CN116887680A - 基于小球藻生产细胞外囊泡包埋的小rna用于生物防治应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种生产靶向植物病原体的毒力因子、必需基因和/或抗菌素耐药性基因的小RNA的新方法。更具体地，本发明涉及在小球藻(Chlorella)细胞中表达外源性RNA干扰(RNAi)前体，所述小球藻细胞转而表达并释放细胞外囊泡(EV)包埋的抗菌小RNA。可以从小球藻培养物的无细胞培养基中收集这些EV，并进一步浓缩和纯化用于生物防治应用。重要地，小球藻EV保护小RNA免受核糖核酸酶介导的消化，表明这些基于脂质的颗粒不仅作为小RNA向致病细胞的天然载体，而且还可能限制它们在环境中的降解。因此，本发明可能用于降低多种病原体的致病性和生长，或者潜在地增强植物相关共生和共栖微生物的有益作用和生长。此外，由于在光生物反应器中生产时和在冷冻储存时，小球藻EV包埋的抗菌siRNA的完整性保持不变，因此该方法具有进一步开发用于新一代基于微藻的生物制剂的工业化和制造的潜力。

Description

基于小球藻生产细胞外囊泡包埋的小RNA用于生物防治应用
技术领域
本发明涉及一种生产靶向植物病原体的毒力因子、必需基因和/或抗菌素耐药性基因的小RNA的新方法。更具体地，本发明涉及在小球藻(Chlorella)细胞中表达外源性RNA干扰(RNAi)前体，所述小球藻细胞转而表达并释放细胞外囊泡(EV)包埋和/或相关的抗菌小RNA。可以从小球藻培养物的无细胞培养基中收集这些EV，并进一步浓缩和纯化用于生物防治应用。重要地，小球藻EV保护小RNA免受核糖核酸酶介导的消化，表明这些基于脂质的颗粒不仅作为小RNA至致病细胞的天然载体，而且还可能限制它们在环境中的降解。因此，本发明可能用于降低多种病原体的致病性和生长，或者潜在地增强植物相关共生和共栖微生物的有益作用和生长。此外，由于在光生物反应器中生产时和在冷冻储存时，小球藻EV包埋和/或相关的抗菌siRNA的完整性保持不变，因此该方法具有进一步开发用于新一代基于微藻的生物制剂的工业化和制造的潜力。
背景技术
RNA沉默控制植物-病原体相互作用
在植物中，可移动的小RNA可以在相邻细胞以及远端组织中触发非细胞自主沉默(Melynk等人，2011)。它们对于在感染之前事先准备抗病毒防御尤其重要(Melynk等人，2011)。非细胞自主沉默对于植物细胞和与其相互作用的非病毒致病生物体、寄生生物体或共生生物体之间的沉默信号易位也至关重要(Baulcombe，2015)。最近尤其在植物-真菌相互作用中表征了该天然跨界调节机制(Weiberg等人，2015，Koch等人，2014，Zhang等人，2016，Wang等人，2016，Weiberg等人，2013，Cai等人，2018)。例如，发现特定的植物miRNA被输出至真菌病原体大丽轮枝菌(Verticillium dahliae)的菌丝中，以触发毒力因子的沉默(Zhang等人，2016，Cai等人，2018)。另一方面，内源灰葡萄孢(B.cinerea)小RNA可以被输出至植物细胞中以沉默植物防御基因(Weiberg等人，2013)，突出显示了植物和真菌病原体之间的双向跨界RNAi。尽管对宿主细胞和真菌细胞之间小RNA/dsRNA运输的机制知之甚少，但吸器外基质中许多囊泡的存在表明它们可能在两种生物体之间转运沉默信号(Micali等人，2011)。与该假设一致，最近的两项研究提供证据表明，植物细胞外囊泡(EV)对于将抗真菌小RNA递送至灰葡萄孢细胞中以及将抗卵菌小RNA递送至辣椒疫霉菌(Phytophthoracapsici)细胞中至关重要(Cai等人，2018，Koch等人，2013)。
可以利用跨界RNAi来赋予针对具备经典RNA沉默机制的病原体的保护
最初通过表达与来自给定寄生物或有害生物(前提是它们具有经典RNAi机制，例如功能性DCL和AGO蛋白)的维持生命必需因子或致病因子具有同源性的dsRNA，证明了跨界RNAi的生物学相关性。到目前为止，该宿主诱导基因沉默(HIGS)技术已成功用于保护植物免受昆虫、线虫、卵菌、真菌、细菌和寄生植物的侵袭和捕食(Singla-Rastogi，Navarro，PCT/EP2019/072169，PCT/EP2019/072170；WO 2012/155112，WO 2012/155109，CA 2 799453，EP 2 405013，US 2013/177539，Wang等人，2016，Koch等人，2016，Wang等人，2017)。例如，HIGS赋予针对禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)和灰葡萄孢的全面保护，并且通过在真菌感染之前将相关的外源dsRNA或siRNA喷洒至野生型植物上来完全重现该现象(Wang等人，2016，Koch等人，2016，Wang等人，2017)。后一种现象被称为喷雾诱导基因沉默(SIGS)，使人联想到“环境RNAi”，其是一种涉及从环境摄入RNA的过程，最初描述于秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)和一些昆虫中(Wang等人，2016，Wang等人，2017，Lacombe等人，2010)。因此，认为HIGS/SIGS是旨在将抗病基因引入农业相关作物中的传统育种或基因工程的有力补充，甚至有时是替代物(Jones等人，2014，Mansfield等人，2012，Escobar等人，2001)。此外，该技术提供了一种更耐久且环保的植物保护解决方案，其将可能有助于减少使用农用化学品，农用化学品在一些情况下可以对人类健康和环境产生显著影响。
然而，对于此类基于RNA的生物制剂的工业化和制造，需要建立以高通量水平和具有成本效益的方式生产载体化(vectorized)小RNA的方法，从而赋予对于植物病原体的有效保护。
本发明的目的在于满足该需要。事实上，本文提出了一种生产大量EV包埋的小RNA的方法，所述小RNA可以对广泛的植物病原体有效，并且可以在感染之前和/或之后应用于各种植物组织。也可以通过树干注射或叶柄吸收将其递送至木本植物中，并全身运输至靶向的维管植物病原体。因此，通过使用新一代基于微藻的生物制剂，该方法将在疾病管理中具有重大的农业应用。
此外，由于发现EV包埋和/或相关的小RNA耐受核糖核酸酶介导的消化，预计该方法将适合于在被靶向病原体内化之前保护抗菌小RNA在环境中的完整性，它们将在所述靶向病原体中触发期望的抗毒力和/或抗生存作用。
此外，因为可以工程改造小球藻以生产与靶向病原体的大部分毒力因子、必需基因和/或抗菌剂耐药性基因具有序列同源性的siRNA群体，所以提出的方法应当赋予持久的抗性。这是与经典杀虫剂的主要区别，经典杀虫剂通常由于病原体逃逸突变而在几年内变得无效。
最后，可以预期本文所描述的技术还将可用于控制来自有益微生物的基因的表达，以增强其增殖和/或其对于宿主植物的有益作用。
发明内容
结果和发明概述
在下面的结果中，发明人在本文中提供了小球藻细胞可以生产细胞外囊泡(EV)的最先证据。他们还首次证明了可以工程改造小球藻以生产EV包埋和/或与EV相关的生物活性抗菌小RNA。更具体地，他们通过用与来自植物病原菌的关键毒力因子具有序列同源性的反向重复转基因来转化普通小球藻(C.Vulgaris)，表明小球藻EV能够在细菌细胞中递送有效小RNA，从而抑制所述细菌细胞的致病性。此外，他们表明小球藻EV有效保护这些抗菌小RNA免受非特异性微球菌核酸酶介导的消化。因此，这些数据突出显示了小球藻EV作为向细菌病原体递送小RNA的载体的巨大潜力。此外，因为已知植物EV在植物病原真菌和卵菌中递送有效抗菌小RNA(Cai等人，2018；Hou等人，2019)，所以预计小球藻EV将用于在各种植物病原体(包括细菌、真菌和卵菌生物体)中转运活性小RNA。
小球藻EV包埋的小RNA产品的工业化的先决条件是证明它们可以在光生物反应器(PBR)中生产时保持完全完整性。为了解决该问题，发明人首先使生产抗菌siRNA的小球藻参考系在一升的PBR中生长，收集了相应的细胞外培养基并进一步冷冻储存。随后将细胞外培养基融化并进行过滤和超速离心，以回收纯化的EV。重要地，发现这些小球藻EV表现出正态尺寸分布。此外，当相同的小球藻转基因系在150升的PBR中生长时，获得了相当的结果，只是在这些条件下，回收的EV颗粒的产率比从烧瓶或1L PBR收集的产率增加了～20倍。此外，我们发现从1L和150L PBR中回收的小球藻EV包埋和/或相关的小RNA的抗菌活性没有改变。这些发现表明，在PBR中生产时，尽管被冷冻储存，但小球藻EV包埋和/或相关的小RNA的完整性和功能性保持不变。因此，微藻诱导基因沉默(MIGS)技术适用于在PBR中生产EV包埋的抗菌小RNA。
小球藻EV包埋的抗菌小RNA工业化的另一个先决条件是以快速、可靠且具有成本效益的方式验证由PBR生产的每个批次的功效。为了解决该问题，发明人设计并工程改造了细菌表达的小RNA报告系统，该系统依赖于在有效的小球藻EV包埋和/或相关的抗菌小RNA存在下进行差异性的荧光或生物发光信号检测。可以容易地生成并操作这些定量报告基因，以在产品制造之前确保生产的每一批均具有高活性。另外，它们可以用于快速选择表达活性EV包埋和/或相关的小RNA物种的独立小球藻转基因系。
基于所有这些发现，本发明人提出使用该MIGS技术以生产针对任何目的植物病原体的小球藻EV包埋的小RNA。更准确地，他们提出一种高产率生产靶向一种或多种目标病原体的小球藻EV包埋的小RNA的方法，通过以下进行：i)在小球藻细胞中表达iRNA分子(siRNA和miRNA的前体)，ii)收集所述小球藻细胞释放的EV，iii)在产品制造之前验证小球藻EV包埋的siRNA的功效，以及iv)将浓缩或纯化的EV产品递送至植物上(即叶表面、种子上或脉管系统中，在木本植物的情况下尤其是通过树干注射或叶柄吸收)。值得注意的是，在这种生产线中，携带有效EV的细胞外培养基或纯化的EV均可以冷冻储存，而不会对这些基于EV的抗感染剂的完整性和功能性产生重大负面影响。
因此，预计MIGS技术将广泛用于针对广谱植物病原体的生物防治应用。
本发明的方法的以下特征和优点值得提及。
1)小球藻是生产内源和异源分子的理想生物系统：
小球藻属于一组绿色微藻(绿藻门(Chlorophyta)，共球藻纲(Trebuxiophyceae))，其能够适应各种条件并生长。小球藻易于在实验室条件下维持，具有简单的生命周期、单倍体基因组和类似于高等植物的代谢途径(Blanc等人，2010)。它还具有在自养、异养或兼养条件下以高生长速率生长的能力(Zuniga等人，2016)。代谢灵活性、易于维持和生长的特点使得小球藻能够在PBR中用作各种目的分子的工业生产支架。特别是，可以容易地用卸甲的(disarmed)根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)转化小球藻细胞(Cha等人，2012)，并且可以在2个月时间内选择稳定转化的转基因系。该异常快速的选择过程将小球藻定位为在短时间内生产任何目的构建体的理想生物系统。该特征在爆发情况下尤其有价值，因为可以利用小球藻快速生产针对来自任何目的植物病原体(现在可以在几天内对其进行测序)的毒力因子、必需基因和/或抗菌素耐药性基因的载体化(vectorized)小RNA。
总而言之，用目的转基因快速转化小球藻并由PBR获得大量小球藻细胞外培养基的可能性表明，该绿色微藻适用于EV包埋和/或相关的抗菌小RNA的工业生产。
2)MIGS技术具有高度多功能性和序列特异性。
MIGS技术依赖于在小球藻中稳定表达反向重复的人工miRNA或有义-反义转基因，其将被内源Dicer样酶和/或其他内源RNA酶加工为siRNA或miRNA，并进一步内化至EV中。MIGS技术还可以依赖于由重组病毒生产RNAi前体，所述重组病毒可以感染小球藻细胞，并如先前在植物中描述的那样，类似地通过病毒诱导的基因沉默(VIGS)来高产率生成siRNA群体。尤其可以以这样一种方式设计这些基于转基因和病毒的RNAi前体，即它们将靶向一个或多个目的基因并触发其选择性沉默。该特征对于控制一种或多种植物病原体的复制特别有价值，同时对培养的植物、其相关共栖微生物、或以这些植物为食的动物(包括人)没有副作用。
3)MIGS技术可以用于生产抗菌小RNA群体，可能赋予持久的抗病性。
小球藻可以用于生产小RNA群体，其靶向来自单个基因或多达十几个基因的长达1500bp的区域。因此，小球藻非常适用于生产覆盖微生物基因的大部分的小RNA，从而使检测到对靶向微生物基因的强效沉默作用的机会最大化。此外，通过靶向长序列区域，微生物将不太可能沿靶向区域一直突变，从而产生针对靶向植物病原体的持久保护作用。因此，预期MIGS技术会克服反复出现病原体定向逃逸突变的问题，因此预期会赋予持久抗病性。
4)MIGS技术有效针对原核细胞，而其他生产长dsRNA的平台则不然。
本发明人先前报道了外源应用siRNA可以以序列特异性的方式靶向细菌病原体中的毒力因子(Singla-Rastogi，Navarro，PCT/EP2019/072169，PCT/EP2019/072170)。相比之下，长dsRNA在该过程中没有活性，表明它们不被细菌细胞摄入或在细菌细胞中没有活性。这是与以下的主要区别：先前报道的线虫和植物食草动物中的环境RNAi，其专门依赖于长dsRNA(Bolognesi等人，2012；Ivashuta等人，2015；Whangbo等人，2008)，或真菌和卵菌中的环境RNAi，其依赖于小RNA物种和长dsRNA物种两者(Koch等人，2016；Wang等人，2016)。因此，通过生产小RNA物种，MIGS技术具有用作抗菌剂的新型生产支架的潜力，而目前用于生产长dsRNA作为杀真菌剂、杀虫剂或杀线虫剂用于农业应用的其他工业生物系统则不然。MIGS技术还可以用于选择性靶向共生或共栖细菌的基因以增强其对宿主植物的有益作用。因此，MIGS是一种独特的RNAi生产支架技术，其可以用于针对原核细胞，以及可能用于针对许多其他不相关的微生物和有害生物。
定义
如本文所用，术语“功能性干扰RNA”(功能性iRNA)是指能够诱导至少一个基因的序列特异性沉默过程的RNA分子。特别是，所述功能性干扰RNA分子可以是i)小干扰RNA，本领域公知为小干扰RNA或短干扰RNA(siRNA)分子(单链体或双链体)，或其前体；或ii)microRNA(miRNA)分子(单链体或双链体)或其前体。
iRNA是一种保守的基因调节机制，其促进植物、蝇、虫和哺乳动物的抗病毒抗性(Guo等人，2019)。抗病毒沉默的核心机制涉及RNA酶III DICER对病毒双链RNA(dsRNA)的识别和加工其导致产生20-25nt长的短干扰RNA(siRNA)双链体。这些siRNA双链体随后与RNA诱导沉默复合物(RISC)的核心成分即Argonaute(AGO)蛋白结合，并且一条链即向导链与AGO保持结合以转录后沉默互补病毒转录本。最近的研究表明了植物和/或动物内源小RNA还可以直接靶向来自真菌、细菌和卵菌病原体的毒力基因或必需基因，从而支持RNAi在宿主-病原体相互作用期间跨界基因调节中的广泛作用(Guo等人，2019；Cai等人，2018)。
本文中的术语“siRNA的前体”或“siRNA前体”是指可以在小球藻细胞(或小球藻提取物)中直接或间接加工成siRNA双链体的RNA分子。可以直接加工的siRNA前体的例子包括长双链RNA(长dsRNA)，而可以间接加工的siRNA前体的例子包括可以用作生产可加工的长dsRNA的模板的长单链RNA(长ssRNA)。
本文中的术语“miRNA的前体”或“miRNA前体”是指可以在小球藻细胞(或小球藻提取物)中加工成miRNA双链体的RNA分子。miRNA前体的例子包括初级miRNA前体(pri-miRNA)和pre-miRNA，其包含发夹环。
值得注意的是，编码所述前体分子的质粒或载体以及其他DNA构建体或病毒载体也涵盖于“功能性干扰iRNA”的定义中。
对于靶向多个基因，本发明的方法可以使用i)数种不同iRNA的混合物，其总体上靶向多个目的基因，或ii)靶向数个不同目的基因的嵌合iRNA，或iii)任何这些嵌合iRNA的混合物。
在一个具体的实施方案中，本发明的方法/用途包括将一个或多个长功能性iRNA作为前体引入小球藻细胞中，这些细胞将生产小RNA(如siRNA或miRNA)，其可以被进一步配制并用于预防致病性感染。
这些长功能性iRNA可以是长单链RNA分子(以下称为“长ssRNA”)。这些长ssRNA可以引入小球藻细胞中，转化成长dsRNA分子，并通过小球藻DCL酶进一步加工成siRNA。可选地，长ssRNA可以由可以感染小球藻细胞的RNA病毒产生，并在病毒复制期间进一步转化成长dsRNA分子(作为复制中间体)。所得病毒dsRNA随后被小球藻DCL酶加工成siRNA。
如本文所用，术语“长ssRNA”是指含有单链的单链结构，所述单链为至少50个碱基，更优选80至3000个碱基。长ssRNA在由小球藻转基因生产时可以含有80至3000个碱基，但在由重组RNA病毒生产时优选含有80至1500个碱基。
这些长功能性iRNA也可以是双链RNA分子(以下称为“长dsRNA”)。这些长dsRNA用作miRNA或siRNA前体，并且由于小球藻基因组编码的DCL蛋白而可以在小球藻细胞中加工成miRNA或siRNA(参见实施例3)。
如本文所用，术语“长dsRNA”是指含有第一链(有义链)和第二链(反义链)的双链结构，所述第一链和第二链为至少50个碱基对，更优选80至3000个碱基对。
本发明人的结果表明，在小球藻细胞中，长dsRNA可以有效地加工成有效小RNA(实施例3)。此类长dsRNA有利地为嵌合dsRNA，即它们与多个基因具有序列同源性。
本发明的方法中使用的长功能性iRNA优选为可由小球藻细胞中的DCL酶切割的长dsRNA，以在小球藻细胞中生成miRNA或siRNA。
这些长dsRNA可以由发夹结构生成，通过有义-反义转录构建体生成，通过进一步用作长dsRNA生产底物的人工有义转录本构建体生成，或通过VIGS生成。更准确地，它们可以包含凸起、环或摆动碱基对，以调节dsRNA分子的活性，以便于介导目标细胞中的有效RNA干扰。可以通过基于核酸或基于非核酸的接头的方式来连接这些长dsRNA分子的互补有义区和反义区。这些长dsRNA还可以包含一个双链体结构和一个环结构，以形成对称或不对称的发夹二级结构。
在具体的实施方案中，本发明的前体可以同时靶向～150-250bp的数个苛养木杆菌(Xylella fastidiosa)基因区域，并具有例如以下序列：IR-cheA/gaCA/tolC/pglA/engXCA1/engXCA2＝SEQ ID NO：1-2；IR-cheA/GumH/GumD/XpsE/LesA/HolC＝SEQ ID NO：3-4；IR-LesA/gumH/gumD＝SEQ ID NO：5-6；IR-XpsE/HolC/LesA＝SEQ ID NO：7-8；IR-cheA/pglA/LesA＝SEQ ID NO：9-10；IR-cheA/engXCA1/engXCA2＝SEQ ID NO：11-12；IR-gacA/pglA/engXCA2＝SEQ ID NO：13-14和IR-cheA/tolC/engXCA1＝SEQ ID NO：15-16。
在另一个具体的实施方案中(参见实施例9)，本发明的前体可以靶向来自韧皮部杆菌亚洲种(Candidatus Liberibacter asiaticus)的必需基因，并具有以下序列：IR-wp015452784/WP012778510/wp015452939/act56857/wp012778668＝SEQ ID NO：55-56；IR-wp012778355/wp015452784/WP012778510＝SEQ ID NO：57-58和IR-wp015452939/act56857/wp012778668＝SEQ ID NO：59-60。
在另一个具体的实施方案中，本发明的前体可以靶向来自软腐欧文氏菌(Erwiniacarotovora)的关键毒力基因，其具有以下序列：IR-GyrB/MreB/rbfA/RsgA/FliA/QseC＝SEQ ID NO：47-48；IR-GyrB/rbfA/QseC＝SEQ ID NO：49-50；IR-fliA/MreB/QseC＝SEQ IDNO：51-52和IR-GyrB/MreB/RsgA＝SEQ ID NO：53-54。
在另一个具体的实施方案中，本发明的前体可以靶向来自丁香假单胞猕猴桃致病变种(Pseudomonas syringae pv.actinidiae)的关键基因，并具有以下序列：IR-GyrB/Hfq/HrpR/HRPS/MreB/RpoD＝SEQ ID NO：61-62；IR-GyrB/Hfq/MreB＝SEQ ID NO：63-64；IR-HrpR/HrpS/Hfq＝SEQ ID NO：65-66和IR-HrpR/GyrB/RpoD＝SEQ ID NO：67/148。
在另一个具体的实施方案中，本发明的前体可以靶向丁香假单胞菌番茄致病变种(Pseudomonas syringae pv.tomato)DC3000菌株的必需基因，并具有以下序列：IR-CFA6/HRPL＝SEQ ID NO：90-91；IR-HRPL＝SEQ ID NO：92-93；IR-FusA＝SEQ ID NO：136-137；IR-GyrB＝SEQ ID NO：138-139；IR-FusA/GyrB＝SEQ ID NO：140-141；IR-AvrPto/AvrPtoB＝SEQ ID NO：94-95；IR-AvrPto/AvrPtoB/HopT1-1＝SEQ ID NO：130-131；IR-rpoB/rpoC/FusA＝SEQ ID NO：132-133；IR-secE/rpoA/rplQ＝SEQ ID NO：134-135；IR-secE＝SEQ IDNO：142-143；IR-GyrB/hrpL＝SEQ ID NO：144-145和IR-dnaA/dnaN/gyrB＝SEQ ID NO：146-147。
在另一个具体的实施方案中，本发明的前体可以靶向青枯雷尔氏菌(Ralstoniasolanacearum)的毒力基因，使用以下构建体进行：IR-HRPH/HRPB/HRCC＝SEQ ID NO：99-98；IR-HRPB/HRCC/TssB/XpsR-SEQ ID NO：100-101。
在另一个具体的实施方案中，本发明的前体可以靶向野油菜黄单胞菌野油菜致病变种(Xanthomonas campestris pv.campestris)的毒力基因，使用以下构建体进行：IR-HRPG/HRPX/RsmA＝SEQ ID NO：102-103；IR-NadHb/NadHd/NadHe＝SEQ ID NO：104-105和IR-DnaA/DnaE1/DnaE2＝SEQ ID NO：106-107。
在另一个具体的实施方案中，本发明的前体可以靶向来自野油菜黄单胞菌莴苣致病变种(Xanthomonas hortorum pv.vitians)的必需基因，并具有以下序列：IR-GyrB＝SEQID NO：17-18；IR-FusA＝SEQ ID NO：19-20；IR-ZipA＝SEQ ID NO：21-22和IR-GyrB/FusA/ZipA＝SEQ ID NO：128-129。
在另一个具体的实施方案中，本发明的前体可以靶向来自柑橘黄单胞柑橘溃疡病菌(Xanthomonas citripv.fucan)的必需基因，并具有以下序列：IR-GyrB/FusA/MreB/HrpG/PhoP/FhaB＝SEQ ID NO：120-121；IR-GyrB/RbfA/MreB＝SEQ ID NO：122-123；IR-HrpG/PhoP/FtsZ＝SEQ ID NO：124-125；IR-FhaB/FusA/MreB＝SEQ ID NO：126-127和IR-GyrB/FusA/ZipA＝SEQ ID NO：128-129。
在另一个具体的实施方案中，本发明的前体可以靶向来自新缬草食酸菌(Acidovorax valerianella)的必需基因，并具有以下序列：IR-rimM/rsgA/rbfA/MreB/gyrB/FtsZ＝SEQ ID NO：23-24；IR-rimM/rbfA/FtsZ＝SEQ ID NO：25-26；IR-RsgA/gyrB/MreB＝SEQ ID NO：27-28和IR-RsgA/rbfA/FtsZ＝SEQ ID NO：29-30；
在另一个具体的实施方案中，本发明的前体可以靶向来自西瓜食酸菌(Acidovorax citrulli)的必需基因，并具有以下序列：IR-MreB/ybeY/rbfA/gyrB/FtsZ/rsgA＝SEQ ID NO：31-32；IR-MreB/ybeY/rbfA＝SEQ ID NO：33-34；IR-rsgA/gyrB/MreB＝SEQ ID NO：35-36和IR-YbeY/RsgA/MreB＝SEQ ID NO：37-38。
在另一个具体的实施方案中，本发明的前体可以靶向来自灰葡萄孢(Botrytiscinerea)的必需基因，并具有以下序列：IR-TOR/CGF1/DCL1/DCL2/LTF1/HBF1＝SEQ ID NO：76-77；IR-TOR/DCL1/DCL2＝SEQ ID NO：78-79；IR-CGF1/HBF1/LTF1＝SEQ ID NO：80-81和IR-DCL1/HBF1/TOR＝SEQ ID NO：82-83；
在另一个具体的实施方案中，本发明的前体可以靶向来自小麦叶枯病菌(Zymoseptoria tritici)的必需基因，并具有以下序列：IR-Br1A2/StuA/F1bc/PKS1/PPT1＝SEQ ID NO：108-109；IR-Br1A2/StuA/F1bc＝SEQ ID NO：110-111和IR-StuA/PKS/PPT1＝SEQ ID NO：112-113。
在另一个具体的实施方案中，本发明的前体可以靶向来自致病疫霉(Phytophthora infestans)的必需基因，并具有以下序列：IR-NPP1/INF1/GK4/piacwp1-1/piacwp1-2/piacwp1-3＝SEQ ID NO：68-69；IR-piacwp1-1/piacwp1-2/piacwp1-3＝SEQ IDNO：70-71；IR-GK4/INF1/NPP1＝SEQ ID NO：72-73和IR-GK4/INF1/piacwp1-1＝SEQ ID NO：74-75。
在另一个具体的实施方案中，本发明的前体可以靶向来自葡萄生单轴霉(Plasmopara viticola)的必需基因，并具有以下序列：IR-PITG_17947/PITG_10772/PITG_13671/PITG_16956/PITG_00891＝SEQ ID NO：114-115；IR-PITG_17947/PITG_10772/PITG_13671＝SEQ ID NO：116-117和IR-PITG_13671/PITG_16956/PITG_00891＝SEQ ID NO：118-119。
在另一个具体的实施方案中，本发明的前体可以靶向来自李痘病毒(Plum PoxVirus(PPV))的病毒基因，并具有以下序列：IR-P1/HC-Pro/CP＝SEQ ID NO：39-40；IR-P1＝SEQ ID NO：41-42；IR-HC-Pro＝SEQ ID NO：43-44和IR-CP＝SEQ ID NO：45-46。
在另一个具体的实施方案中，本发明的前体可以靶向来自刺盘孢属物种(Colletotrichum species)的必需基因，并具有以下序列：IR-CclA/ACS1/ACS2/ELP1/ELP2/MOB2＝SEQ ID NO：84-85；IR-CclA/ACS1/ACS2＝SEQ ID NO：86-87和IR-ELP1/ELP2/MOB2＝SEQ ID NO：88-89；
在另一个具体的实施方案中，本发明的前体可以靶向来自禾谷镰刀菌的必需基因，并具有以下序列：IR-CYP51A/CYP51B/CYP51C＝SEQ ID NO：96-97。
本发明的目的在于SEQ ID NO：1-148的这些siRNA前体中的任一种在小球藻细胞中生产功能性小iRNA群体的用途。
如本申请的实施例所证明的，将dsRNA引入小球藻细胞会触发生产包埋在EV中的小RNA分子，其因此免受核糖核酸酶介导的消化(实施例5)。更准确地，本发明的小球藻细胞能够生产功能性小iRNA，如siRNA或miRNA。这些小RNA具有短尺寸，其少于50个碱基对，优选在10和30个碱基对之间，更优选在15和30个碱基对之间。更特别地，小球藻细胞生产的小RNA主要含有15或18个碱基对(参见实施例4和图2)。
在一个特别优选的实施方案中，本发明的功能性干扰小RNA是“siRNA”，其是指“siRNA双链体”或“siRNA单链体”。该双链体或单链体siRNA优选含有15或18个碱基对。因此，它们比通常含有21或24个碱基对的植物生产的siRNA或者比～22个碱基对的哺乳动物生产的siRNA更短。
因此，由小球藻细胞生成的本发明的功能性小RNA表现出与由植物和其他真核细胞生产的那些小RNA不同的特征。
更具体地，术语“siRNA双链体”是指含有第一链(有义链)和第二链(反义链)的双链结构或双链体分子，所述第一链和第二链为至少10或15个碱基对，优选少于20个碱基对；优选地，所述反义链包含与靶向基因的转录本互补的至少15个连续核苷酸的区域。在优选的实施方案中，如下面的实验部分所示，这些分子精确地含有15或18个碱基对。这些siRNA双链体可以由小球藻DCL酶和/或其他内源RNA酶加工的长dsRNA前体产生。
如本文所用，术语“siRNA单链体”或“成熟siRNA”是指源自siRNA双链体的单链体分子(也称为“单链”分子)，但其已在微藻细胞的RISC机制中成熟并加载在小球藻AGO蛋白中和/或与其他RNA结合蛋白相关。它们具有短尺寸，其小于50个碱基，优选在10和30个碱基之间，更优选在15和30个碱基之间，甚至更优选在10和18个碱基之间(优选不是16个碱基)，并且甚至更优选含有15或18个碱基。
在另一个实施方案中，本发明的功能性iRNA是“miRNA”，其是指“miRNA双链体”或“miRNA单链体”。在优选的实施方案中，本发明的iRNA是双链miRNA。
更具体地，术语“miRNA双链体”是指含有第一链(有义链)和第二链(反义链)的双链结构或双链体分子，所述第一链和第二链为至少15个碱基对，优选至少19个碱基对；优选地，所述反义链包含与靶向基因的转录本互补的至少15个连续核苷酸的区域。这些miRNA双链体也可以含有凸起。这些miRNA双链体可以由小球藻DCL酶加工的miRNA前体产生。作为双链体siRNA，它们具有短尺寸，其小于50个碱基对，优选在15和30个碱基对之间。更特别地，由小球藻细胞生产的小miRNA主要含有18个碱基对。它们还可以含有15个碱基对(参见实施例4和图2)。
如本文所用，术语“miRNA单链体”或“成熟miRNA”是指源自miRNA双链体的单链体分子(也称为“单链”分子)，但其已在微藻细胞的RISC机制中成熟并加载在小球藻AGO蛋白中和/或与其他RNA结合蛋白相关。这些单链体miRNA通常含有10至18个碱基(优选不是16个碱基)，优选15至18个碱基，甚至更优选15或18个碱基。
设计iRNA(如可以转化为siRNA/miRNA的长dsRNA)的方法是本领域可得的，并且可以用于获得本发明的前体的序列。
发明人在本文中表明(实施例2-13)，可以使用长双链反向重复构建体，以便(i)有效地转化小球藻细胞以及(ii)使它们生产可以抑制致病性的功能性小iRNA，所述小iRNA包埋于EV中，EV保护这些RNA实体免受核糖核酸酶介导的消化(参见图2-8)。
如本文所用，术语“序列同源性”是指具有序列相似性的序列，即核酸序列之间具有足够程度的同一性或对应性。在本发明的上下文中，当至少约80％，或者至少约81％，或者至少约82％，或者至少约83％，或者至少约84％，或者至少约85％，或者至少约86％，或者至少约87％，或者至少约88％，或者至少约89％，或者至少约90％，或者至少约91％，或者至少约92％，或者至少约93％，或者至少约94％，或者至少约95％，或者至少约96％，或者至少约97％，或者至少约98％，或者至少约99％的核苷酸相似时，则两个核苷酸序列共有“序列同源性”。
相反地，具有“无序列同源性”的核苷酸序列是同一性程度小于约10％、或者小于约5％、或者小于2％的核苷酸序列。
优选地，使用Needleman和Wunsch的算法鉴定相似或同源的核苷酸序列。除非另有说明，否则本文提供的序列同一性/相似性值是指使用GAP第10版使用以下参数获得的值：使用GAP权重为50和长度权重为3，以及nwsgapdna.cmp评分矩阵获得的核苷酸序列的同一性％和相似性％；使用GAP权重为8和长度权重为2，以及BLOSUM62评分矩阵获得的氨基酸序列的同一性％和相似性％；或其任何等同程序。“等同程序”旨在指对于所讨论的任何两个序列，与GAP第10版生成的相应比对相比，生成具有相同核苷酸残基匹配和相同百分比序列同一性的比对的任何序列比较程序。
本发明的生产方法
在第一方面，本发明涉及一种用于生产功能性干扰小RNA的方法，所述方法包括至少以下步骤：
a)用包含至少一个目标基因的片段的siRNA或miRNA前体转化小球藻细胞，以及
b)在合适的条件下培养所述小球藻细胞，以使它们表达所述前体并释放靶向所述基因片段的EV包埋的功能性小iRNA。
术语“干扰小RNA”和“siRNA或miRNA前体”已在上面的定义部分中定义。
在优选的实施方案中，所述siRNA或miRNA前体是长单链或双链RNA分子。在更优选的实施方案中，所述siRNA或miRNA前体是长双链RNA分子，所述分子包含至少一个目标基因片段或其互补序列。
如上面所解释的，可以通过大型核苷酸构建体转化小球藻细胞。更准确地，所述前体中含有的靶向片段可以具有大尺寸，例如多达3000bp。
本发明的前体中含有的“片段”事实上可以含有单个基因的一个或数个部分，或数个基因的数个部分(参见下面的实施例11和12)。转化后，小球藻细胞将生产siRNA群体，其靶向来自单个基因或来自数个基因的一个或多个部分。这是相比于其他iRNA生产者细胞的一项明显优点，因为覆盖微生物/寄生物基因的大部分使得触发对靶向基因的有效沉默效应的机会最大化，并且减少了微生物/寄生物获取针对小iRNA群体的耐药性(为此，它将必须沿小RNA靶向部分一直突变)的机会，从而产生针对靶向病原体的持久保护作用。也可以设计并使用含有来自数种病原体的基因的一个或多个部分的前体(它们将被称为“嵌合前体”，见下)。
在具体的实施方案中，本发明的前体中含有的目标基因片段在50和3000bp之间，优选在100bp和2000bp之间，更优选在500bp和1500bp之间。
具体的“目标基因”描述于下面的相应章节中。
小球藻是单细胞绿藻的一个属，其属于绿藻门。它是球形的，直径约2至10μm，没有鞭毛。它的叶绿体中含有绿色光合色素叶绿素-a和叶绿素-b。它在理想条件下迅速繁殖，只需要二氧化碳、水、光和少量矿物质即可生长。由于升高的蛋白质、维生素、矿物质和色素含量，各种小球藻细胞目前被用作人和牲畜的食物补充。
本发明的方法中使用的小球藻细胞可以是任何小球藻物种。特别是，它们可以是目前用作人和牲畜的食物补充的任何细胞(Safi等人，2014)。在具体的实施方案中，它们可以属于以下物种：椭圆小球藻(Chlorella ellipsoidea)、蛋白核小球藻(Chlorellapyrenoidosa)、索罗金小球藻(Chlorella sorokiniana)、普通小球藻(Chlorellavulgaris)或多变小球藻(Chlorella variabilis)。
在优选的实施方案中，本发明的方法中使用的小球藻细胞来自普通小球藻属。与其他小球藻细胞一样，普通小球藻细胞能够适应各种条件并生长。它们易于在实验室条件下维持，具有简单的生命周期、单倍体基因组和类似于高等植物的代谢途径。它们还具有在自养、异养或兼养条件下以高生长速率生长的能力(de Andrade等人，2017)。代谢灵活性、易于维持和生长的特点使得普通小球藻能够在光生物反应器(PBR)中用作各种目的分子的工业生产支架(Lin等人，2013；Blanc等人，2010)。
在本发明的方法的第一步中，将本发明的siRNA或miRNA前体引入所选择的小球藻细胞中。所述siRNA或miRNA前体将通过使用小球藻DCL酶和其他小RNA加工因子加工成siRNA或miRNA双链体。所述小RNA双链体和/或成熟小RNA向导(即加载至AGO中)随后在细胞外培养基中或在小球藻细胞表面释放，包埋至细胞外囊泡中。如下面的实施例(实施例5和6和7以及图3至图5)中所证明的，当与含有siRNA的小球藻EV接触时，细菌细胞的毒力降低。
在将核酸插入细胞的上下文中，术语“引入”是指“转染”或“转化”或“转导”，并包括提及将核酸掺入真核细胞中，其中所述核酸可以稳定地掺入所述细胞的基因组(例如染色体、质粒)或瞬时表达(例如通过根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)瞬时递送基因构建体、用重组病毒感染)。
本发明的iRNA在宿主小球藻细胞中的表达可以是瞬时的或稳定的。稳定表达特别是指使用常规技术制备转基因小球藻细胞谱系。
作为非限制性例子，可以通过使用电穿孔、基因枪、PEG介导的原生质体转化、病毒介导的转化、缀合、农杆菌(Agrobacterium)介导的转化等来进行本发明的方法的步骤a)。这些转化方法例如描述于Kim等人，2002；Cha等人，2012；Lin等人，2013；Yang等人，2015；Bai等人，2013；Niu等人，2011；Chien等人，2012；Run等人，2016中。
在优选的实施方案中，本发明方法的步骤a)涉及通过根癌农杆菌的方式将基因构建体递送至小球藻细胞中。该技术是公知的，不需要解释(Cha等人，2012；Lin等人，2013)。
在具体的实施方案中，本发明的方法包括向小球藻细胞引入一种或数种dsRNA，其靶向不同寄生物(如病毒、真菌、卵菌、细菌、昆虫或线虫)的一个或多个基因。在该实施方案中，EV针对数种病原体或寄生物的必需基因、毒力基因或抗微生物/抗寄生物抗性基因。
此类方法可用于同时预防或治疗由数种病原体和/或寄生物引起的植物疾病。可以使用嵌合EV实施此类方法，所述嵌合EV与不同致病基因/寄生物基因具有序列同源性，或者使用分别生产的EV的混合物(cocktail)，其中一些EV含有与一种病原体/寄生物的基因具有同源性的iRNA，而另一些EV含有与来自其他病原体/寄生物的基因具有同源性的iRNA。
在第二步中，培养含有本发明的前体的转化小球藻细胞，以表达所述前体并释放靶向所述基因片段的EV包埋的功能性小iRNA。
在该步骤中，可以使用本领域公知的用于培养小球藻细胞的经典条件(Kim等人，2002；Cha等人，2012；Lin等人，2013；Yang等人，2015；Bai等人，2013；Niu等人，2011；Chien等人，2012；Run等人，2016)。具体的培养方法描述于下面的实施例1中。
本发明人在本文中表明，与植物细胞一样，可以通过在非生物或生物胁迫条件下培养小球藻细胞来提高EV生产的产率，例如通过将细胞置于特定的温度条件下、置于细菌或病毒感染下或通过将其与植物激素或其他化合物接触来进行。如下面的实施例13中所公开的，可以通过用热杀细菌(如大肠杆菌(E.coli)K12TOP10或Pto DC3000 Wt细胞)的上清液处理它们来提高生产小球藻EV的产率。使用来自热杀细菌细胞的上清液的基本原理是，这些上清液应当含有分子混合物，所述分子包括MAMP/PAMP，其可以被仍未知的小球藻模式识别受体(PRR)感应，从而如在植物中所发现的那样导致EV生产和/或分泌增强。
发明人发现，像在植物中发现的那样，可以通过这种处理将小球藻的EV生产提高数倍。因此，提出因此可以利用一些生物胁迫来增加小球藻EV的生产和/或分泌。优选的处理是使用来自热杀细菌的上清液，其可以容易地以具有成本效益的方式生产，并已发现其适合于增强小球藻EV的生产(实施例13和图8)。
在一个优选的实施方案中，本发明的小RNA被分离为游离RNA分子。这些RNA分子可以直接用于植物治疗目的(参见实施例5-8)。
在该实施方案中，本发明的方法进一步包括从培养的小球藻细胞中回收表达的小iRNA的步骤。
分离小球藻细胞内含有的完整RNA需要四个步骤：1)破坏小球藻细胞；2)使内源核糖核酸酶(RNA酶)活性失活；3)使核蛋白复合物变性；4)去除污染DNA和蛋白质。最重要的步骤是在破坏细胞时，立即使从膜结合细胞器释放的内源RNA酶失活。RNA纯化方法通常使用基于硅胶膜、基于树脂和磁性的核酸结合选项，并并入DNA酶处理以去除污染基因组DNA。然后从固体载体洗脱纯化的RNA。
众所周知，RNA易被降解，并且RNA酶普遍存在。许多市售可得的RNA纯化方法包括特定化学物质以使细胞或组织裂解物中存在的RNA酶灭活还可以包括RNA酶抑制剂以在整个过程中防止RNA降解。这些方法中的任一种均可以用于回收本发明的小RNA。
在另一个优选的实施方案中，小RNA不作为游离RNA分子使用，而是包埋至细胞外囊泡(EV)中。本发明人实际上表明了小球藻细胞可以生产尺寸范围与植物外泌体相似的EV(50-200nm)，并且这些EV可以被植物细胞摄入，在此它们可以递送其小iRNA内容物并具有有效沉默效应(参见实施例7)。如源自哺乳动物和植物的EV那样，这些源自小球藻的含有iRNA的EV可以用于生物防治目的。
在该特别优选的实施方案中，本发明的方法进一步包括回收细胞外培养基中由小球藻细胞释放的细胞外囊泡(EV)的步骤。
在本发明的上下文中，可以通过本领域描述的任何常规方式来进行EV的回收。分离和纯化方法例如在Colao等人，2018中讨论。有效纯化的下游处理可以用于从细胞培养基中富集EV，例如通过尺寸排阻(基于典型直径)、沉降力或浮选密度、基于沉淀的方法和基于亲和力的捕获来进行。尽管可以使用差速超速离心，但将优选其他纯化方法，如过滤或色谱分离。由于尺寸分布密集且可重复以及过程易于改变规模，切向流过滤更有前景。也可以使免疫亲和方法适合于本发明的特定EV。
通过本发明的方法获得的EV
