的ProC和RpoB mRNA的水平保持不变(图6A)。因此，这些数据暗示植物抗菌RNA可能被Pto DC3000细胞摄取，并随后触发Cfa6和HrpL基因的序列特异性沉默。这也表明，这些抗菌性RNA的外源应用可以用作抑制Col-0植物中Pto DC3000发病机理的策略。为验证这个有趣的假设，我们用来自IR-CFA6/HRPL植物的总RNA提取物对拟南芥Col-0叶组织进行1小时的预处理，随后用Pto DC3000对其进行3小时的攻击，并进一步监测细菌诱导的气孔重新打开事件。令人惊讶的是，我们发现IR-CFA6/HRPL植物的RNA提取物完全抑制Pto DC3000重新打开气孔的能力(图6B)，从而模拟感染的IR-CFA6/HRPL转基因植物中观察到的表型(图3)。我们还研究这种方法是否可用于控制植物原位Pto DC3000的生长。为此目的，我们首先用来自IR-CFA6/HRPL植物的总RNA提取物对Col-0拟南芥植物进行一个小时的预处理，然后用Pto Dc3000对其进行浸入接种。我们发现这些RNA提取物在2dpi时触发降低的Pto DC3000滴度(图6C)，该表型与在受感染的IR-CFA6/HRPL转基因植物(图4C)、以及用PtoΔcfa6菌株接种的Col-0植物中观察到的表型相当(图6C)。相比之下，在相同条件下，施加来自CV植物的总RNA提取物不会改变Pto DC3000的生长(图6C)，支持抗菌RNA在此方法中的特异性作用。为评估这种基于RNA的生物防治方法在栽培植物中是否也有效，我们对番茄(Solanum lycopersicum，栽培品种Moneymaker)重复相同的测定，番茄是Pto DC3000的天然宿主。用IR-CFA6/HRPL植物的RNA提取物对WT番茄叶子预处理一小时，与用源自CV植物的RNA提取物预处理的叶子相比，导致Pto DC3000诱导的坏死性疾病症状受损以及细菌含量降低(图6D-F)。总而言之，这些数据提供证据，证明在拟南芥和番茄植物中外源应用植物来源的抗菌RNA可触发AGS和针对Pto DC3000的疾病保护。
实施例6.小RNA种类而不是其dsRNA前体是外源施加源自IR-CFA6/HRPL发夹的总RNA时观察到的气孔重新打开表型受损的原因
接下来，我们询问在外部施加抗菌RNA时哪些RNA实体负责AGS和发病机理降低。为解决这个问题，我们首先将IR-CFA6/HRPL#4参考品系与dcl2-1 dcl3-1dcl4-2(dcl234)三突变体杂交，然后选择三dcl突变和IR-CFA6/HRPL转基因的纯合子的F3植物。与IR-CFA6/HRPL#4亲本品系中检测到的水平相比，这些IR-CFA6/HRPL#4x dcl234植物的分子表征显示，IR-CFA6/HRPL#4反向重复转录本(即未加工的dsRNA)的积累增加(图7A)。此外，这种作用与抗Cfa6和抗HrpL siRNA的不可检测水平相关(图7A)。因此，这些数据与DCL2、DCL3和DCL4通过IR-CFA6/HRPL反向重复序列的加工在这些siRNA的生物合成中的作用相一致。随后，我们从这些植物中提取总RNA，将其与Pto DC3000细胞孵育8小时，并通过RT-qPCR分析进一步监测Cfa6和HrpL mRNA的水平。使用这种体外测定，我们发现尽管人工dsRNA前体高积累(图7A)，但IR-CFA6/HRPL#4xdcl234植物的RNA提取物不再能够触发Cfa6和HrpL mRNA的下调(图7B)。相比之下，IR-CFA6/HRPL#4亲本品系的RNA提取物含有高水平的抗Cfa6和抗HrpL siRNA(图7A)，触发两种靶向毒力因子的积累减少(图7B)。此外，虽然IR-CFA6/HRPL#4植物的RNA提取物抑制Pto DC3000诱导的气孔重新打开事件，但我们发现IR-CFA6/HRPL#4xdcl234植物的RNA提取物在此方法中没有活性，如源自自Col-0或dcl234植物的对照RNA提取物(图7C，数据未显示)。总体而言，这些数据提供令人信服的证据，表明从IR-CFA6/HRPL反向重复序列产生的dsRNA既不参与AGS也不参与发病机理的降低。其实际上表明，小分子RNA可能是负责这些分子和生理表型的抗菌RNA实体。为验证该假设，我们使用基于玻璃纤维滤器的方法从IR-CFA6/HRPL植物总RNA中进一步纯化小RNA种类(图7D)，并将其进行气孔重新打开测定。通过这样做，我们发现这些小的RNA种类抑制Pto DC3000触发的气孔重新打开，其程度与IR-CFA6/HRPL植物总RNA提取物的程度相同(图7E)。相比之下，未通过上述柱过滤的长RNA种类(200bp以上)没有活性(图7E)，进一步支持抗菌性植物dsRNA不参与此反应。总而言之，这些数据提供可靠的证据，表明从反向重复IR-CFA6/HRPL产生的DCL依赖性siRNA对AGS和发病机理降低至关重要，而同源dsRNA前体对这两个过程均无效。
实施例7.细菌表达的HrpL的小RNA弹性(resilient)形式对siRNA定向沉默不敏感，并表现出正常的气孔重新打开表型，表明抗HrpL siRNA是AGS和发病机理的降低的原因
尽管以上发现表明，外部施加抗菌siRNA可以触发AGS和抗菌活性，但它们并不能坚定地证明这些RNA实体是造成这些现象的原因。为解决这个问题，我们决定产生和表征表达HrpL基因的siRNA弹性形式的重组细菌，发现该细菌在体外和植物原位条件下均受到AGS调控(图1和6)。为此，我们用WT HrpL转基因或突变形式(突变体HrpL)补偿PtoΔhrpL突变体，所述突变体HrpL在siRNA靶向区域含有尽可能多的沉默突变，预测其能够改变siRNA与HrpL mRNA的结合但产生相同的蛋白序列。此外，为评估抗HrpL siRNA可能作用于这些细菌转基因的转录后调控控制，我们在组成型新霉素磷酸转移酶II(NPTII)启动子下表达它们。两种产生的重组细菌分别称为PtoΔhrpL WT HrpL和PtoΔhrpL mut HrpL，并且发现它们接种到Col-0植物上后恢复重新打开气孔的能力(图8A，数据未显示)，表明这两个转基因均具有功能。我们进一步评估每种重组细菌对AGS的敏感性。为此，我们将PtoΔhrpL WT HrpL和PtoΔhrpL mut HrpL菌株与来自CV和IR-CFA6/HRPL#4植物的总RNA提取物孵育8小时，然后进一步通过RT-qPCR分析监测HrpL转基因mRNA水平。我们发现来自PtoΔhrpL WT HrpL菌株表达的HrpL mRNA的积累显著减少，而这种减少在来自CV植物的对照RNA提取物处理后未检测到(图8B)。这些数据表明，从PtoΔhrpL WT HrpL菌株表达的WT HrpL转基因对AGS完全敏感，尽管其组成型表达由NPTII启动子驱动。相比之下，响应于来自IR-CFA6/HRPL#4植物的RNA提取物，从PtoΔhrpL mut HrpL菌株表达的HrpL mRNA的积累没有改变(图8B)，说明siRNA不再发挥其对该重组细菌的AGS作用。总的来说，这些发现表明抗HrpL siRNA是导致Pto DC3000细胞内HrpL毒力因子基因转录后沉默的原因。接下来，我们通过利用对小RNA作用高度敏感的Pto DC3000诱导的气孔重新打开测定，研究每个重组细菌菌株对siRNA指导的发病机理降低的反应性。为评估siRNA针对抑制HrpL介导的气孔重新打开功能的特异性作用，我们首先克隆IR-HRPL反向重复序列，其靶向与IR-CFA6/HRPL发夹所靶向的区域相同的HrpL序列区域，以及进一步验证其通过农杆菌介导的本氏烟草叶子中瞬时转化产生HrpLsiRNA的能力(图8C)。发现含有抗HrpL siRNA的本氏烟草总RNA提取物可完全抑制PtoDC3000重新打开气孔的能力(图8D)。重要的是，将含有抗HrpL siRNA的本氏烟草RNA提取物与PtoΔhrpL WT HrpL菌株一起孵育时，获得相似的结果(图8D)，支持该菌株对siRNA作用的敏感性。相比之下，PtoΔhrpL mut HrpL菌株在相同条件下完全有能力重新打开气孔(图8D)，表明抗HrpL siRNA不再对该重组细菌菌株发挥其抗菌作用。因此，这些数据提供证据表明抗HrpL siRNA是抑制HrpL介导的气孔重新打开功能的原因。他们还进一步证实HrpL在细菌诱导的气孔重新打开中的新作用，表明AGS可以用作表征细菌基因功能的工具。
实施例8.IR-CFA6/HRPL植物的非原质体流体由功能性抗菌siRNA组成，这些功能性抗菌siRNA可以包埋进EV中以免受微球菌核酸酶的作用、或呈对微球菌核酸酶消化敏感的游离形式
实施例3和4中描述的表型分析结果表明，在IR-CFA6/HRPL转基因品系中组成型表达的小RNA种类必须从植物细胞外化至叶表面、非原质体环境和木质部维管，以便到达附生和内生细菌菌群。为深入了解可能与这种现象有关的小RNA转运机制，我们首先从IR-CFA6/HRPL植物中提取非原质体流体(APF)，并通过监测其对Pto DC3000诱导的气孔重新打开的影响来检验其抑制细菌发病机理的能力。我们发现，这种细胞外流体在感染期间触发气孔重新打开的完全抑制，从而模拟IR-CFA6/HRPL来源的总RNA触发的效应(图9A)。相比之下，来自IR-CYP51植物的APF是无活性的，支持来自IR-CFA6/HRPL植物AFP的抗Cfa6和抗HrpLsiRNA在该过程中的特异性作用(图9A)。我们进一步检验来自IR-CFA6/HRPL植物的EV是否可能有助于AGS。为此，我们从IR-CFA6/HRPL植物中回收APF，并进一步以40,000g、或以40,000g接着以100,000g进行差速超速离心，这使我们能够分别收集两个级分，即，P40和P100。有趣的是，我们发现这两个级分均能抑制气孔重新打开，尽管在该过程中P100效果稍差(图9B)。重要的是，两种级分在微球菌核酸酶(Mnase)的存在下仍保持活性，这表明小分子RNA包埋进EV时可免受外部降解。有趣的是，我们还注意到，在40,000g和100,000g的顺序离心后回收的上清液级分(SN)表现出很强的抗菌活性，尽管在该级分中未检测到典型的EV(图9B，数据未显示)。这表明与蛋白质结合和/或呈游离形式的EV游离的小RNA可能还胜任AGS。为确定两个小RNA实体中的哪个可以具有这种抗菌活性，我们用Mnase或蛋白酶K处理来自IR-CFA6/HRPL植物的SN级分，并对其进行气孔重新打开测定。有趣的是，我们发现Mnase处理消除IR-CFA6/HRPL来源的SN级分触发的抗菌作用，而在整体降解蛋白的蛋白酶K存在的情况下检测到未改变的抗菌活性(图9B，未显示数据)。总体而言，这些数据表明功能性EV游离的抗菌小RNA不可能与蛋白质结合，因此在这里称为“细胞外游离小RNA”或“efsRNA”。我们的结果还表明efsRNA对Mnase的作用敏感，因为它们在用该核酸酶处理后失去抗菌作用(图9B)。基于这些发现，我们建议IR-CFA6/HRPL植物的APF由至少三个功能性抗菌小RNA的群体组成，即1)包埋进大EV(P40级分)的功能性抗菌小RNA群体、2)包埋进较小尺寸EV的功能性抗菌小RNA群体(P100级分)、或3)游离形式的功能性抗菌小RNA群体。
实施例9.小RNA的体外合成是一种简便、快速且可靠的方法以筛选具有抗菌活性的候选小RNA。
为开发筛选平台以鉴定具有抗菌活性的候选小RNA，我们旨在生产针对特定细菌基因转录本的体外合成的siRNA，并进一步检验其在细菌致病性或存活上的活性。为此，我们首先决定生成体外合成的与通过DCL依赖性加工IR-CFA6/HRPL产生的植物siRNA靶向相同序列的抗Cfa6和抗HrpL siRNA。为此，我们使用携带T7启动子序列的引物，从含有IR-CYP51或IR-CFA6/HRPL序列的质粒中扩增CYP51或CFA6/HRPL DNA。所得的PCR产物经过凝胶纯化，随后作为模板用于使用T7 RNA聚合酶进行的体外RNA转录，从而产生预期尺寸的CYP51或CFA6/HRPL dsRNA(图10A)。通过使用
Figure BDA0003024780770000591
RNase III将这些dsRNA消化成18-25bp siRNA，可以进一步获得小RNA，尽管其他非商业性RNase III也可以用于此过程(数据未显示)。正如琼脂糖凝胶电泳所揭示的，从dsRNA中剥离出这些siRNA(图10A)，表明在这些实验中使用的RNase III完全加工dsRNA分子的初始库。接下来，我们分析合成的dsRNA和siRNA抑制气孔重新打开的能力。与我们先前的数据显示植物dsRNA在触发AGS时无活性相一致(图7)，我们发现体外合成的CFA6/HRPL dsRNA不会干扰Pto DC3000诱导的气孔重新打开，用作阴性对照的体外合成的CYP51 dsRNA也不会干扰Pto DC3000诱导的气孔重新打开(图10B)。相比之下，针对Cfa6和HrpL的体外合成siRNA完全阻止Pto DC3000诱导的气孔重新打开，而体外合成的抗CYP51 siRNA在此过程中没有活性(图10B)。后一个结果表明，体外合成的抗Cfa6和抗HrpL siRNA可能能够触发Cfa6和HrpL基因的沉默。为检验该假设，我们进一步将浓度为2ng/ul的体外合成的CYP51和CFA6/HRPL siRNA与1x107cfu/ml的PtoDC3000孵育6小时，并通过RT-qPCR分析进一步监测Cfa6和HrpL mRNA。通过这样做，我们发现与抗CYP51 siRNA相比，抗Cfa6/HrpL siRNA触发Cfa6和HrpL mRNA的积累显著减少(图10B)，这种分子作用与对含有抗Cfa6和抗HrpL siRNA的植物来源总RNA的反应中观察到的作用是可比较的(图6A，7B)。相比之下，与抗CYP51 siRNA相比，针对抗Cfa6和抗HrpL siRNA的非靶向ProC和RpoB mRNA的水平保持不变(图10B)。总体而言，这些数据表明，体外合成的siRNA与植物来源的抗Cfa6和抗HrpL siRNA可在相同程度上触发AGS和抗菌活性。
接下来，我们决定确定这种方法是否可用于鉴定具有杀菌活性的候选siRNA。为测试这个观点，我们进行针对来自Pto DC3000的三个保守的管家基因的siRNA的体外合成，所述三个保守的管家基因，即SecE(PSPTO_0613，前蛋白转位酶SecE亚基)、FusA(PSPTO_0623，翻译延伸因子G)和GyrB(PSPTO_0004，DNA旋转酶亚基B)，并进一步监测其对这种细菌体外生长的影响。为此，我们利用已建立的基于液滴的微流体品系统，该系统适用于细菌生物质和细菌表达的荧光报告基因活性的准确测量。通过使用这种方法，我们发现与缺少siRNA或存在抗SecE siRNA的情况相比，0.33ng/μl的体外合成的针对FusA的siRNA能够减少来自带有GFP标签的Pto DC3000(Pto DC3000-GFP)的生物质和GFP信号(图10E、F)。令人惊讶的是，当Pto DC3000-GFP菌株与1ng/ul的体外合成的抗FusA siRNA孵育时，或者当体外合成的针对GyrB的siRNA以0.33ng/μl或1ng/μl的浓度施用时，我们未检测到任何GFP信号或细菌生物质(图10E、F)。这些数据表明，针对FusA和GyrB的siRNA具有有效的杀菌活性，其模仿在存在抗生素的情况下可以检测到的效果。基于这些概念验证实验，我们得出结论，siRNA的体外合成是用于筛选具有抗菌活性的新型候选小RNA的一种简便、快速且可靠的方法。他们还揭示FusA和GyrB在Pto DC3000存活中的作用，此前尚未报告过针对这种细菌。因此，这些结果进一步支持以下事实：AGS可以用作表征细菌基因功能的工具。