细胞外囊泡(EV)是纳米尺寸的膜结合囊泡，其被释放至细胞外空间中并将货物运送至受体细胞。哺乳动物EV部分由外泌体组成，外泌体由多泡体(MVB)和质膜融合形成，其中MVB释放直径范围为40至150纳米的囊泡(O’Brien等人，2020)。在过去十年中，哺乳动物外泌体被广泛表征为miRNA的载体。有趣地，新出现的证据表明，植物来源的EV也可以作为miRNA或siRNA的载体工作(Wang等人，2013；Zhang等人，2016；Cai等人，2018；Hou等人，2019)。
在另一方面，如上所述，本发明涉及通过本发明的方法获得的细胞外囊泡(EV)。这些EV含有功能性小iRNA群体，其靶向目的基因中的一个或数个区域。有趣地，可以从Mnase处理的小球藻EV中检测到抗菌小iRNA(参见实施例7和图5)。
如实施例3和图1所示，本发明人能够通过纳米颗粒跟踪分析(NTA)并通过标记基于脂质的细胞外颗粒来表征小球藻EV。该首次分析揭示，小球藻EV的尺寸范围在50和200nm之间。进一步的透射电子显微镜(TEM)揭示了存在圆形颗粒，其具有表观脂质双层，平均直径～130nm。
发明人的结果(实施例2和表1)还表明，由小球藻细胞生产的EV不太可能在其膜中含有CD63四次穿膜蛋白(tetraspanin)，因为小球藻基因组和转录组不含此类因子。然而，已知植物EV上存在四次穿膜蛋白8(tetraspanin 8)(Cai等人，2018)。因此，由小球藻细胞生产的EV与植物生产的EV不同。
在优选的实施方案中，本发明的EV优选含有功能性小iRNA群体，优选为10至18个碱基对，更优选为15至18个碱基对，其靶向一个或数个病毒基因中的数个区域。因此，这些EV可以用作抗病毒剂。
例如，这些抗病毒EV可以含有功能性小iRNA群体，优选为10至18个碱基对，更优选为15至18个碱基对，其靶向对李痘病毒(造成Sharka病的原因)的复制或致病性至关重要的一个或数个病毒基因的一个或数个区域。
在另一个优选的实施方案中，这些本发明的EV优选含有功能性小iRNA群体，优选为10至18个碱基对，更优选为15至18个碱基对，其靶向一个或数个细菌基因中的数个区域。因此，这些EV可以用作抗菌剂。
例如，这些抗菌EV可以含有功能性小iRNA群体，优选为10至18个碱基对，更优选为15至18个碱基对，其靶向对以下的复制或致病性至关重要的一个或数个细菌基因的一个或数个区域：苛养木杆菌、韧皮部杆菌(Candidatus liberibacter)、丁香假单胞菌猕猴桃致病变种(pseudomonas syringae pv actinidiae)、丁香假单胞菌番茄致病变种DC3000菌株、野油菜黄单胞菌野油菜致病变种、青枯雷尔氏菌、软腐欧文氏菌、野油菜黄单胞菌(Xanthomonas hortorum)、新缬草食酸菌、西瓜食酸菌。
在另一个优选的实施方案中，这些本发明的EV优选含有功能性小iRNA群体，优选为10至18个碱基对，更优选为15至18个碱基对，其靶向一个或数个真菌基因中的数个区域。因此，这些EV可以用作抗真菌剂。
例如，这些抗真菌EV可以含有功能性小iRNA群体，优选为10至18个碱基对，更优选为15至18个碱基对，其靶向对以下的复制或致病性至关重要的一个或数个细菌基因的一个或数个区域：禾谷镰刀菌、灰葡萄孢、刺盘孢属物种、小麦叶枯病菌。
在另一个优选的实施方案中，这些本发明的EV优选含有功能性小iRNA群体，优选为10至18个碱基对，更优选为15至18个碱基对，其靶向一个或数个卵菌基因中的数个区域。因此，这些EV可以用作抗卵菌剂。
例如，这些抗卵菌EV可以含有功能性小iRNA群体，优选为10至18个碱基对，更优选为15至18个碱基对，其靶向对以下的复制或致病性至关重要的一个或数个细菌基因的一个或数个区域：致病疫霉、葡萄生单轴霉。
如上面所解释的，可以通过各种方法进行EV的纯化。尽管可以使用差速超速离心，但出于工业目的将优选其他纯化方法，如过滤、色谱分离或亲和纯化方法。
本发明的植物治疗组合物
值得注意的是，本发明的天然细胞外囊泡(EV)中含有的本发明的小RNA被保护免受RNA酶的作用(实施例7)。因此，含有iRNA的EV可以作为杀伤或抑制目标病原体感染的工具有效且持久地用于植物治疗组合物中。
在进一步的方面，本发明因此涉及含有本发明的包埋小RNA的EV作为活性成分的植物治疗组合物。更准确地，如上所定义的，它们含有有效量的小球藻衍生的EV。
本文中的“有效量”是指已在如下面实施例中描述的测试中表明具有抗致病作用(例如抗菌或抗病毒作用)的量。该量为含有有效小RNA的EV优选在0.05pM和100pM之间，优选在0.05pM和10pM之间(用于体外应用)或在0.05pM和100nM之间，优选在0.05pM和10nM之间(用于体内应用)。
本发明的植物治疗组合物可以配制于生理或农艺上可接受的载体、赋形剂或稀释剂中。此类载体可以是待处理的植物可以耐受的任何材料。此外，载体必须使得组合物在控制感染方面保持有效，并且对以处理的植物为食的动物或昆虫无毒。此类载体的例子包括水、盐水、林格氏溶液、右旋糖或其他糖溶液、Hank's溶液、和其他生理平衡的水性盐溶液、磷酸盐缓冲液、碳酸氢盐缓冲液和Tris缓冲液。
本发明的组合物可以以浓缩形式供应，如浓缩水溶液。它甚至可以以冷冻形式或以冷冻干燥或冻干粉末形式供应。该后者可以对于长期储存更稳定，并且可以在使用之前立即解冻和/或用适当的稀释剂复溶。
这些组合物还可以含有表面活性剂、惰性载体、防腐剂、保湿剂、摄食刺激剂、引诱剂、包封剂、粘合剂、乳化剂、染料、紫外线保护剂、缓冲剂、助流剂或肥料、微量营养素提供剂(donor)、或其他影响植物生长的制剂。一种或多种农用化学品包括但不限于：除草剂、杀昆虫剂、杀真菌剂、杀细菌剂、杀线虫剂、杀软体动物剂、杀螨剂、植物生长调节剂、落叶剂和肥料，可以与制剂领域常用的载体、表面活性剂或辅助剂或其他组分组合以促进产品处理和用于特定目标细菌的应用。适当的载体和助剂可以是固体或液体，并且对应于制剂技术中通常使用的物质，例如天然或再生矿物物质、溶剂、分散剂、润湿剂、增粘剂、粘合剂或肥料。
本发明的组合物可以是固体缓释制剂、干燥可涂抹颗粒形式的用于农药用途的表面活性剂硅藻土制剂、由固体疏水核(具有嵌入核表面的磷脂层)形成的水不溶性脂质球、微胶囊等。
赋形剂的性质和组合物的物理形式可以根据期望处理的植物部分的性质而变化。
本发明的植物治疗方法和用途
在本发明的另一方面，本发明涉及包括使用本发明的EV的植物治疗方法。这些EV可以用于治疗植物的任何寄生物感染和/或感染性疾病。
所述寄生物感染和/或感染性疾病可以由例如病毒、细菌、真菌、卵菌、或任何其他病原体或寄生物引起。
本发明的EV可以靶向所述病原体的基因和/或患病宿主培养植物的基因(如果已知该基因/这些基因促进感染或作为防御的负调节因子)。
在一方面，本发明涉及一种用于治疗目标植物抵御致病感染或寄生物感染的方法，所述方法包括将本发明的EV应用于所述植物的一部分上的步骤。
该方法可用于避免污染植物并确保其充分生长和高产量。
因此在另一方面，本发明涉及一种用于治疗植物抵御病原体或寄生物感染的基于EV的生物防治方法，所述方法包括以下步骤：在感染之前和/或之后，在植物组织、种子、果实、蔬菜上递送本发明的EV或包含这些EV的组合物。如先前对于合成siRNA所示，在木本植物的情况下，也可以通过树干注射或叶柄吸收来进行这种递送(Dalakouras等人，2018)。该感染可以是由任何病原体引起的，如细菌、病毒、真菌、卵菌或其他与植物生物体相关的寄生物。
所有这些病原体在下面描述。
本发明的另一方面涉及如上所定义的本发明的EV作为植物治疗剂的用途。优选地，所述EV用于治疗由致病细菌引起的植物疾病或用于预防植物的细菌感染。
在一个实施方案中，这些植物治疗EV或含有其的组合物含有如上所定义的siRNA双链体或miRNA双链体分子。在又一个实施方案中，这些EV靶向如上所定义的细菌基因和其他非细菌病原体或寄生物的基因，用于同时预防或治疗由细菌病原体和其他病原体/寄生物引起的植物疾病。上面针对EV、iRNA、载体和转化方法提出的所有实施方案都涵盖在内，无需重复。
本发明的EV可以应用于将被感染或已被感染的作物区、植物、生殖器官、果实、种子和根。
应用本发明的EV或含有EV的组合物的方法包括但不限于：叶柄吸收、树干注射、叶面应用、种子包衣和土壤应用。应用的数量和应用的速率取决于感染的强度。
具体地，本发明的组合物可以通过以下方式应用于植物，例如喷洒、雾化、撒粉、撒播、包衣或倾倒、引入土壤中或土壤上、引入灌溉水中、通过种子处理或一般应用或在细菌感染已经开始时或在细菌感染之前作为保护措施进行撒粉。
本发明还涉及所述植物治疗组合物用于控制、抑制或预防任何病原体在目标植物上的生长或致病性的用途。
如下面详细解释的，本发明的组合物可以更准确地用于：
-治疗和/或预防和/或控制病原体致病性，
-治疗和/或预防和/或控制病原体生长，
-降低病原体的抗菌素耐药性，
-增强共生或一些共栖微生物的生长或有益作用，
从而提高植物产量。
本发明的EV可用于沉默任何微生物中的基因，所述微生物为：致病菌或非致病菌；革兰氏阳性或革兰氏阴性细菌、病毒、真菌、卵菌、或其他与植物相关的生物体。现在公开这些不同的目标病原体的例子。
致病菌
在优选的实施方案中，所述病原体是植物致病菌。
可以使用本发明的EV靶向的植物致病菌的非限制性例子包括：青枯雷尔氏菌、水稻黄单胞菌(Xanthomonas oryzae)致病变种、野油菜黄单胞菌致病变种、地毯草黄单胞菌(Xanthomonas axonopodis)致病变种、Xanthomonas euvesicatoria致病变种、Xanthomonas hostorum致病变种、丁香假单胞菌致病变种、绿黄假单胞菌(Pseudomonasviridiflava)致病变种、油橄榄癌肿假单胞菌(Pseudomonas savastonoi)致病变种、韧皮部杆菌亚洲种(Candidatus liberibacter asiaticus)、马铃薯斑纹片病菌(Candidatusliberibacter solanacearum)、西瓜食酸菌(Acidovorax citrulli)、燕麦食酸菌(Acidovorax avenae)致病变种、黑胫病果胶杆菌(Pectobacterium atrosepticum)致病变种、胡萝卜软腐果胶杆菌(Pectobacteriumcarotovorum)致病变种、果胶杆菌属物种(Pectobacterium sp.)、根癌农杆菌、迪克氏菌(Dickeya)(达旦提狄克氏菌(dadantii)和茄狄克氏菌(solani))、解淀粉欧文氏菌(Erwinia amylovora)、密执安棍状杆菌(michiganensis和sepedonicus)、苛养木杆菌、果胶杆菌(Pectobacterium)(胡萝卜软腐果胶杆菌(carotovorum)和黑胫病果胶杆菌(atrosepticum))、疮痂病链霉菌(Streptomycesscabies)、植原体属物种(Phytoplasma sp.)、螺原体属物种(Spiroplasma sp.)(Zhang等人，2009)。
如果处理观赏植物，可以靶向以下细菌：菊苣假单胞菌(Pseudomonas cichorii)，已知其感染菊花(Chrysanthemum)、老鹳草(Geranium)和凤仙花(Impatiens)；野油菜黄单胞菌天竺葵致病变种(Xanthomonas campestris pv.Pelargoni)，已知其感染老鹳草；带化红球菌(Rhodococcus fascians)，已知其感染菊花(Chrysanthemummorifolium)、天竺葵(Pelargonium)、草夹竹桃(Phlox)，还可能感染杜鹃花(Rhododendron)；青枯雷尔氏菌，已知其感染老鹳草、花烛属物种(Anthurium spp)、玫瑰树、姜黄(Curcumas)和花烛；地毯草黄单胞菌(Xanthomonas axonopodis)、野油菜黄单胞菌，已知其感染老鹳草、秋海棠、花烛和朱槿(Hibiscus rosa-sinensis)；胡萝卜软腐果胶杆菌(Pectobacterium carotovorum)，已知其感染孤挺花(Amaryllis)、秋海棠(Amaryllis)、水芋(Calla)、仙客来(Cyclamen)、龙血树(Dracaena)和凤仙花(Impatiens)。
有益细菌
在具体的实施方案中，本发明的EV含有功能性iRNA，其靶向通常称为植物生长促进根际细菌(PGPR)的有益细菌的一个或多个基因。该具体的实施方案的目的是促进所述PGPR的有益作用。在该具体的实施方案中，靶向细菌基因是当沉默时会促进靶向细菌细胞的复制或对宿主有益的途径的因子，以及正调节有益化合物(例如植物激素)、次级代谢物生产的因子，所述次级代谢物(i)改变周围植物病原体的存活/致病性，(ii)激活植物防御反应(例如诱导系统抗性)，(iii)促进从环境摄入营养物质(例如通过增强根瘤菌-豆类共生所必需的细菌因子的生产)，(iv)增强宿主生物体对非生物胁迫条件的耐受性等。因此，沉默此类细菌靶向基因将导致宿主生物体的生长速率增加和/或对宿主生物体的数种其他可能的有益作用。
在这种实施方案中，本发明的EV中含有的iRNA应当与有益细菌基因具有序列同源性，但与致病细菌基因组、宿主基因组或宿主定植体和/或以宿主生物体为食的哺乳动物的其他基因组没有序列同源性。
可以用本发明的方法靶向的有益细菌的非限制性例子包括：芽孢杆菌(例如枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis))、假单胞菌(例如恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)、施氏假单胞菌(Pseudomonas stuzeri)、荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)、生防假单胞菌(Pseudomonas protegens)、油菜假单胞菌(Pseudomonas brassicacearum))、根瘤菌(苜蓿根瘤菌(Rhizobium meliloti))、伯克霍尔德菌(例如Burkholderiaphytofirmans)、固氮螺菌(例如生脂固氮螺菌(Azospirillum lipoferum))、葡糖醋杆菌(例如Gluconacetobacter diazotrophicus)、沙雷氏菌(例如变形斑沙雷氏菌(Serratiaproteamaculans))、寡养单胞菌(例如嗜麦芽寡养单胞菌(Stenotrophomonasmaltophilia))、肠杆菌(例如阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae))。
致病真菌或卵菌
在具体的实施方案中，本发明的EV含有功能性iRNA，其靶向致病真菌或卵菌的一个或多个基因。
所述真菌或卵菌可以例如选自：肢端菌(Acrocalymma)，药物肢端菌(Acrocalymmamedicaginis)，镰刀菌属(Fusarium)，瓣状镰刀菌(Fusarium affine)、分节孢子镰刀菌(Fusarium arthrosporioides)、克地镰刀菌(Fusariumcrookwellense)、黄色镰刀菌(Fusarium culmorum)、禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)、变红镰刀菌(Fusariumincarnatum)、腐皮镰刀菌(Fusarium solani)、朗瑟亚镰刀菌(Fusarium langsethiae)、芒果镰刀菌(Fusarium mangiferae)、尖孢镰刀菌专化型(Fusarium oxysporumf.sp.albedinis)、尖孢镰刀菌芦笋专化型(Fusarium oxysporum f.sp.asparagi)、尖孢镰刀菌甘薯专化型(Fusarium oxysporum f.sp.batatas)、尖孢镰刀菌甜菜专化型(Fusariumoxysporum f.sp.betae)、尖孢镰刀菌大麻专化型(Fusarium oxysporum f.sp.cannabis)、尖孢镰刀菌红花专化型(Fusarium oxysporum f.sp.carthami)、尖孢镰刀菌洋兰专化型(Fusarium oxysporum f.sp.cattleyae)、尖孢镰刀菌鹰嘴豆专化型(Fusarium oxysporumf.sp.ciceris)、尖孢镰刀菌咖啡专化型(Fusarium oxysporum f.sp.coffea)、尖孢镰刀菌古巴专化型(Fusarium oxysporum f.sp.cubense)、尖孢镰刀菌荔枝专化型(Fusariumoxysporum f.sp.cyclaminis)、尖孢镰刀菌康乃馨专化型(Fusarium oxysporumf.sp.dianthi)、尖孢镰刀菌扁豆专化型(Fusarium oxysporum f.sp.lentis)、尖孢镰刀菌亚麻专化型(Fusarium oxysporum f.sp.lini)、尖孢镰刀菌番茄专化型(Fusariumoxysporum f.sp.lycopersici)、尖孢镰刀菌苜蓿专化型(Fusarium oxysporumf.sp.medicaginis)、尖孢镰刀菌豌豆专化型(Fusarium oxysporum f.sp.pisi)、尖孢镰刀菌玉蜀番茄根专化型(Fusarium oxysporum f.sp.radicis-lycopersici)、尖孢镰刀菌菠菜专化型(Fusarium oxysporum f.sp.spinacia)、尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)、半裸镰刀菌(Fusarium pallidoroseum)、贴片镰刀菌(Fusarium patch)、层生镰刀菌(Fusarium proliferatum)、芳香镰刀菌(Fusarium redolens)、甘蔗镰刀菌(Fusariumsacchari)、腐皮镰刀菌(Fusarium solani)、亚黏团镰刀菌(Fusarium subglutinans)、硫色镰刀菌(Fusarium sulphureum)、枯萎病镰刀菌(Fusarium wilt)，葡萄孢属(Botrytis)，葱腐葡萄孢(Botrytis allii)、喜花葡萄孢(Botrytis anthophila)、灰葡萄孢(Botrytiscinerea)、蚕豆葡萄孢(Botrytis fabae)、菌核病葡萄孢(Botrytis narcissicola)，链格孢属(Alternaria)，烟草链格孢(Alternaria alternata)、芸苔链格孢(Alternariabrassicae)、甘蓝链格孢(Alternaria brassicicola)、红花链格孢(Alternariacarthami)、瓜叶菊链格孢(Alternaria cinerariae)、胡萝卜链格孢(Alternaria dauci)、石竹链格孢(Alternaria dianthi)、石竹生链格孢(Alternaria dianthicola)、大戟生链格孢(Alternaria euphorbiicola)、向日葵链格孢(Alternaria helianthi)、向日葵生链格孢(Alternaria helianthicola)、粳稻链格孢(Alternaria japonica)、白花菊链格孢(Alternaria leucanthemi)、泥生链格孢(Alternaria limicola)、亚麻生链格孢(Alternaria linicola)、稻毛锥孢(Alternaria padwickii)、人参链格孢(Alternariapanax)、根生链格孢(Alternaria radicina)、萝卜链格孢(Alternaria raphani)、皂草链格孢(Alternaria saponariae)、千里光链格孢(Alternaria senecionis)、茄链格孢(Alternaria solani)、细极链格孢(Alternaria tenuissima)、小麦链格孢(Alternariatriticina)、百日草链格孢(Alternaria zinniae)，白粉菌属(Erisyphe)，板口线虫病白粉菌(Erisyphe necator)、甜菜白粉菌(Erysiphe betae)、褐斑白粉菌(Erysiphebrunneopunctata)、菊科白粉菌(Erysiphe cichoracearum)、十字花科白粉菌(Erysiphecruciferarum)、白粉菌燕麦专化型(Erysiphe graminis f.sp.Avenae)、白粉菌小麦专化型(Erysiphe graminis f.sp.tritici)、独活白粉菌(Erysiphe heraclei)、豌豆白粉菌(Erysiphe pisi)，麦角菌属(Claviceps)，纺锤麦角菌(Claviceps fusiformis)、紫色麦角菌(Claviceps purpurea)、高粱麦角菌(Claviceps sorghi)、菰属麦角菌(Clavicepszizaniae)，顶囊壳属(Gaeumannomyces)，禾顶囊壳(Gaeumannomyces graminis)，小球腔菌属(Leptosphaeria)，颖枯壳小球腔菌(Leptosphaeria nodorum)、尖孢小球腔菌(Leptosphaeria acuta)、大麻小球腔菌(Leptosphaeria cannabina)、盾壳霉小球腔菌(Leptosphaeria coniothyrium)、胡萝卜褐腐病菌(Leptosphaeria libanotis)、向日葵黑茎病菌(Leptosphaeria lindquistii)、茎基溃疡病菌(Leptosphaeria maculans)、香蕉小球腔菌(Leptosphaeria musarum)、草地小球腔菌(Leptosphaeria pratensis)、甘蔗小球腔菌(Leptosphaeria sacchari)、向日葵小球腔菌(Leptosphaeria woroninii)，微座孢属(Microdochium)，微座孢属物种(Microdochium spp.)、博利微座孢(Microdochiumbolleyi)、二聚微座孢(Microdochium dimerum)、潘氏微座孢(Microdochiumpanattonianum)、双孔微座孢(Microdochium phragmitis)，球腔菌属(Mycosphaerella)，花生球腔菌(Mycosphaerella arachidis)、网孢球腔菌(Mycosphaerella areola)、伯克利球腔菌(Mycosphaerella berkeleyi)、布伦球腔菌(Mycosphaerella bolleana)、芸苔生球腔菌(Mycosphaerella brassicicola)、番木瓜球腔菌(Mycosphaerella caricae)、卡塔球腔菌(Mycosphaerella caryigena)、樱桃球腔菌(Mycosphaerella cerasella)、咖啡生球腔菌(Mycosphaerella coffeicola)、杂木球腔菌(Mycosphaerella confusa)、菜豆球腔菌(Mycosphaerella cruenta)、山核桃球腔菌(Mycosphaerella dendroides)、芭蕉球腔菌(Mycosphaerella eumusae)、棉球腔菌(Mycosphaerella gossypina)、禾生球腔菌(Mycosphaerella graminicola)、木薯球腔菌(Mycosphaerella henningsii)、保利球腔菌(Mycosphaerella horii)、核桃球腔菌(Mycosphaerella juglandis)、长形球腔菌(Mycosphaerella lageniformis)、亚麻球腔菌(Mycosphaerella linicola)、路易斯安那球腔菌(Mycosphaerella louisianae)、香蕉球腔菌(Mycosphaerella musae)、香蕉生球腔菌(Mycosphaerella musicola)、棕榈生球腔菌(Mycosphaerella palmicola)、豆类球腔菌(Mycosphaerella pinodes)、黄连木球腔菌(Mycosphaerella pistaciarum)、开心果球腔菌(Mycosphaerella pistacina)、梧桐球腔菌(Mycosphaerella platanifolia)、多态球腔菌(Mycosphaerella polymorpha)、苹果球腔菌(Mycosphaerella pomi)、斑叶球腔菌(Mycosphaerella punctiformis)、梨叶球腔菌(Mycosphaerella pyri)，眼斑病菌(Oculimacula)，针状眼斑病菌(Oculimacula acuformis)、雅兰德眼斑病菌(Oculimaculayallundae)，白粉菌属(Blumeria)，小麦白粉菌(Blumeria graminis)，核腔菌属(Pyrenophora)，燕麦核腔菌(Pyrenophora avenae)、毛壳核腔菌(Pyrenophorachaetomioides)、大麦核腔菌(Pyrenophora graminea)、小麦核腔菌(Pyrenophoraseminiperda)、圆核腔菌(Pyrenophora teres)、斑核腔菌(Pyrenophora teresf.maculata)、研核腔菌(Pyrenophora teres f.teres)、小麦-褐斑核腔菌(Pyrenophoratritici-repentis)，柱隔孢属(Ramularia)，天鹅颈柱隔孢(Ramularia collo-cygni)、甜菜灰白斑长柱隔孢(Ramularia beticola)、榛树柱隔孢(Ramularia coryli)、仙客来生柱隔孢(Ramularia cyclaminicola)、大孢柱隔孢(Ramularia macrospora)、薄荷生柱隔孢(Ramularia menthicola)、板口线虫柱隔孢(Ramularia necator)、报春花生柱隔孢(Ramularia primulae)、菠菜柱隔孢(Ramularia spinaciae)、细小柱隔孢(Ramulariasubtilis)、柔嫩柱隔孢(Ramularia tenella)、水仙生柱隔孢(Ramulariavallisumbrosae)，喙孢属(Rhynchosporium)，黑麦喙孢(Rhynchosporium secalis)，旋孢腔菌(Cochliobolus)，旋孢腔菌(Cochliobolus)、炭色旋孢腔菌(Cochlioboluscarbonum)、芸香草旋孢腔菌(Cochliobolus cymbopogonis)、夏威夷旋孢腔菌(Cochliobolus hawaiiensis)、异旋孢腔菌(Cochliobolus heterostrophus)、月状旋孢腔菌(Cochliobolus lunatus)、宫部旋孢腔菌(Cochliobolus miyabeanus)、黄粉旋孢腔菌(Cochliobolus ravenelii)、禾旋孢腔菌(Cochliobolus sativus)、狗尾草旋孢腔菌(Cochliobolus setariae)、穗状旋孢腔菌(Cochliobolus spicifer)、甘蔗旋孢腔菌(Cochliobolus stenospilus)、圆疣旋孢腔菌(Cochliobolus tuberculatus)、维多利亚旋孢腔菌(Cochliobolus victoriae)，微座孢属(Microdochium)，稻微座孢(Microdochiumoryzae)，梨孢属(Pyricularia)，稻梨孢(Pyricularia oryzae)，帚枝霉属(Sarocladium)，稻帚枝霉(Sarocladium oryzae)，稻绿核菌属(Ustilaginoides)，稻绿核菌(Ustilaginoides virens)，尾孢菌(Cercospora)，尾孢菌(Cercospora)、芹菜尾孢菌(Cercospora apii)、芹菜尾孢梧桐尾孢菌专化型(Cercospora apii f.sp.clerodendri)、变灰尾孢菌(Cercospora apiicola)、花生尾孢菌(Cercospora arachidicola)、天门冬尾孢菌(Cercospora asparagi)、黑线尾孢菌(Cercospora atrofiliformis)、甜菜生尾孢菌(Cercospora beticola)、细窄尾孢菌(Cercospora brachypus)、芥生尾孢菌(Cercosporabrassicicola)、天竺葵尾孢菌(Cercospora brunkii)、大麻尾孢菌(Cercosporacannabis)、坎地尾孢菌(Cercospora cantuariensis)、辣椒尾孢菌(Cercosporacapsici)、胡萝卜尾孢菌(Cercospora carotae)、榛尾孢菌(Cercospora corylina)、豇豆尾孢菌(Cercospora fuchsiae)、蒲公英尾孢菌(Cercospora fusca)、梭斑尾孢菌(Cercospora fusimaculans)、非洲菊尾孢菌(Cercospora gerberae)、变灰尾孢菌(Cercospora halstedii)、杜鹃花假尾孢菌(Cercospora handelii)、干草尾孢菌(Cercospora hayi)、绣球花尾孢菌(Cercospora hydrangeae)、菊池尾孢菌(Cercosporakikuchii)、扁豆尾孢菌(Cercospora lentis)、枫香尾孢菌(Cercospora liquidambaris)、长尾孢菌(Cercospora longipes)、莴苣褐斑尾孢菌(Cercospora longissima)、番木瓜尾孢菌(Cercospora mamaonis)、芒果尾孢菌(Cercospora mangiferae)、常随苜蓿尾孢菌(Cercospora medicaginis)、茄尾孢菌(Cercospora melongenae)、微小尾孢菌(Cercospora minuta)、烟草尾孢菌(Cercospora nicotianae)、兰花尾孢菌(Cercosporaodontoglossi)、木瓜尾孢菌(Cercospora papayae)、狼尾草尾孢菌(Cercosporapenniseti)、豌豆尾孢菌(Cercospora pisa-sativae)、车前草尾孢菌(Cercosporaplatanicola)、普德瑞尾孢菌(Cercospora puderii)、一品红尾孢菌(Cercosporapulcherrima)、观音棕竹生尾孢菌(Cercospora rhapidicola)、蔷薇生尾孢菌(Cercosporarosicola)、大豆尾孢菌(Cercospora sojina)、茄尾孢菌(Cercospora solani)、茄-韭菜尾孢菌(Cercospora solani-tuberosi)、高粱尾孢菌(Cercospora sorghi)、茶茎尾孢菌(Cercospora theae)、结节尾孢菌(Cercospora tuberculans)、钟器尾孢菌(Cercosporavexans)、维科斯尾孢菌(Cercospora vicosae)、玉蜀尾孢菌(Cercospora zeae-maydis)、吊竹尾孢菌(Cercospora zebrina)、轮纹尾孢菌(Cercospora zonata)，棒孢属(Corynespora)，多主棒孢菌(Corynespora cassiicola)，层锈菌属(Phakospora)，豆属层锈菌(Phakospora pachyrhizi)、棉花层锈菌(Phakopsora gossypii)，炭疽菌属(Colletotrichum)，尖孢炭疽菌(Colletotrichum acutatum)、花生炭疽菌(Colletotrichum arachidis)、辣椒炭疽菌(Colletotrichum capsici)、谷类炭疽菌(Colletotrichum cereale)、北方炭疽菌(Colletotrichum crassipes)、黑线炭疽菌(Colletotrichum dematium)、黑线炭疽菌菠菜专化型(Colletotrichum dematiumf.spinaciae)、南洋杉炭疽菌(Colletotrichum derridis)、毁灭炭疽菌(Colletotrichumdestructivum)、大豆炭疽菌(Colletotrichum glycines)、棉花炭疽菌(Colletotrichumgossypii)、萝菔炭疽菌(Colletotrichum higginsianum)、卡哈瓦炭疽菌(Colletotrichumkahawae)、菜豆炭疽菌(Colletotrichum lindemuthianum)、亚麻炭疽菌(Colletotrichumlini)、曼根炭疽菌(Colletotrichummangenotii)、香蕉炭疽菌(Colletotrichum musae)、龙葵炭疽菌(Colletotrichum nigrum)、西瓜炭疽菌(Colletotrichum orbiculare)、豌豆炭疽菌(Colletotrichum pisi)、高粱炭疽菌(Colletotrichum sublineolum)、常春藤炭疽菌(Colletotrichum trichellum)、三叶草炭疽菌(Colletotrichum trifolii)、截短炭疽菌(Colletotrichum truncatum)，腐霉属物种(Pythium spp.)，色二孢菌属(Diplodia)，异色二孢菌(Diplodia allocellula)、兰属洋兰色二孢菌(Diplodia laelio-cattleyae)、木薯色二孢菌(Diplodia manihoti)、拟酸浆色二孢菌(Diplodia paraphysaria)、系列色二孢菌(Diplodia seriata)、茶茎-茶树色二孢菌(Diplodia theae-sinensis)，链核盘菌属(Monilia)，杜鹃花链核盘菌(Monilinia azaleae)、果生链核盘菌(Moniliniafructicola)、桃链核盘菌(Monilinia fructigena)、核果链核盘菌(Monilinia laxa)、卵链核盘菌(Monilinia oxycocci)，佩齐库拉菌(Pezzicula)，白斑佩齐库拉菌(Pezziculaalba)、玛琳佩齐库拉菌(Pezzicula malicorticis)，枯病菌(Zymoseptoria)，小麦叶枯病菌(Zymoseptoria tritici)，疫霉属(Phytophthora)，致病疫霉(Phytophthorainfestans)，球座菌属(Guignardia)，葡萄球座菌(Guignardia bidwelli)、山茶球座菌(Guignardia camelliae)、佛里达球座菌(Guignardia fulvida)、芒果球座菌(Guignardiamangiferae)、香蕉球座菌(Guignardia musae)、虫状球座菌(Guignardia philoprina)，单轴霉属(Plasmopara)，葡萄生单轴霉(Plasmopara viticola)，柄锈菌属(Puccinia)，狭窄柄锈菌(Puccinia angustata)、花生柄锈菌(Puccinia arachidis)、三芒草柄锈菌(Puccinia aristidae)、芦笋柄锈菌(Puccinia asparagi)、卡卡巴塔柄锈菌(Pucciniacacabata)、风铃草柄锈菌(Puccinia campanulae)、红花柄锈菌(Puccinia carthami)、冠状柄锈菌(Puccinia coronata)、异株柄锈菌(Puccinia dioicae)、蔗茅柄锈菌(Pucciniaerianthi)、莴苣柄锈菌(Puccinia extensicola)、向日葵柄锈菌(Puccinia helianthi)、大麦柄锈菌(Puccinia hordei)、杰卡柄锈菌(Puccinia jaceae)、屈恩柄锈菌(Pucciniakuehnii)、锦葵柄锈菌(Puccinia malvacearum)、玛丽-威尔柄锈菌(Puccinia mariae-wilsoniae)、黑顶柄锈菌(Puccinia melanocephala)、薄荷柄锈菌(Puccinia menthae)、酢浆草柄锈菌(Puccinia oxalidis)、天竺葵-带状柄锈菌(Puccinia pelargonii-zonalis)、皮氏柄锈菌(Puccinia pittieriana)、早熟禾柄锈菌(Puccinia poarum)、紫柄锈菌(Puccinia purpurea)、小麦叶柄锈菌(Puccinia recondita)、谢尔登柄锈菌(Pucciniaschedonnardii)、无柄柄锈菌(Puccinia sessilis)、多形柄锈菌(Pucciniastriiformis)、多形柄锈菌(Puccinia striiformis)、细小柄锈菌(Puccinia subnitens)、亚纹柄锈菌(Puccinia 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peckianus)，天冬酰胺壳二孢(Ascochyta asparagina)、波西米亚壳二孢(Ascochyta bohemica)、木瓜球壳二孢(Ascochyta caricae)、多孔壳二孢(Ascochytadoronici)、蚕豆叶壳二孢乳香专化型(Ascochyta fabae f.sp.lentis)、禾壳二孢(Ascochyta graminea)、大麦壳二孢(Ascochyta hordei)、葎草壳二孢(Ascochytahumuli)、豌豆壳二孢(Ascochyta pisi)、丝孢壳二孢(Ascochyta prasadii)、高粱壳二孢(Ascochyta sorghi)、菠菜壳二孢(Ascochyta spinaciae)、塔尔达壳二孢(Ascochytatarda)、小麦壳二孢(Ascochyta tritici)，红核子囊孢(Ascospora ruborum)，棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus)、灰绿曲霉(Aspergillus fischerianus)、黑曲霉(Aspergillusniger)，番木瓜座糙孢菌(Asperisporium caricae)，小光壳炱属(Asteridiella)，山核桃小星盾炱(Asteroma caryae)，蛛形纲阿太菌(Athelia arachnoidea)、罗耳阿太菌(Athelia rolfsii)，裂皮深黄孔菌(Aurantiporus fissilis)，普鲁兰短梗霉(Aureobasidium pullulans)，竹节菌属(Bambusiomyces)，香蕉黑星病(Banana freckle)，Bayoud病(Bayoud disease)，扁圆球孢(Beniowskia sphaeroidea)，淡色生赤壳(Bionectria ochroleuca)，平脐蠕孢属(Bipolaris)，仙人掌平脐蠕孢(Bipolariscactivora)、库氏平脐蠕孢(Bipolaris cookei)、内弯平脐蠕孢(Bipolaris incurvata)、甘蔗平脐蠕孢(Bipolaris sacchari)，烟色炭角菌(Biscogniauxia capnodes)、棒茎炭角菌(Biscogniauxia marginata)，烟管菌(Bjerkandera 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tussilaginis)，分生孢子菌(Conidiosporomyces)，栗生垫壳孢(Coniellacastaneicola)、白腐垫壳孢(Coniella diplodiella)、草莓垫壳孢(Coniellafragariae)，冢镶孢(Coniothecium chomatosporum)，朴丽-南方盾壳霉(Coniothyriumceltidis-australis)、何氏盾壳霉(Coniothyrium henriquesii)、蔷薇盾壳霉(Coniothyrium rosarum)、威氏盾壳霉(Coniothyrium wernsdorffiae)，鬼伞(Coprinopsis psychromorbida)，约氏双孢菌(Cordana johnstonii)、香蕉双孢菌(Cordana musae)，从卷毛革孔菌(Coriolopsis floccosa)，玉米灰叶斑病(Corn greyleaf spot)，菌核伏革菌(Corticium invisum)、潘氏伏革菌(Corticium penicillatum)、茶茎伏革菌(Corticium theae)，红伏革菌(Coryneopsis rubi)，杜鹃花棒盘孢(Coryneumrhododendri)，坚黑穗病(Covered smut)，垂叶燕麦菌(Crinipellis sarmentosa)，茶藨生柱锈菌(Cronartium ribicola)，隐丛壳科(Cryphonectriaceae)，隐担子科(Cryptobasidiaceae)，荔枝黑脂病菌(Cryptocline cyclaminis)，柳杉菌(Cryptomeliola)，掩荫小隐孢壳(Cryptosporella umbrina)，塔拉科拟隐孢壳(Cryptosporiopsis tarraconensis)，隐小孢子菌(Cryptosporiumminimum)，新月弯孢(Curvularia lunata)、番木瓜生弯孢(Curvularia caricae-papayae)、狼尾草弯孢(Curvularia penniseti)、塞纳加尔弯孢(Curvularia senegalensis)、车轴草弯孢(Curvularia trifolii)，落针病菌(Cyclaneusma needle 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isaacii)、克氏轮枝孢(Verticillium klebahnii)、长孢轮枝孢(Verticillium longisporum)、苜蓿轮枝孢(Verticillium nonalfalfae)、鳄梨轮枝孢(Verticillium theobromae)、枯萎病轮枝孢(Verticillium wilt)、狗草轮枝孢(Verticillium zaregamsianum)，圆皮水母菌(Waitea circinata)，西方菌(Westea)，小麦叶锈病(Wheat leaf rust)，小麦霉病(Wheat mildew)，乔治亚芜菁草菌(Wuestneiopsisgeorgiana)，白蜡木旱藻(Xeromphalina fraxinophila)，唑普菲亚根菌(Zopfiarhizophila)，拜氏接合酵母(Zygosaccharomyces bailii)、罗伦丁接合酵母(Zygosaccharomyces florentinus)和浆硫藻(Zythiostroma)。