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<160> 109
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 500
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 用于共同靶向Pto DC3000的HrpL和Cfa6基因的HRPL/CFA6 dsRNA 的第一臂的序列
<400> 1
atgaacaagc gctacggcaa caacttgccg ggatcctgtt gcgcgctgag caaccggatc 60
gactggacgt caccttcgcg cagcacgcca tctggcaaaa aggccgccgt taatcgtttc 120
caatatttct gcaggagtct gcccgtgacc accttcaccg tgcccctgat tctgtcggat 180
gcaagcccca cggcactcgc cgctaccgcg caacgtctgc gcgccgagca cgagacgcgc 240
tccttcgccg ctgatgactg acatcaccgt gcccttccag ctcggaatgc acttcgtctt 300
cccagctttc ctgatacggc tgacgataca ttttgcggaa gtgattgcgg atcaggttca 360
gcgcgatgcc acacagccag gtctgcggtt tgctggcatg ttgaaacttg tgctcgttac 420
gcagggcttc aagaaacacg cactggagaa tgtcatccac atcatcaggg ttcatcaccc 480
gcttttggat aaacgccctg 500
<210> 2
<211> 1410
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 用于生成本发明的所有反向重复序列的CHSA内含子序列
<400> 2
ggcgcgccca atcgatgatt taaatgtgta agaatttctt atgttacatt attacattca 60
acgttttatc ttaattggct cttcatttga ttgaaatttg acaattattt cttgtttttt 120
tttttgtcac actctttttg ggttggggtg gccgacgaat tgtgggaagg tagaaagagg 180
ggaggacttt tgttatactc cattagtaat tactgtttcc gtttcaattt atgtgacaat 240
atttcctttt tagtcggttc caaaagaaaa tgtcagcatt ataaacaatt taattttgaa 300
attacaattt tgccattaat aaaatgattt acaaccacaa aagtatctat gagcctgttt 360
gggtgggctt ataagcagct tattttaagt ggcttataag tcaaaaagtg acattttttg 420
agaagttaga aaatcctaac ttctcaaaaa gtagctttta agccacttat gacttataag 480
tccaaaaatt tttaagttac caaacatata ttaatgggtt tataagctta taagccactt 540
ttaagctcac ccaaacgggt tctatgtctc actttagact acaaatttta aaagtcttca 600
tttatttctt aatctccgtg gcgagtaaaa ctataacaca taaagtgaaa cggagggaat 660
aagatggagt cataaactaa tccaaatcta tactctctcc gttaatttgt tttttagttt 720
gatttggtac attaataaaa cagatttttc gaaggttata aacacagaca gatgtttccc 780
agcgagctag caaaattcca agatttctgt cgaaaattcg tgtgtttcta gctagtactt 840
gatgttatct ttaacctttt agtaattttt tgtccttttc tttctatttt tcatcttaca 900
atgaattatg agcaagttcc ttaagtagca tcacacgtga gatgtttttt atgatattga 960
ctaaatccaa tctttaccat tccttaacta gtaaaataca acacatgtta attgatacat 1020
tgcttaacac tgaggttaga aaattttaga aattagttgt ccaaatgctt tgaaattaga 1080
aatctttaat cccttatttt tttttaaaat gttttttctc actccaaaga aagagaaact 1140
gacatgaaag ctcaaaagat catgaatctt actaactttg tggaactaaa tgtacatcag 1200
aatgtttctg acatgtgaaa atgaaagctc ttaattttct tcttttattt attgagggtt 1260
tttgcatgct atgcattcaa tttgagtact ttaaagcacc tataaacact tacttacact 1320
tgccttggag tttatgtttt agtgttttct tcacatcttt tttggtcaat ttgcaggtat 1380
ttggatccta ggtgagtcta gaggcgcgcc 1410
<210> 3
<211> 500
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 用于共同靶向Pto DC3000的HrpL和Cfa6基因的HRPL/CFA6 dsRNA的第二臂的序列
<400> 3
cagggcgttt atccaaaagc gggtgatgaa ccctgatgat gtggatgaca ttctccagtg 60
cgtgtttctt gaagccctgc gtaacgagca caagtttcaa catgccagca aaccgcagac 120
ctggctgtgt ggcatcgcgc tgaacctgat ccgcaatcac ttccgcaaaa tgtatcgtca 180
gccgtatcag gaaagctggg aagacgaagt gcattccgag ctggaagggc acggtgatgt 240
cagtcatcag cggcgaagga gcgcgtctcg tgctcggcgc gcagacgttg cgcggtagcg 300
gcgagtgccg tggggcttgc atccgacaga atcaggggca cggtgaaggt ggtcacgggc 360
agactcctgc agaaatattg gaaacgatta acggcggcct ttttgccaga tggcgtgctg 420
cgcgaaggtg acgtccagtc gatccggttg ctcagcgcgc aacaggatcc cggcaagttg 480
ttgccgtagc gcttgttcat 500
<210> 4
<211> 250
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 用于靶向Pto DC3000的Cfa6基因的CFA6-A dsRNA的第一臂的序列
<400> 4
atgaacaagc gctacggcaa caacttgccg ggatcctgtt gcgcgctgag caaccggatc 60
gactggacgt caccttcgcg cagcacgcca tctggcaaaa aggccgccgt taatcgtttc 120
caatatttct gcaggagtct gcccgtgacc accttcaccg tgcccctgat tctgtcggat 180
gcaagcccca cggcactcgc cgctaccgcg caacgtctgc gcgccgagca cgagacgcgc 240
tccttcgccg 250
<210> 5
<211> 250
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 用于靶向Pto DC3000的Cfa6基因的CFA6-A dsRNA的第二臂的序列
<400> 5
cggcgaagga gcgcgtctcg tgctcggcgc gcagacgttg cgcggtagcg gcgagtgccg 60
tggggcttgc atccgacaga atcaggggca cggtgaaggt ggtcacgggc agactcctgc 120
agaaatattg gaaacgatta acggcggcct ttttgccaga tggcgtgctg cgcgaaggtg 180
acgtccagtc gatccggttg ctcagcgcgc aacaggatcc cggcaagttg ttgccgtagc 240
gcttgttcat 250
<210> 6
<211> 472
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 用于靶向Pto DC3000的Cfa6基因的CFA6-B dsRNA的第一臂的序列
<400> 6
atgaacaagc gctacggcaa caacttgccg ggatcctgtt gcgcgctgag caaccggatc 60
gactggacgt caccttcgcg cagcacgcca tctggcaaaa aggccgccgt taatcgtttc 120
caatatttct gcaggagtct gcccgtgacc accttcaccg tgcccctgat tctgtcggat 180
gcaagcccca cggcactcgc cgctaccgcg caacgtctgc gcgccgagca cgagacgcgc 240
tccttcgccg aatggcaagt attctgccga cagcaactga cacgcgacca tgccgaatac 300
cgcgcggcca tcttagccac cgatcaagcc agcctactca aagggctgga tatgctggcc 360
cgcggccgag cctcgcgcca tctggtgctg ggccgcgccg accagttgcg acagccggta 420
ctggtgtttc caggccaagg accgctatgg ccgcggatga ctaccggact ga 472
<210> 7
<211> 472
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 用于靶向Pto DC3000的Cfa6基因的CFA6-B dsRNA的第二臂的序列
<400> 7
tcagtccggt agtcatccgc ggccatagcg gtccttggcc tggaaacacc agtaccggct 60
gtcgcaactg gtcggcgcgg cccagcacca gatggcgcga ggctcggccg cgggccagca 120
tatccagccc tttgagtagg ctggcttgat cggtggctaa gatggccgcg cggtattcgg 180
catggtcgcg tgtcagttgc tgtcggcaga atacttgcca ttcggcgaag gagcgcgtct 240
cgtgctcggc gcgcagacgt tgcgcggtag cggcgagtgc cgtggggctt gcatccgaca 300
gaatcagggg cacggtgaag gtggtcacgg gcagactcct gcagaaatat tggaaacgat 360
taacggcggc ctttttgcca gatggcgtgc tgcgcgaagg tgacgtccag tcgatccggt 420
tgctcagcgc gcaacaggat cccggcaagt tgttgccgta gcgcttgttc at 472
<210> 8
<211> 250
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 用于靶向Pto DC3000的HrpL基因的HRPL-A dsRNA的第一臂的序列
<400> 8
ctgatgactg acatcaccgt gcccttccag ctcggaatgc acttcgtctt cccagctttc 60
ctgatacggc tgacgataca ttttgcggaa gtgattgcgg atcaggttca gcgcgatgcc 120
acacagccag gtctgcggtt tgctggcatg ttgaaacttg tgctcgttac gcagggcttc 180
aagaaacacg cactggagaa tgtcatccac atcatcaggg ttcatcaccc gcttttggat 240
aaacgccctg 250
<210> 9
<211> 250
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 用于靶向Pto DC3000的HrpL基因的HRPL-A dsRNA的第二臂的序列
<400> 9
cagggcgttt atccaaaagc gggtgatgaa ccctgatgat gtggatgaca ttctccagtg 60
cgtgtttctt gaagccctgc gtaacgagca caagtttcaa catgccagca aaccgcagac 120