这些真菌中的一些(灰葡萄孢、希金斯刺盘孢(Colletotrichum higginsianum)、禾谷镰刀菌、小麦叶枯病菌)的特定目标基因公开于下面的实施例9中。
这些卵菌中的一些(致病疫霉、葡萄生单轴霉)的特定目标基因公开于下面的实施例9中。
有益真菌
在具体的实施方案中，本发明的EV含有功能性iRNA，其靶向有益真菌的一个或多个基因。有益真菌包括经典的丛枝菌根真菌，但也包括其他共栖真菌(包括最近表征的真菌炭疽菌(Colletotrichum tofieldiae))(Hiruma等人，2016)。
靶向病毒
在具体的实施方案中，本发明的EV含有功能性iRNA，其靶向病毒的一个或多个基因。在具体的实施方案中，所述病毒选自：烟草花叶病毒(Tobacco mosaic virus)、番茄斑萎病毒(Tomato spotted wilt virus)、番茄黄化曲叶病毒(Tomato yellow leaf curlvirus)、黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus)、马铃薯Y病毒(Potato virus Y)、花椰菜花叶病毒(Cauliflower mosaic virus)、非洲木薯花叶病毒(African cassava mosaicvirus)、李痘病毒(Plum pox virus)、雀麦花叶病毒(Brome mosaic virus)和马铃薯X病毒(Potato virus X)、柑桔速衰病毒(Citrus tristeza virus)、大麦黄矮病毒(Barleyyellow dwarf virus)、马铃薯卷叶病毒(Potato leafroll virus)和番茄丛矮病毒(Tomato bushy stunt virus)。
这些病毒之一(李痘病毒)的特定目标基因公开于下面的实施例9中。
本发明的嵌合EV
为了保护植物免受由数种细菌病原体引起的疾病，本发明的方法有利地使用与多于一种植物病原体或有害生物具有序列同源性的功能性EV(以下称为“嵌合EV”)。
在该实施方案中，本发明的EV中含有的小RNA可以靶向数种病原体或寄生物的数个基因。这些“嵌合EV”不是对一种病原体或有害生物具有特异性的，而是可以影响数种病原体(例如一种细菌和一种病毒，或两种不同的细菌，或三种不同的病毒等)的生长。
上面针对EV、iRNA、载体和转化方法提出的所有实施方案都涵盖在内，无需重复。
当本发明的EV靶向数种病原体或寄生物时，本发明的植物治疗组合物可以同时治疗或预防由这些不同的病原体/寄生物引起的疾病。
在优选的实施方案中，本发明的EV含有嵌合iRNA，其抑制编码如上所定义的细菌细胞的毒力因子或必需基因的至少一个基因，以及编码其他病原体或寄生物的毒力因子或必需基因(已知其对宿主诱导的基因沉默敏感)的至少一个其他基因。它也可以是非细菌病原体或寄生物的有毒次生代谢物的生物合成所需的基因。
在另一个优选的实施方案中，本发明的植物治疗应用使用：(i)含有一种或多种iRNA的EV，所述iRNA靶向在大量病原体中保守的必需基因或毒力基因的广泛序列区域，或(ii)含有一种或多种iRNA的EV，所述iRNA靶向来自不相关病原体的必需因子或毒力因子基因。这种具体实施方案赋予对多种病原体的广谱保护。
本发明的EV可用于沉默任何微生物中的任何基因。现在公开有用的目标基因的例子。
细菌目标基因
对于抗菌应用，本发明的EV应当含有与至少一个细菌基因具有足够序列同源性的有效小RNA，以诱导所述至少一个基因的序列特异性沉默。此外，为了防止不需要的脱靶效应，所述EV中含有的dsRNA、miRNA或小RNA物种与真核宿主基因组或有益细菌、宿主定植体和/或以宿主生物体为食的哺乳动物的其他基因组的序列同源性应当是准不存在的(如果不是不存在的)。
根据本发明，术语“细菌基因”是指细菌中的任何基因，包括天然存在于细菌中的(天然)蛋白质编码基因或非编码基因，和通过重组DNA技术引入细菌中的人工基因。所述目标细菌基因是给定细菌物种特异性的，或在多种细菌物种中保守。优选地，它与真核宿主基因组、宿主定植体和/或以宿主生物体为食的哺乳动物的任何基因均不具有同源性。这避免了对植物宿主、与宿主相关的有益细菌、宿主定植体和/或以宿主生物体为食的动物的附带效应。
在优选的实施方案中，所述至少一个细菌基因是细菌毒力因子或细菌必需基因或抗生素耐药性基因。
如本文所用，术语“细菌必需基因”是指对细菌细胞活力至关重要的任何细菌基因。假如所有营养物质都可得，则这些基因是维持细菌存活所绝对必需的。据认为，细菌绝对必需的必需基因数量为约250-500个。通过使用转座子测序方法，从不相关的细菌中鉴定此类必需基因现在变得相对容易可得。这些必需基因编码蛋白质以维持中枢代谢、复制DNA、确保适当的细胞分裂、将基因翻译成蛋白质、维持基本的细胞结构、以及介导进出细胞的运输过程(Zhang等人，2009)。GyrB和FusA就是这种情况。
如其中所用，术语“毒力基因”是指已被证明对以下活性中的至少一种起关键作用的任何细菌基因：致病性、疾病发生、定植于特定宿主组织(例如维管组织)或宿主细胞环境(例如质外体)、抑制植物防御反应、调节植物激素信号传导和/或生物合成以促进增殖和/或疾病发展、干扰保守宿主调节过程以促进繁殖和/或疾病发展等。所有这些活性均有助于细菌在宿主中生长和/或促进疾病症状，尽管对其体外生存不是必需的。公知的毒力因子为：粘附素、植物毒素(例如冠菌素、syringoline A)、降解酶(例如纤维素酶、纤维二糖苷酶、脂肪酶、木聚糖酶、内切葡聚糖酶、聚半乳糖醛酸酶)、组装I/II/III/IV型或VI型分泌系统所需的因子、效应蛋白、与植物细胞接触时促进Hrp基因表达所需的转录因子、适当表达毒力因子所需的机制(例如群体感应、双组分系统)、控制来自毒力因子基因的mRNA的稳定性/翻译的转录后因子。
数种不同植物致病菌的公知细菌必需基因或毒力因子提供于下表中：
·对于大多数细菌：生存和/或毒力所需的中心因子如FtsZ、FtsA、cheA、gacA、tolC、pglA、engXCA1、engXCA2、GumH、GumD、XpsE、LesA、HolC、Wp012778355、wp015452784、WP012778510、wp015452939、act56857、wp012778668、GyrB、MreB、RbfA、RsgA、FliA、QseC、Hfq、HrpR、HrpS、RpoD、HrpL、Cfa6、fusA、gyrB、rpoB、RpoC、secE、RpoA、dnaA、dnaN、HrpG、HrpB、HrcC、XpsR、TssB、HrpG、HrpX、RsmA、NadHb、NadHd和NadHe、DnaA、DnaE1、DnaE2、ZipA、PhoP、FhaB、PhoP、rim、ybeY、rplQ。
·对于细菌丁香假单胞菌菜豆晕疫病致病变种(Pseudomonas syringaepv.phaseolicola)(菌株Pph 1448A；Pph 1302A)，已知其感染常见豆类植物菜豆(Phaseolus vulgaris)并引起晕疫病：
必需基因 描述 功能
cheA2 趋化感应因子组氨酸激酶CheA 趋化性
cheZ 趋化蛋白CheZ 趋化性
flhB 鞭毛生物合成蛋白FlhB 鞭毛
fliO 鞭毛蛋白FliO 鞭毛
fliN 鞭毛运动开关蛋白FliN 鞭毛
fliM 鞭毛运动开关蛋白FliM 鞭毛
fliK 鞭毛钩长度控制蛋白FliK 鞭毛
fleS 鞭毛感应因子组氨酸激酶FleS 鞭毛
flgJ 肽聚糖水解酶FlgJ 鞭毛
flgE 鞭毛钩蛋白FlgE 鞭毛
flgD 基体杆修饰蛋白FlgD 鞭毛
FlgA 鞭毛基体P环形成蛋白，推定 鞭毛
MotA MotA家族运动蛋白 鞭毛
plsC hdtS蛋白(100％) 群体感应分子
impL OmpA结构域蛋白(98％) 外膜蛋白和致病性；可能在T6SS中涉及
mdoG1 周质葡聚糖生物合成蛋白MdoG
CobQ 钴啉胺酸合成酶 钴胺素(维生素B12)生物合成
carA 氨甲酰磷酸合成酶，小亚基 嘧啶生物合成
pyrB 天冬氨酸转氨甲酰酶 嘧啶生物合成
carB 氨甲酰磷酸合成酶，大亚基 嘧啶生物合成
purH 双功能嘌呤生物合成蛋白PurH 嘌呤生物合成
pyrD 二氢乳清酸脱氢酶 嘧啶生物合成
钴胺素合成蛋白/P47K家族蛋白
·对于细菌丁香假单胞菌猕猴桃致病变种，已知其感染猕猴桃植物和果实(猕猴桃属物种)并引起猕猴桃溃疡病：
·对于细菌胡萝卜软腐果胶杆菌，已知其感染大白菜并引起软腐病：
必需基因 描述
pyrD 二氢乳清酸脱氢酶
purH 双功能磷酸核糖酰氨基咪唑甲酰胺甲酰基转移酶/IMP环化水解酶
purD 磷酸核糖胺-甘氨酸连接酶
leuA 2-异丙基苹果酸合成酶
serB 磷酸丝氨酸磷酸酶
expl 合成N-(3-氧代己酰基)-L-高丝氨酸内酯
expR 群体感应转录调节因子
flgA 鞭毛基体P环生物合成蛋白
fliA 鞭毛生物合成σ因子
flhB 鞭毛生物合成蛋白
qseC 感应蛋白QseC细菌肾上腺素能受体
tolC 外膜通道蛋白
PCC21_023220 推定的DNA结合蛋白
·对于细菌青枯雷尔氏菌，已知其感染番茄、马铃薯、烟草、香蕉和大豆并引起细菌青枯病：
·对于细菌水稻黄单胞菌稻生致病变种(Xanthomonas oryzae pv.oryzicola)，已知其感染水稻(Oryza sativa)并引起水稻细菌性叶条斑病：
·对于细菌野油菜黄单胞菌野油菜致病变种，已知其感染所有十字花科(Brassicaceae)(卷心菜、西兰花、花椰菜、羽衣甘蓝、芜菁、油菜、芥菜、萝卜等)并引起十字花科黑腐病：
必需基因 描述
B109F06(pilC) 菌毛组装蛋白
B205G02(pilB) 纤毛生物发生蛋白
B202G01(iroN) TonB依赖性受体
B302H04(wxcM) 双功能乙酰转移酶/异构酶
A404F11(wrcC) 糖基转移酶
C302F11(wxcA) 糖基转移酶
A105E01(nagA) N-乙酰葡糖胺-6-磷酸脱乙酰酶
C110C10(rmlA) 葡萄糖-1-磷酸胸苷基转移酶
A202H06(xpsM) 一般分泌途径蛋白M
C406A04(xpsK) 一般分泌途径蛋白K
B502F09(xpsF) 一般分泌途径蛋白F
B405E02(xpsE) 一般分泌途径蛋白E
B401G05(virB8) VirB8蛋白
C109G03(engXCA) 纤维素酶
B101F11(rpfG) 反应调节因子
B203D06 转导因子蛋白car
A308G04(trpE) 邻氨基苯甲酸合成酶组分I
B605H08(trpD) 邻氨基苯甲酸合成酶组分II
B504A10(metA) 高丝氨酸O-乙酰转移酶
A506A08(hisF) 环化酶
C206E04 可能的限制修饰系统特异性亚基
C111B03(cypC) 脂肪酸α羟化酶
A507C08(fadB) 对羟基肉桂酰辅酶A水合酶/裂解酶
B302H05(uptB) 马来酰乙酰乙酸异构酶
C307G11(catB) 过氧化氢酶(前体)
B104E02(icd) 异柠檬酸脱氢酶
B106G06(ppsA) 磷酸烯醇丙酮酸合成酶
·对于细菌地毯草黄单胞菌致病变种(Xanthomonas axonopodis pathovars)(例如柑橘致病变种(pv.citri)和木薯萎蔫致病变种(pv.manihotis))，已知其分别感染柑橘树和木薯并分别引起柑橘溃疡病和木薯细菌性萎蔫病：
必需基因 描述
XAC1211(KatE) 单功能过氧化氢酶
Xac1815(XacFhaB) 推定的血凝素转运因子蛋白
XAC3600(wzt) LPS生物合成
AvrBs2 3型分泌效应子
XopX 3型分泌效应子
XopZ 3型分泌效应子
XopAO1 3型分泌效应子
XopN 3型分泌效应子
XopQ 3型分泌效应子
·对于细菌解淀粉欧文氏菌，已知其感染苹果和梨树并引起火疫病：
必需基因
A7/74SmSp-A20
Ea7/74SmSp-A29
Ea7/74Sm-A33
Ea7174SmSp-A38
Ea7/74Sm-A41
Ea7/74SmSp-A56
Ea7/74SmSp-A64
Ea7/74SmSp-A72
Ea7/74SmSp-A75
Ea7/74SmSp-A76
Ea7/74SmSp-A83
·对于细菌达旦提狄克氏菌(Dickeya dadantii)，已知其感染马铃薯、番茄、茄子、菊苣并引起软腐病：
必需基因 描述
Dda3937_00335(glpD) 甘油-3-磷酸脱氢酶
Dda3937_03379(purL) 磷酸核糖甲酰甘氨酸酰胺合成酶
Dda3937_03564(opgG) 葡聚糖生物合成蛋白G前体
Dda3937_00244(purH) 磷酸核糖氨基咪唑甲酰胺甲酰转移酶/IMP环化水解酶
Dda3937_00532(hflK) FtsH蛋白酶调节因子
Dda3937_02515(purM) 磷酸核糖氨基咪唑合成酶
Dda3937_02627 4-羟基苏氨酸-4-磷酸脱氢酶
Dda3937_00004(guaB) IMP脱氢酶
Dda3937_03563(opgH) 葡聚糖生物合成葡糖基转移酶H
Dda3937_01284(pyrB) 天冬氨酸转氨甲酰酶
Dda3937_03924(rffG) dTDP-葡萄糖4,6-脱水酶
Dda3937_01389(carB) 氨甲酰磷酸合成酶大亚基
Dda3937_03299(acrA) MexE家族多药物外排RND转运因子周质衔接子亚基
Dda3937_03300(acrB) 多药物外排系统蛋白
Dda3937_03258(pyrE) 乳清酸磷酸核糖基转移酶
Dda3937_02336(nlpI) 脂蛋白
Dda3937_02506(nlpB) 外膜蛋白组装因子BamC
Dda3937_04018(pta) 磷酸乙酰转移酶
Dda3937_03554(pyrC) 二氢乳清酸酶
Dda3937_04573(lpxM) 酰基(肉豆蔻酸)转移酶
Dda3937_01116(glnG) 氮调节蛋白NR(I)，双组分系统
Dda3937_02099(purF) 酰胺磷酸核糖基转移酶
·对于细菌苛养木杆菌，已知其感染葡萄藤和橄榄树并引起葡萄藤的皮尔斯病、柑橘杂色褪绿病、或橄榄速衰综合征：
·对于细菌马铃薯斑纹片病菌，已知其感染马铃薯并引起斑马片病，以及韧皮部杆菌亚洲种(或美洲/非洲种)，已知其感染柑橘并引起柑桔黄龙病：
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这些基因中的任一个均可以是本发明的EV的靶点。
在有益细菌中，将靶向的细菌基因例如是：负调节细菌存活的噬菌体生产所需的基因(例如噬菌体基板组装蛋白GpV)；来自大豆根瘤菌(Bradyrhizobium japonicum)的NolA和NodD2基因，已知其在高群体密度下会降低nod基因的表达，从而减少生产Nod，Nod是一种对共生入侵至关重要的细菌信号(因此，从接种体菌株中敲低这些基因应当导致竞争结瘤)；由spot forty-two(spf)基因编码的小非编码RNA spot42，该基因控制碳水化合物代谢和摄入(从给定细菌中敲低该基因应当导致细菌滴度增加)。
在维管细菌中，将靶向的细菌基因例如是III型分泌基因。
当靶向细菌是植物致病菌时，所述必需细菌基因或毒力细菌基因可以是分泌系统(包括III型分泌系统)的结构基因(例如HrcC)，
-VI型分泌系统适当发挥功能所需的基因(例如TssB)，
-编码细菌效应子表达的主调节因子的基因(例如HrpL、HrpG、HrpX)，
-编码植物毒素生物合成所需因子的基因(例如Cfa6，其对一些丁香假单胞菌致病变种中的冠菌素生物合成很重要)，
-毒力化合物生物合成所需的基因(例如XpsR，其对胞外多糖EPS1的生物合成很重要；双组分系统RavS/RavR)。
本发明的EV含有小RNA，其与来自靶向细菌病原体物种的这些必需基因或毒力基因中的任一个有利地共有序列同源性。
因此，在优选的实施方案中，所述毒力因子基因或细菌活力基因选自：AvrPto、AvrPtoB、HopT1-1、FtsZ、FtsA、cheA、gacA、tolC、pglA、engXCA1、engXCA2、GumH、GumD、XpsE、LesA、HolC、Wp012778355、wp015452784、WP012778510、wp015452939、act56857、wp012778668、GyrB、MreB、RbfA、RsgA、FliA、QseC、Hfq、HrpR、HrpS、RpoD、HrpL、Cfa6、fusA、gyrB、rpoB、RpoC、secE、RpoA、dnaA、dnaN、HrpG、HrpB、HrcC、XpsR、TssB、HrpG、HrpX、RsmA、NadHb、NadHd和NadHe、DnaA、DnaE1、DnaE2、ZipA、PhoP、FhaB、PhoP、rim、ybeY和rplQ。
在抗菌应用中，本发明的EV有利地与来自细菌病原体物种的活力必需基因或毒力基因具有序列同源性，但与共生细菌基因组没有序列同源性。所述方法的这种有利的实施方案避免了对宿主中存在的共生细菌的附带效应。
靶向这些细菌基因中的一些的特别有用的序列提供于下面的实施例9和随附的序列表中，特别是在以下序列中：SEQ ID NO：1-16(靶向苛养木杆菌基因的IR构建体)、SEQ IDNO：55-60(靶向韧皮部杆菌亚洲种基因的IR构建体)、SEQ ID NO：47-54(靶向软腐欧文氏菌基因的IR构建体)、SEQ ID NO：61-67和148(靶向丁香假单胞菌猕猴桃致病变种基因的IR构建体)、SEQ ID NO：90-95和SEQ ID NO：130-145(靶向来自丁香假单胞菌番茄致病变种DC3000菌株的基因的IR构建体)、SEQ ID NO：98-101(靶向来自青枯雷尔氏菌的基因的IR构建体)、SEQ ID NO：102-107(靶向来自野油菜黄单胞菌野油菜致病变种的基因的IR构建体)、SEQ ID NO：17-22和SEQ ID NO：128-129(靶向来自野油菜黄单胞菌莴苣致病变种的基因的IR构建体)、SEQ ID NO：120-129(靶向来自柑橘黄单胞柑橘溃疡病菌的基因的IR构建体)、SEQ ID NO：23-30(靶向来自新缬草食酸菌的基因的IR构建体)、和SEQ ID NO：31-38(靶向来自西瓜食酸菌的基因的IR构建体)。
病毒目标基因
对于抗病毒应用，本发明的EV应当含有与至少一个病毒基因具有足够序列同源性的有效小RNA，以诱导所述至少一个基因的序列特异性沉默。例如，所述病毒基因可以选自：P1、HC-Pro、CP、RdR、MP、N、5’LTR、3’LTR、5’UTR、3’UTR、P3、6k1、CI、6k2、NIa、Nib、VAP、pro-pol、viroplasmin、CPm、HEL、HSP70h、HSP70 L1、L2、MT、CP-RTD、VSR、VPg、P2、P3、P4、P5、Rap1、p33、p92、p41、p19、p22、AV2、AC4、TrAP和Ben。
靶向病毒区域的特别有用的序列提供于下面的实施例9和随附的序列表中，特别是在SEQ ID NO：39-46(靶向来自李痘病毒(PPV)的基因的IR构建体)中。
真菌和卵菌目标基因
对于抗真菌应用，本发明的EV应当含有与至少一个真菌基因具有足够序列同源性的有效小RNA，以诱导所述至少一个基因的序列特异性沉默。例如，所述真菌基因可以选自：CYP51A、CYP51B、CYP51C、TOR、CGF1、DCL1、DCL2、LTF1、HBF1、CclA、ACS1、ToxA、ACS2、ELP1、ELP2、MOB2、Br1A2、stuA、F1bc、pks1、PPT1、NPP1、INF1、GK4、piacwp1-1、piacwp 1-2、piacwp1-3、PITG_17947、PITG_10772、PITG_13671、PITG_16956、PITG_00891。
靶向真菌或卵菌区域的特别有用的序列提供于下面的实施例9和随附的序列表中，特别是在以下序列中：SEQ ID NO：96-97(靶向来自禾谷镰刀菌的基因的IR构建体)、SEQID NO：76-83(靶向来自灰葡萄孢的基因的IR构建体)、SEQ ID NO：84-89(靶向来自刺盘孢属物种的基因的IR构建体)、SEQ ID NO：108-113(靶向来自小麦叶枯病菌的基因的IR构建体)、SEQ ID NO：68-75(靶向来自致病疫霉的基因的IR构建体)、和SEQ ID NO：114-119(靶向来自葡萄生单轴霉的基因的IR构建体)。
含有具有杀生物作用的化合物的试剂盒(kit of parts)
本发明的EV可以与其他化合物同时或连续应用。
在优选的实施方案中，本发明的植物治疗组合物除了含有本发明的EV之外，还含有杀生物化合物。当本发明的沉默元件抑制触发对所述杀菌化合物的抗性的基因的表达时，这是特别合适的。
在这种情况下，本发明的组合物可以作为“试剂盒”供应，所述试剂盒包含本发明的EV和单独容器中的相应杀生物化合物。
所述试剂盒优选含有本发明的植物治疗组合物，所述植物治疗组合物含有携带小RNA的小球藻衍生的EV和相应的杀生物化合物。
本发明还涉及所述组合产品用于抑制或预防病原体在目标植物上的生长或致病性的用途。
换言之，本发明涉及一种用于治疗目标植物抵御病原体感染的方法，所述方法包括以下步骤：向所述目标植物的细胞中引入靶向至少一个抗菌抗性基因的长dsRNA分子，并向所述植物递送相应的杀生物化合物。
本发明还涉及一种用于治疗目标植物抵御病原体感染的方法，所述方法包括以下步骤：在细菌感染之前和/或之后，在目标植物组织上递送本发明的EV、或含有其的组合物以及相应的杀生物化合物。
在该实施方案中，优选在杀生物化合物之前应用本发明的EV，例如在几小时之前，通常在两小时之前。
本发明的转基因小球藻细胞
用本发明的iRNA转化并能够生成本发明的EV的小球藻细胞在下文中命名为“本发明的转基因小球藻细胞”或“本发明的重组小球藻细胞”或“本发明的宿主细胞”。
这些生产者细胞可以是任何小球藻物种。特别是，它们可以是目前用作人和牲畜的食物补充的任何细胞。在具体的实施方案中，它们可以属于以下物种：椭圆小球藻、蛋白核小球藻、索罗金小球藻、普通小球藻或多变小球藻。
在另一方面，本发明涉及分离的小球藻细胞或稳定或瞬时表达至少一种本发明的功能性iRNA的转基因小球藻。它还涉及含有DNA或病毒载体的分离的小球藻细胞，所述DNA或病毒载体含有本发明的前体。所述小球藻细胞可以是用所述DNA构建体或载体转化而获得的基因修饰细胞。
如上所述，转化过程的例子是农杆菌介导的转化或鸟枪法介导的转化。
上面针对小球藻细胞、iRNA、前体、载体和转化方法提出的所有实施方案都涵盖在内，无需重复。
生成这种转基因小球藻的方法在下面的实施例部分中公开(实施例1)。它们含有以下步骤：
i)如上面所解释的，用表达至少一个本发明的长功能性干扰RNA的DNA载体转化小球藻细胞，或，
ii)用病毒感染小球藻细胞，所述病毒优选选自能够感染小球藻细胞的RNA病毒，其被设计为由其基因组表达至少一种本发明的功能性干扰RNA，
经过足够的时间(通常为3至8天)以使小球藻细胞稳定或瞬时表达显著量的小RNA。
本文中的“显著量”是指已在如上所述的测试中表明具有抗菌/抗寄生物作用的量。该显著量为含有本发明的有效小RNA的EV优选在0.05pM至100pM之间，优选在0.05pM和10pM之间(用于体外应用)或在0.05pM至100nM之间，优选在0.05pM和10nM之间(用于体内应用)。
特别是，所述转基因小球藻能够触发病原体(例如病毒或细菌)的宿主诱导的基因沉默，并且含有可表达的iRNA，所述iRNA能够下调或抑制所述病原体的至少一个基因的表达。
在另一方面，本发明涉及一种稳定或瞬时表达上述小RNA的目标转基因小球藻。在一个实施方案中，所述目标转基因小球藻含有上述本发明的前体。
更准确地，本发明涉及一种表达siRNA或miRNA前体的重组小球藻细胞，所述前体包含至少一个目标基因片段，所述小球藻细胞释放靶向所述基因片段的EV包埋的功能性小iRNA。
在一个优选的实施方案中，所述至少一个目标基因是卵菌基因、病毒基因、细菌基因、或真菌基因或任何其他病原体或寄生物的基因。
在一个优选的实施方案中，所述小球藻细胞选自：椭圆小球藻、蛋白核小球藻、索罗金小球藻、普通小球藻或多变小球藻。
在进一步的方面，本发明还引述一种植物治疗组合物，其含有稳定或瞬时表达上述小RNA的转基因小球藻细胞作为活性成分。更准确地，这些植物治疗组合物有利地含有有效量的转基因小球藻细胞，其一旦应用于目标植物就能够原位生产本发明的小RNA。在该方面，小球藻细胞的生物量可以作为治疗植物中任何寄生物感染和/或感染性疾病的生物防治工具。这些小球藻细胞优选为以上公开的重组细胞，其更优选地已转化为粉末。事实上，本发明的该部分植物治疗组合物优选为粉末形式，其尤其可以容易地分散在土壤中。
优选将其用于以上公开的所有植物。
为了获得这些转基因细胞的高产率或提高这些转基因细胞生产EV的能力，可以遵循上面题为“本发明的生产方法”的具体部分中公开的建议。它们在这里比照适用，无需重复。
如先前所公开的，本发明的植物治疗组合物可以配制于生理或农艺上可接受的载体、赋形剂或稀释剂中。此类载体可以是待处理的植物可以耐受的任何材料。此外，载体必须使得组合物在控制感染方面保持有效，并且对以处理的植物为食的动物或昆虫无毒。此类载体的例子包括水、盐水、林格氏溶液、右旋糖或其他糖溶液、Hank’s溶液、和其他生理平衡的水性盐溶液、磷酸盐缓冲液、碳酸氢盐缓冲液和Tris缓冲液。
本发明的平台
在最后一方面，本发明涉及一种用于高通量生产功能性EV包埋的干扰小RNA的多功能平台，所述平台使用如上所定义的重组小球藻细胞。
“多功能”是指该平台能够适应或被调节以适应许多不同的功能或活性，以快速的方式生成多种不同病原体的调节剂。
该平台被称为“MIGS平台”。它可用于生产大量siRNA群体，其靶向多达十几个基因中的长达1500bp的区域。因此，这些siRNA针对任何病原体均有效，特别是针对不能容易地积累病原体逃逸突变的必需基因。它们包埋在细胞外囊泡(EV)中，其保护小RNA免受核糖核酸酶介导的消化。该平台的所有优点已在上面突出显示。
发明人生成了用于快速评估由转化小球藻参考系生产的每批次P40级分的生物活性的报告基因。更准确地，他们工程改造了表达报告系统的细菌(在此是大肠杆菌K12菌株)，当EV包埋的siRNA被内化并在细菌细胞中发挥活性时，所述报告系统表现出差异性的siRNA靶向报告基因表达。
本文提出了五种不同的报告系统：
第一报告系统家族基于二分盒(bipartite cassette)的质粒表达，所述二分盒由第一构建体和第二构建体组成，所述第一构建体表达转录阻遏子(即LacI-lite)的短寿命变体，在其5’或3’末端携带目的抗菌siRNA目标区域，所述第二构建体由GFP的中等稳定性变体组成(Andersen等人，1998；Elowitz&Leibler，2000)，其转录活性由pLac启动子指导并由lacO操纵子调节(图6A)。在没有EV包埋和/或相关的小RNA的情况下，LacI-lite蛋白应当在细菌中组成型产生，进而关闭GFP的表达，导致没有GFP荧光信号。相反，当给定的小RNA群体被细菌细胞内化并在其中发挥活性时，LacI-lite的沉默导致GFP表达的去抑制，导致检测到GFP荧光信号(图6A)。值得注意的是，LacI-lacO以外的其他系统也可以用于同一目的，如TetR-lite/tetO2或cI-lite/λPR系统。可以在目的质粒中将二分报告系统与适合在大肠杆菌和Pto DC3000中表达和复制的骨架组装在一起。然后可以在LacI-lite阻遏子的3’端引入目标基因(本文中例如Pto DC3000基因fusA)特异性的小RNA目标序列。可以用IPTG孵育转化的细菌细胞，可以测量OD600和GFP荧光。可以使用-IPTG和氯霉素对照对+IPTG条件的GFP荧光进行归一化，以便在去除背景信号后确定正确的诱导动力学。
可以生成基于GFP的报告基因的第二报告系统，通过将强组成型启动子pCMV组装至在编码序列的3’末端与小RNA目标序列融合的GFP转基因来进行。该报告基因可以进一步转染至用候选EV群体处理的人细胞中，并且可以通过不同的方法(包括在处理后24小时和48小时进行蛋白质印迹分析)进一步监测GFP蛋白的沉默。
第三报告系统家族依赖于基于质粒的盒的表达，所述盒由第一构建体和第二构建体组成，所述第一构建体组成型表达非靶向DsRed报告基因，其用作用于归一化的内部对照，所述第二构建体携带不稳定化的GFP报告基因，在其下游区域(或上游区域)含有目的抗菌siRNA目标区域(图6D)。当在细菌(例如大肠杆菌)中表达时，在给定的有效EV包埋的siRNA群体被内化后，该系统将导致GFP表达和荧光信号特异性降低。
第四报告系统家族基于三分盒(tripartite cassette)的质粒表达，所述三分盒由第一构建体、第二构建体和第三构建体组成，所述第一构建体表达转录阻遏子的短寿命变体(即TetR-lite)，在其下游区域携带目的抗菌siRNA目标区域，所述第二构建体由GFP的中等稳定性变体组成(Andersen等人，1998；Elowitz&Leibler，2000)，其转录活性由tetO2(或tetO1)操纵子控制，所述第三构建体表达非靶向DsRed报告基因，其作为用于归一化的内部对照(图6E)。在没有EV包埋的小RNA的情况下，TetR-lite蛋白应当在细菌中组成型产生，进而关闭GFP的表达，导致没有GFP荧光信号(应当仅检测到DsRed报告基因的荧光)。相反，当给定的siRNA群体被细菌细胞内化并在其中发挥活性时，TetR-lite的沉默导致GFP表达的去抑制，导致检测到GFP荧光信号。
第五报告系统家族依赖于基于质粒的二分盒的表达，所述二分盒由第一构建体和第二构建体组成，所述第一构建体表达转录阻遏子(即TetR-lite)的短寿命变体，在其下游区域(或上游区域)携带目的抗菌siRNA目标区域，所述第二构建体由GFP组成(Andersen等人，1998；Elowitz&Leibler，2000)或由生物发光报告基因(例如发光光杆状菌(Photorhabdus luminescens)操纵子luxCDABE(Meighen，1991))组成，其转录活性由tetO2(或tetO1)操纵子控制(图6F)。当给定的siRNA群体被细菌细胞内化并在其中发挥活性时，TetR-lite的沉默导致GFP或luxCDABE操纵子表达的去抑制，导致检测到GFP荧光信号或生物发光信号。值得注意的是，TetR-tetO2以外的其他系统也可以用于同一目的，如lacI-lite/lacO或cl-lite/λPR系统。
这些报告系统也是本发明的一部分，将有助于在产品制造之前验证EV包埋的siRNA批次的生物活性。
序列表
除了以上布置以外，本发明还包含其他布置，其将从下面的描述中显现，其参考本发明的主题的示例性实施方案并参考附图和序列的表，其中：
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附图说明
图1.小球藻EV的散射和荧光NTA分析
A)来自P40级分的整体小球藻颗粒的尺寸分布，通过散射分析(使用ParticleMetrix ZetaView系统)确定。
B)来自P100级分的整体小球藻颗粒的尺寸分布，通过散射分析(使用ParticleMetrix ZetaView系统)确定。
C)P100小球藻EV的透射电子显微镜(TEM)图像。
D)由TEM图像测量的P100小球藻EV的尺寸分布(n＝609)。
E)来自P40级分的PKH26标记的小球藻颗粒的尺寸分布(使用Particle MetrixZetaView系统)。使用488nm激光器进行测量。
图2.多变小球藻AGO和DCL蛋白的系统发育分析以及来自普通小球藻参考转基因系的小RNA的RNA测序分析
A)NJ树(1000个引导)，分别包括来自植物、动物、真菌和藻类的111个AGO序列和77个DCL序列。显示了多变小球藻AGO和DCL蛋白的位置。树在中点生根。
B)拟南芥(Arabidopsis)IR-CFA6/HRPL#4和小球藻参考转基因系IT20-3的小RNA之间的比较尺寸分布谱。来自小球藻的最丰富的小RNA群体长18nt，而在拟南芥中它们长21和24nt。同样值得注意的是，小球藻和拟南芥分别在15和16nt处表现出小RNA物种的小峰。该分析中分别显示了两个生物学重复。
图3.可以工程改造普通小球藻以生产靶向Pto DC3000毒力因子cfa6和hrpL的活性小RNA
A)IT20构建体的示意图，该构建体被设计为在组成型花椰菜花叶病毒(CaMV)35S启动子控制下表达靶向Pto DC3000 cfa6和hrpL mRNA的小RNA。使用Green Gate组装策略，在有义(B模块)和反义(D模块)方向上克隆了靶向两个毒力基因的嵌合的504bp区域。
B)在感染后3小时(hpi)对用以下孵育的拟南芥(登录号Col-0)叶切片进行气孔重新开放测定：水(模拟)或来自拟南芥(Arabidopsis thaliana)(At)、野生型小球藻或表达IR-CFA6/HRPL转基因的转基因小球藻系的总RNA(20μg)。将叶子与野生型(Pto/Pto Wt)或突变Pto DC3000菌株孵育(值得注意的是，PtoΔCor的cfa6基因缺失，因此气孔重新开放发生改变)。N，分析的气孔的总数。使用双因素方差分析(2way ANOVA)进行统计分析，并与模拟条件进行比较(p值：ns>0.05；***<0.001；****<0.0001)。
C)小RNA读取的覆盖度，显示沿IR-CFA6/HRPL反向重复序列(在负链和正链两者上)的映射读取总计数。黑色读取映射至cfa6序列区域，而深灰色读取映射至hrpL序列区域。
图4.针对Pto DC3000 hrpL转录本的小球藻人工小RNA是抑制hrpL介导的气孔重新开放功能的原因。
A)Pto DC3000ΔhrpL菌株以及分别用编码WT hrpL或mut hrpL(在组成型启动子NPTII的控制下)的质粒转化后生成的补充菌株的示意图。
B)在3hpi，在用以下孵育的拟南芥(Col-0)叶切片上进行气孔重新开放测定：来自拟南芥(At)或表达IR-HRPL构建体的小球藻转基因系(拟南芥，克隆IT29#4；小球藻，克隆IT29#12和IT29#15)或表达对照IR-CYP51构建体的小球藻转基因系(小球藻，IT19#7)的总RNA(20μg)。如图3B所述评估气孔重新开放反应。
图5.使用来自转基因普通小球藻系的浓缩培养基(CM)和P40级分进行气孔重新开放测定
A)在3hpi，在用以下孵育的拟南芥(Col-0)叶切片上进行气孔重新开放测定：水(模拟)、来自小球藻转基因系(IT20#3和IT20#5)和野生型(Wt)系的总RNA(20μg)或浓缩培养基(CM)。还使用来自拟南芥IR-CFA6/HRPL#4参考系的总RNA(20μg)作为对照。叶切片接种Pto DC3000 Wt或突变菌株。N，分析的气孔的总数。使用双因素方差分析进行统计分析，并与模拟条件进行比较(p值：ns>0.05；***<0.001；****<0.0001)。
B)如A)中那样，除了来自IT20#3系的P40级分用于该测定。还使用来自同一小球藻转基因系的RNA提取物作为阳性对照。N，分析的气孔的总数。使用双因素方差分析进行统计分析，并与模拟条件进行比较(p值：ns>0.05；***<0.001；****<0.0001)。
C)如B)中那样，但在37℃，在存在或不存在300U/ml Mnase的情况下孵育P40级分30'。通过加入终浓度为20mM的EGTA来阻断消化反应。
D)描绘了来自P100级分样品的小RNA读取的覆盖度，其计算为沿IR-CFA6/HRPL反向重复序列的映射读取总计数，包括构建体的正链和负链两者。黑色读取映射至cfa6序列区域，而深灰色读取映射至hrpL序列区域。
E)使用补充Wt或Mut hrpL版本的Pto DC3000ΔhrpL细菌进行气孔重新开放测定。如前所述，用Mnase处理来自小球藻IR-HRPL(IT29#12)和IR-CYP51(IT19#7)系的P40和P100EV级分，然后进行测定。如A)中所述评估气孔重新开放反应。
图6.将用于监测细菌细胞中EV包埋的siRNA活性的报告系统的示意图
A)二分盒的示意图，所述二分盒设计为在用给定的EV包埋的siRNA群体处理后检测GFP表达的特异性增益。该系统由第一构建体和第二构建体组成，所述第一构建体包括转录阻遏子(如所描绘的lacI-lite)的短寿命变体，在其下游区域(或潜在地在其上游区域)中含有目的siRNA目标区域，由组成型启动子(作为例子，例如此处描绘的nptII启动子序列)和下游终止子序列(例如SoxR终止子序列)驱动；所述第二构建体包括不稳定化的GFP报告基因序列(例如中等稳定性GFP变体gpf-aav序列(Campbell-Valois等人，2014；Elowitz&Leibler，2000))，其转录活性由pLac启动子中的lacO操纵子控制，并由下游终止子序列(例如SoxR终止子序列)组成。在正常情况下，GFP表达被LacI-lite阻遏子的存在所阻遏(1)。靶向调节区域“X”的EV含有的小RNA触发这种阻遏子的沉默，从而释放抑制并允许GFP表达(2)。
B)在含有R37构建体的大肠杆菌TOP10细胞上，不同浓度的IPTG介导荧光诱导动力学。该构建体具有小RNA靶向区域，其对应于Pto DC3000基因fusA，克隆在lacI基因的3’末端。通过减去-IPTG和+氯霉素条件的荧光值得到的GFP荧光用作对照。通过在37℃用特定的滤光器每5’执行一次数据采集，持续15小时，来在Tecan Infinite 200读板器系统中监测荧光和OD600(未显示)。
C)在含有R37构建体的Pto DC3000 Wt细胞上，IPTG介导的荧光诱导动力学。通过减去-IPTG和+氯霉素条件的荧光值得到的GFP荧光用作对照。通过在28℃用特定的滤光器每5’执行一次数据采集，持续15小时，来在Tecan Infinite 200读板器系统中监测荧光和OD600(未显示)。
D)第一双报告基因家族盒的示意图，所述盒设计为在用给定的EV包埋的siRNA群体处理后检测GFP表达的特异性降低。双报告基因盒由第一DsRed报告基因构建体和第二构建体组成，所述第一DsRed报告基因构建体由组成型启动子(作为例子，例如此处描绘的Rpsm启动子序列)和下游终止子序列(作为例子，例如此处描绘的TonB终止子序列)驱动；所述第二构建体由不稳定化的GFP报告基因版本(例如在其下游区域携带降解标签的GFPsmf2序列或中等稳定性GFP变体gpf-aav序列(Campbell-Valois等人，2014；Elowitz&Leibler，2000))组成，在其下游区域(或上游，未显示)含有克隆的目的siRNA目标序列区域，由组成型启动子驱动(作为例子，例如此处描绘的NPTII启动子序列)，并具有下游终止子序列(作为例子，例如此处描绘的SoxR终止子序列)。
E)第二三分盒的示意图，所述三分盒设计为在用给定的EV包埋的siRNA群体处理后检测GFP表达的特异性增益。所述三分盒由第一构建体、第二构建体和第三构建体组成，所述第一构建体包括转录阻遏子(如所描述的TetR-lite)的短寿命变体，在其下游区域(或最终在其上游区域，未显示)中含有目的siRNA目标区域，由组成型启动子(作为例子，例如此处描绘的NPTII启动子序列)和下游终止子序列(作为例子，例如此处描绘的SoxR终止子序列)驱动；所述第二构建体包括不稳定化的GFP报告基因序列(例如在其下游区域携带降解标签的GFPsmf2序列或中等稳定性GFP变体gpf-aav序列(Campbell-Valois等人，2014；Elowitz&Leibler，2000))，其转录活性由tetO2操纵子控制，并由下游终止子序列组成(作为例子，例如此处描绘的soxR或tonB终止子序列)；所述第三构建体包括DsRed报告基因序列，由组成型启动子(作为例子，例如此处描绘的Rpsm启动子序列)和下游终止子序列(作为例子，例如此处描绘的TonB终止子序列)驱动。
F)第三二分盒的示意图，其设计为在用给定的EV包埋的siRNA群体处理后检测报告基因表达的特异性增益。所述二分盒由第一构建体和第二构建体组成，所述第一构建体包括转录阻遏子(如所描述的TetR-lite)的短寿命变体，在其下游区域(或最终在其上游区域，未显示)中含有目的siRNA目标区域，由组成型启动子(作为例子，例如此处描绘的NPTII启动子序列)和下游终止子序列(作为例子，例如此处描绘的SoxR终止子序列)驱动；所述第二构建体包括不稳定化的GFP报告基因序列(例如在其下游区域携带降解标签的GFPsmf2序列或中等稳定性GFP变体gpf-aav序列(Campbell-Valois等人，2014；Elowitz&Leibler，2000))或生物发光报告基因(例如发光光杆状菌操纵子luxCDABE(Meighen，1991))，其转录活性由tetO2操纵子控制，并由下游终止子序列组成(作为例子，例如此处描绘的soxR或tonB终止子序列)。
图7.在光生物反应器中培养参考小球藻系不影响相应EV级分的质量和功能性
A)可以容易地在不同尺寸的光生物反应器(PBR)(1至150L PBR)(AlgoSolis，Saint Nazaire，法国)中培养转基因小球藻，如IT20#3参考系。