ctggctgtgt ggcatcgcgc tgaacctgat ccgcaatcac ttccgcaaaa tgtatcgtca 180
gccgtatcag gaaagctggg aagacgaagt gcattccgag ctggaagggc acggtgatgt 240
cagtcatcag 250
<210> 10
<211> 348
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 用于靶向Pto DC3000的HrpL基因的HRPL-B dsRNA的第一臂的序列
<400> 10
ctgatgactg acatcaccgt gcccttccag ctcggaatgc acttcgtctt cccagctttc 60
ctgatacggc tgacgataca ttttgcggaa gtgattgcgg atcaggttca gcgcgatgcc 120
acacagccag gtctgcggtt tgctggcatg ttgaaacttg tgctcgttac gcagggcttc 180
aagaaacacg cactggagaa tgtcatccac atcatcaggg ttcatcaccc gcttttggat 240
aaacgccctg agcatctgaa tctgatcggc cgtcatttgg cgaataccgg cggacgaaga 300
tggctgacgg ggctgggttg agtcgaggat cacaatcttc tgaaacat 348
<210> 11
<211> 348
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 用于靶向Pto DC3000的HrpL基因的HRPL-B dsRNA的第二臂的序列
<400> 11
atgtttcaga agattgtgat cctcgactca acccagcccc gtcagccatc ttcgtccgcc 60
ggtattcgcc aaatgacggc cgatcagatt cagatgctca gggcgtttat ccaaaagcgg 120
gtgatgaacc ctgatgatgt ggatgacatt ctccagtgcg tgtttcttga agccctgcgt 180
aacgagcaca agtttcaaca tgccagcaaa ccgcagacct ggctgtgtgg catcgcgctg 240
aacctgatcc gcaatcactt ccgcaaaatg tatcgtcagc cgtatcagga aagctgggaa 300
gacgaagtgc attccgagct ggaagggcac ggtgatgtca gtcatcag 348
<210> 12
<211> 360
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 用于靶向Pto DC3000的HrcC基因的HrcC dsRNA的第一臂的序列
<400> 12
gaaggcgtgg ttctggttcg tggtccggcc aaatacgtgg agtttgtgcg cgactacagc 60
aagaaagtcg aaaagcccga cgagaaggcc gacaagcaag atgttgtcgt gctgccactc 120
aaatacgcca acgcggctga tcggactatt cgctaccgtg accagcagtt agtggtggcc 180
ggtgtcgcca gtattcttca agagctgctg gaaagccgtt cgcgtggcga aagcattgac 240
agcgtgaacc tgttgccggg gcagggcagc agtgttgcca acagcacagg tgtcgcggcc 300
gccggcctgc cttacaacct gggctccaat ggtatcgata cgggagcact gcaacagggc 360
<210> 13
<211> 360
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 用于靶向Pto DC3000的HrcC基因的HRCC dsRNA的第二臂的序列
<400> 13
gccctgttgc agtgctcccg tatcgatacc attggagccc aggttgtaag gcaggccggc 60
ggccgcgaca cctgtgctgt tggcaacact gctgccctgc cccggcaaca ggttcacgct 120
gtcaatgctt tcgccacgcg aacggctttc cagcagctct tgaagaatac tggcgacacc 180
ggccaccact aactgctggt cacggtagcg aatagtccga tcagccgcgt tggcgtattt 240
gagtggcagc acgacaacat cttgcttgtc ggccttctcg tcgggctttt cgactttctt 300
gctgtagtcg cgcacaaact ccacgtattt ggccggacca cgaaccagaa ccacgccttc 360
<210> 14
<211> 400
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 用于靶向Pto DC3000的AvrPto和AvrPtoB基因的AvrPto/AvrPtoB dsRNA的第一臂的序列
<400> 14
atgggaaata tatgtgtcgg cggatccagg atggcccatc aggtgaactc cccagaccga 60
gttagtaaca actcgggtga cgaagataac gtaacgtcca gtcaactgct gagcgtcaga 120
catcaacttg cggagtctgc tggtgtacca agagatcagc atgaatttgt tagtaaccaa 180
gcacctcaaa gcctgagaaa atggcgggta tcaatagagc gggaccatcg ggcgcttatt 240
ttgttggcca cacagacccc gagccagtat cggggcaagc acacggatcc ggcagcggcg 300
ccagctcctc gaacagtccg caggttcagc cgcgaccctc gaatactccc ccgtcgaacg 360
cgcccgcacc gccgccaacc ggacgtgaga ggctttcacg 400
<210> 15
<211> 400
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 用于靶向Pto DC3000的AvrPto和AvrPtoB基因的AvrPto/AvrPtoB dsRNA的第二臂的序列
<400> 15
cgtgaaagcc tctcacgtcc ggttggcggc ggtgcgggcg cgttcgacgg gggagtattc 60
gagggtcgcg gctgaacctg cggactgttc gaggagctgg cgccgctgcc ggatccgtgt 120
gcttgccccg atactggctc ggggtctgtg tggccaacaa aataagcgcc cgatggtccc 180
gctctattga tacccgccat tttctcaggc tttgaggtgc ttggttacta acaaattcat 240
gctgatctct tggtacacca gcagactccg caagttgatg tctgacgctc agcagttgac 300
tggacgttac gttatcttcg tcacccgagt tgttactaac tcggtctggg gagttcacct 360
gatgggccat cctggatccg ccgacacata tatttcccat 400
<210> 16
<211> 752
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 用于靶向禾谷镰刀菌的FgCYP51A、FgCYP51B和FgCYP51C基因的CYP51 dsRNA的第一臂的序列
<400> 16
cagcaagttt gacgagtccc tggccgctct ctaccacgac ctcgatatgg gcttcacccc 60
catcaacttc atgcttcact gggcccctct cccctggaac cgtaagcgcg accacgccca 120
gcgcactgtt gccaagatct acatggacac tatcaaggag cgccgcgcca agggcaacaa 180
cgaatccgag catgacatga tgaagcacct tatgaactct cggtccattg acaatccccg 240
tctttggtag cgatgtcgta tacgattgtc ccaactcgaa gctcatggaa caaaagaagt 300
ttgtcaagtt tggccttacg caaaaagcac tcgagtcaca cgtccagtta atcgagcgag 360
aggttcttga ctacgtcgaa actgatccat ccttttctgg cagaactagc accatcgatg 420
tccccaaggc aatggctgag ataacaatct ttactgcctc acgttctttg cagggtgagg 480
aagttcggag aaaactcact gccgagtttg ctgcattgga agcaccgtac aatatggcat 540
cgacccgtac gcttttttct tcgactgcag agataaatac ggcgactgct ttacctttat 600
tctccttggc aaatcaacga ctgtctttct tggtcccaag ggcaatgact ttatcctcaa 660
cggcaaacac gccgatctca acgccgagga cgtttatggg aaacttacca cgcccgtgtt 720
tggtgaggag gttgtttatg actgctccaa tg 752
<210> 17
<211> 752
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 用于靶向禾谷镰刀菌的FgCYP51A、FgCYP51B和FgCYP51C基因的CYP51 dsRNA的第二臂的序列
<400> 17
cattggagca gtcataaaca acctcctcac caaacacggg cgtggtaagt ttcccataaa 60
cgtcctcggc gttgagatcg gcgtgtttgc cgttgaggat aaagtcattg cccttgggac 120
caagaaagac agtcgttgat ttgccaagga gaataaaggt aaagcagtcg ccgtatttat 180
ctctgcagtc gaagaaaaaa gcgtacgggt cgatgccata ttgtacggtg cttccaatgc 240
agcaaactcg gcagtgagtt ttctccgaac ttcctcaccc tgcaaagaac gtgaggcagt 300
aaagattgtt atctcagcca ttgccttggg gacatcgatg gtgctagttc tgccagaaaa 360
ggatggatca gtttcgacgt agtcaagaac ctctcgctcg attaactgga cgtgtgactc 420
gagtgctttt tgcgtaaggc caaacttgac aaacttcttt tgttccatga gcttcgagtt 480
gggacaatcg tatacgacat cgctaccaaa gacggggatt gtcaatggac cgagagttca 540
taaggtgctt catcatgtca tgctcggatt cgttgttgcc cttggcgcgg cgctccttga 600
tagtgtccat gtagatcttg gcaacagtgc gctgggcgtg gtcgcgctta cggttccagg 660
ggagaggggc ccagtgaagc atgaagttga tgggggtgaa gcccatatcg aggtcgtggt 720
agagagcggc cagggactcg tcaaacttgc tg 752
<210> 18
<211> 667
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 用于同时靶向雷尔氏菌属的HrpG、HrpB和HrcC基因的HRPG/HRPB/HRCC dsRNA的第一臂的序列
<400> 18
cgcatgcctg gccgtgcaga acgtggaatg tgtccggttc gacgatgccc tgacgctgtt 60
gcgtgcacgg cgtaccgagg cattcagtct gctgctgatc gatgcccagc agttccgcag 120
cgcgggacag ctggtgctgt cctggcgcga gtgcaacgcc gacatgtgct ggccgacgct 180
ggtgttcggc cagttcgcag tgaagaagcg gaagaaggct tccgcctggc gcagcgcctg 240
atccgccatt cggatgacgc gcgatcgcta cgccgcggcg gcgagctgct tctcgcgcat 300
ggccgaagac gatggcgcga cctggaccca gcaggtcgag ggcctgatcg gcccgcggct 360
ggctggccac catcgatctg atcatctacg ttttcgccgt gcaggccggc atccgctgct 420
ccaaccgcct gctcgagcat gcgttctggc aatcggccga aatgggcatc tcgacgcagg 480
tcgagggcag cgtgacgggc tcgttcaacg agacgccgca gaagtttctc gaccgcatgg 540
ccggcacgtt cggctttgcg tggtactacg acggcgcggt gctgcgcgtg accagcgcca 600
acgaagcgca gagcgccacc atcgcgctga cccgcgcctc gaccgcgcag gtcaagcggg 660