B)通过散射分析(使用Particle Metrix ZetaView系统)测定小球藻颗粒在0-500nm范围内的尺寸分布，所述小球藻颗粒来自从150L PBR培养物中获得的P40级分。
C)使用Particle Metrix ZetaView系统测定PKH26标记的小球藻颗粒在0-500nm范围内的尺寸分布，所述小球藻颗粒来自从150L PBR培养物中获得的P40级分。使用488nm激光器进行测量。
D)使用来自参考IT20#3和对照IT19#7系的总RNA和P40级分进行气孔重新开放测定。如所描绘的，使用来自不同生产系统的细胞生物质和培养基来制备样品。如先前所述评估气孔重新开放反应。
图8.用热杀细菌的上清液处理会改善小球藻EV的生产和/或分泌
A)增加EV生产的处理方案。使新鲜稀释的小球藻培养物生长至早期稳定期(2至4×106个细胞/ml)。然后用相当于25mg/ml的上清液处理培养物，所述上清液来自重悬于水中的热杀大肠杆菌和Pto DC3000细胞。在两天后，收集来自不同处理(未处理、+大肠杆菌和+Pto DC3000)的P100级分并进行定量。还确定了小球藻细胞的总数以检查对微藻生长的可能影响。
(B)未处理(Ctl)、+大肠杆菌和+Pto DC3000(DC3000)培养物的P100级分中的颗粒浓度。N＝4个独立的生物学重复。
具体实施方式
实施例
实施例1：材料和方法
普通小球藻材料和生长条件
野生型普通小球藻藻株UTEX265保持于BG11，1％琼脂平板中，并在Sanyo MLR-351生长室中在自养条件下生长。环境条件保持在25℃，14h/10h光周期和约100μmol/m2/s的光强度。在相同的条件下，使用含有20μg/ml潮霉素的平板保持转基因小球藻系。通过在充气的25cm2塑料烧瓶中接种BG11(pH 7)中的单个菌落而不搅拌来开始液体培养，然后每周定期稀释一次或两次(稀释比例1:10)，以达到最终体积(200-800ml，分在数个充气的75cm2烧瓶中)。使用Malassez室评估培养密度。为了评估培养物的无外来污染性，通过将1ml培养物加入补充有蛋白胨的BG11中来进行常规污染测试。混合物避光保持3周，使细菌生长，然后进行显微镜观察。150L PBR中的小球藻生产在连续光周期制度下进行，白光的光强度从150增加至400μmol/m2/s以应对PBR中不断增长的细胞密度，平均温度为22.9±6℃，固定pH值为8。在这些标准生长条件下，转基因小球藻细胞在8天后达到约1.1g/L的最大培养密度。通过以下进行无细胞培养基收集：以3600g连续两轮离心，以进行总细胞沉淀，并以4000g离心以去除所有剩余的细胞。
生物信息学、序列保守性和系统发育分析
为了鉴定属于囊泡和细胞外囊泡生物发生或功能的蛋白序列，使用候选的人和植物蛋白序列作为NCBI和JGI(多变小球藻)数据库的BLASTP分析查询。保留前10次命中并用于与查询序列进行局部比对。还在Pfam(http://pfam.xfam.org/)和SMART(http://smart.embl-heidelberg.de/)数据库上分析了最佳候选物(即序列相似性较高的候选物)，并使用PHMMER搜索(https://www.ebi.ac.uk/Tools/hmmer/search/phmmer)以将蛋白质结构域组成与查询进行比较。认为显示出高序列相似性和保守结构域组成的小球藻蛋白是“推定直系同源物”。
对于普通小球藻分析，使用UTEX 395株的转录组(Guarnieri等人，2018)进行局部blastp和blastn搜索。如前所述分析检索到的序列的相似性和结构域结构。
对于小球藻AGO和DCL蛋白系统发育分析，将人和拟南芥的AGO和DCL的蛋白质序列用作针对多变小球藻基因组(JGI)的BLASTP分析的查询。植物、动物和真菌AGO(Murphy等人，2008)和DCL(Mukherjee等人，2013；Gao等人，2014)的蛋白质序列获自文献。初步比对后共保留111个AGO蛋白和77个DCL蛋白，消除歧义的序列。分析蛋白质结构域结构以明确识别与典型蛋白相似的AGO和DCL蛋白。手动剪切序列比对，以仅保留最保守的区域进行分析，对于AGO对应于288aa，对于DCL对应于436aa。MEGA X软件用于进行NJ系统发育，使用FigTree1.4编辑树。
生成用于在小球藻中生产小RNA的构建体
使用Green Gate组装策略生成了反向重复构建体，其设计为生产靶向来自各种细菌植物病原体的毒力基因和必需基因的特定区域的人工小RNA。将基因特异性靶向区域或嵌合靶向区域克隆为“B”(有义)和“D”(反义)模块，并组装在表达构建体中。所有生成的发夹均含有来自牵牛花查耳酮合酶基因CHSA(SEQ ID NO：149)的特定内含子序列，并在花椰菜花叶病毒(CaMV)35S启动子的控制下，包括潮霉素耐药性盒。先前已描述了嵌合cfa6-hrpL构建体(IT20)(PCT/EP2019/072169、PCT/EP2019/072170)。
通过将不同DNA片段同时连接成“B”Green Gate模块来获得所有嵌合构建体，并使用特异性寡核苷酸来生成和克隆反向平行链作为“D”模块。通过限制性分析、Sanger测序验证所有质粒，然后通过电穿孔法引入根癌农杆菌C58C1菌株中。
普通小球藻转基因系的生成
使用卸甲的根癌农杆菌菌株进行普通小球藻基因转化。更详细地，将来自指数生长培养物的总共5×108个细胞接种在BG11琼脂平板上，并在正常光辐照度下生长5天。在转化前一天，预接种来自甘油储备液或在28℃、180rpm振荡下LB平板的根癌农杆菌，其携带合适的反向重复构建体。转化当天，使用5mL根癌农杆菌预接种物接种50ml LB并生长至OD600＝0.8-1.2。在正确的光密度时，收集、洗涤细菌并以OD600＝0.5重悬于诱导培养基(BG11，pH5.6，乙酰丁香酮100μM)中。将小球藻细胞从平板上轻轻刮下，重悬于200μl细菌中，并在25℃、在诱导培养基琼脂平板上避光共培养2天。共培养后，收获细胞，放入补充有50μg/mL替卡西林二钠/克拉维酸钾(TIM，T0190，Duchefa)或头孢噻肟(C7039，Merck)的7ml BG11中，并在25℃避光放置2天。最后，收集细胞并接种至补充有20μg/ml潮霉素和50μg/ml替卡西林二钠/克拉维酸钾(TIM，T0190，Duchefa)或头孢噻肟(C7039，Merck)的BG11琼脂平板上。避光放置2天后，将板暴露于光照。2-3周后，将20-30个群落铺板在具有20μg/ml潮霉素的新鲜BG11琼脂平板上。
普通小球藻转基因品系的选择与鉴定
为了鉴定携带表达构建体的克隆，从转化体群落中收集gDNA，如下。用无菌塑料枪头从琼脂平板上生长的群落刮下一些小球藻细胞，并放入10μl HotShot5裂解缓冲液(150mM NaOH，0.1mM EDTA，1％ Triton X-100)中。在RT孵育混合物10’，并在95℃煮沸15’。然后通过加入100μl H2O来稀释裂解物，1-5μl用作使用IT特异性寡核苷酸的PCR反应的模板。纳入野生型株作为阴性对照，对应的IT质粒(每个反应5ng)作为阳性对照。
总RNA提取(小球藻)
通过离心(Beckman转头JS5.3，5000g，15’，18℃)收获50至800ml液体小球藻培养物(5×106-1×107个细胞/ml)，在1×PBS中洗涤沉淀并在LN中快速冷冻。使用研钵和研杵在液氮中将冷冻颗粒研磨成细粉。根据制造商的说明，使用约100mg粉末，使用Tri-Reagent(Sigma，St.Louis，MO)进行总RNA提取。
小球藻EV级分的纯化
为了分离小球藻EV，采用了两种无细胞培养基浓度/纯化策略：通过离心浓缩(Pall macrosep 100kDa设备)或切向流过滤(Sartorius VivaFlow 50R 100kDa设备)。对于第一种方法，进一步离心在细胞分离后收集的BG11(Beckman转头JS5.3，5000g，10’，18℃)以消除所有残留细胞。然后根据制造商的说明使用Pall Macrosep100kDa设备(MAP100C37)过滤上清液。然后使回收的浓缩培养基(CM)通过0.45μm过滤器并储存于4℃，然后进行进一步的纯化步骤。对于第二种策略，进一步离心在细胞分离后收集的BG11(Beckman转头JA18，10000g，10’，4℃)并真空过滤至0.65μm Whatman纸过滤器上，以消除所有残留细胞。然后根据制造商的说明，使用Sartorius VivaFlow 50R 100kDa系统(VF05H4)过滤上清液。然后使回收的浓缩培养基(CM)通过0.45μm过滤器并用于纯化小球藻EV。从CM开始，通过在4℃、在Sorvall WX 80超速离心机(ThermoFischer)中以40,000g超速离心1小时来获得P40级分，以100000g获得P100级分。离心后，弃去上清液，将纯化的EV沉淀(来自P40或P100纯化)重悬于1ml过滤的1×PBS中，并使用0.22μm过滤器过滤。对于样品质量分析，使用纳米颗粒跟踪系统(ParticleMetrix ZetaView)处理了1/200的EV样品。为了估计样品中外泌体样EV的量，使用PKH26染料标记颗粒。
为了从150L PBR的无细胞细胞外培养基中回收P40级分，采用了改进的超滤和超速离心方案。首先，在Millipore玻璃纤维预过滤器AP25(2μm)上进行两轮真空过滤。然后以5000g(10’，4℃)离心样品，然后在MF-Millipore 0.65μm过滤器上进行第二次真空过滤，以消除仍存在于无细胞培养基中的悬浮有机物质。然后如上所述处理澄清的培养基，以通过离心过滤和超速离心纯化P40级分。
使用细菌上清液提高小球藻EV生产
稀释新鲜(最多4天)Wt小球藻培养物，并以≈5×105个细胞/ml分在3个不同的75cm2充气烧瓶中，培养物50ml。使烧瓶达到指数期的结束，在我们的条件下≈3/4天，2/4×106个细胞/ml，然后开始用细菌上清液处理。在汇合生长时从平板上刮下细菌，大肠杆菌K12、TOP10和Pto DC3000 Wt，将回收的沉淀重悬于300μl H2O中并称重，然后在95℃热灭活15’。通过离心将灭活的细菌旋转沉淀，并将上清液稀释至10μg沉淀/100μl的浓度。用细菌上清液处理小球藻培养物至终浓度为10μg/100ml，然后放回培养箱中，在标准条件(25℃，14/10光/暗，无振荡)下48小时。在孵育结束时，使用Malassez室对小球藻细胞进行计数，以验证处理不会影响细胞生长。然后，如上所述制备P100级分(Sartorius Vivaflow 50R100kDa)并通过NTA分析进行分析。
用PKH26或DiR染料标记EV
对于使用PKH26染料(Sigma)标记EV，将P40级分和含有相同体积BG11培养基的超速离心管用稀释剂C加至1ml。然后，根据制造商的方案将6μl PKH26染料添加至两管中。连续混合样品30”并孵育5’。在室温孵育后，加入2ml 1％ BSA的PBS溶液，并用BG11加至体积为8.5ml。在沉淀前，在超速离心管底部仔细形成1.5ml 0.931M葡萄糖溶液分层。在4℃以190000g超速离心样品2小时，并小心弃去所有上清液。在4℃以100000g用1×PBS洗涤所得沉淀30’。使标记的EV通过0.45μm过滤器进行注射器过滤，然后进一步处理(NTA分析或内化实验)。
对于DiR标记，制备染料在100％乙醇中的1mg/ml工作溶液，并将5μl该溶液加至1ml新鲜制备的P40级分中，终浓度为5μM。在37℃孵育样品1小时，然后在4℃以100000g离心30’。在4℃以100000g用1×PBS洗涤所得沉淀30’，以去除游离染料，最后重悬于1ml 1×PBS中。在使用前使标记的EV通过0.45μm过滤器。
气孔重新开放测定
植物(4/5周龄，8h/16h光/暗光周期)在进行任何处理之前保持在光照(100μE/m2/s)下至少3小时以确保气孔完全扩张。将完整的幼叶切片(每种条件至少6个)浸入水或细菌悬浮液中(浓度为108cfu/ml，OD600＝0.2)。在细菌感染前一小时，用EV(从≈10pM开始)或总RNA(20μg)处理切片。用细菌感染3小时后，用碘化丙啶(10ng/ml H2O溶液)标记叶切片10’，在H2O中洗涤5’，并在SP5激光扫描共聚焦显微镜下观察。对于每种条件，从不同的叶表面区域拍摄10-15张图片。从图片中，使用ImageJ 1.53c手动测量气孔以获得其宽度和长度，每个条件至少60个气孔。使用excel计算宽度/长度比，并使用双因素方差分析检验进行统计分析。
对于Mnase保护测定，在与叶切片孵育之前，通过在37℃、在存在或不存在300U/mlMnase的情况下孵育30’来处理样品。通过加入EGTA至终浓度为20mM来停止反应，然后使用样品进行气孔重新开放测定。
生成构建体以检测细菌细胞中的小RNA活性
为了检测来自总RNA提取物或纯化的EV样品中的小RNA活性，使用Green gate方法生成了功能获得的基于lacI的报告基因构建体。使用抑制质粒(repressilator plasmid)作为PCR扩增的模板将报告系统的所有元件克隆在不同的Green gate模块中(Elowitz&Leibler，2000)。该策略旨在在同一构建体中组装两个不同的盒：一个组成型表达LacI阻遏子，其在5’或3’末端融合至siRNA目标序列(盒C-F)，一个仅在没有LacI阻遏子的情况下表达GFP报告基因(盒A-B)。为此，克隆pLac(与RBS)启动子作为A模块，克隆不稳定化的GFPaav与tRrnB T1终止子作为B模块，组成型pNPTII启动子(与RBS)作为C模块，LacI-lite不稳定化阻遏子作为模块D和E，小RNA目标区域作为模块D和E，以及tRrnB T1终止子作为模块F。选择在LacI基因3’末端带有fusA目标区域的构建体R37，以使用lacI抑制剂IPTG测试大肠杆菌TOP10细胞中GFP诱导的动力学。
使用细菌报告系统检测小RNA活性
为了在细菌细胞中测试报告基因构建体，在37℃，180rpm将携带R37构建体的大肠杆菌TOP10细胞O/N接种于补充有50μg/ml大观霉素的LB中。第二天，通过将O/N培养物1:1000接种于新鲜培养基中，在相同条件下进行4-5小时的过日(overday)培养。在预培养结束时，测量OD600并连续稀释培养物以达到OD600＝0.02。将总共180μl稀释的培养物按两个技术重复放入96孔板中，以在TECAN Infinite 200Pro读板器中进行动力学。用含有不同IPTG浓度(1至0.001mM)(+IPTG条件)、25μg/ml氯霉素(背景对照)或用H2O稀释的LB(-IPTG条件)的20μl LB处理细胞。通过读板器中的特定滤光器的方式，在12-16小时动力学内在每个时间点(5’)同时测量OD600和GFP荧光。在动力学结束时，分析OD600值以确认细胞在时间过程中正确生长。如下对GFP荧光进行归一化：从对照氯霉素孔和-IPTG条件的平均值中减去+IPTG处理的技术重复的平均值。
小RNA测序和数据挖掘
通过构建了多达43个核苷酸的自定义文库并进行测序，所述文库用于对来自小球藻参考系IT20-3(IR cfa6/hrpL)的P100级分的总RNA和源自EV的RNA进行小RNA测序。使用UMI库v0.2.3(https://github.com/CGATOxford/UMI-tools)剪切读取衔接子。基于Q20的碱基判定(base-call)阈值(99％的碱基判定准确率)来过滤掉低质量的读取。为了表示由cfa6/hrpL发夹生产小RNA，我们选择了在10和25个核苷酸之间的读取大小子集，用于进一步分析和图形表示。使用bowtie将读取映射至IR cfa6/hrpL序列(Langmead等人，2009)，允许零错配。然后，我们使用内部R脚本从“.bam”文件中加载比对的读取，并使用GenomicAlignments包(https://github.com/Bioconductor/GenomicAlignments)表示cfa6/hrpL发夹两个末端的读取丰度。
小球藻EV的透射电子显微术观察
对于透射电子显微术，将一滴纯化的EV(2至10μl，109至1011个颗粒/ml)沉积在formvar/碳涂覆的网格上20’。孵育后，去除多余的样品，并在RT用2％多聚甲醛/1％戊二醛的0.1M PBS溶液(pH 7.4)固定网格20’。在H2O中洗涤1’六次后，用乙酸铀酰的甲基纤维素溶液(4％乙酸铀酰的H2O/甲基纤维素溶液，比例为1:9)增强样品衬度(contrast)10’。在孵育期结束时，去除多余的衬度并风干网格，然后进行可视化。在配备4k CCD相机的TecnaiSpirit电子显微镜(Thermo Fisher，Eindhoven，荷兰)上获取电子显微照片。
实施例2：小球藻微藻具有高度保守的EV生物发生因子以及与植物相关的EV因子
为了确定小球藻是否可以用作用于生产EV包埋和/或相关的小RNA的支架，我们首先研究了可能存在于其基因组或转录组中的EV生物发生及功能所需的核心成分。为此，我们使用多变小球藻NC64a、普通小球藻UTEX 395、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、人和拟南芥的可用基因组和转录组进行了计算机比较分析。该分析的结果揭示，多变小球藻编码ESCRT-I、ESCRT-II和ESCRT-III复合物以及植物FREE1/FYVE1样蛋白(一种植物特异性ESCRT，其对细胞内囊泡生物发生至关重要)的推定直系同源物(表1，Kolb等人，2015)。
表1：酵母、人、植物和小球藻中编码ESCRT复合物和其他微囊泡相关蛋白的因子的比较
√＝数个潜在候选物×＝非通过blast搜索鉴定*＝可能是同一转录本的一部分
通过分析普通小球藻UTEX 395转录组，我们还能够鉴定出EV生物发生涉及的大多数典型ESCRT因子。令人惊讶地，尽管在多变小球藻的转录组中检索到单个编码经典ESCRT-0相关蛋白(例如人STAM1/2)的转录本，我们没有在多变小球藻的基因组中鉴定出这种推定因子。然而，人和普通小球藻蛋白之间的低序列相似性表明，小球藻ESCRT-0复合物更可能由不同的且仍然未知的因子组成。另一个非常有趣的观察结果是小球藻基因组和转录组中明显没有四次穿膜蛋白：使用特定候选物(例如人CD63)或四次穿膜蛋白结构域(PF00335)针对pfam或JGI蛋白质结构域数据库的搜索未能鉴定出此类因子，已知此类因子存在于植物和哺乳动物两者中。在其他绿藻中也观察到没有四次穿膜蛋白(Wang等人，2012)，虽然认为该蛋白质家族存在于所有多细胞生物中，但在单细胞物种中，数据显示基因增益和损失的情况更复杂，需要进一步研究。相比之下，在小球藻中回收了潜在的ESCRT非依赖性EV生物发生因子，如Rab GTP酶(例如人Rab27a和Rab27b的直系同源物，其控制外泌体分泌的不同步骤(Ostrowski等人，2010))。此外，我们检索到了突触融合蛋白PENETRATION1(PEN1)的推定直系同源物，其最近被表征为拟南芥和本氏烟草(Nicotiana benthamiana)的外泌体标志物(Rutter&Innes，2017；Zhang等人，2020)。除了该因子之外，我们还能够鉴定出其他植物EV标志物的同源物，如HSP70和BRO/ALIX(表1)。
总体上，我们的数据表明小球藻微藻具有人、酵母和植物之间共有的保守的EV相关因子，但也具有迄今为止仅从植物基因组中回收的EV相关因子。它们还表明，相比于酵母或人，小球藻EV生物发生和功能的机制与植物的机制更密切相关。
实施例3：普通小球藻的细胞外培养基含有尺寸在50和200nm之间的EV
为了确定小球藻是否可以生产EV，并表征这些基于脂质的囊泡，我们接下来决定调整先前用于分离和纯化拟南芥叶质外体EV的方案(Rutter&Innes，2017；PCT/EP2019/072169、PCT/EP2019/072170)。简要地，首先使用100kDa MWCO Pall膜通过离心，或使用100kDa Sartorius VivaFlow 50R切向过滤装置，来浓缩来自烧瓶中生长的小球藻的无细胞培养基，以获得将用于EV纯化的浓缩培养基(30-50×)。如先前在拟南芥中报道的那样(Rutter&Innes，2017)，进一步在4℃以40000g的离心速度超速离心所得的浓缩培养基(称为“CM”)，以将小球藻EV与分泌的蛋白质/多糖分离。后一个纯化步骤导致回收称为“P40级分”的级分。可选地，还通过在4℃以100000g进行CM超速离心步骤来获得“P100级分”。这些级分的纳米颗粒跟踪分析(NTA)揭示了存在尺寸在50至350nm之间的颗粒群体，以及以120nm左右为中心的更离散且丰富的颗粒群体(图1A、图1B分别为P40和P100)。为了进一步确认这些结果并更深入地了解这些小球藻EV的形态，通过透射电子显微术(TEM)分析了P100级分。后一种分析揭示了存在具有明显脂质双层的圆形颗粒，形态与哺乳动物和植物EV相似(图1C，Rutter&Innes，2017；Zhang等人，2020；Noble等人，2020)。尺寸测量揭示了存在平均直径为～130nm的异质颗粒，表明通过NTA检测到的颗粒确实对应于小球藻EV(图1D)。用亲脂性染料PKH26进一步标记P40级分，PKH26使用脂肪族尾部锚定至脂质双层中(Fick等人，1995；Askenasy等人，2002)，经典用于标记哺乳动物外泌体以进行荧光成像(Chuo等人，2018)，揭示了尺寸超过200nm的绝大多数颗粒不是基于脂质的颗粒(图1E)。基于该荧光成像与TEM和NTA分析的结合，我们得出结论，可以从烧瓶的无细胞培养基中回收尺寸在50和200nm之间的小球藻EV。迄今为止，这些结果提供了支持无细胞培养基中存在小球藻EV的最先证据。
实施例4：小球藻细胞生产小RNA，表明该微藻中存在的RNAi机制具有功能在藻类和微藻中，已在来自数个不同谱系的几个物种(包括红藻门(Rhodophyta)、绿藻门(Chlorophyta)、定鞭藻门(Haptophyta)、不等鞭毛类(Stramenopiles)和沟鞭藻门(Dinoflagellata))中证明存在小RNA和/或RNAi活性(Cerutti等人，2011)。尽管小球藻基因组含有由单个DCL和AGO蛋白组成的简单RNAi机制(Cerrutti等人，2011)，我们发现所述蛋白在系统发育上与其植物对应物相关(图2A)，但目前没有证据表明该绿藻可以生产小的非编码RNA。为了测试该可能性，我们对从普通小球藻细胞提取的总RNA进行了小RNA测序(sRNA-seq)。作为对照，我们还使用了我们先前从拟南芥成长叶组织提取的总RNA生成的sRNA-seq数据集。非常有趣地，我们发现普通小球藻生产的主要小RNA群体的尺寸为18nt，这与通常从拟南芥和其他植物物种中回收的两种主要的21和24nt长的小RNA物种非常不同(图2B)。此外，我们注意到普通小球藻和拟南芥可以额外生产分别为15和16nt长的小RNA的小峰(图2B)。鉴于Dicer充当分子尺并以精确长度切割dsRNA底物，所述长度由PAZ和RNA酶III结构域之间的距离决定(Zhang等人，2004)，因此与植物DCL酶的结构相比，小球藻DCL酶的结构可能表现出不同的特征，其将有利于生产较短的小RNA物种。可选地或另外，从小球藻基因组和转录组检索到的其他RNA酶III酶(表2)或其他生物发生因子可能有助于该过程。总之，这些数据提供的证据表明，小球藻可以生产小RNA物种，其与先前在植物中报道的小RNA物种相比具有不同的尺寸等级。它们还表明小球藻配备有小RNA生物发生的功能机制。
表2：通过在多变小球藻和普通小球藻中blast搜索鉴定的推定RNA酶III和DCL样因子
*潜在地为同一转录本的一部分
实施例5：可以工程改造小球藻以生产具有抗菌活性的小RNA
先前的研究证明，外源施用小RNA和/或长dsRNA可以有效针对真核致病/寄生(微)生物，包括真菌、卵菌、昆虫和线虫(Ivashuta等人，2015；Wang等人，2016；Koch等人，2016；Wang&Jin，2017；Wang等人，2017)。还可以针对致病菌发生环境RNAi，其依赖于小RNA实体而不是长dsRNA(Singla-Rastogi&Navarro，PCT/EP2019/072169，PCT/EP2019/072170)。基于这些研究以及普通小球藻生产小RNA物种的能力(实施例4)，我们推断我们可以利用该生物系统来生产抗菌小RNA。为了测试该可能性，用反向重复(IR)转基因稳定转化普通小球藻，所述转基因与丁香假单胞菌番茄致病变种DC3000菌株(Pto DC3000)的两种主要毒力因子具有序列同源性，该菌株是一种革兰氏-阴性细菌，先前表明其对环境RNAi敏感(Singla-Rastogi&Navarro，PCT/EP2019/072169，PCT/EP2019/072170，图3A)。第一靶向毒力因子是冠菌酸聚酮合酶I(cfa6)基因，其编码植物毒素冠菌素(COR)的主要结构成分(Brooks等人，2004)。第二靶向毒力因子是hrpL，其编码一种替选的σ因子，已知该因子直接控制III型分泌系统相关基因的表达，并间接调节COR生物合成基因的表达(Fouts等人，2002；Sreedharan等人，2006)。有趣地，当在拟南芥中稳定表达时，IR-CFA6/HRPL反向重复被内源植物DCL有效地加工成抗Cfa6 siRNA和抗HrpL siRNA，其进而靶向Pto DC3000中的Cfa6和hrpL基因，从而导致抑制其致病性(Singla-Rastogi&Navarro，PCT/EP2019/072169，PCT/EP2019/072170)。重要地，在外源施用来自这些转基因植物的总RNA后，这些表型中的一些完全重现，所述转基因植物含有有效的抗cfa6和抗hrpL siRNA(Singla-Rastogi&Navarro，PCT/EP2019/072169，PCT/EP2019/072170)。特别是，外源应用这些RNA提取物抑制PtoDC3000触发气孔开放的能力，这是该细菌通过气孔进入并定植内叶组织的主要毒力反应(Melotto等人，2006；Singla-Rastogi&Navarro，PCT/EP2019/072169，PCT/EP2019/072170)。通过使用对抗Cfa6 siRNA和抗HrpL siRNA高度敏感的相同气孔重新开放读数，我们发现源自测试的表达IR-CFA6/HRPL转基因的五个独立小球藻IT20系的RNA提取物均抑制气孔重新开放事件(图3B)。重要地，这些表型与存在源自对照拟南芥IR-CFA6/HRPL#4植物的RNA提取物的情况下观察到的表型相当，模仿了响应无法产生COR的Pto DC3000突变菌株检测到的气孔重新开放受损表型(图3B)。此外，由于已知该表型依赖于抗cfa6 siRNA和抗hrpL siRNA，而不依赖于未加工的IR-CFA6/HRPL转录本(Singla-Rastogi&Navarro，PCT/EP2019/072169，PCT/EP2019/072170)，我们的数据表明小球藻IR-CFA6/HRPL系可能能够生产抗菌小RNA物种。因此，从小球藻IR-CFA6/HRPL IT20#3参考系回收了映射至IR-CFA6/HRPL反向转基因转录本的小RNA(图3C)。还值得注意的是，这些小RNA由反向重复转录本的cfa6和hrpL区域两者产生，对应于hrpL区域的小RNA的积累增强(图3C)。总体上，这些数据提供的证据表明，可以工程改造小球藻以生产表现出抗菌活性的小RNA。
实施例6：针对毒力因子hrpL的小球藻人工小RNA是抑制hrpL介导的气孔重新开放功能的原因
为了确定小球藻人工小RNA是否可能是观察到的抗菌活性的原因，我们接下来利用了先前描述的重组细菌，其表达hrpL基因的小RNA弹性(resilient)版本(Singla-Rastogi&Navarro，PCT/EP2019/072169，PCT/EP2019/072170)。该hrpL基因突变版本在小RNA靶向区域含有尽可能多的沉默突变，以改变抗hrpL小RNA与hrpL mRNA的结合，同时生产野生型HrpL蛋白。在质粒中克隆hrpL基因的突变和Wt版本两者，其在新霉素磷酸转移酶II(NPTII)启动子的控制下，并进一步转化Pto DC3000ΔhrpL菌株，所述菌株缺失hrpL基因，因此其重新打开气孔的能力完全损坏(Singla-Rastogi&Navarro，PCT/EP2019/072169，PCT/EP2019/072170，图4A)。值得注意的是，所得的重组细菌称为Pto DC3000ΔhrpL WThrpL和mut hrpL，先前表明其恢复了Pto DC3000ΔhrpL菌株重新打开气孔的能力，表明两种转基因均具有功能(Singla-Rastogi&Navarro，PCT/EP2019/072169，PCT/EP2019/072170)。随后在来自拟南芥IR-HRPL#4系或小球藻IT29#12、IT29#15系(其从小球藻基因组表达特异性靶向hrpL基因的IR-HRPL反向重复序列)的总RNA提取物的存在下，将这些重组细菌用于气孔重新开放测定。作为对照，我们使用Pto DC3000 Wt和ΔhrpL菌株以及来自IT19#7参考系的总RNA，所述IT19#7参考系从小球藻基因组表达IR-CYP51反向重复序列，该重复序列不与Pto DC3000基因组表现出序列同源性，而是靶向真菌植物病原体禾谷镰刀菌的三个细胞色素P450羊毛甾醇C-14α-去甲基化酶(CYP51)基因(Koch等人，2013)。我们发现，补充有hrpL Wt基因的细菌对源自两个独立的小球藻IT29#12和IT29#15系的RNA提取物敏感，但也对来自对照拟南芥IR-HRPL#4系的RNA提取物敏感，表现为这些细菌重新打开气孔的能力改变(图4B)。相比之下，这些重组细菌在源自小球藻IT19#7参考系的RNA提取物存在下重新打开气孔(图4B)，这支持抗hrpL小RNA在该现象中的特异性作用。重要地，我们发现补充有突变hrpL基因的细菌对源自两个独立的小球藻IT29系和对照拟南芥IR-HRPL#4系的RNA提取物具有完全抗性，允许正常的气孔重新开放表型(图4B)。后一组数据表明，气孔重新开放表型的抑制不是由于这些抗hrpL小RNA的潜在脱靶效应，而是由它们对hrpL转录本序列的靶向效应引起。它们还表明，由小球藻或拟南芥转基因系产生的抗hrpL小RNA是抑制hrpL介导的气孔重新开放功能的原因。因此，实施例5和6中报告的结果提供了概念验证，证明可以工程改造小球藻以序列特异性方式生产有效的抗菌小RNA。
实施例7：来自小球藻IR-CFA6/HRPL转基因系的EV表现出抗菌活性
先前研究报道，植物EV可以在真菌、卵菌和细菌细胞中递送具有生物活性的抗菌小RNA(Cai等人，2018；Teng等人，2018；Hou等人，2019；PCT/EP2019/072169,PCT/EP2019/072170)，从而降低所述细胞的致病性。为了研究该现象是否同样适用于小球藻EV包埋和/或相关的抗菌小RNA，我们首先从表达IR-CFA6/HRPL转基因的两个独立的小球藻IT20系收集无细胞培养基，并进一步使用超滤方法，其设计为保留30-90nm以上的颗粒。所得浓缩培养基(CM)相当于原始小球藻培养基的30-50倍浓缩，使用0.45μm灭菌过滤器对其进行额外过滤，以消除可能的源自超滤过程的细菌污染物。使用气孔重新开放测定进一步分析CM的抗菌活性，并将来自相应小球藻IT20细胞和来自拟南芥IR-CFA6/HRPL#4植物的RNA提取物纳入测定作为阳性对照。有趣地，来自两个独立的小球藻IT20系的CM抑制气孔重新开放事件，其程度与源自相同生产细胞或拟南芥IR-CFA6/HRPL#4植物的总RNA提取物相同(图5A)。这些结果表明，小球藻IT20系可以生产大于30-90nm的细胞外EV，其含有抗cfa6和/或抗hrpL小RNA。与这一想法一致，我们发现来自参考小球藻IT20#3系的P40级分完全有能力抑制Pto DC3000诱导的气孔重新开放，其程度与来自小球藻细胞或来自拟南芥IR-CFA6/HRPL#4植物的总RNA相同(图5B)。我们得出结论，来自小球藻IT20系的EV可能加载抗cfa6小RNA和抗hrpL小RNA和/或与其相关，这些小RNA必须被递送至Pto DC3000细胞中以触发检测到的抗菌作用。
我们先前表明了植物EV保护抗菌小RNA免受非特异性微球菌核酸酶(Mnase)介导的消化(Singla-Rastogi&Navarro，PCT/EP2019/072169，PCT/EP2019/072170)。在此，为了确定小球藻EV是否可以共有相似的特征，我们用Mnase处理IT20#3参考系的P40级分，并将其进一步用于气孔重新开放测定。更详细地，在37℃，在存在或不存在300U/ml Mnase的情况下孵育样品30’。在此孵育期结束时，加入终浓度为20mM的EGTA以抑制Mnase活性，并将样品进一步用于气孔重新开放测定。值得注意的是，我们发现像用作对照的未处理P40级分那样，用Mnase处理的P40级分仍然能够完全抑制Pto DC3000诱导的气孔重新开放(图5C)。
这些数据表明，当包埋在小球藻EV中和/或与其相关时，保护了抗cfa6小RNA和抗hrpL小RNA免受核糖核酸酶介导的消化。与该假设一致，我们能够通过sRNA-seq分析从小球藻IT20#3参考系生产的Mnase处理的EV样品中检测到抗cfa6小RNA和抗hrpL小RNA读取(图5D)。
基于这些总体结果，我们提出由小球藻IT20#3系生产的EV相关的抗cfa6小RNA和抗hrpL小RNA在囊泡内和/或在囊泡外，但可能与核糖核蛋白复合物相关，因此被保护免受RNA酶的影响。
实施例8：针对hrpL的小球藻EV包埋和/或相关的小RNA是抑制hrpL介导的气孔重新开放功能的原因
为了确认抗菌小RNA是生物活性货物，并比较P40和P100级分的抗菌潜力，我们使用实施例4中描述的Pto DC3000ΔhrpL Wt hrpL和Mut hrpL细菌进行了气孔重新开放测定。如先前所述的，从小球藻IT19#7(IR-CYP51)和IT29#12(IR-HRPL)参考系收集P40和P100级分，并用Mnase处理，使用未处理Pto DC3000 Wt和ΔhrpL菌株作为对照。如使用实施例4中的总RNA提取物所观察到的那样，只有补充有Wt hrpL基因的细菌对来自小球藻IT29#12参考系的EV敏感，P40和P100级分显示出相似的抗菌作用(图5E)。相比之下，这些重组细菌在源自小球藻IT19#7系的Mnase处理的P40和P100级分的存在下重新打开气孔(图5E)，这支持EV包埋和/或相关的抗hrpL小RNA的特异性作用。重要地，表达hrpL突变版本的重组细菌对由小球藻IT29#12参考系生产的Mnase处理的P40和P100级分介导的气孔重新开放作用的抑制完全不应(refractory)(图5B)。这些数据支持EV包埋和/或相关的抗hrpL小RNA在抑制Pto DC3000重新打开气孔的能力方面的因果作用。它们还表明，小球藻EV可能在PtoDC3000细胞中递送抗hrpL小RNA，以序列特异性方式靶向hrpL基因，从而抑制细菌触发的气孔重新开放。
实施例9：表达靶向来自农业相关植物病原体的必需因子和/或毒力因子的反向重复转基因的稳定小球藻系的生成
为了生产小球藻EV包埋和/或相关的小RNA，其最终可能用作针对农业相关植物病原体的基于RNA的生物防治剂，我们生成了反向重复构建体，其靶向的必需基因和/或关键毒力因子来自：细菌植物病原体苛养木杆菌、韧皮部杆菌亚洲种、丁香假单胞菌猕猴桃致病变种、丁香假单胞菌番茄致病变种、软腐欧文氏菌、青枯雷尔氏菌、野油菜黄单胞菌野油菜致病变种、野油菜黄单胞菌莴苣致病变种(Xanthomonas horturum pv.vitians)、柑橘黄单胞柑橘溃疡病菌、新缬草食酸菌、西瓜食酸菌；真菌植物病原体禾谷镰刀菌、灰葡萄孢、刺盘孢属物种、小麦叶枯病菌；卵菌植物病原体致病疫霉、葡萄生单轴霉；以及病毒植物病原体李痘病毒(PPV)。
以下IR构建体靶向苛养木杆菌基因(除了目标序列以外，它们含有SEQ ID NO：149的内含子)：
-IR-cheA/gaCA/tolC/pglA/engXCA1/engXCA2，SEQ ID NO：1-2；
-IR-cheA/GumH/GumD/XpsE/LesA/HolC，SEQ ID NO：3-4；
-IR-LesA/gumH/gumD，SEQ ID NO：5-6；
-IR-XpsE/HolC/LesA，SEQ ID NO：7-8；
-IR-cheA/pglA/LesA，SEQ ID NO：9-10；
-IR-cheA/engXCA1/engXCA2，SEQ ID NO：11-12；
-IR-gacA/pglA/engXCA2，SEQ ID NO：13-14；
-IR-cheA/tolC/engXCA1，SEQ ID NO：15-16。
以下IR构建体靶向韧皮部杆菌亚洲种基因(除了目标序列以外，它们含有SEQ IDNO：149的内含子)：
-IR-wp015452784/WP012778510/wp015452939/act56857/wp012778668，SEQ IDNO：55-56；
-IR-wp012778355/wp015452784/WP012778510，SEQ ID NO：57-58；
-IR-wp015452939/act56857/wp012778668NO，SEQ ID NO：59-60。
以下IR构建体靶向软腐欧文氏菌基因(除了目标序列以外，它们含有SEQ ID NO：149的内含子)：
-IR-GyrB/MreB/rbfA/RsgA/FliA/QseC，SEQ ID NO：47-48；
-IR-GyrB/rbfA/QseC，SEQ ID NO：49-50；
-IR-fliA/MreB/QseC NO，SEQ ID NO：51-52；
-IR-GyrB/MreB/RsgA NO，SEQ ID NO：53-54。
以下IR构建体靶向丁香假单胞菌猕猴桃致病变种基因(除了目标序列以外，它们含有SEQ ID NO：149的内含子)：
-IR-GyrB/Hfq/HrpR/HRPS/MreB/RpoD，SEQ ID NO：61-62；
-IR-GyrB/Hfq/MreB，SEQ ID NO：63-64；
-IR-HrpR/HrpS/Hfq，SEQ ID NO：65-66；
-IR-HrpR/GyrB/RpoD，SEQ ID NO：67-/148。
以下IR构建体靶向来自丁香假单胞菌番茄致病变种DC3000菌株的基因(除了目标序列以外，它们含有SEQ ID NO：149的内含子)：
-IR-CFA6/HRPL，SEQ ID NO：90-91；
-IR-HRPL，SEQ ID NO：92-93；
-IR-FusA，SEQ ID NO：136-137；
-IR-GyrB，SEQ ID NO：138-139；
-IR-FusA/GyrB，SEQ ID NO：140-141；
-IR-AvrPto/AvrPtoB，SEQ ID NO：94-95；
-IR-AvrPto/AvrPtoB/HopT1-1：SEQ ID NO：130-131
-IR-rpoB/rpoC/FusA，SEQ ID NO：132-133；
-IR-secE/rpoA/rplQ，SEQ ID NO：134-135；
-IR-secE，SEQ ID NO：142-143；
-IR-GyrB/hrpL，SEQ ID NO：144-145；
-IR-dnaA/dnaN/gyrB，SEQ ID NO：146-147。
以下IR构建体靶向来自青枯雷尔氏菌的基因(除了目标序列以外，它们含有SEQID NO：149的内含子)：
-IR-HRPG/HRPB/HRCC，SEQ ID NO：98-99；
-IR-HRPB/HRCC/TssB/XpsR，SEQ ID NO：100-101。
以下IR构建体靶向来自野油菜黄单胞菌野油菜致病变种的基因(除了目标序列以外，它们含有SEQ ID NO：149的内含子)：
-IR-HRPG/HRPX/RsmA，SEQ ID NO：102-103；
-IR-NadHb/NadHd/NadHe，SEQ ID NO：104-105；
-IR-DnaA/DnaE1/DnaE2，SEQ ID NO：106-107。
以下IR构建体靶向来自野油菜黄单胞菌莴苣致病变种的基因(除了目标序列以外，它们含有SEQ ID NO：149的内含子)：
-IR-GyrB，SEQ ID NO：17-18；
-IR-FusA，SEQ ID NO：19-20；
-IR-ZipA，SEQ ID NO：21-22；
-IR-GyrB/FusA/ZipA，SEQ ID NO：128-129。
以下IR构建体靶向来自柑橘黄单胞柑橘溃疡病菌的基因(除了目标序列以外，它们含有SEQ ID NO：149的内含子)：
-IR-GyrB/FusA/MreB/HrpG/PhoP/FhaB，SEQ ID NO：120-121；
-IR-GyrB/RbfA/MreB，SEQ ID NO：122-123；
-IR-HrpG/PhoP/FtsZ，SEQ ID NO：124-125；
-IR-FhaB/FusA/MreB，SEQ ID NO：126-127；
-IR-GyrB/FusA/ZipA，SEQ ID NO：128-129。
以下IR构建体靶向来自新缬草食酸菌的基因(除了目标序列以外，它们含有SEQID NO：149的内含子)：
-IR-rimM/rsgA/rbfA/MreB/gyrB/FtsZ，SEQ ID NO：23-24；
-IR-rimM/rbfA/FtsZ，SEQ ID NO：25-26；
-IR-RsgA/gyrB/MreB，SEQ ID NO：27-28；
-IR-RsgA/rbfA/FtsZ，SEQ ID NO：29-30。
以下IR构建体靶向来自西瓜食酸菌的基因(除了目标序列以外，它们含有SEQ IDNO：149的内含子)：
-IR-MreB/ybeY/rbfA/gyrB/FtsZ/rsgA：SEQ ID NO：31-32；
-IR-MreB/ybeY/rbfA：SEQ ID NO：33-34；
-IR-rsgA/gyrB/MreB：SEQ ID NO：35-36；
-IR-YbeY/RsgA/MreB：SEQ ID NO：37-38。
以下IR构建体靶向来自禾谷镰刀菌的基因(除了目标序列以外，它们含有SEQ IDNO：149的内含子)：
-IR-CYP51A/CYP51B/CYP51C：SEQ ID NO：96-97。
以下IR构建体靶向来自灰葡萄孢的基因(除了目标序列以外，它们含有SEQ IDNO：149的内含子)：
-IR-TOR/CGF1/DCL1/DCL2/LTF1/HBF1，SEQ ID NO：76-77；
-IR-TOR/DCL1/DCL2，SEQ ID NO：78-79；
-IR-CGF1/HBF1/LTF1，SEQ ID NO：80-81；
-IR-DCL1/HBF1/TOR，SEQ ID NO：82-83。
以下IR构建体靶向来自刺盘孢属物种的基因(除了目标序列以外，它们含有SEQID NO：149的内含子)：
-IR-CclA/ACS1/ACS2/ELP1/ELP2/MOB2，SEQ ID NO：84-85；
-IR-CclA/ACS1/ACS2，SEQ ID NO：86-87；
-IR-ELP1/ELP2/MOB2，SEQ ID NO：88-89。
以下IR构建体靶向来自小麦叶枯病菌的基因(除了目标序列以外，它们含有SEQID NO：149的内含子)：
-IR-Br1A2/StuA/F1bc/PKS1/PPT1，SEQ ID NO：108-109；
-IR-Br1A2/StuA/F1bc，SEQ ID NO：110-111；
-IR-StuA/PKS/PPT1，SEQ ID NO：112-113。
以下IR构建体靶向来自致病疫霉的基因(除了目标序列以外，它们含有SEQ IDNO：149的内含子)：
-IR-NPP1/INF1/GK4/piacwp1-1/piacwp1-2/piacwp1-3，SEQ ID NO：68-69；
-IR-piacwp1-1/piacwp1-2/piacwp1-3，SEQ ID NO：70-71；
-IR-GK4/INF1/NPP1，SEQ ID NO：72-73；
-IR-GK4/INF1/piacwp1-1，SEQ ID NO：74-75。
以下IR构建体靶向来自葡萄生单轴霉的基因(除了目标序列以外，它们含有SEQID NO：149的内含子)：
-IR-PITG_17947/PITG_10772/PITG_13671/PITG_16956/PITG_00891，SEQ ID NO：114-115；
-IR-PITG_17947/PITG_10772/PITG_13671，SEQ ID NO：116-117；
-IR-PITG_13671/PITG_16956/PITG_00891，SEQ ID NO：118-119。
以下IR构建体靶向来自李痘病毒(PPV)的基因(除了目标序列以外，它们含有SEQID NO：149的内含子)：
-IR-P1/HC-Pro/CP，SEQ ID NO：39-40；
-IR-P1，SEQ ID NO：41-42；
-IR-HC-Pro，SEQ ID NO：43-44；
-IR-CP，SEQ ID NO：45-46。
实施例10：设计并生成细菌小RNA报告基因以验证由小球藻参考系生产的P40级分批次的生物活性
为了验证由表达抗菌小RNA的小球藻转基因系生产的EV的生物活性，我们开发了工程改造细菌(包括大肠杆菌K12菌株)。当EV包埋和/或相关的小RNA被受体细胞内化时，预期这些报告系统会表现出差异性的报告基因表达。一种报告系统家族可以基于二分盒的质粒表达，所述二分盒由第一构建体和第二构建体组成，所述第一构建体表达转录阻遏子(即LacI-lite)的短寿命变体，在其5’或3’末端携带目的抗菌siRNA目标区域，所述第二构建体由GFP的中等稳定性变体组成(Andersen等人，1998；Elowitz&Leibler，2000)，其转录活性由pLac启动子指导并由lacO操纵子调节(图6A)。在没有EV包埋和/或相关的小RNA的情况下，LacI-lite蛋白应当在细菌中组成型产生，进而关闭GFP的表达，导致没有GFP荧光信号。相反，当给定的小RNA群体被细菌细胞内化并在其中发挥活性时，LacI-lite的沉默导致GFP表达的去抑制，导致检测到GFP荧光信号(图6A)。值得注意的是，LacI-lacO以外的其他系统也可以用于同一目的，如TetR-lite/tetO2或cI-lite/λPR系统。我们在目的质粒中将二分报告系统与适合在大肠杆菌和Pto DC3000中表达和复制的骨架组装在一起。在这两种情况下，我们在LacI-lite阻遏子的3’末端引入对Pto DC3000基因fusA具有特异性的小RNA目标序列，得到R37构建体。作为第一表征步骤，我们利用了异丙基β-d-1-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)直接抑制LacI蛋白的能力，以测试报告系统及其在细菌中转化后的敏感性。因此，我们用不同的IPTG浓度(10-3至1M)孵育了用R37构建体转化的大肠杆菌TOP10细菌细胞，并在15小时的动力学实验过程中连续测量OD600和GFP荧光。使用-IPTG和氯霉素对照对+IPTG条件的GFP荧光进行归一化，以便在去除背景信号后确定正确的诱导动力学。分析揭示了0.1mM的IPTG浓度足以在60’后触发GFP诱导，孵育约2-3小时后荧光开始急剧增加(图6B)。有趣地，如OD600测量所示，报告基因的存在和IPTG本身均不影响细菌在动力学过程中的生长速率(数据未显示)。在用R37构建体生成Pto DC3000兼容载体后，我们在该细菌植物病原体中进行了相同的IPTG测试。归一化GFP荧光揭示了报告系统具有活性，并从孵育2-3小时开始在该假单胞菌物种中也响应IPTG诱导(图6C)。然而，我们注意到与在大肠杆菌细胞中检测到的水平相比，总体GFP水平较低。
我们还工程改造了三种其他双报告系统，当EV包埋的siRNA被细菌细胞内化时，所述双报告系统表现出差异性的siRNA靶向报告基因表达。
第一报告系统家族依赖于基于质粒的盒的表达，所述盒由第一构建体和第二构建体组成，所述第一构建体组成型表达非靶向DsRed报告基因，其用作归一化的内部对照，所述第二构建体携带不稳定化的GFP报告基因，在其下游区域含有目的抗菌siRNA目标区域(图6D)。当在细菌(例如大肠杆菌)中表达时，在给定的EV包埋的siRNA群体被内化后，预测该系统会导致GFP表达和荧光信号特异性降低。
第二双报告系统家族基于三分盒(tripartite cassette)的质粒表达，所述三分盒由第一构建体、第二构建体和第三构建体组成，所述第一构建体表达转录阻遏子的短寿命变体(即TetR-lite)，在其下游区域携带目的抗菌siRNA目标区域，所述第二构建体由GFP的中等稳定性变体组成(Andersen等人，1998；Elowitz&Leibler，2000)，其转录活性由tetO2(或tetO1)操纵子控制，所述第三构建体表达非靶向DsRed报告基因，其作为归一化的内部对照(图6E)。在没有EV包埋的小RNA的情况下，TetR-lite蛋白应当在细菌中组成型产生，进而关闭GFP的表达，导致没有GFP荧光信号(应当仅检测到DsRed报告基因的荧光)。相反，当给定的siRNA群体被细菌细胞内化并在其中发挥活性时，TetR-lite的沉默导致GFP表达的去抑制，导致检测到GFP荧光信号。
第三报告系统家族依赖于基于质粒的二分盒的表达，所述二分盒由第一构建体和第二构建体组成，所述第一构建体表达转录阻遏子(即TetR-lite)的短寿命变体，在其下游区域携带目的抗菌siRNA目标区域，所述第二构建体由GFP的中等稳定性变体组成(Andersen等人，1998；Elowitz&Leibler，2000)或由生物发光报告基因(例如发光光杆状菌(Photorhabdus luminescens)操纵子luxCDABE(Meighen，1991))组成，其转录活性由tetO2(或tetO1)操纵子控制(图6F)。当给定的siRNA群体被细菌细胞内化并在其中发挥活性时，TetR-lite的沉默导致GFP或luxCDABE操纵子表达的去抑制，导致检测到GFP荧光信号或生物发光信号。值得注意的是，TetR-tetO2以外的其他系统也可以用于同一目的，如lacI-lite/lacO或cl-lite/λPR系统。
实施例11：在一升光生物反应器中生产的小球藻IR-CFA6/HRPL EV保持正态尺寸分布和生产速率
开发源自MIGS的应用的先决条件是验证在光生物反应器(PBR)中生产时小球藻EV保持其完整性。为了解决该问题，在连续光照条件下(270μmol/m2/s)在1L PBR中使表达IR-CFA6/HRPL转基因的参考小球藻转基因系IT20#3生长3.3天(图7A)。值得注意的是，该系的生长速率与在相同PBR条件下生长的野生型普通小球藻藻株的生长速度相当，表明反向重复转基因的表达似乎未改变该微藻的适应性(数据未显示)。这是与哺乳动物细胞系的一个重要区别，哺乳动物细胞系在通过RIG-I样受体(RLR)感应到长dsRNA后触发强效炎症反应(Fan&Jin，2019)。进一步收集来自以上小球藻IT20#3培养物的细胞外培养基，并使用低速离心方法从微藻细胞分离，以3000至4000g，10至15min离心两轮。使用实施例3所述的超滤和超速离心方法进一步纯化小球藻EV，并通过NTA分析所得P40级分。我们发现EV的尺寸分布与从烧瓶条件下生长的同一小球藻系中检索到的相似(数据未显示)。此外，当分析从烧瓶和PBR条件下回收的相当体积的无细胞培养基时，我们从1升收集的细胞外培养基中检测到相似数量的PKH26阳性外泌体样颗粒，范围为每ml 3.7×107至3.8×108个颗粒。这些数据表明，当在小型PBR中生产时，我们可以保持小球藻EV的正态尺寸分布和生产速率。
实施例12：可以相对容易地由150L PBR的细胞外培养基生产和纯化小球藻EV含有的抗菌小RNA，而不改变其产率、完整性和功能性。
接下来，我们想验证从几升生产(实验室)扩大至几m3(前工业)是否不会影响小球藻EV的产率和完整性。为了测试这一点，如实施例1中所详述的，我们使参考小球藻IT20#3系在150L PBR中生长(图7A)。NTA分析揭示，尽管原始样品中存在悬浮有机物质，但小球藻EV的尺寸分布很好地集中在直径150nm左右，～70％的样品尺寸范围在100和200nm之间，其余的在200nm以上(图7B)。进一步PKH26标记从150L PBR中回收的P40级分，然后在荧光模式下进行NTA分析，表现出的尺寸分布类似于在散射模式下对未标记的P40级分进行NTA分析时观察到的尺寸分布(图7B/C)。该结果表明从未标记的P40级分中检测到的颗粒可能是基于脂质的EV。有趣地，从5L无细胞培养基中获得的颗粒浓度相当高：3.3×1010个颗粒/ml，对应于～2.5ml中～60pM。相比之下，从数个烧瓶(～800ml无细胞培养基)获得的EV的生产通常在1ml中产生～0.5pM(3×108个颗粒/ml)。因此，在150L PBR中生产小球藻EV的产率是烧瓶中的～20倍。总体上，这些数据表明从150L PBR中回收的小球藻EV表现出正态尺寸分布。它们还表明即使在使用标准生长条件时，此类PBR中的EV产率也可以提高～20倍。因此，预计通过优化生长条件和随后的预过滤、过滤和纯化步骤，将相对容易地提高EV产率。
最后，我们评估了从150L PBR培养物获得的小球藻EV包埋和/或相关的小RNA的生物活性。为此，如实施例5中所述，我们在气孔重开测定中比较了来自不同生产系统(烧瓶、1L和150L PBR)的IT20#3(IR-CFA6/HRPL)和IT19#7(IR-CYP51)系的总RNA和P40级分。该比较分析揭示了来自小球藻IT20#3系的总RNA和P40级分具有相似的抗菌作用，抑制PtoDC3000触发的气孔重新开放，不依赖于采用的生产方法(图7D)。我们的结果因此提供了概念验证，证明可以相对容易地由150L PBR的细胞外培养基生产和纯化小球藻EV含有的抗菌小RNA，而不改变其产率、完整性和功能性。
实施例13：通过用来自热杀细菌的上清液处理小球藻培养物来优化EV的生产和/或分泌
我们的来自不同条件(烧瓶与PBR)下生长的小球藻培养物的数据表明，生长条件(如150L PBR中使用的条件)可以提高纯化EV的产率(实施例12)。除了生长条件以外，还有新数据表明非生物和生物胁迫可以促进由真核细胞生产和/或分泌EV(Collett等人，2018；Nakase等人，2021)。例如，表明了特定的温度条件或病毒感染会触发EV从细胞的释放增强(Bewicke等人，2017；Schatz等人，2017)。此外，在响应丁香假单胞菌感染时以及用水杨酸处理后，发现植物EV分泌增加(Rutter&Innes，2017)，水杨酸是一种植物激素，已知其促进针对(半)生体营养植物病原体的抗病性(Durrant&Dong，2004)。此外，我们检测到在响应细菌微生物或病原体相关分子模式(MAMP/PAMP)鞭毛蛋白肽flg22时，植物EV分泌和/或生物发生增加，模式识别受体(PRR)鞭毛蛋白感应因子2(FLS2)感应flg22并触发植物免疫信号传导(Gomez-Gomez&Boller，2000；Zipfel等人，2004；Navarro等人，2004；数据未显示)。为了确定小球藻EV的分泌和/或生物发生是否可以在响应生物胁迫时得到类似的增强，我们决定用早期稳定期的培养物进行研究,以获得足够的生物量并使生物胁迫对EV生产和/或释放的最终积极影响最大化。用来自热杀大肠杆菌K12 TOP10或Pto DC3000 Wt细胞的上清液进一步处理小球藻培养物，然后将其置于标准生长条件下，以避免同时施加多种胁迫的风险，这可能会改变小球藻的生长和/或EV的生产/分泌。使用来自热杀细菌细胞的上清液的基本原理是，它们应当含有分子混合物，包括MAMP/PAMP，其可以被仍未知的小球藻PRR感应，从而如在植物中所发现的那样导致EV生产和/或分泌增强。孵育2天后，我们对细胞和纯化的EV进行定量(图8A)。有趣地，尽管处理在孵育的2天内没有显著影响小球藻生长(数据未显示)，但与对照条件相比，使用任一细菌上清液处理后，检测到纯化EV的产率增加了5至7倍(图8B)。因此，这些生物胁迫可以用于增加小球藻EV的生产和/或分泌。鉴于可以容易地以具有成本效益的方式生产热杀细菌的上清液，我们的发现揭示了可能适合提高大型PBR中小球藻EV生产的有前景的条件。
参考书目
·Andersen,J.B.,Sternberg,C.,Poulsen,L.K.,Bjorn,S.P.,Givskov,M.,&Molin,S.(1998).New unstable variants of green fluorescent protein for studiesof transient gene expression in bacteria.Applied and environmentalmicrobiology,64(6),2240–2246.
·Askenasy,N.,&Farkas,D.L.(2002).Optical imaging of PKH-labeledhematopoietic cells in recipient bone marrow in vivo.Stem cells(Dayton,Ohio),20(6),501–513.
·Bai,L.L.,Yin,W.B.,Chen,Y.H.,Niu,L.L.,Sun,Y.R.,Zhao,S.M.,Yang,F.Q.,Wang,R.R.,Wu,Q.,Zhang,X.Q.,&Hu,Z.M.(2013).A new strategy to produce adefensin:stable production of mutated NP-1 in nitrate reductase-deficientChlorella ellipsoidea.PloS one,8(1),e54966.
·Baulcombe DC.(2015).VIGS,HIGS and FIGS:small RNA silencing in theinteractions of viruses or filamentous organisms with their plant hosts.CurrOpin Plant Biol.26,141-25 6.
·Bewicke-Copley,F.,Mulcahy,L.A.,Jacobs,L.A.,Samuel,P.,Akbar,N.,Pink,R.C.,&Carter,D.(2017).Extracellular vesicles released following heat stressinduce bystander effect in unstressed populations.Journal of extracellularvesicles,6(1),1340746.https://doi.org/10.1080/20013078.2017.1340746.
·Blanc,G.,Duncan,G.,Agarkova,I.,Borodovsky,M.,Gurnon,J.,Kuo,A.,Lindquist,E.,Lucas,S.,Pangilinan,J.,Polle,J.,Salamov,A.,Terry,A.,Yamada,T.,Dunigan,D.D.,Grigoriev,I.V.,Claverie,J.M.,&Van Etten,J.L.(2010).The Chlorellavariabilis NC64A genome reveals adaptation to photosymbiosis,coevolution withviruses,and cryptic sex.The Plant cell,22(9),2943–2955.
·Bolognesi,R.,Ramaseshadri,P.,Anderson,J.,Bachman,P.,Clinton,W.,Flannagan,R.,Ilagan,O.,Lawrence,C.,Levine,S.,Moar,W.,Mueller,G.,Tan,J.,Uffman,J.,Wiggins,E.,Heck,G.,&Segers,G.(2012).Characterizing the mechanism ofaction of double-stranded RNA activity against western corn rootworm(Diabrotica virgifera virgifera LeConte).PloS one,7(10),e47534.
·Broglie,K.E.,Cerf,D.C.,Herrmann,R.,Lu,A.L.,McGonigle,B.andPresnail,J.K.(2011).Composition and Methods for Insecticidial Control ofStinkbugs.CA 2 799453,WO 2011/153418
·Brooks,D.M.,Hernández-Guzmán,G.,Kloek,A.P.,Alarcón-Chaidez,F.,Sreedharan,A.,Rangaswamy,V.,-Vázquez,A.,Bender,C.L.,&Kunkel,B.N.(2004).Identification and characterization of a well-defined series ofcoronatine biosynthetic mutants of Pseudomonas syringae pv.tomatoDC3000.Molecular plant-microbe interactions:MPMI,17(2),162–174.
·Cai,Q.,Qiao,L.,Wang,M.,He,B.,Lin,F.M.,Palmquist,J.,Huang,S.D.,&Jin,H.(2018).Plants send small RNAs in extracellular vesicles to fungal pathogento silence virulence genes.Science(New York,N.Y.),360(6393),1126–1129.
·Campbell-Valois,F.X.,Schnupf,P.,Nigro,G.,Sachse,M.,Sansonetti,P.J.,&Parsot,C.(2014).A fluorescent reporter reveals on/off regulation of theShigella type IIIsecretion apparatus during entry and cell-to-cellspread.Cell host&microbe,15(2),177–189.
·Cerutti,H.,Ma,X.,Msanne,J.,&Repas,T.(2011).RNA-mediated silencingin Algae:biological roles and tools for analysis of gene function.Eukaryoticcell,10(9),1164–1172.
·Cha,T.S.,Yee,W.,&Aziz,A.(2012).Assessment of factors affectingAgrobacterium-mediated genetic transformation of the unicellular green alga,Chlorella vulgaris.World journal of microbiology&biotechnology,28(4),1771–1779.
·Chien,L.F.,Kuo,T.T.,Liu,B.H.,Lin,H.D.,Feng,T.Y.,Huang,C.C.(2012).Solar-to-bio H(2)production enhanced by homologous overexpression ofhydrogenase in green alga Chlorella sp.DT,Int.J.Hydrog.Energy 37(2012)17738–17748.
·Colao,I.L.,Corteling,R.,Bracewell,D.,&Wall,I.(2018).ManufacturingExosomes:A Promising Therapeutic Platform.Trends in molecular medicine,24(3),242–256.Dalakouras A,Jarausch W,Buchholz G,Bassler A,Braun M,Manthey T,KrczalG,Wassenegger M(2018)Delivery of hairpin RNAs and small RNAs into woody andherbaceous plants by trunk injection and petiole absorption.Front Plant Sci9:1253.
·Collett G.P.,Redman C.W.,Sargent I.L.,Vatish M.Endoplasmicreticulum stress stimulates the release of extracellular vesicles carryingdanger-associated molecular pattern(DAMP)molecules.Oncotarget.2018；9:6707-6717
·de Andrade,C.J.,de Andrade,L.M.(2017).An overview on theapplication of genus Chlorella in biotechnological processes.J Adv ResBiotech 2(1):1-9.
·Durrant WE,Dong X.Systemic acquired resistance.AnnuRevPhytopathol.2004；42:185-209.doi:10.1146/annurev.phyto.42.040803.140421.PMID:15283665.
·Elowitz,M.B.,&Leibler,S.(2000).A synthetic oscillatory network oftranscriptional regulators.Nature,403(6767),335–338.
·Escobar,M.A.,Civerolo,E.L.,Summerfelt,K.R.,Dandekar,A.M.(2001).RNAi-mediated oncogene silencing confers resistance to crown gall tumorogenesis.Proc.Natl.Acad.Sci.98:13437-13442.
·Fan,X.,&Jin,T.(2019).Structures of RIG-I-Like Receptors andInsights into Viral RNA Sensing.Advances in experimental medicine andbiology,1172,157–188.
·Fick,J.,Barker,F.G.,2nd,Dazin,P.,Westphale,E.M.,Beyer,E.C.,&Israel,M.A.(1995).The extent of heterocellular communication mediated by gapjunctions is predictive of bystander tumor cytotoxicity in vitro.Proceedingsof the National Academy of Sciences of the United States of America,92(24),11071–11075.
·Fouts,D.E.,Abramovitch,R.B.,Alfano,J.R.,Baldo,A.M.,Buell,C.R.,Cartinhour,S.,Chatterjee,A.K.,D'Ascenzo,M.,Gwinn,M.L.,Lazarowitz,S.G.,Lin,N.C.,Martin,G.B.,Rehm,A.H.,Schneider,D.J.,van Dijk,K.,Tang,X.,&Collmer,A.(2002).Genomewide identification of Pseudomonas syringae pv.tomatoDC3000promoters controlled by the HrpL alternative sigma factor.Proceedingsof the National Academy of Sciences of the United States of America,99(4),2275–2280.
·Gao,Z.,Wang,M.,Blair,D.,Zheng,Y.,&Dou,Y.(2014).Phylogeneticanalysis of the endoribonuclease Dicer family.PloS one,9(4),e95350.
·Ge Q,Filip L,Bai A,Nguyen T,Eisen HN,Chen J.Inhibition of influenzavirus production in virus-infected mice by RNA interference.Proc Natl AcadSci U S A.2004；101(23):8676-8681.doi:10.1073/pnas.0402486101.
·Gómez-Gómez L,Boller T.FLS2:an LRR receptor-like kinase involved inthe perception of the bacterial elicitor flagellin in Arabidopsis.MolCell.2000Jun；5(6):1003-11.doi:10.1016/s1097-2765(00)80265-8.PMID:10911994.
·Guarnieri,M.T.,Levering,J.,Henard,C.A.,Boore,J.L.,Betenbaugh,M.J.,Zengler,K.,&Knoshaug,E.P.(2018).Genome Sequence of the Oleaginous Green Alga,Chlorella vulgaris UTEX 395.Frontiers in bioengineering and biotechnology,6,37.https://doi.org/10.3389/fbioe.2018.00037.
·Guo,Z.,Li,Y.,&Ding,S.W.(2019).Small RNA-based antimicrobialimmunity.Nature reviews.Immunology,19(1),31–44.
·Herrmann,R.,Lassner,M.,Lu,A.L.,Nelson,M.,Presnail,J.K.and Rice,J.A.(2012).Compositions and methods for the suppression of target polynucleotidesfrom the family Aphididae.EP 2 405 013 A
·Hiruma,K.,Gerlach,N.,Sacristán,S.,Nakano,R.T.,Hacquard,S.,Kracher,B.,Neumann,U.,Ramírez,D.,Bucher,M.,O'Connell,R.J.,&Schulze-Lefert,P.(2016).Root Endophyte Colletotrichum tofieldiae Confers Plant Fitness Benefits thatAre Phosphate Status Dependent.Cell,165(2),464–474.
·Hou,Y.,Zhai,Y.,Feng,L.,Karimi,H.Z.,Rutter,B.D.,Zeng,L.,Choi,D.S.,Zhang,B.,Gu,W.,Chen,X.,et al.(2019).A Phytophthora Effector SuppressesTrans-Kingdom RNAi to Promote Disease Susceptibility.Cell Host Microbe25,153–165.e5
·Ivashuta,S.,Zhang,Y.,Wiggins,B.E.,Ramaseshadri,P.,Segers,G.C.,Johnson,S.,Meyer,S.E.,Kerstetter,R.A.,McNulty,B.C.,Bolognesi,R.,&Heck,G.R.(2015).Environmental RNAi in herbivorous insects.RNA(New York,N.Y.),21(5),840–850.
·Jones,JD.,Vance,RE.,Dangl,JL.(2016).Intracellular innate immunesurveillance devices in plants and animals.Science.354,DOI:10.1126/science.aaf6395.
·Kim,D.H.,Kim,Y.T.,Cho,J.J.,Bae,J.H.,Hur,S.B.,Hwang,I.,&Choi,T.J.(2002).Stable integration and functional expression of flounder growthhormone gene in transformed microalga,Chlorella ellipsoidea.Marinebiotechnology(New York,N.Y.),4(1),63–73.Koch A.,Kumar N.,Weber L.,Keller,H.,Imani J.,Kogel,KH.(2013)Host-induced gene silencing of cytochrome P450lanosterol C14α-demethylase-encoding genes confers strong resistance toFusarium species.Proc Natl Acad Sci U S A.110:19324-9.
·Koch,A.et al.Host-induced gene silencing of cytochrome P450lanosterol C14alpha-demethylase-encoding genes confers strong resistance toFusarium species.Proc Natl Acad Sci U S A 110,19324-9(2013).
·Koch,A.,Biedenkopf,D.,Furch,A.,Weber,L.,Rossbach,O.,Abdellatef,E.,Linicus,L.,Johannsmeier,J.,Jelonek,L.,Goesmann,A.,Cardoza,V.,McMillan,J.,Mentzel,T.,Kogel,KH.(2016).An RNAi-based control of Fusarium graminearuminfections through spraying of long dsRNAs involves a plant passage and iscontrolled by the fungal silencing machinery.PLoS Pathog.12:e1005901.
·Koch,A.,Kogel,KH.(2014).New wind in the sails:improving theagronomic value of crop plants through RNAi-mediated gene silencing.PlantBiotechnol J.12,821-31.30
·Kolb,C.,Nagel,M.K.,Kalinowska,K.,Hagmann,J.,Ichikawa,M.,Anzenberger,F.,Alkofer,A.,Sato,M.H.,Braun,P.,&Isono,E.(2015).FYVE1 isessential for vacuole biogenesis and intracellular trafficking inArabidopsis.Plant physiology,167(4),1361–1373.
·Lacombe,S.,Rougon-Cardoso,A.,Sherwood,E.,Peeters,N.,Dahlbeck,D.,vanEsse,HP.,Smoker,M.,Rallapalli,G.,Thomma,BP.,Staskawicz,B.,Jones,JD.,Zipfel,C.(2010).Interfamily transfer of a plant pattern-recognition receptor confersbroad-spectrum bacterial resistance.Nat.Biotechnol.28:365-9.
·Langmead,B.,Trapnell,C.,Pop,M.,Salzberg,S.L.,2009.Ultrafast andmemory-efficient alignment of short DNA sequences to the human genome.GenomeBiol.10,R25.
·Lin,H.D.,Liu,B.H.,Kuo,T.T.,Tsai,H.C.,Feng,T.Y.,Huang,C.C.,&Chien,L.F.(2013).Knockdown of PsbO leads to induction of HydA and production ofphotobiological H2 in the green alga Chlorella sp.DT.Bioresource technology,143,154–162.
·Mansfield,J.,Genin,S.,Magori,S.,Citovsky,V.,Sriariyanum,M.,Ronald,P.,Dow,M.,Verdier,V.,Beer,SV.,Machado,M.A.,Toth,I.,Salmond,G.,Foster,G.D.(2012).Top 10 plant pathogenic bacteria in molecular plant pathology.MolPlant Pathol.13:614-29.69
·Meighen E.A.(1991).Molecular biology of bacterialbioluminescence.Microbiological reviews,55(1),123–142.
·Melnyk,CW.,Molnar,A.,Baulcombe,DC.(2011).Intercellular and systemicmovement of RNA silencing signals.EMBO J.30,3553-63.
·Melotto M,Underwood W,Koczan J,Nomura K,He SY.Plant stomatafunction in innate immunity against bacterial invasion.Cell.2006；126(5):969-980.
·Micali,CO.,Neumann,U.,Grunewald,D.,Panstruga,R.,O’Connell.(2011).Biogenesis of a specialized plant-fungal interface during host cellinternalization of Golovinomyces orontii haustoria.Cell Microbiol.13,210-226.
·Michelmore,R.and Govindarajulu,M.(2012).Host-Induced gene silencingin vegetable species to provide durable disease resistance.WO2012/155109
·Michelmore,R.,Dubcovsky,J.,Govindarajulu and M.,Cantu,D.(2012).Disease-Resistance in cereals mediated by host-Induced genesilencing.WO2012/155112
·Mukherjee,K.,Campos,H.,&Kolaczkowski,B.(2013).Evolution of animaland plant dicers:early parallel duplications and recurrent adaptation ofantiviral RNA binding in plants.Molecular biology and evolution,30(3),627–641.
·Murphy D.,Dancis B.,Brown J.R.(2008).The evolution of core proteinsinvolved in microRNA biogenesis.BMC Evol.Biol.8:92.10.1186/1471-2148-8-92
·Nakase,I.,Ueno,N.,Matsuzawa,M.,Noguchi,K.,Hirano,M.,Omura,M.,Takenaka,T.,Sugiyama,A.,Bailey Kobayashi,N.,Hashimoto,T.,Takatani-Nakase,T.,Yuba,E.,Fujii,I.,Futaki,S.and Yoshida,T.(2021),Environmental pH stressinfluences cellular secretion and uptake of extracellular vesicles.FEBS OpenBio,11:753-767.https://doi.org/10.1002/2211-5463.13107.
·Navarro L,Zipfel C,Rowland O,Keller I,Robatzek S,Boller T,JonesJD.The transcriptional innate immune response to flg22.Interplay and overlapwith Avrgene-dependent defense responses and bacterial pathogenesis.PlantPhysiol.2004Jun；135(2):1113-28.doi:10.1104/pp.103.036749.Epub 2004 Jun4.PMID:15181213；PMCID:PMC514144.
·Navarro,L.and Singla-Rastogi,M.(2020).RNA-Based Biocontrol Methodsto Protect Plants Against Pathogenic Bacteria and/or Promote BeneficialEffects of Symbiotic and Commensal Bacteria.WO/2020/035619,PCT/EP2019/072169
·Navarro,L.and Singla-Rastogi,M.(2020).RNA-Based Therapeutic Methodsto Protect Animals Against Pathogenic Bacteria and/or Promote BeneficialEffects of Symbiotic and Commensal Bacteria.WO/2020/035620,PCT/EP2019/072170
·Niu,Y.F.,Zhang,M.H.,Xie,W.H.,Li,J.N.,Gao,Y.F.,Yang,W.D.,Liu,J.S.,&Li,H.Y.(2011).A new inducible expression system in a transformed green alga,Chlorella vulgaris.Genetics and molecular research:GMR,10(4),3427–3434.