cgctgac 667
<210> 19
<211> 667
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 用于同时靶向雷尔氏菌属的HrpG、HrpB和HrcC基因的HRPG/HRPB/HRCC dsRNA的第二臂的序列
<400> 19
gtcagcgccc gcttgacctg cgcggtcgag gcgcgggtca gcgcgatggt ggcgctctgc 60
gcttcgttgg cgctggtcac gcgcagcacc gcgccgtcgt agtaccacgc aaagccgaac 120
gtgccggcca tgcggtcgag aaacttctgc ggcgtctcgt tgaacgagcc cgtcacgctg 180
ccctcgacct gcgtcgagat gcccatttcg gccgattgcc agaacgcatg ctcgagcagg 240
cggttggagc agcggatgcc ggcctgcacg gcgaaaacgt agatgatcag atcgatggtg 300
gccagccagc cgcgggccga tcaggccctc gacctgctgg gtccaggtcg cgccatcgtc 360
ttcggccatg cgcgagaagc agctcgccgc cgcggcgtag cgatcgcgcg tcatccgaat 420
ggcggatcag gcgctgcgcc aggcggaagc cttcttccgc ttcttcactg cgaactggcc 480
gaacaccagc gtcggccagc acatgtcggc gttgcactcg cgccaggaca gcaccagctg 540
tcccgcgctg cggaactgct gggcatcgat cagcagcaga ctgaatgcct cggtacgccg 600
tgcacgcaac agcgtcaggg catcgtcgaa ccggacacat tccacgttct gcacggccag 660
gcatgcg 667
<210> 20
<211> 705
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 用于同时靶向雷尔氏菌属的HrpB、HrcC、XpsR和TssB基因的HRPB/HRCC/TssB/XpsR dsRNA的第一臂的序列
<400> 20
gcgcgatcgc tacgccgcgg cggcgagctg cttctcgcgc atggccgaag acgatggcgc 60
gacctggacc cagcaggtcg agggcctgat cggcccgcgg ctggctggcc accatcgatc 120
tgatcatcta cgttttcgcc gtgcaggccg gcatccgctg ctccaaccgc ctgctcgagc 180
atgcgttctg gcaatcggcc gaaatgggca tctcgacgca ggtcgagggc agcgtgacgg 240
gctcgttcaa cgagacgccg cagaagtttc tcgaccgcat ggccggcacg ttcggctttg 300
cgtggtacta cgacggcgcg gtgctgcgcg tgaccagcgc caacgaagcg cagagcgcca 360
ccatcgcgct gacccgcgcc ggccgcgcgt gcggagaccc atcggcggcc gcagagcgaa 420
tgcgactgga agcattactt tgcggacctg ctctatgcgc cgaacggcgc cgagttcaag 480
ctcagcctgt ttccgctgcc cgcgcagcag atcggcgaca cgccctggtc gcgggcattc 540
cgcgggcagc cggcgatgct tgacaaccaa tccgccgcgc tcgcgcagag cgcaccggca 600
gccgagtccg tcaacctgct cgacgagatc gtcgagcaga gccgcgtcgc caagtcggac 660
gccgagcacg cgcgcgccaa ggacatcatc ggcgagctgg tcaac 705
<210> 21
<211> 705
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 用于同时靶向雷尔氏菌属的HrpB、HrcC、XpsR和TssB基因的HRPB/HRCC/TssB/XpsR dsRNA的第二臂的序列
<400> 21
gttgaccagc tcgccgatga tgtccttggc gcgcgcgtgc tcggcgtccg acttggcgac 60
gcggctctgc tcgacgatct cgtcgagcag gttgacggac tcggctgccg gtgcgctctg 120
cgcgagcgcg gcggattggt tgtcaagcat cgccggctgc ccgcggaatg cccgcgacca 180
gggcgtgtcg ccgatctgct gcgcgggcag cggaaacagg ctgagcttga actcggcgcc 240
gttcggcgca tagagcaggt ccgcaaagta atgcttccag tcgcattcgc tctgcggccg 300
ccgatgggtc tccgcacgcg cggccggcgc gggtcagcgc gatggtggcg ctctgcgctt 360
cgttggcgct ggtcacgcgc agcaccgcgc cgtcgtagta ccacgcaaag ccgaacgtgc 420
cggccatgcg gtcgagaaac ttctgcggcg tctcgttgaa cgagcccgtc acgctgccct 480
cgacctgcgt cgagatgccc atttcggccg attgccagaa cgcatgctcg agcaggcggt 540
tggagcagcg gatgccggcc tgcacggcga aaacgtagat gatcagatcg atggtggcca 600
gccagccgcg ggccgatcag gccctcgacc tgctgggtcc aggtcgcgcc atcgtcttcg 660
gccatgcgcg agaagcagct cgccgccgcg gcgtagcgat cgcgc 705
<210> 22
<211> 633
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 用于同时靶向芸苔黄单胞菌芸苔致病变种的HrpG、HrpX和RsmA基因的HRPG/HRPX/RsmA dsRNA的第一臂的序列
<400> 22
gtgatggacg ccgctgcgaa tgaccgccaa ggatcggcat tcgtactgac gcaggacgcg 60
cggctggcat cacagatcaa cgccagcctg gcgactctgg tcccagaggt caccatcttt 120
tcagacgaac tcgaattgct gcgctgcctg cgccactcgc cgtgcgagct tctggttttc 180
gatgcccatt gcgtggcatc ggacgacagt atgatccttt cgacctactt cgcagcgatc 240
tctgcgttgt cttacgcaga ccgtcttccg atctatacga gcaggatgct tgttggtgct 300
tggccacagg gtctgcagca cctccagcaa cgtcgcgagg ggcaggcagc tccggatggc 360
agcgacgacg aagtcgcatt gctgggcgcc agcgccgatg ccttgttgat tctggagtat 420
atgttgatcc tcactcgccg agtaggcgaa accctgatga tcggcgactt ggtcaccgtg 480
accgtgctcg gcgtcaaggg aaatcaggtg cgcattggca ttgacgcgcc taaggatgtt 540
gccgtgcatc gcgaagaaat ctatcagcgc atccagcgcg gtgacgagcc ggttgcgtcc 600
ggtgcgcatc acaacgacga ttgttcggac tga 633
<210> 23
<211> 633
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 用于同时靶向芸苔黄单胞菌芸苔致病变种的HrpG、HrpX和RsmA基因的HRPG/HRPX/RsmA dsRNA的第二臂的序列
<400> 23
tcagtccgaa caatcgtcgt tgtgatgcgc accggacgca accggctcgt caccgcgctg 60
gatgcgctga tagatttctt cgcgatgcac ggcaacatcc ttaggcgcgt caatgccaat 120
gcgcacctga tttcccttga cgccgagcac ggtcacggtg accaagtcgc cgatcatcag 180
ggtttcgcct actcggcgag tgaggatcaa catatactcc agaatcaaca aggcatcggc 240
gctggcgccc agcaatgcga cttcgtcgtc gctgccatcc ggagctgcct gcccctcgcg 300
acgttgctgg aggtgctgca gaccctgtgg ccaagcacca acaagcatcc tgctcgtata 360
gatcggaaga cggtctgcgt aagacaacgc agagatcgct gcgaagtagg tcgaaaggat 420
catactgtcg tccgatgcca cgcaatgggc atcgaaaacc agaagctcgc acggcgagtg 480
gcgcaggcag cgcagcaatt cgagttcgtc tgaaaagatg gtgacctctg ggaccagagt 540
cgccaggctg gcgttgatct gtgatgccag ccgcgcgtcc tgcgtcagta cgaatgccga 600
tccttggcgg tcattcgcag cggcgtccat cac 633
<210> 24
<211> 676
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 用于同时靶向Pto DC3000和丁香假单孢菌CC440的RpoB、RpoC和FusA基因的RpoB/RpoC/FusA dsRNA的第一臂的序列
<400> 24
aacacgtatc cgcaaggact ttagcaagtt gccggacgta atggatgtgc cgtatctctt 60
ggccatccag ctggattcgt atcgcgaatt cctgcaggcg ggagcgacca aagatcagtt 120
ccgcgacgtc ggtctgcatg cagccttcaa atccgttttc ccgatcatca gctactccgg 180
caatgctgcg ctggagtatg taggttatcg cttgggcgag atcttgaaag acctactgaa 240
tttgctgaaa aaccagggtc aagtcgaaga gttcgacgca atccgtatcg gacttgcatc 300
gcctgagatg atccgctctt ggtcgttcgg tgaagttaaa aagccggaaa ccatcaacta 360
ccgtacgttc aagcctgagc gtgacggtct gttctgcgcc aagatctttg gtccggtaaa 420
agattacgag tgcctgtgcg gtaagtacaa ggcatatggc tcgtactact ccgattagcc 480
gttaccgtaa catcggtatc gtcgctcacg tggatgctgg taaaaccacc accaccgagc 540
gcgtcctttt ttacaccggc aaaagccaca aaatgggcga ggtgcatgat ggcgccgcga 600
ccacggactg gatggttcag gagcaggagc gtggtattac cattacttct gctgctatca 660
ctgccttttg gcggct 676
<210> 25
<211> 676
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 用于同时靶向Pto DC3000和丁香假单孢菌CC440的RpoB、RpoC和FusA基因的RpoB/RpoC/FusA dsRNA的第二臂的序列
<400> 25
tcaggccaaa aggcagtgat agcagcagaa gtaatggtaa taccacgctc ctgctcctga 60
accatccagt ccgtggtcgc ggcgccatca tgcacctcgc ccattttgtg gcttttgccg 120
gtgtaaaaaa ggacgcgctc ggtggtggtg gttttaccag catccacgtg agcgacgata 180
ccgatgttac ggtaacggct aatcggagta gtacgagcca tatgccttgt acttaccgca 240
caggcactcg taatctttta ccggaccaaa gatcttggcg cagaacagac cgtcacgctc 300
aggcttgaac gtacggtagt tgatggtttc cggcttttta acttcaccga acgaccaaga 360
gcggatcatc tcaggcgatg caagtccgat acggattgcg tcgaactctt cgacttgacc 420
ctggtttttc agcaaattca gtaggtcttt caagatctcg cccaagcgat aacctacata 480
ctccagcgca gcattgccgg agtagctgat gatcgggaaa acggatttga aggctgcatg 540