·Noble JM,Roberts LM,Vidavsky N,Chiou AE,Fischbach C,Paszek MJ,Estroff LA,Kourkoutis LF.Direct comparison of optical and electron microscopymethods for structural characterization of extracellular vesicles.J StructBiol.2020 Apr1；210(1):107474.doi:10.1016/j.jsb.2020.107474.Epub 2020 Feb4.PMID:32032755；PMCID:PMC7067680.
·O'Brien,K.,Breyne,K.,Ughetto,S.,Laurent,L.C.,&Breakefield,X.O.(2020).RNA delivery by extracellular vesicles in mammalian cells and itsapplications.Nature reviews.Molecular cell biology,1–22.Advance onlinepublication.
·Ostrowski,M.,Carmo,N.B.,Krumeich,S.,Fanget,I.,Raposo,G.,Savina,A.,Moita,C.F.,Schauer,K.,Hume,A.N.,Freitas,R.P.,Goud,B.,Benaroch,P.,Hacohen,N.,Fukuda,M.,Desnos,C.,Seabra,M.C.,Darchen,F.,Amigorena,S.,Moita,L.F.,&Thery,C.(2010).Rab27a and Rab27b control different steps of the exosome secretionpathway.Nature cell biology,12(1),19–13.
·Run,C.,Fang,L.,Fan,J.,Fan,C.,Luo,Y.,Hu,Z.,Li,Y.(2016).Stablenuclear transformation of the industrial alga Chlorella pyrenoidosa,AlgalResearch 17(2016)196–201
·Rutter,B.D.,&Innes,R.W.(2017).Extracellular Vesicles Isolated fromthe Leaf Apoplast Carry Stress-Response Proteins.Plant physiology,173(1),728–741.
·Safi,C.,Zebib,B.,Merah,O.,Pontalier,P.-Y.,Vaca-Garcia,C.(2014).Morphology,composition,production,processing and applications of Chlorellavulgaris:A review.Renewable and Sustainable Energy Reviews,Volume 35,July2014,Pages 265-278.
·Schatz D,Rosenwasser S,Malitsky S,Wolf SG,Feldmesser E,VardiA.Communication via extracellular vesicles enhances viral infection of acosmopolitan alga.Nat Microbiol.2017 Nov；2(11):1485-1492.doi:10.1038/s41564-017-0024-3.Epub 2017 Sep 18.PMID:28924189.
·Singla-Rastogi,M.,Charvin,M.,Thiébeauld,O.,Perez-Quintero,A.L.,Ravet,A.,Fortunato,A.E.,Mendu,V.,Navarro,L.(2019).Plant Small RNA SpeciesDirect Gene Silencing in Pathogenic Bacteria as well as DiseaseProtection.bioRxiv 863902；
·Sreedharan,A.,Penaloza-Vazquez,A.,Kunkel,B.N.,&Bender,C.L.(2006).CorR regulates multiple components of virulence in Pseudomonas syringaepv.tomato DC3000.Molecular plant-microbe interactions:MPMI,19(7),768–779.
·Teng,Y.,Ren,Y.,Sayed,M.,Hu,X.,Lei,C.,Kumar,A.,Hutchins,E.,Mu,J.,Deng,Z.,Luo,C.,et al.(2018).Plant-Derived Exosomal MicroRNAs Shape the GutMicrobiota.Cell Host Microbe24,637–652.e8.
·Wang,M.,Thomas,N.,Jin,H.(2017).Cross-kingdom RNA trafficking andenvironmental RNAi for powerful innovative pre-and post-harvest plantprotection.Curr Opin Plant Biol.38:133-141.
·Wang,M.,Weiberg,Arne.,Lin FM.,Thomma,BPH.,Huang,HD.,Jin,H.(2016).Bidirectional cross-kingdom RNAi and fungal uptake of external RNAs conferplant protection.Nature plants.16151.
·Wang,Q.,Zhuang,X.,Mu,J.,Deng,Z.B.,Jiang,H.,Zhang,L.,Xiang,X.,Wang,B.,Yan,J.,Miller,D.,&Zhang,H.G.(2013).Delivery of therapeutic agents bynanoparticles made of grapefruit-derived lipids.Nature communications,4,1867.
·Wang F,Vandepoele K,Van Lijsebettens M.Tetraspanin genes inplants.Plant Sci.2012 Jul；190:9-15.doi:10.1016/j.plantsci.2012.03.005.Epub2012 Mar 23.PMID:22608515.
·Weiberg,A.,Bellinger,M.,Jin H.(2015).Conversations betweenkingdoms:small RNAs.Curr Opin Biotechnol.32,207-15.
·Weiberg,A.,Wang,M.,Lin,FM.,Zhao,H.,Zhang,Z.,Kaloshian,I.,Huang,HD.,Jin,H.5(2013).Fungal small RNAs suppress plant immunity by hijacking host RNAinterference pathways.Science.342,118-23.
·Whangbo,J.S.,&Hunter,C.P.(2008).Environmental RNAinterference.Trends in genetics:TIG,24(6),297–305.
·Yang,B.,Liu,J.,Liu,B.,Sun,P.,Ma,X.,Jiang,Y.,Wei,D.,Chen,F.(2015).Development of a stable genetic system for Chlorella vulgaris—a promisinggreen alga for CO2 biomitigation,Algal Res.12(2015)134–141.
·Zhang,J.,Qiu,Y.,&Xu,K.(2020).Characterization of GFP-AtPEN1 as amarker protein for extracellular vesicles isolated from Nicotiana benthamianaleaves.Plant signaling&behavior,15(9),1791519.
·Zhang,M.,Viennois,E.,Xu,C.,&Merlin,D.(2016).Plant derived ediblenanoparticles as a new therapeutic approach against diseases.Tissue barriers,4(2),e1134415.
·Zhang,R.,Lin,Y.(2009).DEG 5.0,a database of essential genes in bothprokaryotes and eukaryotes.Nucleic Acids Res.,37:D455-D458.
·Zhang,T.,Zhao,YL.,Zhao,JH.,Wang,S.,Jin,Y.,Chen,ZQ.,Fang,YY.,Hua,CL.,Ding,SW.,Guo,HS.(2016).Cotton plants export microRNAs to inhibitvirulence gene expression in a fungal pathogen.Nature Plants.
·Zhang H,Kolb FA,Jaskiewicz L,Westhof E,Filipowicz W.Singleprocessing center models for human Dicer and bacterial RNase III.Cell.2004Jul 9；118(1):57-68.doi:10.1016/j.cell.2004.06.017.PMID:15242644.
·Zipfel C,Robatzek S,Navarro L,Oakeley EJ,Jones JD,Felix G,BollerT.Bacterial disease resistance in Arabidopsis through flagellinperception.Nature.2004Apr 15；428(6984):764-7.doi:10.1038/nature02485.PMID:15085136.
·C.,Li,C.T.,Huelsman,T.,Levering,J.,Zielinski,D.C.,McConnell,B.O.,Long,C.P.,Knoshaug,E.P.,Guarnieri,M.T.,Antoniewicz,M.R.,Betenbaugh,M.J.,&Zengler,K.(2016).Genome-Scale Metabolic Model for the Green AlgaChlorella vulgaris UTEX 395 Accurately Predicts Phenotypes under Autotrophic,Heterotrophic,and Mixotrophic Growth Conditions.Plant physiology,172(1),589–602./>
序列表
<110> 免疫科技公司
国家科学研究中心
<120> 基于小球藻生产细胞外囊泡包埋的小RNA用于生物防治应用
<130> B380080 D40243
<150> EP20306016.5
<151> 2020-09-11
<160> 149
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 919
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> cheA/gaCA/tolC/pglA/engXCA1/engXCA2 dsRNA的第一臂的序列，
该dsRNA用于同时靶向来自苛养木杆菌的cheA、gaCA、tolC、pglA、
engXCA1、engXCA2基因和区域
<400> 1
atgaacgcac ttcgtgatgc gatgagccat gctgtgcttg gctgggtaaa gcctgatcta 60
gatgaagctt tgggccaagc acgccaggag attgagttat tcgttgagaa ccctgtagac 120
actagtcgga tactttcttg cgctgattag atcatgacta ttaagatttt tctgattgat 180
gatcatactc tcgtgcgtgt tggcatgaag atgatcttat ccaatgaatt agatctcgaa 240
gtgatagggg aagcggagac aggggaggcg gctttaccac agatccgtga gctacgcccg 300
aatatgcatg atccgccgct gcctcgcctt ggccgtgacc accgccctat ttcccgtcgt 360
ttcacaagcg acaaacctat tacaagtcta cgaaatggca cgcgctgctg accctcaatt 420
aagcgcagcc gaatccactc ggctatacag cgttgaagtg catgaacctt gaccgtttcc 480
tccccctagt gtttggactg cactgttttg ccgcaatggg cggcactgct gatgtctttc 540
gagtgtcaca gctgtcctca tcagatcttt ccgagccggt atcggtgaaa acgctatggg 600
gcgaggtgca aaagctggcc tccgccatgt acggtggaac ggtgggtgca caaaatgcag 660
tgtctgatac tcactttgtt gaaccactcc gcggcgttaa ctggcgtggt ttggaaacgg 720
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caaacacttc ggcaaactca tgttggccac gtgcctatcc ttatctgcgg caccagcatt 840
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gggcgtcaac tggtttggt 919
<210> 2
<211> 919
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> cheA/gaCA/tolC/pglA/engXCA1/engXCA2 dsRNA的第二臂的序列，
该dsRNA用于同时靶向来自苛养木杆菌的cheA、gaCA、tolC、pglA、
engXCA1、engXCA2基因和区域
<400> 2
accaaaccag ttgacgcccc ttaattggat ttggttgcct ttgtcatcga cgaccttccc 60
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gagtttgccg aagtgtttgg aaaacgacat tggacttcac gccagggacg ttgatttaaa 180
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gccagctttt gcacctcgcc ccatagcgtt ttcaccgata ccggctcgga aagatctgat 360
gaggacagct gtgacactcg aaagacatca gcagtgccgc ccattgcggc aaaacagtgc 420
agtccaaaca ctagggggag gaaacggtca aggttcatgc acttcaacgc tgtatagccg 480
agtggattcg gctgcgctta attgagggtc agcagcgcgt gccatttcgt agacttgtaa 540
taggtttgtc gcttgtgaaa cgacgggaaa tagggcggtg gtcacggcca aggcgaggca 600
gcggcggatc atgcatattc gggcgtagct cacggatctg tggtaaagcc gcctcccctg 660
tctccgcttc ccctatcact tcgagatcta attcattgga taagatcatc ttcatgccaa 720
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catcacgaag tgcgttcat 919
<210> 3
<211> 1073
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> cheA/GumH/GumD/XpsE/LesA/HolC dsRNA的第一臂的序列，该dsRNA用于同时靶向来自苛养木杆菌的cheA、GumH、GumD、Xpse、LesA、HolC基因和区域
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atgaacgcac ttcgtgatgc gatgagccat gctgtgcttg gctgggtaaa gcctgatcta 60
gatgaagctt tgggccaagc acgccaggag attgagttat tcgttgagaa ccctgtagac 120
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gagtgtcaca gctgtcctca tcagatcttt ccgagccggt atcggtgaaa acgctatggg 600
gcgaggtgca aaagcgtgga aaataggaat aacgacaata cgttgttgtg cgttgttggc 660
ggaagtatga atgtaagtat ggaagcatcc atcgttgagt cgttgttgca gcgtcgttgc 720
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<210> 4
<211> 1073
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> cheA/GumH/GumD/XpsE/LesA/HolC dsRNA的第二臂的序列，该dsRNA用于同时靶向来自苛养木杆菌的cheA、GumH、GumD、Xpse、LesA、HolC基因和区域
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<210> 5
<211> 758
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<220>
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<210> 6
<211> 758
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> LesA/GumH/GumD dsRNA的第二臂的序列，该dsRNA用于同时靶向来自苛养木杆菌的LesA、GumH、GumD基因和区域
<400> 6
gccaactgcg atacaacggg aaaaaagaaa aacaaatcac cgaatacaat aacgtgttac 60
caatagcaat acgatatgtg gccgttaaca tccaattacc aaacaacaat ctgtaaatca 120
gtacaccaga cagcaccacc attgttagat caaaaacacg aagtattaga tcagcggcag 180
cagaatattt cgacaataac cgcggtgaag aagcaatatc agtaacactg ttcagatctg 240
ccagaagcat gcatacatac tcaacactcc tggtgccaat ggataacgcg aagaaccacg 300
ataaccaatg cgctggatcg acacaccctg atacttatca gtacatggaa gtagaacatc 360
agactgagta aatactcggt tcaacgtcac aacatcaaca ccgattccag catgcaaatg 420
cagctgcatc gcaatattga agaccacatc ctccatccca ccaattgacg gatgaaattg 480
acgaacaaca tgcaccactt tcatgatcgt tcaccaacca caccaaccgt tgtatacgtc 540
atttcaacca ctcgaacgtt gcatttgggt tgctcggatg gcggctcatc agtaagcaga 600
gcagcaatct gacgctgcgt atagctacca ataatttttc tgttaatcac catcccacgt 660
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<210> 7
<211> 758
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> XpsE/HolC/LesA dsRNA的第一臂的序列，该dsRNA用于同时靶向来自苛养木杆菌的XpsE、HolC、LesA基因和区域
<400> 7
gtggaaaata ggaataacga caatacgttg ttgtgcgttg ttggcggaag tatgaatgta 60
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ctgtatcgtg cgcgtcagtt gcaggccgaa tccggtgttg ggttgttacc tttgttgggc 180
cgtcttggtt tggtttctga gcgcgatcac gctgaagtat gtgcggaggt gatggggctg 240
ttgttgatac gatcatggca cgcgccgact tctatttgat tgccaaaccg cgctttcttg 300
agaaaccgct gcaattagtc tgcgaattag tccgcaaagc ctacgacacc catcagccca 360
cactgattct ggcccgcgac caggcccagg ccgaagcact ggatgaccta ctgtgggcgt 420
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cccccgtatt gattgccacc ccggatgcat gatgtatggt tctcaacgaa aaccggtgct 540
tcttatcctg agttacttta tttttatctg tgctctgttc ccctgtgttg cagctgcttg 600
gccttcacgt gggatggtga ttaacagaaa aattattggt agctatacgc agcgtcagat 660
tgctgctctg cttactgatg agccgccatc cgagcaaccc aaatgcaacg ttcgagtggt 720
tgaaatgacg tatacaacgg ttggtgtggt tggtgaac 758
<210> 8
<211> 758
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> XpsE/HolC/LesA dsRNA的第二臂的序列，该dsRNA用于同时靶向来自苛养木杆菌的XpsE、HolC、LesA基因和区域
<400> 8
gttcaccaac cacaccaacc gttgtatacg tcatttcaac cactcgaacg ttgcatttgg 60
gttgctcgga tggcggctca tcagtaagca gagcagcaat ctgacgctgc gtatagctac 120
caataatttt tctgttaatc accatcccac gtgaaggcca agcagctgca acacagggga 180
acagagcaca gataaaaata aagtaactca ggataagaag caccggtttt cgttgagaac 240
catacatcat gcatccgggg tggcaatcaa tacgggggtg atgtcgtcgt cttcgtcgct 300
gccagcgatt tggtggggga tgtaggcgtc cgggtcgaac gcccacagta ggtcatccag 360
tgcttcggcc tgggcctggt cgcgggccag aatcagtgtg ggctgatggg tgtcgtaggc 420
tttgcggact aattcgcaga ctaattgcag cggtttctca agaaagcgcg gtttggcaat 480
caaatagaag tcggcgcgtg ccatgatcgt atcaacaaca gccccatcac ctccgcacat 540
acttcagcgt gatcgcgctc agaaaccaaa ccaagacggc ccaacaaagg taacaaccca 600
acaccggatt cggcctgcaa ctgacgcgca cgatacagat cactttcttt caagcaacga 660
cgctgcaaca acgactcaac gatggatgct tccatactta cattcatact tccgccaaca 720
acgcacaaca acgtattgtc gttattccta ttttccac 758
<210> 9
<211> 759
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CheA/pglA/LesA dsRNA的第一臂的序列，该dsRNA用于同时靶向来自苛养木杆菌的CheA、pglA、lesA基因和区域
<400> 9
tgaacgcact tcgtgatgcg atgagccatg ctgtgcttgg ctgggtaaag cctgatctag 60
atgaagcttt gggccaagca cgccaggaga ttgagttatt cgttgagaac cctgtagaca 120
ctagtcggat actttcttgc gctgattacc tgcatcaggt gcagggtacc ttgcgaatgc 180
ttgaattata tgctcccgca atggtggccg aggaaatgga acggctagct aaggtgatgc 240
aagtcgatgg gatcatgaac cttgaccgtt tcctccccct agtgtttgga ctgcactgtt 300
ttgccgcaat gggcggcact gctgatgtct ttcgagtgtc acagctgtcc tcatcagatc 360
tttccgagcc ggtatcggtg aaaacgctat ggggcgaggt gcaacgtccc agcctaccta 420
cccacgtgtg tacggtattg cctgcgcgcc tgactcctaa acatggctcc attgacgcac 480
tcgatgccaa tccaaaggtt tccaaatgca tgatgtatgg ttctcaacga aaaccggtgc 540
ttcttatcct gagttacttt atttttatct gtgctctgtt cccctgtgtt gcagctgctt 600
ggccttcacg tgggatggtg attaacagaa aaattattgg tagctatacg cagcgtcaga 660
ttgctgctct gcttactgat gagccgccat ccgagcaacc caaatgcaac gttcgagtgg 720
ttgaaatgac gtatacaacg gttggtgtgg ttggtgaac 759
<210> 10
<211> 759
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CheA/pglA/LesA dsRNA的第二臂的序列，该dsRNA用于同时靶向来自苛养木杆菌的CheA、pglA、lesA基因和区域
<400> 10
gttcaccaac cacaccaacc gttgtatacg tcatttcaac cactcgaacg ttgcatttgg 60
gttgctcgga tggcggctca tcagtaagca gagcagcaat ctgacgctgc gtatagctac 120
caataatttt tctgttaatc accatcccac gtgaaggcca agcagctgca acacagggga 180
acagagcaca gataaaaata aagtaactca ggataagaag caccggtttt cgttgagaac 240
catacatcat gcatttggaa acctttggat tggcatcgag tgcgtcaatg gagccatgtt 300
taggagtcag gcgcgcaggc aataccgtac acacgtgggt aggtaggctg ggacgttgca 360
cctcgcccca tagcgttttc accgataccg gctcggaaag atctgatgag gacagctgtg 420
acactcgaaa gacatcagca gtgccgccca ttgcggcaaa acagtgcagt ccaaacacta 480
gggggaggaa acggtcaagg ttcatgatcc catcgacttg catcacctta gctagccgtt 540
ccatttcctc ggccaccatt gcgggagcat ataattcaag cattcgcaag gtaccctgca 600
cctgatgcag gtaatcagcg caagaaagta tccgactagt gtctacaggg ttctcaacga 660
ataactcaat ctcctggcgt gcttggccca aagcttcatc tagatcaggc tttacccagc 720
caagcacagc atggctcatc gcatcacgaa gtgcgttca 759
<210> 11
<211> 758
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> cheA/engXCA1/engXCA2 dsRNA的第一臂的序列，该dsRNA用于同时靶向来自苛养木杆菌的cheA、engXCA1、engXCA2基因和区域
<400> 11
tgaacgcact tcgtgatgcg atgagccatg ctgtgcttgg ctgggtaaag cctgatctag 60
atgaagcttt gggccaagca cgccaggaga ttgagttatt cgttgagaac cctgtagaca 120
ctagtcggat actttcttgc gctgattacc tgcatcaggt gcagggtacc ttgcgaatgc 180
ttgaattata tgctcccgca atggtggccg aggaaatgga acggctagct aaggtgatgc 240
aagtcgatgg gatcgtggcc tccgccatgt acggtggaac ggtgggtgca caaaatgcag 300
tgtctgatac tcactttgtt gaaccactcc gcggcgttaa ctggcgtggt ttggaaacgg 360
cgcagcacct gccgcaaggt ttaaatcaac gtccctggcg tgaagtactc gaccaaatgc 420
agagcctagg cattaacgca atacgcctgc ccctgtgctc ggacacccta catggcgcca 480
tgcctaccaa tctggatcta gtgcatgcat gtcgttttcc aaacacttcg gcaaactcat 540
gttggccacg tgcctatcct tatctgcggc accagcattc agttacagca tcagtcacgg 600
gaaggtcgtc gatgacaaag gcaaccaaat ccaattaagg ggcgtcaact ggtttggttt 660
tgaaaccgga gatcatgtgg taaatggact atgggcacgt aattggaaag aattcatcac 720
acagctacag ggcatgggat tcaacgcgat acgtttac 758
<210> 12
<211> 758
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> cheA/engXCA1/engXCA2 dsRNA的第二臂的序列，该dsRNA用于同时靶向来自苛养木杆菌的cheA、engXCA1、engXCA2基因和区域
<400> 12
gtaaacgtat cgcgttgaat cccatgccct gtagctgtgt gatgaattct ttccaattac 60
gtgcccatag tccatttacc acatgatctc cggtttcaaa accaaaccag ttgacgcccc 120
ttaattggat ttggttgcct ttgtcatcga cgaccttccc gtgactgatg ctgtaactga 180
atgctggtgc cgcagataag gataggcacg tggccaacat gagtttgccg aagtgtttgg 240
aaaacgacat gcatgcacta gatccagatt ggtaggcatg gcgccatgta gggtgtccga 300
gcacaggggc aggcgtattg cgttaatgcc taggctctgc atttggtcga gtacttcacg 360
ccagggacgt tgatttaaac cttgcggcag gtgctgcgcc gtttccaaac cacgccagtt 420
aacgccgcgg agtggttcaa caaagtgagt atcagacact gcattttgtg cacccaccgt 480
tccaccgtac atggcggagg ccacgatccc atcgacttgc atcaccttag ctagccgttc 540
catttcctcg gccaccattg cgggagcata taattcaagc attcgcaagg taccctgcac 600
ctgatgcagg taatcagcgc aagaaagtat ccgactagtg tctacagggt tctcaacgaa 660
taactcaatc tcctggcgtg cttggcccaa agcttcatct agatcaggct ttacccagcc 720
aagcacagca tggctcatcg catcacgaag tgcgttca 758
<210> 13
<211> 759
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> gacA/pglA/engXCA2 dsRNA的第一臂的序列，该dsRNA用于同时靶向来自苛养木杆菌的gacA、pglA、engXCA2基因和区域
<400> 13
atgactatta agatttttct gattgatgat catactctcg tgcgtgttgg catgaagatg 60
atcttatcca atgaattaga tctcgaagtg ataggggaag cggagacagg ggaggcggct 120
ttaccacaga tccgtgagct acgcccgaat gtcgtattgt gtgacatgca tctccctggg 180
gtgagtgggc tggagattac agaaaaattg gtgaaaggga attatggtag ccgtgtaatt 240
attgtttcgg gatcatgaac cttgaccgtt tcctccccct agtgtttgga ctgcactgtt 300
ttgccgcaat gggcggcact gctgatgtct ttcgagtgtc acagctgtcc tcatcagatc 360
tttccgagcc ggtatcggtg aaaacgctat ggggcgaggt gcaacgtccc agcctaccta 420
cccacgtgtg tacggtattg cctgcgcgcc tgactcctaa acatggctcc attgacgcac 480
tcgatgccaa tccaaaggtt tccaaatgca tgtcgttttc caaacacttc ggcaaactca 540
tgttggccac gtgcctatcc ttatctgcgg caccagcatt cagttacagc atcagtcacg 600
ggaaggtcgt cgatgacaaa ggcaaccaaa tccaattaag gggcgtcaac tggtttggtt 660
ttgaaaccgg agatcatgtg gtaaatggac tatgggcacg taattggaaa gaattcatca 720
cacagctaca gggcatggga ttcaacgcga tacgtttac 759
<210> 14
<211> 759
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> gacA/pglA/engXCA2 dsRNA的第二臂的序列，该dsRNA用于同时靶向来自苛养木杆菌的gacA、pglA、engXCA2基因和区域
<400> 14
gtaaacgtat cgcgttgaat cccatgccct gtagctgtgt gatgaattct ttccaattac 60
gtgcccatag tccatttacc acatgatctc cggtttcaaa accaaaccag ttgacgcccc 120
ttaattggat ttggttgcct ttgtcatcga cgaccttccc gtgactgatg ctgtaactga 180
atgctggtgc cgcagataag gataggcacg tggccaacat gagtttgccg aagtgtttgg 240
aaaacgacat gcatttggaa acctttggat tggcatcgag tgcgtcaatg gagccatgtt 300
taggagtcag gcgcgcaggc aataccgtac acacgtgggt aggtaggctg ggacgttgca 360
cctcgcccca tagcgttttc accgataccg gctcggaaag atctgatgag gacagctgtg 420
acactcgaaa gacatcagca gtgccgccca ttgcggcaaa acagtgcagt ccaaacacta 480
gggggaggaa acggtcaagg ttcatgatcc cgaaacaata attacacggc taccataatt 540
ccctttcacc aatttttctg taatctccag cccactcacc ccagggagat gcatgtcaca 600
caatacgaca ttcgggcgta gctcacggat ctgtggtaaa gccgcctccc ctgtctccgc 660
ttcccctatc acttcgagat ctaattcatt ggataagatc atcttcatgc caacacgcac 720
gagagtatga tcatcaatca gaaaaatctt aatagtcat 759
<210> 15
<211> 759
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> cheA/tolC/engXCA1 dsRNA的第一臂的序列，该dsRNA用于同时靶向来自苛养木杆菌的cheA、tolC、engXCA1基因和区域
<400> 15
tgaacgcact tcgtgatgcg atgagccatg ctgtgcttgg ctgggtaaag cctgatctag 60
atgaagcttt gggccaagca cgccaggaga ttgagttatt cgttgagaac cctgtagaca 120
ctagtcggat actttcttgc gctgattacc tgcatcaggt gcagggtacc ttgcgaatgc 180
ttgaattata tgctcccgca atggtggccg aggaaatgga acggctagct aaggtgatgc 240
aagtcgatgg gatcatgatc cgccgctgcc tcgccttggc cgtgaccacc gccctatttc 300
ccgtcgtttc acaagcgaca aacctattac aagtctacga aatggcacgc gctgctgacc 360
ctcaattaag cgcagccgaa tccactcggc tatacagcgt tgaagggcaa gttcaggcac 420
gtgcagcgct gctgccgcag atgagcggca cagccaccct ggcacgtagc cgcactgaat 480
acgacggtat cagcggatca gccatatgcg tggcctccgc catgtacggt ggaacggtgg 540
gtgcacaaaa tgcagtgtct gatactcact ttgttgaacc actccgcggc gttaactggc 600
gtggtttgga aacggcgcag cacctgccgc aaggtttaaa tcaacgtccc tggcgtgaag 660
tactcgacca aatgcagagc ctaggcatta acgcaatacg cctgcccctg tgctcggaca 720
ccctacatgg cgccatgcct accaatctgg atctagtgc 759
<210> 16
<211> 759
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> cheA/tolC/engXCA1 dsRNA的第二臂的序列，该dsRNA用于同时靶向来自苛养木杆菌的cheA、tolC、engXCA1基因和区域
<400> 16
gcactagatc cagattggta ggcatggcgc catgtagggt gtccgagcac aggggcaggc 60
gtattgcgtt aatgcctagg ctctgcattt ggtcgagtac ttcacgccag ggacgttgat 120
ttaaaccttg cggcaggtgc tgcgccgttt ccaaaccacg ccagttaacg ccgcggagtg 180
gttcaacaaa gtgagtatca gacactgcat tttgtgcacc caccgttcca ccgtacatgg 240
cggaggccac gcatatggct gatccgctga taccgtcgta ttcagtgcgg ctacgtgcca 300
gggtggctgt gccgctcatc tgcggcagca gcgctgcacg tgcctgaact tgcccttcaa 360
cgctgtatag ccgagtggat tcggctgcgc ttaattgagg gtcagcagcg cgtgccattt 420
cgtagacttg taataggttt gtcgcttgtg aaacgacggg aaatagggcg gtggtcacgg 480
ccaaggcgag gcagcggcgg atcatgatcc catcgacttg catcacctta gctagccgtt 540
ccatttcctc ggccaccatt gcgggagcat ataattcaag cattcgcaag gtaccctgca 600
cctgatgcag gtaatcagcg caagaaagta tccgactagt gtctacaggg ttctcaacga 660
ataactcaat ctcctggcgt gcttggccca aagcttcatc tagatcaggc tttacccagc 720
caagcacagc atggctcatc gcatcacgaa gtgcgttca 759
<210> 17
<211> 799
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> gyrB dsRNA的第一臂的序列，该dsRNA用于同时靶向来自葡萄黄单胞菌的促旋酶B亚基基因
<400> 17
atgaccgaag atcaaacacc ccgaccacac ccaacagcac ctacgattcc agcaagatca 60
ccgtgctgcg tggcctggaa gccgtccgca agcgccccgg catgtacatc ggcgatgtcc 120
atgacggcac cggcctgcat cacatggtgt tcgaggtggt cgacaactcg gtcgacgagg 180
ccctggccgg ccatgccgac gacatcgtgg tcaagatcct ggtcgatggc tcggtcgccg 240
tgtcggataa cggccgcggc gtgccggtcg acatccacaa ggaagaaggc gtgtcggcgg 300
cggaggtgat cctcaccgtg ctgcatgccg gcggcaagtt cgacgataac agttacaagg 360
tttccggcgg cctgcacggc gtgggcgtgt cggtggtcaa cgcgctgtcc gagcacctgt 420
ggctggacat ctggcgcgac ggcttccact accagcagga atacgcgctg ggtgagccgc 480
agtacccgct caagcaactc gaagcctcga ccaagcgcgg caccacgctg cgcttcaagc 540
cggccgtggc catcttcagc gacgtcgagt tccattacga catcctggcg cgccgtctgc 600
gtgagctgtc gttcctcaat tccggcgtca agatcgcgct gatcgacgaa cgtggcgaag 660
gccgccgcga cgatttccat tacgaaggcg gcatccgcag cttcgtggag catctggccc 720
agctgaagtc gccgctgcac cccaacgtga tctcggtgac cggcgagcac aacggcatcg 780
tggtggacgt ggccctgca 799
<210> 18
<211> 798
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> gyrB dsRNA的第二臂的序列，该dsRNA用于同时靶向来自葡萄黄单胞菌的促旋酶B亚基基因
<400> 18
tgcagggcca cgtccaccac gatgccgttg tgctcgccgg tcaccgagat cacgttgggg 60
tgcagcggcg acttcagctg ggccagatgc tccacgaagc tgcggatgcc gccttcgtaa 120
tggaaatcgt cgcggcggcc ttcgccacgt tcgtcgatca gcgcgatctt gacgccggaa 180
ttgaggaacg acagctcacg cagacggcgc gccaggatgt cgtaatggaa ctcgacgtcg 240
ctgaagatgg ccacggccgg cttgaagcgc agcgtggtgc cgcgcttggt cgaggcttcg 300
agttgcttga gcgggtactg cggctcaccc agcgcgtatt cctgctggta gtggaagccg 360
tcgcgccaga tgtccagcca caggtgctcg gacagcgcgt tgaccaccga cacgcccacg 420
ccgtgcaggc cgccggaaac cttgtaactg ttatcgtcga acttgccgcc ggcatgcagc 480
acggtgagga tcacctccgc cgccgacacg ccttcttcct tgtggatgtc gaccggcacg 540
ccgcggccgt tatccgacac ggcgaccgag ccatcgacca ggatcttgac cacgatgtcg 600
tcggcatggc cggccagggc ctcgtcgacc gagttgtcga ccacctcgaa caccatgtga 660
tgcaggccgg tgccgtcatg gacatcgccg atgtacatgc cggggcgctt gcggacggct 720
tccaggccac gcagcacggt gatcttgctg gaatcgtagg tgctgttggg tgtggtcggg 780
ggtttgatct tcggtcat 798
<210> 19
<211> 801
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> fusA dsRNA的第一臂的序列，该dsRNA用于同时靶向来自葡萄黄单胞菌的fusa延伸因子G基因
<400> 19
gtggccgcaa ccaaccccta tcgagcgtta ccgcaacttc ggcatcatgg ctcacatcga 60
tgccggcaag accaccacct ccgagcgcat cctgttttac accggcgtca gtcacaagat 120
cggcgaagtc catgacggcg ccgcggtgat ggactggatg gagcaggagc aggagcgtgg 180
tatcaccatc acctccgctg ccaccaccgc gttctggtcg ggtatggaca agtccatgcc 240
gcagcatcgc ctcaacatca tcgacacccc cgggcacgtc gacttcacca tcgaggtgga 300
gcgctccttg cgcgtgctcg acggtgcggt gttcgtgctg tgcgccgtgg gtggcgtgca 360
gccgcagtcc gagaccgtgt ggcgccaggc caacaagtat tccgtgccgc gtatggcctt 420
cgtcaacaag atggaccgta ccggtgccaa cttcgacaag gtcgtcgagc agctgaaggc 480
ccgtctggga gcctacgccg tgccgatgca ggtgccgatc ggtgctgaag acggtttcga 540
gggcgtggtc gacctgctga agatgaaggc gatccattgg gatgttgcct cgcagggcac 600
caccttcgaa tacggtgaca tcccggccga tctggtcgag attgcgaccg aggcgcgttc 660
gttcatggtt gaagcggctg cagaagccag cgaagacctg atggacaagt acctcaacga 720
aggcgacctg accgaagaag agatcctggt gggtctgcgc gagcgcaccc tgaaggtcga 780
gatcgtgccg gtgttctgtg g 801
<210> 20
<211> 801
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> fusA dsRNA的第二臂的序列，该dsRNA用于同时靶向来自葡萄黄单胞菌的fusa延伸因子G基因
<400> 20
gtggccgcaa ccaaccccta tcgagcgtta ccgcaacttc ggcatcatgg ctcacatcga 60
tgccggcaag accaccacct ccgagcgcat cctgttttac accggcgtca gtcacaagat 120
cggcgaagtc catgacggcg ccgcggtgat ggactggatg gagcaggagc aggagcgtgg 180
tatcaccatc acctccgctg ccaccaccgc gttctggtcg ggtatggaca agtccatgcc 240
gcagcatcgc ctcaacatca tcgacacccc cgggcacgtc gacttcacca tcgaggtgga 300
gcgctccttg cgcgtgctcg acggtgcggt gttcgtgctg tgcgccgtgg gtggcgtgca 360
gccgcagtcc gagaccgtgt ggcgccaggc caacaagtat tccgtgccgc gtatggcctt 420
cgtcaacaag atggaccgta ccggtgccaa cttcgacaag gtcgtcgagc agctgaaggc 480
ccgtctggga gcctacgccg tgccgatgca ggtgccgatc ggtgctgaag acggtttcga 540
gggcgtggtc gacctgctga agatgaaggc gatccattgg gatgttgcct cgcagggcac 600
caccttcgaa tacggtgaca tcccggccga tctggtcgag attgcgaccg aggcgcgttc 660
gttcatggtt gaagcggctg cagaagccag cgaagacctg atggacaagt acctcaacga 720
aggcgacctg accgaagaag agatcctggt gggtctgcgc gagcgcaccc tgaaggtcga 780
gatcgtgccg gtgttctgtg g 801
<210> 21
<211> 733
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ZipA dsRNA的第一臂的序列，该dsRNA用于同时靶向来自葡萄黄单胞菌的ZipA基因
<400> 21
atgtccgaac atggccatga tccggatcgg gatcctgatc gctggactgc tgctggtcgc 60
ggccatcttc ctgtttggtc gcccgaaaaa atcgccgcaa gggcgccggg tcgacaagga 120
cgacgggcag ccgcgcgaac gccgcgagcc ggtgatttcc ggcgagcctg gggtggaggg 180
cgacccgttc aagcgcactg aaggcgccga gcagagcgaa ctcaatctgg acgatgccga 240
tgcggccggc ggcaacgatg tcggcaagcg tccgaatcag gacttcgaca agatcgtctc 300
gctgttcgtc gcggccaagg ccggacaggt gctgcgcggc gaagacgtgg ttgttgctgc 360
cgagaagacg gggttggtgt tcggccacat gaatgtcttc caccgcttgg tggaagggca 420
cccggagcgc gggccgatct tcagcatggc cagcatcctc aagcccggca gtttcgacat 480
ggccaacatc cgcgagatgc agaccccggc gatcgcattt ttcctcacgc tgccggcgcc 540
gatgactgcg ctggatgcct gggaaaaaat gctgccgacc gtgcagcgca tggccgaact 600
actcgatggc gtggtgctgg acgacagccg caatgcgctg ggccgtcaac gtgtggcgca 660
tatccgcgat gagctgcgcg cctacgatcg ccagcatcag gcgccgccgc taaccaagtc 720
gccgcgctgg tga 733
<210> 22
<211> 733
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ZipA dsRNA的第二臂的序列，该dsRNA用于同时靶向来自葡萄黄单胞菌的ZipA基因
<400> 22
tcaccagcgc ggcgacttgg ttagcggcgg cgcctgatgc tggcgatcgt aggcgcgcag 60
ctcatcgcgg atatgcgcca cacgttgacg gcccagcgca ttgcggctgt cgtccagcac 120
cacgccatcg agtagttcgg ccatgcgctg cacggtcggc agcatttttt cccaggcatc 180
cagcgcagtc atcggcgccg gcagcgtgag gaaaaatgcg atcgccgggg tctgcatctc 240
gcggatgttg gccatgtcga aactgccggg cttgaggatg ctggccatgc tgaagatcgg 300
cccgcgctcc gggtgccctt ccaccaagcg gtggaagaca ttcatgtggc cgaacaccaa 360
ccccgtcttc tcggcagcaa caaccacgtc ttcgccgcgc agcacctgtc cggccttggc 420
cgcgacgaac agcgagacga tcttgtcgaa gtcctgattc ggacgcttgc cgacatcgtt 480
gccgccggcc gcatcggcat cgtccagatt gagttcgctc tgctcggcgc cttcagtgcg 540
cttgaacggg tcgccctcca ccccaggctc gccggaaatc accggctcgc ggcgttcgcg 600
cggctgcccg tcgtccttgt cgacccggcg cccttgcggc gattttttcg ggcgaccaaa 660
caggaagatg gccgcgacca gcagcagtcc agcgatcagg atcccgatcc ggatcatggc 720
catgttcgga cat 733
<210> 23
<211> 919
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> rimM/rsgA/rbfA/mreB/gyrB/ftsZ dsRNA的第一臂的序列，该dsRNA用于同时靶向来自新缬草食酸菌的rimM、rsgA、rbfA、mreB、gyrB、ftsZ基因
<400> 23
atgcctaacc tccccgttct tgagcctgcc gaattgccgc ccgacgcggt ggagatcggc 60
cgtattgccg atgcctgggg tgtgaagggc tggttcaagg tgatggcata cagtgccgac 120
cccgaagcgc tgttttcgtc caagcgctgg gatcatggct gagcgcagcg ccctgtttga 180
cggactggtg gtggccagcc atggccggca ctgccttgtc gagtcgcccg acggccagcg 240