cagaccgacg tcgcggaact gatctttggt cgctcccgcc tgcaggaatt cgcgatacga 600
atccagctgg atggccaaga gatacggcac atccattacg tccggcaact tgctaaagtc 660
cttgcggata cgctgc 676
<210> 26
<211> 681
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 用于同时靶向Pto DC3000和丁香假单孢菌CC440的SecE、RpoA和RplQ基因的SecE/RpoA/RplQ dsRNA的第一臂的序列
<400> 26
aacatgaatc ccaaggctga agcatcagac tctcgctttg atttgctgaa atggctcctg 60
gtagtcattt tggtagtcgt gggtgttgtc ggtaatcagt attactctgc tgagccgatc 120
ctgtaccgtg ttctcgctct ccttgtgatt gccgcagcag ctgcatttgt agcgctgcag 180
actggcaagg gcaaagcttt cttcgttttg gcgaaagaag cgcgtgcaga gatgatctgc 240
agatttcggt aaatgagttc ctgacacccc gccacattga tgtgcaggtt gtcagtccaa 300
cccgcgccaa aatcactctc gagcctctcg agcgtggttt cggccatacc ctgggcaacg 360
cgcttcgccg cattttgttg tcctccatgc ccggctgtgc agtagtcgag gccgagattg 420
acggtgtact ccatgagtac agcgccatcg aaggtgtagc atatgcgtca tcgtaaaagt 480
ggacgtcacc tgagccgtac cagctctcac cgtaaagcca tgtttcaaaa catggcggtg 540
tcgctgttcg agcacgagct gatcaaaact accctgccga aagccaagga actgcgccgc 600
gttgccgagc cgctgatcac cctggccaag gaagacagtg ttgctaaccg tcgtctggct 660
ttcgaccgta ctcgttcggc t 681
<210> 27
<211> 681
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 同时靶向Pto DC3000和丁香假单孢菌CC440的SecE、RpoA和RplQ基因的SecE/RpoA/RplQ dsRNA的第二臂的序列
<400> 27
tcaggaacga gtacggtcga aagccagacg acggttagca acactgtctt ccttggccag 60
ggtgatcagc ggctcggcaa cgcggcgcag ttccttggct ttcggcaggg tagttttgat 120
cagctcgtgc tcgaacagcg acaccgccat gttttgaaac atggctttac ggtgagagct 180
ggtacggctc aggtgacgtc cacttttacg atgacgcata tgctacacct tcgatggcgc 240
tgtactcatg gagtacaccg tcaatctcgg cctcgactac tgcacagccg ggcatggagg 300
acaacaaaat gcggcgaagc gcgttgccca gggtatggcc gaaaccacgc tcgagaggct 360
cgagagtgat tttggcgcgg gttggactga caacctgcac atcaatgtgg cggggtgtca 420
ggaactcatt taccgaaatc tgcagatcat ctctgcacgc gcttctttcg ccaaaacgaa 480
gaaagctttg cccttgccag tctgcagcgc tacaaatgca gctgctgcgg caatcacaag 540
gagagcgaga acacggtaca ggatcggctc agcagagtaa tactgattac cgacaacacc 600
cacgactacc aaaatgacta ccaggagcca tttcagcaaa tcaaagcgag agtctgatgc 660
ttcagccttg ggattcactg c 681
<210> 28
<211> 718
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 用于同时靶向黄单胞菌属的NadHb、NadHd和NadHe基因的NadHb/NadHd/NadHedsRNA的第一臂的序列
<400> 28
aacagaagaa gggagcgctg gaatgggagt gattcagacc ctggatcgtc tgatgaccaa 60
cccgatgccg gaaggccggg tcgaagacat cctgcgcccg gaaggcgaaa acccgttgct 120
cgaaaagggc tacgtgacca ccagcgtcga tgcgctgttg aactgggcgc gtacaggttc 180
gatgtggccg atgacctttg gtctggcctg ctgtgcagtc gagatgatgc agatcgtgag 240
tgagtaccgc caggcaaccg atgccttcgc gagcaatcct gtggaaagca agcaggaaat 300
ccgcaattac acgatgaact tcggcccgca gcatcctgcg gcgcacggcg tattgcgcct 360
gatcctggaa atggacggcg aaaccgtggt gcgtgccgac ccgcatatcg gcctgctgca 420
ccgtggcacc gagaagctgg ccgagtccaa gccgttcaac cagtcggttc cgtacagcat 480
cgacgggtaa tttcgaagcg gcgcgcgacg tcgatccgca ggtagtgctg agcgacaaga 540
cgcgcgcgca catcgatcat tggctgagca agttcccgcc cgaccgcaag cgttcggccg 600
tgttgcaggg tctgcatgcc gcgcaggaac agaaccaggg ttggttgacc gacgagctga 660
tcgtgggcgt ggccaagtat ctggagctgc cgccggtgtg ggcctacgaa gtggggct 718
<210> 29
<211> 718
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 用于同时靶向黄单胞菌属的NadHb、NadHd和NadHe基因的NadHb/NadHd/NadHedsRNA的第二臂的序列
<400> 29
tcagccactt cgtaggccca caccggcggc agctccagat acttggccac gcccacgatc 60
agctcgtcgg tcaaccaacc ctggttctgt tcctgcgcgg catgcagacc ctgcaacacg 120
gccgaacgct tgcggtcggg cgggaacttg ctcagccaat gatcgatgtg cgcgcgcgtc 180
ttgtcgctca gcactacctg cggatcgacg tcgcgcgccg cttcgaaatt acccgtcgat 240
gctgtacgga accgactggt tgaacggctt ggactcggcc agcttctcgg tgccacggtg 300
cagcaggccg atatgcgggt cggcacgcac cacggtttcg ccgtccattt ccaggatcag 360
gcgcaatacg ccgtgcgccg caggatgctg cgggccgaag ttcatcgtgt aattgcggat 420
ttcctgcttg ctttccacag gattgctcgc gaaggcatcg gttgcctggc ggtactcact 480
cacgatctgc atcatctcga ctgcacagca ggccagacca aaggtcatcg gccacatcga 540
acctgtacgc gcccagttca acagcgcatc gacgctggtg gtcacgtagc ccttttcgag 600
caacgggttt tcgccttccg ggcgcaggat gtcttcgacc cggccttccg gcatcgggtt 660
ggtcatcaga cgatccaggg tctgaatcac tcccattcca gcgctccctt cttcctgc 718
<210> 30
<211> 677
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 用于同时靶向黄单胞菌属的DnaA、DnaE1和DnaE2基因的DnaA/DnaE1/DnaE2dsRNA的第一臂的序列
<400> 30
aacaatgctt ggccccgctg tctggaacgt ctcgaagctg aattcccgcc cgaggatgtc 60
cacacctggt tgaaacccct gcaggccgaa gatcgcggcg acagcatcgt gctgtacgcg 120
ccgaacgcct tcattgttga gcaggtccgc gagcgatacc tgccgcgcat ccgcgagttg 180
ctggcatatt tcgccggcaa tggcgaggtg gcgctggcgg tcggctcccg tcgatcgcgc 240
gaagccttcc tcaagccgtt ggcccaggtg gtcaatgtcg tcgaacggcg tcagacattg 300
ccggtactgg cgaacttgct ggtgcaggtg aacaacggcc agctgtcgct gacggggacc 360
gacctggaag tcgaaatgat ctcgcgcacc atggtcgagg acgcccagga cggcgaaacc 420
acgatcccgg cgcgcaagct gttcgacatc ctggcatatg tccacttccc gcttcgtcca 480
tctgcacgtc cacaccgagt tctcgttggc ggattccacc atccgcgtgc ccgagaaacc 540
ggatcaggct gacccgaaaa aagccaagca ggccaacctg ctgagccgcg cggtcgaact 600
cgacttgccc gcgctggcgg tcaccgacct gaacaacctg ttcgccctgg tcaagttcta 660
caaggccgcc gaaggct 677
<210> 31
<211> 677
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 用于同时靶向黄单胞菌属的DnaA、DnaE1和DnaE2基因的DnaA/DnaE1/DnaE2dsRNA的第二臂的序列
<400> 31
tcagttcggc ggccttgtag aacttgacca gggcgaacag gttgttcagg tcggtgaccg 60
ccagcgcggg caagtcgagt tcgaccgcgc ggctcagcag gttggcctgc ttggcttttt 120
tcgggtcagc ctgatccggt ttctcgggca cgcggatggt ggaatccgcc aacgagaact 180
cggtgtggac gtgcagatgg acgaagcggg aagtggacat atgccaggat gtcgaacagc 240
ttgcgcgccg ggatcgtggt ttcgccgtcc tgggcgtcct cgaccatggt gcgcgagatc 300
atttcgactt ccaggtcggt ccccgtcagc gacagctggc cgttgttcac ctgcaccagc 360
aagttcgcca gtaccggcaa tgtctgacgc cgttcgacga cattgaccac ctgggccaac 420
ggcttgagga aggcttcgcg cgatcgacgg gagccgaccg ccagcgccac ctcgccattg 480
ccggcgaaat atgccagcaa ctcgcggatg cgcggcaggt atcgctcgcg gacctgctca 540
acaatgaagg cgttcggcgc gtacagcacg atgctgtcgc cgcgatcttc ggcctgcagg 600
ggtttcaacc aggtgtggac atcctcgggc gggaattcag cttcgagacg ttccagacag 660
cggggccaag catctgc 677
<210> 32
<211> 717
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 在GFPpPNpt质粒中包含的GFP报告子序列
<400> 32
atgagtaagg gggaggagct ctttacaggg gtggtaccca tactcgtcga gctcgacggg 60
gacgtgaacg gtcagaagtt ttcggtaagc ggggaagggg agggggacgc gacgtatggg 120
aagctgacac tcaagttcat atgtacaaca ggaaaactgc cggtcccttg gcccacgctc 180
gttacaacat taacatacgg ggtgcagtgt ttctcgaggt atccggacca catgaagcaa 240
cacgatttct ttaaaagcgc aatgccagag gggtacgttc aagagaggac gattttctat 300
aaggacgatg gtaattataa aacccgggcg gaggttaaat tcgaggggga cacactggtg 360
aacaggatag aattgaaggg gatagacttc aaggaggacg gcaacattct tggacacaaa 420