ccgcatctgc cacccccgcg gaaagaaaag ccaggcggtg gtgggagacc atgtttttgg 300
cagatgcatg gctgagcgca gcgccctgtt tgacggactg gtggtggcca gccatggccg 360
gcactgcctt gtcgagtcgc ccgacggcca gcgccgcatc tgccaccccc gcggaaagaa 420
aagccaggcg gtggtgggag accatgttct ttggcaggtg catgttcgga gctttccgtc 480
ggtacttctc caccgacctt gccattgacc ttggcacagc caacaccctg atttttgccc 540
gcgacaaggg catcgtgctc gatgaaccct cggtcgttgc catccgccac gagggcggtc 600
cccacggaaa gaagcatgac cgctgagaac accctgcccg agccttccac cgacggcgcg 660
ggcgaagcac agcccttcaa gatcgacacc cagcaagtgg gcgccagcga aggctacggc 720
gaaggcgcga tccagatcct ggaaggcctg gaggccgtgc gcaagtccaa tgaccatcga 780
aatgatcgaa gccgaagaat tcaatcaggg cacccagatc aaggtgatcg gtgtcggcgg 840
cggcggcggc aatgccgtgg cccacatgat cgcgcgcaat gttcagggcg tggagttcgt 900
ctgcgccaat accgacgcg 919
<210> 24
<211> 919
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> rimM/rsgA/rbfA/mreB/gyrB/ftsZ dsRNA的第二臂的序列，该dsRNA用于同时靶向来自新缬草食酸菌的rimM、rsgA、rbfA、mreB、gyrB、ftsZ基因
<400> 24
cgcgtcggta ttggcgcaga cgaactccac gccctgaaca ttgcgcgcga tcatgtgggc 60
cacggcattg ccgccgccgc cgccgacacc gatcaccttg atctgggtgc cctgattgaa 120
ttcttcggct tcgatcattt cgatggtcat tggacttgcg cacggcctcc aggccttcca 180
ggatctggat cgcgccttcg ccgtagcctt cgctggcgcc cacttgctgg gtgtcgatct 240
tgaagggctg tgcttcgccc gcgccgtcgg tggaaggctc gggcagggtg ttctcagcgg 300
tcatgcttct ttccgtgggg accgccctcg tggcggatgg caacgaccga gggttcatcg 360
agcacgatgc ccttgtcgcg ggcaaaaatc agggtgttgg ctgtgccaag gtcaatggca 420
aggtcggtgg agaagtaccg acggaaagct ccgaacatgc acctgccaaa gaacatggtc 480
tcccaccacc gcctggcttt tctttccgcg ggggtggcag atgcggcgct ggccgtcggg 540
cgactcgaca aggcagtgcc ggccatggct ggccaccacc agtccgtcaa acagggcgct 600
gcgctcagcc atgcatctgc caaaaacatg gtctcccacc accgcctggc ttttctttcc 660
gcgggggtgg cagatgcggc gctggccgtc gggcgactcg acaaggcagt gccggccatg 720
gctggccacc accagtccgt caaacagggc gctgcgctca gccatgatcc cagcgcttgg 780
acgaaaacag cgcttcgggg tcggcactgt atgccatcac cttgaaccag cccttcacac 840
cccaggcatc ggcaatacgg ccgatctcca ccgcgtcggg cggcaattcg gcaggctcaa 900
gaacggggag gttaggcat 919
<210> 25
<211> 758
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> rimM/rbfA/ftsZ dsRNA的第一臂的序列，该dsRNA用于同时靶向来自新缬草食酸菌的rimM、rbfA、ftsZ基因
<400> 25
atgcctaacc tccccgttct tgagcctgcc gaattgccgc ccgacgcggt ggagatcggc 60
cgtattgccg atgcctgggg tgtgaagggc tggttcaagg tgatggcata cagtgccgac 120
cccgaagcgc tgttttcgtc caagcgctgg tatctgcagc ccagcgagaa gggcgccaag 180
agctttttcg aaggcaccgt ggtgctggcg gtgcgacagg cgcgcgagca ctccgacacg 240
gtcgtggcct gatcatggct gagcgcagcg ccctgtttga cggactggtg gtggccagcc 300
atggccggca ctgccttgtc gagtcgcccg acggccagcg ccgcatctgc cacccccgcg 360
gaaagaaaag ccaggcggtg gtgggagacc atgttctttg gcaggcggcc ccgcccggcc 420
agggtgatga gggcaccatc gagaaggtca aggaacgccg gaacctgttt taccggcaag 480
acgaaattcg caccaaatcc tttgatgcat gaccatcgaa atgatcgaag ccgaagaatt 540
caatcagggc acccagatca aggtgatcgg tgtcggcggc ggcggcggca atgccgtggc 600
ccacatgatc gcgcgcaatg ttcagggcgt ggagttcgtc tgcgccaata ccgacgcgca 660
agccctcacc cgcagccccg cgcaccgcac catccagctg ggcggcagcg gcctgggcgc 720
cggcagcaag cccgacaagg gccgcgacgc cgctgaag 758
<210> 26
<211> 758
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> rimM/rbfA/ftsZ dsRNA的第二臂的序列，该dsRNA用于同时靶向来自新缬草食酸菌的rimM、rbfA、ftsZ基因
<400> 26
cttcagcggc gtcgcggccc ttgtcgggct tgctgccggc gcccaggccg ctgccgccca 60
gctggatggt gcggtgcgcg gggctgcggg tgagggcttg cgcgtcggta ttggcgcaga 120
cgaactccac gccctgaaca ttgcgcgcga tcatgtgggc cacggcattg ccgccgccgc 180
cgccgacacc gatcaccttg atctgggtgc cctgattgaa ttcttcggct tcgatcattt 240
cgatggtcat gcatcaaagg atttggtgcg aatttcgtct tgccggtaaa acaggttccg 300
gcgttccttg accttctcga tggtgccctc atcaccctgg ccgggcgggg ccgcctgcca 360
aagaacatgg tctcccacca ccgcctggct tttctttccg cgggggtggc agatgcggcg 420
ctggccgtcg ggcgactcga caaggcagtg ccggccatgg ctggccacca ccagtccgtc 480
aaacagggcg ctgcgctcag ccatgatcag gccacgaccg tgtcggagtg ctcgcgcgcc 540
tgtcgcaccg ccagcaccac ggtgccttcg aaaaagctct tggcgccctt ctcgctgggc 600
tgcagatacc agcgcttgga cgaaaacagc gcttcggggt cggcactgta tgccatcacc 660
ttgaaccagc ccttcacacc ccaggcatcg gcaatacggc cgatctccac cgcgtcgggc 720
ggcaattcgg caggctcaag aacggggagg ttaggcat 758
<210> 27
<211> 758
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> RsgA/gyrB/MreB dsRNA的第一臂的序列，该dsRNA用于同时靶向来自新缬草食酸菌的RsgA、gyrB、MreB基因
<400> 27
atggctgagc gcagcgccct gtttgacgga ctggtggtgg ccagccatgg ccggcactgc 60
cttgtcgagt cgcccgacgg ccagcgccgc atctgccacc cccgcggaaa gaaaagccag 120
gcggtggtgg gagaccatgt tctttggcag gcggccccgc ccggccaggg tgatgagggc 180
accatcgaga aggtcaagga acgccggaac ctgttttacc ggcaagacga aattcgcacc 240
aaatcctttg gatcatgacc gctgagaaca ccctgcccga gccttccacc gacggcgcgg 300
gcgaagcaca gcccttcaag atcgacaccc agcaagtggg cgccagcgaa ggctacggcg 360
aaggcgcgat ccagatcctg gaaggcctgg aggccgtgcg caagcgcccc ggcatgtaca 420
tcggcgacac ctccgacggc acgggcctgc accacctcgt cttcgaagtc gtggacaact 480
ccatcgacga ggcgctggcc gggcatgcat gttcggagct ttccgtcggt acttctccac 540
cgaccttgcc attgaccttg gcacagccaa caccctgatt tttgcccgcg acaagggcat 600
cgtgctcgat gaaccctcgg tcgttgccat ccgccacgag ggcggtcccc acggaaagaa 660
agtcatccag gccgtcggcc gtgaagccaa ggccatgctg ggcaaggtgc ccggcaacat 720
cgaagccatc cgcccgatga aagacggggt gatcgcgg 758
<210> 28
<211> 758
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> RsgA/gyrB/MreB dsRNA的第二臂的序列，该dsRNA用于同时靶向来自新缬草食酸菌的RsgA、gyrB、MreB基因
<400> 28
ccgcgatcac cccgtctttc atcgggcgga tggcttcgat gttgccgggc accttgccca 60
gcatggcctt ggcttcacgg ccgacggcct ggatgacttt ctttccgtgg ggaccgccct 120
cgtggcggat ggcaacgacc gagggttcat cgagcacgat gcccttgtcg cgggcaaaaa 180
tcagggtgtt ggctgtgcca aggtcaatgg caaggtcggt ggagaagtac cgacggaaag 240
ctccgaacat gcatgcccgg ccagcgcctc gtcgatggag ttgtccacga cttcgaagac 300
gaggtggtgc aggcccgtgc cgtcggaggt gtcgccgatg tacatgccgg ggcgcttgcg 360
cacggcctcc aggccttcca ggatctggat cgcgccttcg ccgtagcctt cgctggcgcc 420
cacttgctgg gtgtcgatct tgaagggctg tgcttcgccc gcgccgtcgg tggaaggctc 480
gggcagggtg ttctcagcgg tcatgatcca aaggatttgg tgcgaatttc gtcttgccgg 540
taaaacaggt tccggcgttc cttgaccttc tcgatggtgc cctcatcacc ctggccgggc 600
ggggccgcct gccaaagaac atggtctccc accaccgcct ggcttttctt tccgcggggg 660
tggcagatgc ggcgctggcc gtcgggcgac tcgacaaggc agtgccggcc atggctggcc 720
accaccagtc cgtcaaacag ggcgctgcgc tcagccat 758
<210> 29
<211> 758
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> RsgA/rbfA/FtsZ dsRNA的第一臂的序列，该dsRNA用于同时靶向来自新缬草食酸菌的RsgA、rbfA、FtsZ基因
<400> 29
atggctgagc gcagcgccct gtttgacgga ctggtggtgg ccagccatgg ccggcactgc 60
cttgtcgagt cgcccgacgg ccagcgccgc atctgccacc cccgcggaaa gaaaagccag 120
gcggtggtgg gagaccatgt tctttggcag gcggccccgc ccggccaggg tgatgagggc 180
accatcgaga aggtcaagga acgccggaac ctgttttacc ggcaagacga aattcgcacc 240
aaatcctttg gatcatggct gagcgcagcg ccctgtttga cggactggtg gtggccagcc 300
atggccggca ctgccttgtc gagtcgcccg acggccagcg ccgcatctgc cacccccgcg 360
gaaagaaaag ccaggcggtg gtgggagacc atgttctttg gcaggcggcc ccgcccggcc 420
agggtgatga gggcaccatc gagaaggtca aggaacgccg gaacctgttt taccggcaag 480
acgaaattcg caccaaatcc tttgatgcat gaccatcgaa atgatcgaag ccgaagaatt 540
caatcagggc acccagatca aggtgatcgg tgtcggcggc ggcggcggca atgccgtggc 600
ccacatgatc gcgcgcaatg ttcagggcgt ggagttcgtc tgcgccaata ccgacgcgca 660
agccctcacc cgcagccccg cgcaccgcac catccagctg ggcggcagcg gcctgggcgc 720
cggcagcaag cccgacaagg gccgcgacgc cgctgaag 758
<210> 30
<211> 758
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> RsgA/rbfA/FtsZ dsRNA的第二臂的序列，该dsRNA用于同时靶向来自新缬草食酸菌的RsgA、rbfA、FtsZ基因
<400> 30
cttcagcggc gtcgcggccc ttgtcgggct tgctgccggc gcccaggccg ctgccgccca 60
gctggatggt gcggtgcgcg gggctgcggg tgagggcttg cgcgtcggta ttggcgcaga 120
cgaactccac gccctgaaca ttgcgcgcga tcatgtgggc cacggcattg ccgccgccgc 180
cgccgacacc gatcaccttg atctgggtgc cctgattgaa ttcttcggct tcgatcattt 240
cgatggtcat gcatcaaagg atttggtgcg aatttcgtct tgccggtaaa acaggttccg 300
gcgttccttg accttctcga tggtgccctc atcaccctgg ccgggcgggg ccgcctgcca 360
aagaacatgg tctcccacca ccgcctggct tttctttccg cgggggtggc agatgcggcg 420
ctggccgtcg ggcgactcga caaggcagtg ccggccatgg ctggccacca ccagtccgtc 480
aaacagggcg ctgcgctcag ccatgatcca aaggatttgg tgcgaatttc gtcttgccgg 540
taaaacaggt tccggcgttc cttgaccttc tcgatggtgc cctcatcacc ctggccgggc 600
ggggccgcct gccaaagaac atggtctccc accaccgcct ggcttttctt tccgcggggg 660
tggcagatgc ggcgctggcc gtcgggcgac tcgacaaggc agtgccggcc atggctggcc 720
accaccagtc cgtcaaacag ggcgctgcgc tcagccat 758
<210> 31
<211> 920
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> mreB/ybeY/rbfA/gyrB/ftsZ/rsgA dsRNA的第一臂的序列，该dsRNA用于同时靶向来自西瓜食酸菌的mreB、ybeY、rbfA、gyrB、ftsZ、rsgA基因
<400> 31
atgttcggag ctttccgtcg gtacttctcc accgaccttg ccattgatct tggcacagcc 60
aacacgctga tcttcgcccg cgacaagggc atcgtgctcg acgaaccctc cgtggtcgcc 120
atccgccacg aaggcggccc ccacggcaag gatcatggcc ctgaaccagc tttccctgtc 180
cctgcagttc gcgcggtttc ccggcgtgga ggcgcaccgc gccgccctgc cccggcatgc 240
cgtcgtccgc tggatccgcc acgcgctctc gctggacgcg gagatcaccg tgcgcatcgt 300
cgatatgcat ggctgctaaa aaatcctcca cgcccaaccg cggcttcaag gtcgcggacc 360
agatccagcg cgatctgacc gagctgatcc gcgagttgaa ggacccgcgc atcggcatgg 420
tcacgctgca ggccgtggaa gtgacgcccg actacgcggt gcatgaccgc tgagaacacc 480
ctgcccgagc ccacccttcc cacgggcgac agccaagcgc agtccgtcgc agcccccgac 540
tccgtgcccg cccaggccgc cgcgcccagc gacggctacg gcgaaggcgc gatccagatc 600
ctggaaggcc tgaagcatga ccatcgaaat gatcgaagcc gaagaattca accagggcac 660
gcagatcaag gtgatcggtg tcggcggcgg cggcggcaat gccgtcgagc acatgatctc 720
gcgccaggta cagggcgtgg aattcgtatg cgccaatacc gatgcgtcca atgtctgagc 780
gctccggccc cctcgaaggc ctggtggtgg ccagccacgg ccggcactgc ctcgtcgaga 840
gccccgacgg cgcgcggcgc atctgccatc cgcgcggcaa gaagagccag gcggtggtcg 900
gcgaccgcgt gctctggcag 920
<210> 32
<211> 920
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> mreB/ybeY/rbfA/gyrB/ftsZ/rsgA dsRNA的第二臂的序列，该dsRNA用于同时靶向来自西瓜食酸菌的mreB、ybeY、rbfA、gyrB、ftsZ、rsgA基因
<400> 32
ctgccagagc acgcggtcgc cgaccaccgc ctggctcttc ttgccgcgcg gatggcagat 60
gcgccgcgcg ccgtcggggc tctcgacgag gcagtgccgg ccgtggctgg ccaccaccag 120
gccttcgagg gggccggagc gctcagacat tggacgcatc ggtattggcg catacgaatt 180
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caccgatcac cttgatctgc gtgccctggt tgaattcttc ggcttcgatc atttcgatgg 300
tcatgcttca ggccttccag gatctggatc gcgccttcgc cgtagccgtc gctgggcgcg 360
gcggcctggg cgggcacgga gtcgggggct gcgacggact gcgcttggct gtcgcccgtg 420
ggaagggtgg gctcgggcag ggtgttctca gcggtcatgc accgcgtagt cgggcgtcac 480
ttccacggcc tgcagcgtga ccatgccgat gcgcgggtcc ttcaactcgc ggatcagctc 540
ggtcagatcg cgctggatct ggtccgcgac cttgaagccg cggttgggcg tggaggattt 600
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gaaaccgcgc gaactgcagg gacagggaaa gctggttcag ggccatgatc cttgccgtgg 780
gggccgcctt cgtggcggat ggcgaccacg gagggttcgt cgagcacgat gcccttgtcg 840
cgggcgaaga tcagcgtgtt ggctgtgcca agatcaatgg caaggtcggt ggagaagtac 900
cgacggaaag ctccgaacat 920
<210> 33
<211> 758
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> mreB/ybeY/rbfA dsRNA的第一臂的序列，该dsRNA用于同时靶向来自西瓜食酸菌的mreB、ybeY、rbfA基因
<400> 33
atgttcggag ctttccgtcg gtacttctcc accgaccttg ccattgatct tggcacagcc 60
aacacgctga tcttcgcccg cgacaagggc atcgtgctcg acgaaccctc cgtggtcgcc 120
atccgccacg aaggcggccc ccacggcaag aaagtcatcc aggccgtcgg ccacgaggcc 180
aaggccatgc tcggcaaggt gcccggcaac atcgaggcca tccgcccgat gaaggatggc 240
gtgatcgccg gatcatggcc ctgaaccagc tttccctgtc cctgcagttc gcgcggtttc 300
ccggcgtgga ggcgcaccgc gccgccctgc cccggcatgc cgtcgtccgc tggatccgcc 360
acgcgctctc gctggacgcg gagatcaccg tgcgcatcgt cgatgccgaa gagggccagg 420
ccctgaaccg cgagtaccgg cacaaggact acgccaccaa cgtgctcacc ttcgactacg 480
cgcaggagcc cgtggtcatg gccgatgcat ggctgctaaa aaatcctcca cgcccaaccg 540
cggcttcaag gtcgcggacc agatccagcg cgatctgacc gagctgatcc gcgagttgaa 600
ggacccgcgc atcggcatgg tcacgctgca ggccgtggaa gtgacgcccg actacgcgca 660
tgcgaaggtg ttcttcagcg tgctcgtggg cgacgccgac gcgacgcagg atgcgctgaa 720
ccaggccgcg ggcttcctgc gcaacggcct gttcaagc 758
<210> 34
<211> 758
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> mreB/ybeY/rbfA dsRNA的第二臂的序列，该dsRNA用于同时靶向来自西瓜食酸菌的mreB、ybeY、rbfA基因
<400> 34
gcttgaacag gccgttgcgc aggaagcccg cggcctggtt cagcgcatcc tgcgtcgcgt 60
cggcgtcgcc cacgagcacg ctgaagaaca ccttcgcatg cgcgtagtcg ggcgtcactt 120
ccacggcctg cagcgtgacc atgccgatgc gcgggtcctt caactcgcgg atcagctcgg 180
tcagatcgcg ctggatctgg tccgcgacct tgaagccgcg gttgggcgtg gaggattttt 240
tagcagccat gcatcggcca tgaccacggg ctcctgcgcg tagtcgaagg tgagcacgtt 300
ggtggcgtag tccttgtgcc ggtactcgcg gttcagggcc tggccctctt cggcatcgac 360
gatgcgcacg gtgatctccg cgtccagcga gagcgcgtgg cggatccagc ggacgacggc 420
atgccggggc agggcggcgc ggtgcgcctc cacgccggga aaccgcgcga actgcaggga 480
cagggaaagc tggttcaggg ccatgatccg gcgatcacgc catccttcat cgggcggatg 540
gcctcgatgt tgccgggcac cttgccgagc atggccttgg cctcgtggcc gacggcctgg 600
atgactttct tgccgtgggg gccgccttcg tggcggatgg cgaccacgga gggttcgtcg 660
agcacgatgc ccttgtcgcg ggcgaagatc agcgtgttgg ctgtgccaag atcaatggca 720
aggtcggtgg agaagtaccg acggaaagct ccgaacat 758
<210> 35
<211> 758
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> rsgA/GyrB/MreB dsRNA的第一臂的序列，该dsRNA用于同时靶向来自西瓜食酸菌的RsgA、GyrB、MreB基因
<400> 35
atgtctgagc gctccggccc cctcgaaggc ctggtggtgg ccagccacgg ccggcactgc 60
ctcgtcgaga gccccgacgg cgcgcggcgc atctgccatc cgcgcggcaa gaagagccag 120
gcggtggtcg gcgaccgcgt gctctggcag gccccgccgc ccggccaggg cgacgaaggc 180
acgatcgaga aagtgctgga gcgccgcaac ctgttctacc ggcaggacga gatccgcacc 240
aaatcgttcg gatcatgacc gctgagaaca ccctgcccga gcccaccctt cccacgggcg 300
acagccaagc gcagtccgtc gcagcccccg actccgtgcc cgcccaggcc gccgcgccca 360
gcgacggcta cggcgaaggc gcgatccaga tcctggaagg cctggaggcc gtgcgcaagc 420
gccccggcat gtacatcggc gacacgtcgg acggcacggg cctgcaccac ctcgtgttcg 480
aagtggtgga caactccatc gacgatgcat gttcggagct ttccgtcggt acttctccac 540
cgaccttgcc attgatcttg gcacagccaa cacgctgatc ttcgcccgcg acaagggcat 600
cgtgctcgac gaaccctccg tggtcgccat ccgccacgaa ggcggccccc acggcaagaa 660
agtcatccag gccgtcggcc acgaggccaa ggccatgctc ggcaaggtgc ccggcaacat 720
cgaggccatc cgcccgatga aggatggcgt gatcgccg 758
<210> 36
<211> 758
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> rsgA/GyrB/MreB dsRNA的第二臂的序列，该dsRNA用于同时靶向来自西瓜食酸菌的RsgA、GyrB、MreB基因
<400> 36
cggcgatcac gccatccttc atcgggcgga tggcctcgat gttgccgggc accttgccga 60
gcatggcctt ggcctcgtgg ccgacggcct ggatgacttt cttgccgtgg gggccgcctt 120
cgtggcggat ggcgaccacg gagggttcgt cgagcacgat gcccttgtcg cgggcgaaga 180
tcagcgtgtt ggctgtgcca agatcaatgg caaggtcggt ggagaagtac cgacggaaag 240
ctccgaacat gcatcgtcga tggagttgtc caccacttcg aacacgaggt ggtgcaggcc 300
cgtgccgtcc gacgtgtcgc cgatgtacat gccggggcgc ttgcgcacgg cctccaggcc 360
ttccaggatc tggatcgcgc cttcgccgta gccgtcgctg ggcgcggcgg cctgggcggg 420
cacggagtcg ggggctgcga cggactgcgc ttggctgtcg cccgtgggaa gggtgggctc 480
gggcagggtg ttctcagcgg tcatgatccg aacgatttgg tgcggatctc gtcctgccgg 540
tagaacaggt tgcggcgctc cagcactttc tcgatcgtgc cttcgtcgcc ctggccgggc 600
ggcggggcct gccagagcac gcggtcgccg accaccgcct ggctcttctt gccgcgcgga 660
tggcagatgc gccgcgcgcc gtcggggctc tcgacgaggc agtgccggcc gtggctggcc 720
accaccaggc cttcgagggg gccggagcgc tcagacat 758
<210> 37
<211> 758
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> YbeY/ RsgA/ MreB dsRNA的第一臂的序列，该dsRNA用于同时靶向来自西瓜食酸菌的YbeY、RsgA、MreB基因
<400> 37
atggccctga accagctttc cctgtccctg cagttcgcgc ggtttcccgg cgtggaggcg 60
caccgcgccg ccctgccccg gcatgccgtc gtccgctgga tccgccacgc gctctcgctg 120
gacgcggaga tcaccgtgcg catcgtcgat gccgaagagg gccaggccct gaaccgcgag 180
taccggcaca aggactacgc caccaacgtg ctcaccttcg actacgcgca ggagcccgtg 240
gtcatggccg gatcatgtct gagcgctccg gccccctcga aggcctggtg gtggccagcc 300
acggccggca ctgcctcgtc gagagccccg acggcgcgcg gcgcatctgc catccgcgcg 360
gcaagaagag ccaggcggtg gtcggcgacc gcgtgctctg gcaggccccg ccgcccggcc 420
agggcgacga aggcacgatc gagaaagtgc tggagcgccg caacctgttc taccggcagg 480
acgagatccg caccaaatcg ttcgatgcat gttcggagct ttccgtcggt acttctccac 540
cgaccttgcc attgatcttg gcacagccaa cacgctgatc ttcgcccgcg acaagggcat 600
cgtgctcgac gaaccctccg tggtcgccat ccgccacgaa ggcggccccc acggcaagaa 660
agtcatccag gccgtcggcc acgaggccaa ggccatgctc ggcaaggtgc ccggcaacat 720
cgaggccatc cgcccgatga aggatggcgt gatcgccg 758
<210> 38
<211> 758
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> YbeY/ RsgA/ MreB dsRNA的第二臂的序列，该dsRNA用于同时靶向来自西瓜食酸菌的YbeY、RsgA、MreB基因
<400> 38
cggcgatcac gccatccttc atcgggcgga tggcctcgat gttgccgggc accttgccga 60
gcatggcctt ggcctcgtgg ccgacggcct ggatgacttt cttgccgtgg gggccgcctt 120
cgtggcggat ggcgaccacg gagggttcgt cgagcacgat gcccttgtcg cgggcgaaga 180
tcagcgtgtt ggctgtgcca agatcaatgg caaggtcggt ggagaagtac cgacggaaag 240
ctccgaacat gcatcgaacg atttggtgcg gatctcgtcc tgccggtaga acaggttgcg 300
gcgctccagc actttctcga tcgtgccttc gtcgccctgg ccgggcggcg gggcctgcca 360
gagcacgcgg tcgccgacca ccgcctggct cttcttgccg cgcggatggc agatgcgccg 420
cgcgccgtcg gggctctcga cgaggcagtg ccggccgtgg ctggccacca ccaggccttc 480
gagggggccg gagcgctcag acatgatccg gccatgacca cgggctcctg cgcgtagtcg 540
aaggtgagca cgttggtggc gtagtccttg tgccggtact cgcggttcag ggcctggccc 600
tcttcggcat cgacgatgcg cacggtgatc tccgcgtcca gcgagagcgc gtggcggatc 660
cagcggacga cggcatgccg gggcagggcg gcgcggtgcg cctccacgcc gggaaaccgc 720
gcgaactgca gggacaggga aagctggttc agggccat 758
<210> 39
<211> 758
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> P1/ HC-Pro/ cp dsRNA的第一臂的序列，该dsRNA用于同时靶向来自李痘病毒的PIPVgp1序列的P1、HC-Pro、外壳蛋白基因
<400> 39
tcagacccag gcaaacaatt ttcggatggt ttcaccaatt catttatgca gtgcaagcta 60
cgcgaaactg atcatcagtg cacatctgac ctggacgtga aggagtgtgg ttatgtcgca 120
gcacttgtgt gccaagcgat aatcccttgc ggaaaaatca cgtgtctgca atgtgctcaa 180
aagtattctt acatgtcaca acaggaaata cgtgatagat tttcgacagt aattgagcag 240
catgagaaaa gatccacttt aaatgactta ggattctcag tactcagaca ggcaacaccc 300
cacttggtag aaaaaagtta tctccaggaa ttggagcaag cttggaaaga gttaagctgg 360
tcggaaaaat tctctgcaat cttggaatcg cagcgatggc gaaaacatat accaaaacct 420
ttcatcccaa aagacggcgc agatttagga ggcaggtacg acatctccgt tcggtcatta 480
cttggcaacc agtacaaacg cctgatgctc agacccaggc aaacaatttt cggatggttt 540
caccaattca tttatgcagt gcaagctacg cgaaactgat catcagtgca catctgacct 600
ggacgtgaag gagtgtggtt atgtcgcagc acttgtgtgc caagcgataa tcccttgcgg 660
aaaaatcacg tgtctgcaat gtgctcaaaa gtattcttac atgtcacaac aggaaatacg 720
tgatagattt tcgacagtaa ttgagcagca tgagaaaa 758
<210> 40
<211> 758
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> P1/ HC-Pro/ cp dsRNA的第二臂的序列，该dsRNA用于同时靶向来自李痘病毒的PIPVgp1序列的P1、HC-Pro、外壳蛋白基因
<400> 40
ttttctcatg ctgctcaatt actgtcgaaa atctatcacg tatttcctgt tgtgacatgt 60
aagaatactt ttgagcacat tgcagacacg tgatttttcc gcaagggatt atcgcttggc 120
acacaagtgc tgcgacataa ccacactcct tcacgtccag gtcagatgtg cactgatgat 180
cagtttcgcg tagcttgcac tgcataaatg aattggtgaa accatccgaa aattgtttgc 240
ctgggtctga gcatcaggcg tttgtactgg ttgccaagta atgaccgaac ggagatgtcg 300
tacctgcctc ctaaatctgc gccgtctttt gggatgaaag gttttggtat atgttttcgc 360
catcgctgcg attccaagat tgcagagaat ttttccgacc agcttaactc tttccaagct 420
tgctccaatt cctggagata acttttttct accaagtggg gtgttgcctg tctgagtact 480
gagaatccta agtcatttaa agtggatctt ttctcatgct gctcaattac tgtcgaaaat 540
ctatcacgta tttcctgttg tgacatgtaa gaatactttt gagcacattg cagacacgtg 600
atttttccgc aagggattat cgcttggcac acaagtgctg cgacataacc acactccttc 660
acgtccaggt cagatgtgca ctgatgatca gtttcgcgta gcttgcactg cataaatgaa 720
ttggtgaaac catccgaaaa ttgtttgcct gggtctga 758
<210> 41
<211> 750
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> P1 dsRNA的第一臂的序列，该dsRNA用于同时靶向来自李痘病毒的PIPVgp1序列的P1基因
<400> 41
tcagacccag gcaaacaatt ttcggatggt ttcaccaatt catttatgca gtgcaagcta 60
cgcgaaactg atcatcagtg cacatctgac ctggacgtga aggagtgtgg ttatgtcgca 120
gcacttgtgt gccaagcgat aatcccttgc ggaaaaatca cgtgtctgca atgtgctcaa 180
aagtattctt acatgtcaca acaggaaata cgtgatagat tttcgacagt aattgagcag 240
catgagaaaa cagtgatgga taactatcca caattttcac atgttctcgc ttttctaaag 300
agatatcgtg aactaatgcg cgtggaaaat cagaattatg aagctttcaa ggatatcacg 360
cacatgatag gcgagcgtaa agaagcacct ttttcccatc tcaacaaaat caatgaatta 420
atcattaagg gtggtatgat gagcgcacaa gactatatag aagcctcgga tcatctacgc 480
gaactagcgc gatatcagaa gaatcgcacg gagaacatta ggagcggatc tataaaggct 540
ttcaggaata aaatctcatc aaaagcacat gtcaatatgc agcttatgtg tgacaatcaa 600
cttgatacta atggcaattt cgtgtgggga cagagagagt atcatgctaa acgcttcttt 660
aggaattact tcgatgtgat cgatgttagc gagggctaca gacgtcatat tgttcgtgaa 720
aatcctagag gtatccgcaa attggccatt 750
<210> 42
<211> 750
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> P1 dsRNA的第二臂的序列，该dsRNA用于同时靶向来自李痘病毒的PIPVgp1序列的P1基因
<400> 42
aatggccaat ttgcggatac ctctaggatt ttcacgaaca atatgacgtc tgtagccctc 60
gctaacatcg atcacatcga agtaattcct aaagaagcgt ttagcatgat actctctctg 120
tccccacacg aaattgccat tagtatcaag ttgattgtca cacataagct gcatattgac 180
atgtgctttt gatgagattt tattcctgaa agcctttata gatccgctcc taatgttctc 240
cgtgcgattc ttctgatatc gcgctagttc gcgtagatga tccgaggctt ctatatagtc 300
ttgtgcgctc atcataccac ccttaatgat taattcattg attttgttga gatgggaaaa 360
aggtgcttct ttacgctcgc ctatcatgtg cgtgatatcc ttgaaagctt cataattctg 420
attttccacg cgcattagtt cacgatatct ctttagaaaa gcgagaacat gtgaaaattg 480
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tatttcctgt tgtgacatgt aagaatactt ttgagcacat tgcagacacg tgatttttcc 600
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gtcagatgtg cactgatgat cagtttcgcg tagcttgcac tgcataaatg aattggtgaa 720
accatccgaa aattgtttgc ctgggtctga 750
<210> 43
<211> 750
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> HC-Pro dsRNA的第一臂的序列，该dsRNA用于同时靶向来自李痘病毒的PIPVgp1序列的HC-Pro基因
<400> 43
ggtcttgaag tggataagtg tgacgaattc aaaaatgtaa agctcttgat cagaagcatt 60
tacaagccac aaatcatgga acaggtgctt aaggaagaac catatttact gctcatgagc 120
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gcagtgaaaa ctttggaaag gatgaaagca cggacggaat ccgatcacac tttaaatgac 420
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gaattggagc aagcttggaa agagttaagc tggtcggaaa aattctctgc aatcttggaa 540
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ggaggcaggt acgacatctc cgttcggtca ttacttggca accagtacaa acgcctgaga 660
gacgtagtcc gatggaaaag agacgatgtg gtttgctata cataccagtc gatggggaag 720
ctattttgca aagccatcgg aatctcacca 750
<210> 44
<211> 750
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> HC-Pro dsRNA的第二臂的序列，该dsRNA用于同时靶向来自李痘病毒的PIPVgp1序列的HC-Pro基因
<400> 44
tggtgagatt ccgatggctt tgcaaaatag cttccccatc gactggtatg tatagcaaac 60
cacatcgtct cttttccatc ggactacgtc tctcaggcgt ttgtactggt tgccaagtaa 120
tgaccgaacg gagatgtcgt acctgcctcc taaatctgcg ccgtcttttg ggatgaaagg 180
ttttggtata tgttttcgcc atcgctgcga ttccaagatt gcagagaatt tttccgacca 240
gcttaactct ttccaagctt gctccaattc ctggagataa cttttttcta ccaagtgggg 300
tgttgcctgt ctgagtactg agaatcctaa gtcatttaaa gtgtgatcgg attccgtccg 360
tgctttcatc ctttccaaag ttttcactgc catcatgtag gatgcgtatg gctgcgttcc 420
aacaaaaaca ctatcatata gaactgctgc atgttcgtca atgacactca tctgtgcatt 480
cagtgtactt gcgagtgaaa ctttggctgc aagtgctgat aacattgatg tgatcgctgc 540
caagctatga gatcgtgtga tccaatattg tgtggctttc tccaatgaac cactattgaa 600
cagcgccatc aagacgccag gtgacaaaac gctcatgagc agtaaatatg gttcttcctt 660
aagcacctgt tccatgattt gtggcttgta aatgcttctg atcaagagct ttacattttt 720
gaattcgtca cacttatcca cttcaagacc 750
<210> 45
<211> 250
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CP dsRNA的第一臂的序列，该dsRNA用于同时靶向来自李痘病毒的PIPVgp1序列的外壳蛋白基因
<400> 45
cactttaaat gacttaggat tctcagtact cagacaggca acaccccact tggtagaaaa 60
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tgcaatcttg gaatcgcagc gatggcgaaa acatatacca aaacctttca tcccaaaaga 180
cggcgcagat ttaggaggca ggtacgacat ctccgttcgg tcattacttg gcaaccagta 240
caaacgcctg 250
<210> 46
<211> 250
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CP dsRNA的第二臂的序列，该dsRNA用于同时靶向来自李痘病毒的PIPVgp1序列的外壳蛋白基因
<400> 46
caggcgtttg tactggttgc caagtaatga ccgaacggag atgtcgtacc tgcctcctaa 60
atctgcgccg tcttttggga tgaaaggttt tggtatatgt tttcgccatc gctgcgattc 120
caagattgca gagaattttt ccgaccagct taactctttc caagcttgct ccaattcctg 180
gagataactt ttttctacca agtggggtgt tgcctgtctg agtactgaga atcctaagtc 240
atttaaagtg 250
<210> 47
<211> 919
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> gyrB/ MreB/ rbfA/ RsgA/ FliA/ QseC dsRNA的第一臂的序列，该dsRNA用于同时靶向来自软腐欧文氏菌的GyrB、MreB、RbfA、RsgA、FliA、QseC基因
<400> 47
atgtcgaatt cttatgactc ctcaagtatc aaggtattga aagggctgga tgcggtacgt 60
aaacgcccag gtatgtatat cggcgatacg gatgacggta ccggcctgca tcacatggta 120
ttcgaggttg tggacaacgc ttcgacgaag atcatgttta agaaatttcg tggcatgttt 180
tccaacgact tgtccatcga cctgggtacc gccaataccc tgatttatgt taaagggcag 240
ggcatcatac tgaatgaacc ctctgtggtt gcgattcgtc aggatcgtgc tggttcccaa 300
aaaatgcatg gcaaaagaat tcagccgcac ccagcgcgtt gcgcaggaaa tgcaaaaaga 360
aatcgccatt atcattcagc gtgaagtaaa agatccgcgt atcggcatgg cgaccgtatc 420
cggtgtggaa gtttctcgcg atctggcgta tgccaaagtg cgtgagcaaa aagaaactgt 480
cgaaaggtca gcagcgtcgg gttagcgcaa accaccagcg ccgcctgaaa aaaacggaaa 540
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ctttggaagc gctatgttcc actagtgcgc catgaagcct tgcgtttaca ggttcgtctc 720
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gcaaatgctg ttcgccaaa 919
<210> 48
<211> 919
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> gyrB/ MreB/ rbfA/ RsgA/ FliA/ QseC dsRNA的第二臂的序列，该dsRNA用于同时靶向来自软腐欧文氏菌的GyrB、MreB、RbfA、RsgA、FliA、QseC基因
<400> 48
tttggcgaac agcatttgct gggtatcaaa tagctcattg atattatggc gtgtttgata 60
ccacgaaagc aggctggcta cgccccagca gatcaaggtc agcagcgtaa aaccggtaat 120
caggcgtagg cgcaggctga gtcggttcat tggagatacc accagcctgt agcagatcgt 180
caagctcaac actcgcgggg agacgaacct gtaaacgcaa ggcttcatgg cgcactagtg 240
gaacatagcg cttccaaagg gaatttttat ccattgtgcc ttcggcggta tacaaatcgc 300
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<210> 49
<211> 758
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> gyrB/ rbfA/ QseC dsRNA的第一臂的序列，该dsRNA用于同时靶向来自软腐欧文氏菌的GyrB、RbfA、QseC基因
<400> 49
atgtcgaatt cttatgactc ctcaagtatc aaggtattga aagggctgga tgcggtacgt 60
aaacgcccag gtatgtatat cggcgatacg gatgacggta ccggcctgca tcacatggta 120
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tgaatgataa cgagccagaa caagttaaaa cggcgctgaa agcactgcag gatgcttcag 480
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gagtctggta cataagaacc gcggcaagca ggacgatg 758
<210> 50
<211> 758
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> gyrB/ rbfA/ QseC dsRNA的第二臂的序列，该dsRNA用于同时靶向来自软腐欧文氏菌的GyrB、RbfA、QseC基因
<400> 50
catcgtcctg cttgccgcgg ttcttatgta ccagactctt ggttttgggc agggacaccg 60
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<210> 51
<211> 758
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> fliA/ MreB/ QseC dsRNA的第一臂的序列，该dsRNA用于同时靶向来自软腐欧文氏菌的FliA、reB、QseC基因
<400> 51
gtgagcgatt tgtataccgc cgaaggcaca atggataaaa attccctttg gaagcgctat 60
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cttgacgatc tgctacaggc tggtggtatc ggtttgctca gtgcagtcga gcgttatgat 180
tcgttgcaag gtacggcgtt tactacctat gccgttcaac gaatccgcgg ttcgatgctg 240
gatgaattac gatcatgttt aagaaatttc gtggcatgtt ttccaacgac ttgtccatcg 300
acctgggtac cgccaatacc ctgatttatg ttaaagggca gggcatcata ctgaatgaac 360