atggaataca actataactc acataatgta tacatcatgg cagacaaacc aaagaatgga 480
atcaaagtta acttcaaaat tagacacaac attaaagatg gaagcgttca attagcagac 540
cattatcaac aaaatactcc aattggcgat ggccctgtcc ttttaccaga caaccattac 600
ctgtccacac aatctgccct ttccaaagat cccaacgaaa agagagatca catgatcctt 660
cttgagtttg taacagctgc tgggattaca catggcatgg atgaactata caaataa 717
<210> 33
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 用于LMW Northern印迹的Cfa6-正向引物序列
<400> 33
caacaacttg ccgggatcct g 21
<210> 34
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 用于LMW Northern印迹的Cfa6-反向引物序列
<400> 34
ggcttgcatc cgacagaatc ag 22
<210> 35
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 用于LMW Northern印迹HrpL-正向的引物序列
<400> 35
cacttcgtct tcccagcttt c 21
<210> 36
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 用于LMW Northern印迹的HrpL-正向引物序列
<400> 36
tttatccaaa agcgggtgat gaac 24
<210> 37
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 用于LMW Northern印迹miR159探针的引物序列
<400> 37
aaacctaact tccctcgaga t 21
<210> 38
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 用于RT-qPCR的GyrA-Fwd引物序列
<400> 38
aactgctggg tgagtacca 19
<210> 39
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 用于RT-qPCR的GyrA-Rev的引物序列
<400> 39
gagctcttcg cggatcact 19
<210> 40
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 用于RT-qPCR的CFA6-Fwd的引物序列
<400> 40
gtcttcatct ttcccggtca 20
<210> 41
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 用于RT-qPCR的CFA6-Rev的引物序列
<400> 41
gtctcgatct ggtcgatggt 20
<210> 42
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 用于RT-qPCR的HrpL-Fwd的引物序列
<400> 42
cgagtcattc aggccattga tt 22
<210> 43
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 用于RT-qPCR的HrpL-Rev的引物序列
<400> 43
gtttcctgat aattgccgtc ca 22
<210> 44
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 用于RT-qPCR的ProC-Fwd的引物序列
<400> 44
cgcagatgat gaaaagcgtc 20
<210> 45
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 用于RT-qPCR的ProC-Rev的引物序列
<400> 45
agtcaggctg gcacaggtg 19
<210> 46
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 用于细菌转录本RpoB的q PCR引物RpoB-Fwd
<400> 46
gtaggtctgg tccgtgttga 20
<210> 47
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 用于RT-qPCR的RpoB-Rev的引物序列
<400> 47
gcaagtaatc tcggacagcg 20
<210> 48
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 用于LMW Northern印迹的Cyp3-正向的引物序列
<400> 48
atccgagcat gacatgatga 20
<210> 49
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 用于LMW Northern印迹的Cyp3-反向的引物序列
<400> 49
gtacgggtcg atgccatatt 20
<210> 50
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 用于Northern印迹分析的探针制备：U6
<400> 50
aggggccatg ctaatcttct c 21
<210> 51
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 用于RT-qPCR的番茄Ubi-Fwd的引物序列
<400> 51
ggacggacgt actctagctg at 22
<210> 52
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 用于RT-qPCR的番茄Ubi-Rev的引物序列
<400> 52
agctttcgac ctcaagggta 20
<210> 53
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223>用于RT-qPCR的Pto GFP-Fwd的引物序列
<400> 53
tggaagcgtt caactagcag 20
<210> 54
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223>用于RT-qPCR的Pto GFP-Rev的引物序列
<400> 54
aaagggcaga ttgtgtggac 20
<210> 55
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 用于RT-qPCR的IR-CFA6/HRPL-Fwd的引物序列
<400> 55
gttcatcacc cgcttttgga 20
<210> 56
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 用于RT-qPCR的IR-CFA6/HRPL-Rev的引物序列
<400> 56
cccctctttc taccttccca 20
<210> 57
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 用于RT-qPCR的Ath-Ubi-Fwd的引物序列
<400> 57
tgaagtcgtg agacagcgtt g 21
<210> 58
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 用于RT-qPCR的Ath-Ubi -Rev的引物序列
<400> 58
gggctttctc attgttggtc 20
<210> 59
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 用于在pDON207-attB1/B2中克隆WT HRPL和mut HRPL的HRPL-pDON207-F
<400> 59
aaaaagcagg cttcatgttt cagaagattg tgatc 35
<210> 60
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 用于在pDON207-attB1/B2中克隆WT HRPL和mut HRPL的HRPL-pDON207- Rev
<400> 60
agaaagctgg gtcggcgaac gggtcgattt gctg 34
<210> 61
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 对dcl2-1等位基因进行基因型分型的引物dcl2-1-WT-fwd
<400> 61
tgaatcatct ggaagaggtg g 21
<210> 62
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 对dcl2-1等位基因进行基因型分型的引物dcl2-1-mut-fwd
<400> 62
attttgccga tttcggaac 19
<210> 63
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 对dcl2-1等位基因进行基因型分型的引物dcl2-1-WT-Rev
<400> 63
tgaatcatct ggaagaggtg g 21
<210> 64
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 对dcl3-1等位基因进行基因型分型的引物dcl3-1-fwd
<400> 64
acaggtaacc ttgccatgtt g 21
<210> 65
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 对dcl3-1等位基因进行基因型分型的引物dcl3-1-Rev
<400> 65
tggaaaagtt tgctacaacg g 21
<210> 66
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 引物LBa1
<400> 66
tggttcacgt agtgggccat cg 22
<210> 67
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 对dcl4-2等位基因进行基因型分型的引物dcl4-2-G8605 Fwd
<400> 67
ggctgcacag ctgatgatta caa 23
<210> 68
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 对dcl4-2等位基因进行基因型分型的引物dcl4-2-G8605 Rev
<400> 68
gccgctcgag atcatcagca aaggaat 27
<210> 69
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 引物GABI-8474-LP
<400> 69
ataataacgc tgcggacatc tacatttt 28
<210> 70
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> Northern印迹分析IR-HHR Fwd引物
<400> 70
ggcatcacag atcaacgcc 19
<210> 71
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> Northern印迹分析IR-HHR Rev引物
<400> 71
actgtcgtcc gatgccac 18
<210> 72
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> RT-qPCR LuxA Fwd
<400> 72
cggagtttgg tttgcttggt 20
<210> 73
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> RT-qPCR LuxA Rev
<400> 73
caagttggcg tactggatgg 20
<210> 74
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> RT-qPCR LuxA Fwd
<400> 74
gcggaggaag cttgcttatt 20
<210> 75
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> RT-qPCR LuxA Rev
<400> 75
tgatattcaa ccgggcgatt 20
<210> 76
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> HRPL-pDON207-Fwd
<400> 76
aaaaagcagg cttcatgttt cagaagattg tgatc 35
<210> 77
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> HRPL-pDON207-Rev
<400> 77
agaaagctgg gtcggcgaac gggtcgattt gctg 34
<210> 78
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> T7 Fwd CFA6/HRPL
<400> 78
taatacgact cactataggg agatgaacaa gcgctac 37
<210> 79
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> T7 Rev CFA6/HRPL
<400> 79
taatacgact cactataggg agcagggcgt ttatcca 37
<210> 80
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> T7 Fwd CYP51
<400> 80
taatacgact cactataggg agcagcaagt ttgacga 37
<210> 81
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> T7 Rev CYP51
<400> 81
taatacgact cactataggg aggcagcaaa ctcggca 37
<210> 82
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> T7 Fwd Dc3000_FusA
<400> 82
taatacgact cactataggg agatggctcg tactactccg att 43
<210> 83
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> T7 Rev Dc3000_FusA
<400> 83
taatacgact cactataggg aggccaaaag gcagtgatag cag 43
<210> 84
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> T7 Fwd Dc3000_SecE
<400> 84
taatacgact cactataggg agtgaatccc aaggctgaag ca 42
<210> 85
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> T7 Rev Dc3000_SecE
<400> 85
taatacgact cactataggg agatctctgc acgcgcttct tt 42
<210> 86
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> T7 Fwd Dc3000_GyrB
<400> 86
taatacgact cactataggg agatgagcga gaacaacacg tac 43
<210> 87
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> T7 Rev Dc3000_GyrB
<400> 87
taatacgact cactataggg agccgtatgg atggtgatgc tga 43
<210> 88
<211> 213
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 第一链 XC_RS06155 : XC_1225
<400> 88
atgcatcgac atgttcatga gcccgaaatc ctagcagacc cggcagcctt cgaagctgcc 60
gaacattggc ggcaacgcga tcttgcggtg gtgtggcacc cctgcaccca gatgcgcgag 120
cacccgcaca cactacccct ggtgccgatc gcacgtggcg acggcgcctg gctgatcggc 180
cacgatggcc gccactatct ggatgcggtc agc 213
<210> 89
<211> 213
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 第二链 XC_RS06155 : XC_1225
<400> 89
gctgaccgca tccagatagt ggcggccatc gtggccgatc agccaggcgc cgtcgccacg 60
tgcgatcggc accaggggta gtgtgtgcgg gtgctcgcgc atctgggtgc aggggtgcca 120
caccaccgca agatcgcgtt gccgccaatg ttcggcagct tcgaaggctg ccgggtctgc 180
taggatttcg ggctcatgaa catgtcgatg cat 213
<210> 90
<211> 189
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 第一链 XC_RS02265 = XC_0447
<400> 90
atgagcgttg acgctgccgc gccgacttcc gcctccactc cgccgcaacc gcctgcgcct 60
ccccagttcc ccaccttgct cggccacccc cggccgctgt ggatgctgtt catgaccgaa 120
ttctgggaac gctttgcgtt ctacggcatt cgttgggcgc tggtgctgta catcgtggcg 180
cagttcttc 189
<210> 91
<211> 189
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 第二链 XC_RS02265 = XC_0447
<400> 91
gaagaactgc gccacgatgt acagcaccag cgcccaacga atgccgtaga acgcaaagcg 60
ttcccagaat tcggtcatga acagcatcca cagcggccgg gggtggccga gcaaggtggg 120
gaactgggga ggcgcaggcg gttgcggcgg agtggaggcg gaagtcggcg cggcagcgtc 180
aacgctcat 189
<210> 92
<211> 196
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 第一链 XC_RS18260 = XC_3609
<400> 92
atgagcgatg tccttccgat cattctttcc ggcggctccg gcacgcgcct gtggccgttg 60
tcgcgcgaat cgtacccgaa gcagttcctg ccgctggtcg gcgagcacag catgctgcag 120
gccacctggc tgcgctccgc tccggtggcg gcgcacgcac ccatcgtggt ggccaacgaa 180
gagcaccgct tcatgg 196
<210> 93
<211> 196
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 第二链 XC_RS18260 = XC_3609
<400> 93
ccatgaagcg gtgctcttcg ttggccacca cgatgggtgc gtgcgccgcc accggagcgg 60
agcgcagcca ggtggcctgc agcatgctgt gctcgccgac cagcggcagg aactgcttcg 120
ggtacgattc gcgcgacaac ggccacaggc gcgtgccgga gccgccggaa agaatgatcg 180
gaaggacatc gctcat 196
<210> 94
<211> 189
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 第一链 XC_RS11930 = XC_2375
<400> 94
gagccgtcgc atcattccct gcctggacgt gcgcgatggc cgcgtggtca agggcgtcaa 60
gttccgcgac cacatcgaca tgggcgacat cgtcgagttg gcgatgcgct accgcgacca 120
gggcgcggac gagttggtgt tctacgacat tggcgccagc ccggaagggc gttcggtgga 180
ctatgcgtg 189
<210> 95
<211> 189
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 第二链 XC_RS11930 = XC_2375
<400> 95
cacgcatagt ccaccgaacg cccttccggg ctggcgccaa tgtcgtagaa caccaactcg 60
tccgcgccct ggtcgcggta gcgcatcgcc aactcgacga tgtcgcccat gtcgatgtgg 120
tcgcggaact tgacgccctt gaccacgcgg ccatcgcgca cgtccaggca gggaatgatg 180
cgacggctc 189
<210> 96
<211> 196
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 第一链 XC_RS17005 = XC_3357
<400> 96
atggcaaaga ctcatgaaat caaggtcgag cgccgcgcag acgaggggaa gggtgcgagc 60
cgccgcctgc gtcacgctgg cgtcattccg gccatcgttt acggtggcga actcgagccg 120
gtcagcatcc agctcaacca cgagcagatc tggcttgcgc agcagaacga gtggttctac 180
tcgtcgatcc tcgacc 196
<210> 97
<211> 196
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 第一链 XC_RS17005 = XC_3357
<400> 97
ggtcgaggat cgacgagtag aaccactcgt tctgctgcgc aagccagatc tgctcgtggt 60
tgagctggat gctgaccggc tcgagttcgc caccgtaaac gatggccgga atgacgccag 120
cgtgacgcag gcggcggctc gcacccttcc cctcgtctgc gcggcgctcg accttgattt 180
catgagtctt tgccat 196
<210> 98
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> T7 Fwd XC_RS06155 : XC_1225
<400> 98
taatacgact cactataggg agatgcatcg acatgttcat gagc 44
<210> 99
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> T7 Rev XC_RS06155 : XC_1225
<400> 99
taatacgact cactataggg aggctgaccg catccagata gt 42
<210> 100
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> T7 Fwd XC_RS02265 = XC_0447
<400> 100
taatacgact cactataggg agatgagcgt tgacgctgcc 40
<210> 101
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> T7 Rev XC_RS02265 = XC_0447
<400> 101
taatacgact cactataggg aggaagaact gcgccacgat gta 43
<210> 102
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> T7 Fwd XC_RS18260 = XC_3609
<400> 102
taatacgact cactataggg agatgagcga tgtccttccg a 41
<210> 103
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> T7 Rev XC_RS18260 = XC_3609
<400> 103
taatacgact cactataggg agccatgaag cggtgctctt 40
<210> 104
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> T7 Fwd XC_RS11930 = XC_2375
<400> 104
taatacgact cactataggg aggagccgtc gcatcattcc 40
<210> 105
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> T7 Rev XC_RS11930 = XC_2375
<400> 105
taatacgact cactataggg agcacgcata gtccaccgaa c 41
<210> 106
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> T7 Fwd XC_RS17005 = XC_3357
<400> 106
taatacgact cactataggg agatggcaaa gactcatgaa atc 43
<210> 107
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> T7 Rev XC_RS17005 = XC_3357
<400> 107
taatacgact cactataggg agggtcgagg atcgacgagt ag 42
<210> 108
<211> 500
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 用于同时靶向Pto C3000的LuxA和LuxB基因的LuxA/LuxB dsRNA的第一臂的序列
<400> 108
atgaaatttg gaaacttttt gcttacatac caacctcccc aattttctca aacagaggta 60
atgaaacgtt tggttaaatt aggtcgcatc tctgaggagt gtggttttga taccgtatgg 120
ttactggagc atcatttcac ggagtttggt ttgcttggta acccttatgt cgctgctgca 180
tatttacttg gcgcgactaa aaaattgaat gtaggaactg ccgctattgt tcttcccaca 240
gcccatccag atgaaatttg gattgttctt ccttaacttc atcaattcaa caactgttca 300
agaacaaagt atagttcgca tgcaggaaat aacggagtat gttgataagt tgaattttga 360
acagatttta gtgtatgaaa atcatttttc agataatggt gttgtcggcg ctcctctgac 420
tgtttctggt tttctgctcg gtttaacaga gaaaattaaa attggttcat taaatcacat 480
cattacaact catcatcctg 500
<210> 109
<211> 500
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 用于同时靶向Pto C3000的LuxA和LuxB基因的LuxA/LuxB dsRNA的第二臂的序列
<400> 109
caggatgatg agttgtaatg atgtgattta atgaaccaat tttaattttc tctgttaaac 60
cgagcagaaa accagaaaca gtcagaggag cgccgacaac accattatct gaaaaatgat 120
tttcatacac taaaatctgt tcaaaattca acttatcaac atactccgtt atttcctgca 180
tgcgaactat actttgttct tgaacagttg ttgaattgat gaagttaagg aagaacaatc 240
caaatttcat ctggatgggc tgtgggaaga acaatagcgg cagttcctac attcaatttt 300
ttagtcgcgc caagtaaata tgcagcagcg acataagggt taccaagcaa accaaactcc 360
gtgaaatgat gctccagtaa ccatacggta tcaaaaccac actcctcaga gatgcgacct 420
aatttaacca aacgtttcat tacctctgtt tgagaaaatt ggggaggttg gtatgtaagc 480
aaaaagtttc caaatttcat 500

Claims (34)

1.一种抑制靶细菌细胞中至少一个基因表达的体外方法，所述方法包括使所述靶细菌细胞与小RNA、或者包含小RNA的组合物接触的步骤。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述小RNA是siRNA或miRNA，其特异性抑制致植物病的细菌的细菌必需基因、或细菌毒力基因或抗菌抗性基因的表达。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述靶细菌细胞是来自致植物病的细菌的细胞，例如选自：青枯雷尔氏菌(Ralstonia solanacearum)、水稻黄单胞菌致病变种(Xanthomonas oryzae pathovars)、芸苔黄单胞菌致病变种(Xanthomonas campestrispathovars)、地毯草黄单胞菌致病变种(Xanthomonas axonopodis pathovars)、Xanthomonas euvesicatoria pathovars、旅馆黄单胞菌致病变种(Xanthomonas hostorumpathovars)、丁香假单孢菌致病变种(Pseudomonas syringae pathovars)、浅绿假单胞菌致病变种(Pseudomonas viridiflava pathovars)、萨氏假单孢菌致病变种(Pseudomonassavastono pathovars)、柑橘黄龙病菌亚洲型(Candidatus liberibacter asiaticus)、土豆斑纹片病菌(Candidatus liberibacter solanacearum)、柠檬酸嗜酸杆菌(Acidovoraxcitrulli)、燕麦酸嗜酸杆菌致病变种(Acidovorax avenae pathovars)、特罗氏芽孢杆菌致病变种(Pectobacterium atrosepticum pathovars)、胡萝卜芽孢杆菌致病变种(Pectobacterium carotovorum pathovars)、果胶杆菌(pectobacterium sp.)、根瘤农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)、Dickeya(dadantii和solani)、小球藻欧文氏菌(Erwinia amylovora)、密歇根棒状杆菌(Clavibacter michiganensis)(michiganensis和sepedonicus)、苛养木杆菌(Xylella fastidiosa)、果胶杆菌(Pectobacterium)(胡萝卜果胶杆菌(carotovorum)和黑胫病果胶杆菌(atrosepticum))、疥疮链霉菌(Streptomycesscabies)、泡桐丛枝病菌(Phytoplasma sp)、螺原体(Spiroplasma sp)。
4.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述靶细菌细胞是来自对植物有益的细菌的细胞，其例如选自：芽孢杆菌(例如，枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis))、假单胞菌(例如，恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)、斯氏假单胞菌(Pseudomonas stuzeri)、荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)、蛋白质假单胞菌(Pseudomonas protegens)、十字花科假单胞菌(Pseudomonas brassicacearum))、根瘤菌(例如，苜蓿根瘤菌(Rhizobiummeliloti))、伯克霍尔德氏菌(例如，Burkholderia phytofirmans)、固氮螺菌(例如，脂铁螺菌(Azospirillum lipoferum))、葡糖杆菌(例如，重氮糖杆菌(Gluconacetobacterdiazotrophicus))、沙雷氏菌(例如，粘质沙雷氏菌(Serratia proteamaculans))、寡养单胞菌(例如，嗜麦芽寡养单胞菌(Stenotrophomonas maltophilia))、肠杆菌(例如，阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae))。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述小RNA的尺寸在15至30个碱基对之间。
6.一种小RNA或包含小RNA的组合物用于抑制靶细菌细胞中至少一个基因表达的体外用途，其中所述靶细菌细胞与所述小RNA或所述组合物直接接触。
7.根据权利要求6所述的体外用途，其中所述小RNA是单链的或双链的。
8.根据权利要求6所述的体外用途，其中所述组合物包含从生产者植物细胞获得的植物提取物，所述植物细胞表达与所述细菌细胞的至少一个基因显示序列同源性的至少一个长dsRNA。
9.根据权利要求8所述的体外用途，其中所述组合物包含来自所述植物细胞的总RNA、或总小RNA、或非原质体流体、或细胞外囊泡、或细胞外游离小RNA。
10.根据权利要求8或权利要求9所述的体外用途，其中所述生产者植物细胞是选自以下的植物的细胞：烟草(例如，本氏烟草(Nicotiana benthamiana)、红花烟草(Nicotianatobaccum))；芋头(槟榔芋(Colocasia esculenta))；姜(Zingiber officinale)、拟南芥(例如，Arabidopsis thaliana)；番茄(例如，栽培番茄(Lycopersicon esculentum)或Solanum lycopersicum)；土豆(Solanum tuberosum)；水稻(Oryza sativa)；玉米(Zeamays)；大麦(Hordeum vulgare)；小麦(例如，普通小麦(Triticum aestivum)、硬质小麦(Triticum durum))、棉籽、棉花、豆、香蕉/车前草、高粱、豌豆、甘薯、大豆、卷心菜、木薯、洋葱、甜瓜、燕麦、花生、向日葵、棕榈油、黑麦、柑橘、小麦、胡椒、山药、橄榄、葡萄、芝麻、甘蔗、甜菜、豌豆和咖啡、橘树、苹果树、柑桔树、橄榄树、菊花、凤仙花、天竺葵、天竺葵属植物、福禄考、杜鹃花红掌属(Rhododendron anthurium spp)、玫瑰树、姜黄、红掌、秋海棠、罗莎木槿(Hibiscus rosa-sinensis)、孤挺花、马蹄莲、仙客来和龙血树。
11.根据权利要求6-10中任一项所述的体外用途，其中如果所述细菌细胞是致病性的，则所述小RNA或长RNA抑制至少一个编码毒力因子或必需基因或抗菌抗性的基因，如果所述细菌细胞对宿主是有益的，则所述小RNA或长RNA抑制至少一个编码生长抑制子的基因、或至少一个编码对于宿主有用的途径的负调节子的基因。
12.一种用于处理靶植物以抵抗细菌感染的方法，所述方法包括向所述靶植物的细胞中引入长dsRNA分子的步骤，所述长dsRNA分子特异性靶向至少一个毒力细菌基因、或至少一个必需细菌基因、或至少一个抗菌抗性基因。
13.一种处理靶植物以抵抗细菌感染的方法，所述方法包括以下步骤：在细菌感染之前和/或细菌感染之后，向靶植物组织递送抑制至少一个必需、或毒力、或抗菌抗性细菌基因的小RNA、或含有这样小RNA的组合物。
14.根据权利要求13所述的方法，其中所述组合物包含从植物细胞获得的植物提取物，所述植物细胞表达对至少一个毒力、或必需、或抗菌抗性细菌基因特异的至少一个长dsRNA。
15.根据权利要求13-14中任一项所述的方法，其中所述组合物包含从所述植物提取物回收的非原质体流体、或细胞外囊泡、或细胞外游离小RNA。
16.根据权利要求13-15中任一项所述的方法，其中所述组合物是液体可喷洒组合物。
17.一种触发植物原位小RNA产生的重组植物RNA病毒，所述小RNA可以抑制至少一个细菌基因靶标的表达。
18.一种DNA重组载体，其包含DNA多核苷酸序列，所述DNA多核苷酸序列编码抑制至少一个必需、毒力、或抗菌抗性细菌基因的表达的长dsRNA，其中所述多核苷酸序列在植物细胞中可表达。
19.一种转基因植物，其包含权利要求17所述的重组植物RNA病毒、或权利要求18所述的重组载体。
20.根据权利要求19所述的转基因植物，其稳定或瞬时表达编码长RNA的DNA多核苷酸序列，所述长RNA抑制至少一个必需细菌基因、毒力细菌基因、或抗菌抗性基因的表达。
21.根据权利要求19所述的转基因植物，其稳定或瞬时表达功能性小RNA，所述小RNA抑制至少一个必需细菌基因、毒力细菌基因或抗菌抗性基因的表达。
22.一种含有大量小RNA的植物治疗组合物，所述小RNA抑制必需细菌基因、或毒力细菌基因、或抗菌抗性细菌基因的表达。
23.根据权利要求22所述的植物治疗组合物，其包含小RNA，所述小RNA包含在来自权利要求19的转基因植物的总RNA提取物、或细胞外囊泡、或非原质体流体或细胞外游离小RNA提取物。
24.根据权利要求22或权利要求23所述的植物治疗组合物，还包含杀菌化合物。
25.一种组合产品，其包含根据权利要求22或权利要求23所定义的植物治疗组合物和杀菌化合物。
26.根据权利要求22-24所述的植物治疗组合物、或权利要求25所述的组合产品，用于抑制、或预防细菌在靶植物上的生长或致病性的用途。
27.根据权利要求26所述的用途，其中所述致植物病的细菌选自：
青枯雷尔氏菌、水稻黄单胞菌致病变种、芸苔黄单胞菌致病变种、地毯草黄单胞菌致病变种、Xanthomonas euvesicatoria pathovars、旅馆黄单胞菌致病变种、丁香假单孢菌致病变种、浅绿假单胞菌致病变种、萨氏假单孢菌致病变种、柑橘黄龙病菌亚洲型、土豆斑纹片病菌、柠檬酸嗜酸杆菌、燕麦酸嗜酸杆菌致病变种、特罗氏芽孢杆菌致病变种、胡萝卜芽孢杆菌致病变种、果胶杆菌、根瘤农杆菌、Dickeya(dadantii和solani)、小球藻欧文氏菌、密歇根棒状杆菌(michiganensis和sepedonicus)、苛养木杆菌、果胶杆菌(胡萝卜果胶杆菌和黑胫病果胶杆菌)、疥疮链霉菌、泡桐丛枝病菌和螺原体。
28.根据权利要求26或27所述的用途，其中所述靶植物选自：水稻、玉米、大麦、棉籽、棉花、豆、香蕉/车前草、高粱、豌豆、甘薯、大豆、卷心菜、木薯、土豆、番茄、洋葱、甜瓜、燕麦、花生、向日葵、棕榈油、黑麦、柑橘、小麦、胡椒、山药、橄榄、葡萄、芋头、烟草、芝麻、甘蔗、甜菜、豌豆和咖啡、橘树、苹果树、柑桔树、橄榄树、菊花、凤仙花、天竺葵、天竺葵属植物、福禄考、杜鹃花红掌属、玫瑰树、姜黄、红掌、秋海棠、罗莎木槿、孤挺花、马蹄莲、仙客来和龙血树。
29.一种制备权利要求23所述的植物治疗组合物的方法，其包括以下步骤：
a)生成产生siRNA或miRNA的重组转基因植物细胞，所述siRNA或miRNA特异性抑制致植物病的细菌的细菌必需基因、或细菌毒力基因、或抗菌抗性基因，
b)从所述重组植物细胞中回收植物细胞提取物、或总RNA、或非原质体流体、或细胞外囊泡、或细胞外游离小RNA，
c)任选地，在所述植物治疗组合物中添加赋形剂或另一种活性成分。
30.根据权利要求29所述的方法，其中所述重组转基因植物细胞来源自：烟草(例如，本氏烟草、红花烟草)；芋头(槟榔芋)；姜(Zingiber officinale)、拟南芥(例如，Arabidopsisthaliana)；番茄(例如，栽培番茄或Solanum lycopersicum)；土豆(Solanum tuberosum)；水稻(Oryza sativa)；玉米(Zea mays)；大麦(Hordeum vulgare)；小麦(例如，普通小麦、硬质小麦)。
31.根据权利要求29或30所述的方法，其中通过用对所述至少一个细菌基因特异性的至少一个长dsRNA表达植物细胞来进行步骤a)。
32.一种鉴定具有抗菌活性的候选小RNA的体外方法，所述方法包括以下步骤：
a)在植物细胞中表达抑制至少一个细菌基因的至少一个长dsRNA，
b)使所述植物细胞与裂解缓冲液、或所述植物细胞的非原质体流体接触，
c)将所述植物细胞裂解物、或流体与靶细菌细胞一起孵育，以及
d)评估所述细菌细胞的活力、生长、代谢活性。
33.根据权利要求32所述的方法，其中所述植物细胞来自烟草叶子。
34.一种鉴定影响细菌细胞增殖的候选基因的体外方法，所述方法包括以下步骤：
a)生成抑制至少一个细菌基因的小RNA,
b)将所述小RNA与细菌细胞一起孵育，以及
c)评估所述细菌细胞的活力、生长、代谢活性。
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