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gagtctggta cataagaacc gcggcaagca ggacgatg 758
<210> 52
<211> 758
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> fliA/ MreB/ QseC dsRNA的第二臂的序列，该dsRNA用于同时靶向来自软腐欧文氏菌的FliA、MreB、QseC基因
<400> 52
catcgtcctg cttgccgcgg ttcttatgta ccagactctt ggttttgggc agggacaccg 60
gctggattcg caattcatca ggattcatgg tggccagacg tttggcgaac agcatttgct 120
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cgccccagca gatcaaggtc agcagcgtaa aaccggtaat caggcgtagg cgcaggctga 240
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ccctttaaca taaatcaggg tattggcggt acccaggtcg atggacaagt cgttggaaaa 480
catgccacga aatttcttaa acatgatcgt aattcatcca gcatcgaacc gcggattcgt 540
tgaacggcat aggtagtaaa cgccgtacct tgcaacgaat cataacgctc gactgcactg 600
agcaaaccga taccaccagc ctgtagcaga tcgtcaagct caacactcgc ggggagacga 660
acctgtaaac gcaaggcttc atggcgcact agtggaacat agcgcttcca aagggaattt 720
ttatccattg tgccttcggc ggtatacaaa tcgctcac 758
<210> 53
<211> 758
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> GyrB/ MreB/ RsgA dsRNA的第一臂的序列，该dsRNA用于同时靶向来自软腐欧文氏菌的GyrB、MreB、RsgA基因
<400> 53
atgtcgaatt cttatgactc ctcaagtatc aaggtattga aagggctgga tgcggtacgt 60
aaacgcccag gtatgtatat cggcgatacg gatgacggta ccggcctgca tcacatggta 120
ttcgaggttg tggacaacgc tatcgacgaa gcgctcgctg gctattgtaa agacattatc 180
atcaccatcc atgccgataa ctcggtgtcg gtgcaggatg atggccgtgg tattccgacc 240
ggcattcatg gatcatgttt aagaaatttc gtggcatgtt ttccaacgac ttgtccatcg 300
acctgggtac cgccaatacc ctgatttatg ttaaagggca gggcatcata ctgaatgaac 360
cctctgtggt tgcgattcgt caggatcgtg ctggttccca aaaaagcgtg gcagcagtag 420
gccacgacgc taagcagatg ctgggcagaa cgcctgggaa tatcgtggcg attcgcccga 480
tgaaagacgg cgttattgcc gactatgcgt gagcaaaaag aaactgtcga aaggtcagca 540
gcgtcgggtt agcgcaaacc accagcgccg cctgaaaaaa acggaaagca aagtcgaatg 600
ggaagatagc caactgggcg acgcacagga aggcattatc atcagccgat tcggtatgca 660
cgccgatgtg gaagccaccg atggcgtggt gcaccgctgc aacattcgtc ggaccctttc 720
atcgctggtt actggcgatc gcgtcgtctg gcgcccag 758
<210> 54
<211> 758
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> GyrB/ MreB/ RsgA dsRNA的第二臂的序列，该dsRNA用于同时靶向来自软腐欧文氏菌的GyrB、MreB、RsgA基因
<400> 54
ctgggcgcca gacgacgcga tcgccagtaa ccagcgatga aagggtccga cgaatgttgc 60
agcggtgcac cacgccatcg gtggcttcca catcggcgtg cataccgaat cggctgatga 120
taatgccttc ctgtgcgtcg cccagttggc tatcttccca ttcgactttg ctttccgttt 180
ttttcaggcg gcgctggtgg tttgcgctaa cccgacgctg ctgacctttc gacagtttct 240
ttttgctcac gcatagtcgg caataacgcc gtctttcatc gggcgaatcg ccacgatatt 300
cccaggcgtt ctgcccagca tctgcttagc gtcgtggcct actgctgcca cgcttttttg 360
ggaaccagca cgatcctgac gaatcgcaac cacagagggt tcattcagta tgatgccctg 420
ccctttaaca taaatcaggg tattggcggt acccaggtcg atggacaagt cgttggaaaa 480
catgccacga aatttcttaa acatgatcca tgaatgccgg tcggaatacc acggccatca 540
tcctgcaccg acaccgagtt atcggcatgg atggtgatga taatgtcttt acaatagcca 600
gcgagcgctt cgtcgatagc gttgtccaca acctcgaata ccatgtgatg caggccggta 660
ccgtcatccg tatcgccgat atacatacct gggcgtttac gtaccgcatc cagccctttc 720
aataccttga tacttgagga gtcataagaa ttcgacat 758
<210> 55
<211> 920
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Wp012778355/wp015452784/WP012778510/wp015452939/act56857/wp012778668 dsRNA的第一臂的序列，该dsRNA用于同时靶向编码来自韧皮部杆菌亚洲种的这些蛋白的序列
<400> 55
gctatcgacc acagtaattg taaactgact aaaccaatta gttataacat tacgtgcaag 60
acttttggct ataggcatga cattctcgtc agaattaatt tcataatatt tagatggatc 120
acttgcacat tgtcttaaag tatatcgcgt gatcgtgata aaagaattag gtttgtctat 180
gttcataatg acgactatct ctggatgtgg tttggctagc agagaaaaga aaaaggtatt 240
tttgcataaa tcgaatgata cagatatcgt caataaaaga tttgggagct ctttagataa 300
agcaatgcat gtcaaaaaca aaacacttga aaaaaacaat atttttatcg aaaaaaggta 360
atataacaat attaacagcg ataatcatcc cattgattat taccttaata actatatcga 420
caacatgtgc aaatatttta taccataggg ctagcatagt gcatgaccgc aattataatt 480
tcggtatgct ttttgtttat cacctatgct atcgatttag cgcacattat gtacatacgg 540
aatcaaatgc aatctgcttt agatgctgct gttctttctg gatgtgcatc tattgtatca 600
gaccgaacaa taaagcatgg taaaaatacg atctcaatac ttttgtcaat cctgtggtga 660
aatccattcg cgttggattg gaaaatgtga ttcatgtaat gcatggaata ccatcatcga 720
ggatagttcc agaaaagaaa gcgatcaaag atttagcaaa acaatttcca atgaatattt 780
cagaaattaa caaatatttc cctcccaata ataatataga gaggaaagag atcgctgata 840
aattaatcaa aaatatctca attgttgaca aaacgatgga cgtattgcct ctgtatcatc 900
aagttcgcga attgacacaa 920
<210> 56
<211> 920
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Wp012778355/wp015452784/WP012778510/wp015452939/act56857/wp012778668 dsRNA的第二臂的序列，该dsRNA用于同时靶向编码来自韧皮部杆菌亚洲种的这些蛋白的序列
<400> 56
ttgtgtcaat tcgcgaactt gatgatacag aggcaatacg tccatcgttt tgtcaacaat 60
tgagatattt ttgattaatt tatcagcgat ctctttcctc tctatattat tattgggagg 120
gaaatatttg ttaatttctg aaatattcat tggaaattgt tttgctaaat ctttgatcgc 180
tttcttttct ggaactatcc tcgatgatgg tattccatgc attacatgaa tcacattttc 240
caatccaacg cgaatggatt tcaccacagg attgacaaaa gtattgagat cgtattttta 300
ccatgcttta ttgttcggtc tgatacaata gatgcacatc cagaaagaac agcagcatct 360
aaagcagatt gcatttgatt ccgtatgtac ataatgtgcg ctaaatcgat agcataggtg 420
ataaacaaaa agcataccga aattataatt gcggtcatgc actatgctag ccctatggta 480
taaaatattt gcacatgttg tcgatatagt tattaaggta ataatcaatg ggatgattat 540
cgctgttaat attgttatat tacctttttt cgataaaaat attgtttttt tcaagtgttt 600
tgtttttgac atgcattgct ttatctaaag agctcccaaa tcttttattg acgatatctg 660
tatcattcga tttatgcaaa aatacctttt tcttttctct gctagccaaa ccacatccag 720
agatagtcgt cattatgaac atagacaaac ctaattcttt tatcacgatc acgcgatata 780
ctttaagaca atgtgcaagt gatccatcta aatattatga aattaattct gacgagaatg 840
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caattactgt ggtcgatagc 920
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<211> 758
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Wp012778355/ wp015452784/WP012778510 dsRNA的第一臂的序列，该dsRNA用于同时靶向编码来自韧皮部杆菌的Wp012778355/wp015452784/WP012778510蛋白的序列
<400> 57
gctatcgacc acagtaattg taaactgact aaaccaatta gttataacat tacgtgcaag 60
acttttggct ataggcatga cattctcgtc agaattaatt tcataatatt tagatggatc 120
acttgcacat tgtcttaaag tatatcgcgt atcttgatcc ggagaaaatc ctacagaaaa 180
tatggtaatt gcacctcttc cagttctatg atgcttatgc atgtaatagc agtcttgcaa 240
aattctatct gatctgataa aagaattagg tttgtctatg ttcataatga cgactatctc 300
tggatgtggt ttggctagca gagaaaagaa aaaggtattt ttgcataaat cgaatgatac 360
agatatcgtc aataaaagat ttgggagctc tttagataaa gcagaagatg aatttcagat 420
gcaattacag gatacgggta tagttgttag tcgtataggt gatatgatta catgttatat 480
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atttttatcg aaaaaaggta atataacaat attaacagcg ataatcatcc cattgattat 600
taccttaata actatatcga caacatgtgc aaatatttta taccataggg ctagcataga 660
agcatccgct gacgaagcct taaatcatgg aatagtcctg ctatgtaagg attctgatct 720
tacaccgcaa gacatcaccc ctcccgtatt aaaagatc 758
<210> 58
<211> 758
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Wp012778355/ wp015452784/WP012778510 dsRNA的第二臂的序列，该dsRNA用于同时靶向编码来自韧皮部杆菌的Wp012778355/wp015452784/WP012778510蛋白的序列
<400> 58
gatcttttaa tacgggaggg gtgatgtctt gcggtgtaag atcagaatcc ttacatagca 60
ggactattcc atgatttaag gcttcgtcag cggatgcttc tatgctagcc ctatggtata 120
aaatatttgc acatgttgtc gatatagtta ttaaggtaat aatcaatggg atgattatcg 180
ctgttaatat tgttatatta ccttttttcg ataaaaatat tgtttttttc aagtgttttg 240
tttttgacat gcatgataca aaagaaacat gtactggtat ataacatgta atcatatcac 300
ctatacgact aacaactata cccgtatcct gtaattgcat ctgaaattca tcttctgctt 360
tatctaaaga gctcccaaat cttttattga cgatatctgt atcattcgat ttatgcaaaa 420
ataccttttt cttttctctg ctagccaaac cacatccaga gatagtcgtc attatgaaca 480
tagacaaacc taattctttt atcagatcag atagaatttt gcaagactgc tattacatgc 540
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> wp015452939/act56857/wp012778668 dsRNA的第一臂的序列，该dsRNA用于同时靶向编码来自韧皮部杆菌亚洲种的wp015452939/act56857/wp012778668蛋白的序列
<400> 59
atgaccgcaa ttataatttc ggtatgcttt ttgtttatca cctatgctat cgatttagcg 60
cacattatgt acatacggaa tcaaatgcaa tctgctttag atgctgctgt tctttctgga 120
tgtgcatcta ttgtatcaga ccgaacaata aaagatccga cgacaaaaaa ggatcaaaca 180
agtactatct tcaaaaaaca gatcaaaaag catctaaaac aaggatctta tataagagaa 240
aacgcaggag gatcatggta aaaatacgat ctcaatactt ttgtcaatcc tgtggtgaaa 300
tccattcgcg ttggattgga aaatgtgatt catgtaatgc atggaatacc atcatcgagg 360
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tgttgacaaa acgatggacg tattgcctct gtatcatcaa gttcgcgaat tgacacaaaa 660
caaagcttcc actgaacaag tcatcgatat ctcaacaaaa gtaaaagacg tcgcagtaga 720
cgtcgcagtg agcatgattc ctatttatgg cacttacc 758
<210> 60
<211> 758
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> wp015452939/act56857/wp012778668 dsRNA的第二臂的序列，该dsRNA用于同时靶向编码来自韧皮部杆菌的wp015452939/act56857/wp012778668蛋白的序列
<400> 60
ggtaagtgcc ataaatagga atcatgctca ctgcgacgtc tactgcgacg tcttttactt 60
ttgttgagat atcgatgact tgttcagtgg aagctttgtt ttgtgtcaat tcgcgaactt 120
gatgatacag aggcaatacg tccatcgttt tgtcaacaat tgagatattt ttgattaatt 180
tatcagcgat ctctttcctc tctatattat tattgggagg gaaatatttg ttaatttctg 240
aaatattcat gcatctgtga cacggtcgag ttcatcaata tgggtttgaa tgcgtgattc 300
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<210> 61
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> GyrB/ Hfq/ HrpR/HRPS/MreB/ RpoD dsRNA的第一臂的序列，该dsRNA用于同时靶向来自丁香假单胞菌猕猴桃致病变种的GyrB、Hfq、HrpR、HrpS、MreB、RpoD基因
<400> 61
atgagcgaaa accaaacgta cgactcgtcc agcattaaag tgctgaaagg acttgatgcc 60
gtacgcaagc gtcccggaat gtacatcggt gatacagacg atggcagcgg tctgcaccat 120
atggtgttcg aggtggttga taactcgatc gatcatgtca aaagggcatt cgctacaaga 180
cccttacttg aacaccttgc gaaaggagaa ggtcggcgtc tcgatctacc tggtcaacgg 240
tatcaagctg cagggaacga tcgagtcttt cgaccagttc gtcattttgc tgaaaaacac 300
tgtcatgcat gaatagcgcg ttcctggata tggacttgct gttgtgcggg gaaaccggca 360
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accctctgtc gttgccattc gtactcacgg caatcagaag agtgtcgtcc aatgtccgga 780
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ctgacttacg cagaggtcaa cgaccacctg cccgaggata tttcagatcc cgagcaggtg 900
gaagacatca tccgcatgat c 921
<210> 62
<211> 921
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> GyrB/ Hfq/ HrpR/HRPS/MreB/ RpoD dsRNA的第二臂的序列，该dsRNA用于同时靶向来自丁香假单胞菌猕猴桃致病变种的GyrB、Hfq、HrpR、HrpS、MreB、RpoD基因
<400> 62
gatcatgcgg atgatgtctt ccacctgctc gggatctgaa atatcctcgg gcaggtggtc 60
gttgacctct gcgtaagtca gatatttctg ctcacgaccc agggtgatca actctttgat 120
acgagactgc tgttgcgctt ttccggacat tggacgacac tcttctgatt gccgtgagta 180
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cacgtcgata cccagttgcg aaatactttc ggcaactatc cccagattcg gaacccgctc 420
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<210> 63
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> GyrB/ Hfq/ MreB dsRNA的第一臂的序列，该dsRNA用于同时靶向来自丁香假单胞菌猕猴桃致病变种的GyrB、Hfq、MreB基因
<400> 63
atgagcgaaa accaaacgta cgactcgtcc agcattaaag tgctgaaagg acttgatgcc 60
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<210> 64
<211> 758
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> GyrB/ Hfq/ MreB dsRNA的第二臂的序列，该dsRNA用于同时靶向来自丁香假单胞菌猕猴桃致病变种的GyrB、Hfq、MreB基因
<400> 64
cgctgaaatc ggcgatgacg ccgtctttca ttgggcgaat ggcggcaatg ttgcctggag 60
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<220>
<223> HrpR/ HrpS/Hfq dsRNA的第一臂的序列，该dsRNA用于同时靶向来自丁香假单胞菌猕猴桃致病变种的HrpR、HrpS、Hfq基因
<400> 65
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gacacactgg ccaaccgcat tcacgagttg tccagcaggt cgggaccctt tgtgggcatg 120
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ccagatggtc tacaaacacg ccatttccac cgtcgtaccg gttcgcccga ttcgcctgcc 720
tagcgctacc gacgctgacg gcgctgacgc cgagccag 758
<210> 66
<211> 758
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> HrpR/ HrpS/Hfq dsRNA的第二臂的序列，该dsRNA用于同时靶向来自丁香假单胞菌猕猴桃致病变种的HrpR、HrpS、Hfq基因
<400> 66
ctggctcggc gtcagcgccg tcagcgtcgg tagcgctagg caggcgaatc gggcgaaccg 60
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ttgcgaaata ctttcggcaa ctatccccag attcggaacc cgctcctcgt ccagatcatc 480
ctcaaacctt tcatcaagac tcatgatccc aggtacaacg tgccaccact ggaggcctct 540
atgtagccct cgcgagcccg gcatacgccg gtgaatgcgc cgttgaccac accgaataac 600
tggctctctg ccagcgactc gggaatggct gcgcagttca tgcccacaaa gggtcccgac 660
ctgctggaca actcgtgaat gcggttggcc agtgtgtcct tgccggtgcc ggtttccccg 720
cacaacagca agtccatatc caggaacgcg ctattcat 758
<210> 67
<211> 758
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> HrpR/ GyrB/ RpoD dsRNA的第一臂的序列，该dsRNA用于同时靶向来自丁香假单胞菌猕猴桃致病变种的HrpR、GyrB、RpoD基因
<400> 67
atgaatagcg cgttcctgga tatggacttg ctgttgtgcg gggaaaccgg caccggcaag 60
gacacactgg ccaaccgcat tcacgagttg tccagcaggt cgggaccctt tgtgggcatg 120
aactgcgcag ccattcccga gtcgctggca gagagccagt tattcggtgt ggtcaacggc 180
gcattcaccg gcgtatgccg ggctcgcgag ggctacatag aggcctccag tggtggcacg 240
ttgtacctgg gatcatgagc gaaaaccaaa cgtacgactc gtccagcatt aaagtgctga 300
aaggacttga tgccgtacgc aagcgtcccg gaatgtacat cggtgataca gacgatggca 360
gcggtctgca ccatatggtg ttcgaggtgg ttgataactc gatcgacgaa gcattggcag 420
gccattgcga cgacatcagc atcatcatcc atccagacga atctatcacc gtgcgcgaca 480
acggccgcgg tattccggta gacgatgcat gtccggaaaa gcgcaacagc agtctcgtat 540
caaagagttg atcaccctgg gtcgtgagca gaaatatctg acttacgcag aggtcaacga 600
ccacctgccc gaggatattt cagatcccga gcaggtggaa gacatcatcc gcatgatcaa 660
cgacatgggg atcccggtac acgagagtgc tccggatgcg gacgccttga tgctggccga 720
cgccgatacc gacgaggcag ccgcagaaga agcggctg 758
<210> 68
<211> 932
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> NPP1/INF1/GK4/piacwp1-1/piacwp1-2/piacwp1-3 dsRNA的第一臂的序列，该dsRNA用于同时靶向来自致病疫霉的NPP1、INF1、GK4、piacwp1-1、piacwp 1-2和piacwp1-3基因
<400> 68
cgcctccaag tcctcgagac tctccaccga catgaacatc cttcaactct tcgcatcggc 60
cgcagcagct cttactgtcg cgcatgccga tgtgatttca cacgatgcag tgatcccgtt 120
cgcccaaccc acaaccacca ctacaacaga gcaggatcgt ttgctgaccc ttccagtcct 180
agctccacaa cttccattgt gcaatttgct ctgttatccc cacccactcc tcctcactcc 240
gtccacgatg aactttcgtg ctctgttcgc tgccaccgtt gctgccctcg tcggctccac 300
ttccgccaat gcatggcgtt gtgcatccct gggtcgtcgc aaaacgcgtc ggcagccgcg 360
agtgtagcca gcacgagcga cagcaccaat ccgttcggcc gacggctact aaccagtgtc 420
gccagctccg cgagcgcagg tgacgatggc tacgtgcagc tcgaggtgca ggagagcgag 480
gaattgacga atgaacttgg cgctttcttt ttgcaaatcc cggagtatag cgagctgaca 540
cacccagcct gcctgtcgga attgtcccct ggcccacctt ttcacggagg agacagcggc 600
gctgtctccg accgcagact aagcctggac tctgcaagca ctcagatgga gattggcagt 660
ggcaggagag cgaggaattg aagaatgaac ttggcgcttt ctctttgcaa atcccggagt 720
atagcgagct gacacaccca gcctgcctgt cggaattgtc ccctggccca ccttttctcc 780
agcactcaga tggagattgg cagtggcagg agagcgagga attgacgaat gaacttggcg 840
ctttcttttt gcaaatcccg gagtatagcg agctgacaca cccagcctgc ctgtcggaat 900
tgtcccctgg cccacctttt cacggaggag ac 932
<210> 69
<211> 932
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> NPP1/INF1/GK4/piacwp1-1/piacwp1-2/piacwp1-3 dsRNA的第二臂的序列，该dsRNA用于同时靶向来自致病疫霉的NPP1、INF1、GK4、piacwp1-1、piacwp 1-2和piacwp1-3基因
<400> 69
gtctcctccg tgaaaaggtg ggccagggga caattccgac aggcaggctg ggtgtgtcag 60
ctcgctatac tccgggattt gcaaaaagaa agcgccaagt tcattcgtca attcctcgct 120
ctcctgccac tgccaatctc catctgagtg ctggagaaaa ggtgggccag gggacaattc 180
cgacaggcag gctgggtgtg tcagctcgct atactccggg atttgcaaag agaaagcgcc 240
aagttcattc ttcaattcct cgctctcctg ccactgccaa tctccatctg agtgcttgca 300
gagtccaggc ttagtctgcg gtcggagaca gcgccgctgt ctcctccgtg aaaaggtggg 360
ccaggggaca attccgacag gcaggctggg tgtgtcagct cgctatactc cgggatttgc 420
aaaaagaaag cgccaagttc attcgtcaat tcctcgctct cctgcacctc gagctgcacg 480
tagccatcgt cacctgcgct cgcggagctg gcgacactgg ttagtagccg tcggccgaac 540
ggattggtgc tgtcgctcgt gctggctaca ctcgcggctg ccgacgcgtt ttgcgacgac 600
ccagggatgc acaacgccat gcattggcgg aagtggagcc gacgagggca gcaacggtgg 660
cagcgaacag agcacgaaag ttcatcgtgg acggagtgag gaggagtggg tggggataac 720
agagcaaatt gcacaatgga agttgtggag ctaggactgg aagggtcagc aaacgatcct 780
gctctgttgt agtggtggtt gtgggttggg cgaacgggat cactgcatcg tgtgaaatca 840
catcggcatg cgcgacagta agagctgctg cggccgatgc gaagagttga aggatgttca 900
tgtcggtgga gagtctcgag gacttggagg cg 932
<210> 70
<211> 790
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> piacwp1-1/piacwp1-2/piacwp1-3 dsRNA的第一臂的序列，该dsRNA用于同时靶向来自致病疫霉的piacwp1-1、piacwp 1-2和piacwp1-3基因
<400> 70
aggagagcga ggaattgacg aatgaacttg gcgctttctt tttgcaaatc ccggagtata 60
gcgagctgac acacccagcc tgcctgtcgg aattgtcccc tggcccacct tttcacggag 120
gagacagcgg cgctgtctcc gcaccgcaga ctctggccca gagagcttac tggccatttt 180
acaattcgca cgctgagact caccctgaca tttctcgttc tttgcaccat ggtcttctcc 240
tctactacct gtattctgat cctggactct gcaagcactc agatggagat tggcagtggc 300
aggagagcga ggaattgaag aatgaacttg gcgctttctc tttgcaaatc ccggagtata 360
gcgagctgac acacccagcc tgcctgtcgg aattgtcccc tggcccacct tttcacggag 420
gagacagcgg cgctgtctcc gcaccgcaga ctctggccca gagagcttac tggccatttt 480
acaattcgca cgctgagact caccctgaca tttctcgttc tttgcaccat gccactcaga 540
tggagattgg cagtggcagg agagcgagga attgacgaat gaacttggcg ctttcttttt 600
gcaaatcccg gagtatagcg agctgacaca cccagcctgc ctgtcggaat tgtcccctgg 660
cccacctttt cacggaggag acagcggcgc tgtctccgca ccgcagactc tggcccagag 720
agcttactgg ccattttaca attcgcacgc tgagactcac cctgacattt ctcgttcttt 780
gcaccatggt 790
<210> 71
<211> 790
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> piacwp1-1/piacwp1-2/piacwp1-3 dsRNA的第二臂的序列，该dsRNA用于同时靶向来自致病疫霉的piacwp1-1、piacwp 1-2和piacwp1-3基因
<400> 71
accatggtgc aaagaacgag aaatgtcagg gtgagtctca gcgtgcgaat tgtaaaatgg 60
ccagtaagct ctctgggcca gagtctgcgg tgcggagaca gcgccgctgt ctcctccgtg 120
aaaaggtggg ccaggggaca attccgacag gcaggctggg tgtgtcagct cgctatactc 180
cgggatttgc aaaaagaaag cgccaagttc attcgtcaat tcctcgctct cctgccactg 240
ccaatctcca tctgagtggc atggtgcaaa gaacgagaaa tgtcagggtg agtctcagcg 300
tgcgaattgt aaaatggcca gtaagctctc tgggccagag tctgcggtgc ggagacagcg 360
ccgctgtctc ctccgtgaaa aggtgggcca ggggacaatt ccgacaggca ggctgggtgt 420
gtcagctcgc tatactccgg gatttgcaaa gagaaagcgc caagttcatt cttcaattcc 480
tcgctctcct gccactgcca atctccatct gagtgcttgc agagtccagg atcagaatac 540
aggtagtaga ggagaagacc atggtgcaaa gaacgagaaa tgtcagggtg agtctcagcg 600
tgcgaattgt aaaatggcca gtaagctctc tgggccagag tctgcggtgc ggagacagcg 660
ccgctgtctc ctccgtgaaa aggtgggcca ggggacaatt ccgacaggca ggctgggtgt 720
gtcagctcgc tatactccgg gatttgcaaa aagaaagcgc caagttcatt cgtcaattcc 780
tcgctctcct 790
<210> 72
<211> 781
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> GK4/ INF1/NPP1 dsRNA的第一臂的序列，该dsRNA用于同时靶向来自致病疫霉的GK4、INF1、NPP1基因
<400> 72
atggcgttgt gcatccctgg gtcgtcgcaa aacgcgtcgg cagccgcgag tgtagccagc 60
acgagcgaca gcaccaatcc gttcggccga cggctactaa ccagtgtcgc cagctccgcg 120
agcgcaggtg acgatggcta cgtgcagctc gagaccgagt tccctggcgc catagctatc 180
tccatggtcg tgaacgcact gtccctgctt ggcttcgctt tcattctcac cacgtacctg 240
ttgttcccac ccgtgcgaaa gcgatcgttt gctgaccctt ccagtcctag ctccacaact 300
tccattgtgc aatttgctct gttatcccca cccactcctc ctcactccgt ccacgatgaa 360
ctttcgtgct ctgttcgctg ccaccgttgc tgccctcgtc ggctccactt ccgccaccac 420
gtgcaccacc tcgcagcaga ccgtagcgta cgtggcgctc gtaagcatcc tctcggacac 480
gtcgtttaat cagtgctcga cggactccgg ctactcgaat gccgcctcca agtcctcgag 540
actctccacc gacatgaaca tccttcaact cttcgcatcg gccgcagcag ctcttactgt 600
cgcgcatgcc gatgtgattt cacacgatgc agtgatcccg ttcgcccaac ccacaaccac 660
cactacaaca gagcagaagg ctggtatcaa gttcaagccc cagatccaca tctcgaacgg 720
ctgccacccg taccctgcag tggatgcaga cggcaacacc agcggcggtc taaaccctac 780
g 781
<210> 73
<211> 781
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> GK4/ INF1/NPP1 dsRNA的第二臂的序列，该dsRNA用于同时靶向来自致病疫霉的GK4、INF1、NPP1基因
<400> 73
cgtagggttt agaccgccgc tggtgttgcc gtctgcatcc actgcagggt acgggtggca 60
gccgttcgag atgtggatct ggggcttgaa cttgatacca gccttctgct ctgttgtagt 120
ggtggttgtg ggttgggcga acgggatcac tgcatcgtgt gaaatcacat cggcatgcgc 180
gacagtaaga gctgctgcgg ccgatgcgaa gagttgaagg atgttcatgt cggtggagag 240
tctcgaggac ttggaggcgg cattcgagta gccggagtcc gtcgagcact gattaaacga 300
cgtgtccgag aggatgctta cgagcgccac gtacgctacg gtctgctgcg aggtggtgca 360
cgtggtggcg gaagtggagc cgacgagggc agcaacggtg gcagcgaaca gagcacgaaa 420
gttcatcgtg gacggagtga ggaggagtgg gtggggataa cagagcaaat tgcacaatgg 480
aagttgtgga gctaggactg gaagggtcag caaacgatcg ctttcgcacg ggtgggaaca 540
acaggtacgt ggtgagaatg aaagcgaagc caagcaggga cagtgcgttc acgaccatgg 600
agatagctat ggcgccaggg aactcggtct cgagctgcac gtagccatcg tcacctgcgc 660
tcgcggagct ggcgacactg gttagtagcc gtcggccgaa cggattggtg ctgtcgctcg 720
tgctggctac actcgcggct gccgacgcgt tttgcgacga cccagggatg cacaacgcca 780
t 781
<210> 74
<211> 802
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> GK4/ INF1/piacwp1.1 dsRNA的第一臂的序列，该dsRNA用于同时靶向来自致病疫霉的GK4、INF1、piacwp1.1基因
<400> 74
atggcgttgt gcatccctgg gtcgtcgcaa aacgcgtcgg cagccgcgag tgtagccagc 60
acgagcgaca gcaccaatcc gttcggccga cggctactaa ccagtgtcgc cagctccgcg 120
agcgcaggtg acgatggcta cgtgcagctc gagaccgagt tccctggcgc catagctatc 180
tccatggtcg tgaacgcact gtccctgctt ggcttcgctt tcattctcac cacgtacctg 240
ttgttcccac ccgtgcgaaa gcgatcgttt gctgaccctt ccagtcctag ctccacaact 300
tccattgtgc aatttgctct gttatcccca cccactcctc ctcactccgt ccacgatgaa 360
ctttcgtgct ctgttcgctg ccaccgttgc tgccctcgtc ggctccactt ccgccaccac 420
gtgcaccacc tcgcagcaga ccgtagcgta cgtggcgctc gtaagcatcc tctcggacac 480
gtcgtttaat cagtgctcga cggactccgg ctactcgaat gcaggagagc gaggaattga 540
cgaatgaact tggcgctttc tttttgcaaa tcccggagta tagcgagctg acacacccag 600
cctgcctgtc ggaattgtcc cctggcccac cttttcacgg aggagacagc ggcgctgtct 660
ccgcaccgca gactctggcc cagagagctt actggccatt ttacaattcg cacgctgaga 720
ctcaccctga catttctcgt tctttgcacc atggtcttct cctctactac ctgtattctg 780
ggtgtggcgg cgctcgcgtc gg 802
<210> 75
<211> 802
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> GK4/ INF1/piacwp1.1 dsRNA的第二臂的序列，该dsRNA用于同时靶向来自致病疫霉的GK4、INF1、piacwp1.1基因
<400> 75
ccgacgcgag cgccgccaca cccagaatac aggtagtaga ggagaagacc atggtgcaaa 60
gaacgagaaa tgtcagggtg agtctcagcg tgcgaattgt aaaatggcca gtaagctctc 120
tgggccagag tctgcggtgc ggagacagcg ccgctgtctc ctccgtgaaa aggtgggcca 180
ggggacaatt ccgacaggca ggctgggtgt gtcagctcgc tatactccgg gatttgcaaa 240
aagaaagcgc caagttcatt cgtcaattcc tcgctctcct gcattcgagt agccggagtc 300
cgtcgagcac tgattaaacg acgtgtccga gaggatgctt acgagcgcca cgtacgctac 360
ggtctgctgc gaggtggtgc acgtggtggc ggaagtggag ccgacgaggg cagcaacggt 420
ggcagcgaac agagcacgaa agttcatcgt ggacggagtg aggaggagtg ggtggggata 480
acagagcaaa ttgcacaatg gaagttgtgg agctaggact ggaagggtca gcaaacgatc 540
gctttcgcac gggtgggaac aacaggtacg tggtgagaat gaaagcgaag ccaagcaggg 600
acagtgcgtt cacgaccatg gagatagcta tggcgccagg gaactcggtc tcgagctgca 660
cgtagccatc gtcacctgcg ctcgcggagc tggcgacact ggttagtagc cgtcggccga 720
acggattggt gctgtcgctc gtgctggcta cactcgcggc tgccgacgcg ttttgcgacg 780
acccagggat gcacaacgcc at 802
<210> 76
<211> 1079
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TOR/ CGF1/ DCL1/DCL2/ LTF1/HBF1 dsRNA的第一臂的序列，该dsRNA用于同时靶向来自灰葡萄孢的TOR/ CGF1/ DCL1/DCL2/ LTF1/HBF1基因
<400> 76
atgtcacaac aatctaatca agcatttgat gctttgaatc gcattgtggc agatttaaga 60
tcacggagtg atgaacagcg aaagagagcg gccctggagt taagagagtt gcttgaggtt 120
gcttctagag actttcccca ggaacgatac acggaatttt ccaatattgt aagtggaaag 180
attagatcat gcatactcca tccatcaata tcttgctcgc tgtgggcctt ctcttctcta 240
ccccattcac atcagctctt actattcctt cgattgacaa gaagtctatc gctggcacag 300
gcatagaatc cattgagact cgtgatattc ctgctctcat caatcgtcac cacaccgatg 360
cgagtttaca tgttttatat atcttcaagc tttctacatt gggaaagatc ttgggcatat 420
ttcaaccgcc cgcaggagca caagcgaatg acgtctcgca gatgacgaga gacgcagcag 480
cagcaaaaag tctctaccat tggcgttggg tttctcctat cggatgaaac gctgggggtg 540
tgcgactgcc tgtaccgaca ttctcagcat ttcttatcga aattgagaat gtcgtacaaa 600
ggtaaaaaaa aaaaaatgac aaatgaaagt ccataaattc ccaaaatgga caactattcg 660
cggaaacaaa agaccccggt cgcaaaaaca aacgcctcat cttaaccacg actctctatc 720
tctcaaacaa gcatggaggg tgcggaaagt ggcagtaggt caagtggcat cctctccatc 780
atgaaccgtg aacatatcga gcgcataaat accgacacga gatatatgca atcaaatcca 840
atggctgcac caccgactgc cagtcctgcg tccgctcact actcaaacgg tgcaccatac 900
tccgcaggat ggccctccag agcgcacaac gtaacaatgg aaacttttcg aatttttctg 960
aaattctcgt cgatttcgac aaagaacgtc ctaagctcct tcttccggta tcattcaaag 1020
aagattttat gaaaaaaaaa acaaagtttg taatgttcta cgctcacgat caacctttg 1079
<210> 77
<211> 1079
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TOR/ CGF1/ DCL1/DCL2/ LTF1/HBF1 dsRNA的第二臂的序列，该dsRNA用于同时靶向来自灰葡萄孢的TOR、CGF1、DCL1、DCL2、LTF1、HBF1基因
<400> 77
caaaggttga tcgtgagcgt agaacattac aaactttgtt ttttttttca taaaatcttc 60
tttgaatgat accggaagaa ggagcttagg acgttctttg tcgaaatcga cgagaatttc 120
agaaaaattc gaaaagtttc cattgttacg ttgtgcgctc tggagggcca tcctgcggag 180
tatggtgcac cgtttgagta gtgagcggac gcaggactgg cagtcggtgg tgcagccatt 240
ggatttgatt gcatatatct cgtgtcggta tttatgcgct cgatatgttc acggttcatg 300
atggagagga tgccacttga cctactgcca ctttccgcac cctccatgct tgtttgagag 360
atagagagtc gtggttaaga tgaggcgttt gtttttgcga ccggggtctt ttgtttccgc 420
gaatagttgt ccattttggg aatttatgga ctttcatttg tcattttttt ttttttacct 480
ttgtacgaca ttctcaattt cgataagaaa tgctgagaat gtcggtacag gcagtcgcac 540
acccccagcg tttcatccga taggagaaac ccaacgccaa tggtagagac tttttgctgc 600
tgctgcgtct ctcgtcatct gcgagacgtc attcgcttgt gctcctgcgg gcggttgaaa 660
tatgcccaag atctttccca atgtagaaag cttgaagata tataaaacat gtaaactcgc 720
atcggtgtgg tgacgattga tgagagcagg aatatcacga gtctcaatgg attctatgcc 780
tgtgccagcg atagacttct tgtcaatcga aggaatagta agagctgatg tgaatggggt 840
agagaagaga aggcccacag cgagcaagat attgatggat ggagtatgca tgatctaatc 900
tttccactta caatattgga aaattccgtg tatcgttcct ggggaaagtc tctagaagca 960
acctcaagca actctcttaa ctccagggcc gctctctttc gctgttcatc actccgtgat 1020
cttaaatctg ccacaatgcg attcaaagca tcaaatgctt gattagattg ttgtgacat 1079
<210> 78
<211> 797
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TOR/ DCL1/DCL2 dsRNA的第一臂的序列，该dsRNA用于同时靶向来自灰葡萄孢的TOR、DCL1、DCL2基因
<400> 78
atgtcacaac aatctaatca agcatttgat gctttgaatc gcattgtggc agatttaaga 60
tcacggagtg atgaacagcg aaagagagcg gccctggagt taagagagtt gcttgaggtt 120
gcttctagag actttcccca ggaacgatac acggaatttt ccaatattgt aagtggaaag 180
attaccagcc tcatcggtca ccatggagat gttgagcgaa ctggtggtat atatgctatc 240
gatgcgctgg tcgattttga cggtgatcga gtttacatgt tttatatatc ttcaagcttt 300
ctacattggg aaagatcttg ggcatatttc aaccgcccgc aggagcacaa gcgaatgacg 360
tctcgcagat gacgagagac gcagcagcag caaaaagtct ctaccattgg cgttgggttt 420
ctcctatcgg atgaaacgct gggggtgagg ggacgttcac ttcttctgaa taacacaacc 480
agataacaat aacaagaatt caatttctcc cgcctctcac ctcccaatgc gactgcctgt 540
accgacattc tcagcatttc ttatcgaaat tgagaatgtc gtacaaaggt aaaaaaaaaa 600
aaatgacaaa tgaaagtcca taaattccca aaatggacaa ctattcgcgg aaacaaaaga 660
ccccggtcgc aaaaacaaac gcctcatctt aaccacgact ctctatctct caaacccaca 720
tcgctcttcc acaattcctc attcccagtt agggttttta gtctaacgaa tcattttcgc 780
tctccggctt ctttcga 797
<210> 79
<211> 797
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TOR/ DCL1/DCL2 dsRNA的第二臂的序列，该dsRNA用于同时靶向来自灰葡萄孢的TOR、DCL1、DCL2基因
<400> 79
tcgaaagaag ccggagagcg aaaatgattc gttagactaa aaaccctaac tgggaatgag 60
gaattgtgga agagcgatgt gggtttgaga gatagagagt cgtggttaag atgaggcgtt 120
tgtttttgcg accggggtct tttgtttccg cgaatagttg tccattttgg gaatttatgg 180
actttcattt gtcatttttt tttttttacc tttgtacgac attctcaatt tcgataagaa 240
atgctgagaa tgtcggtaca ggcagtcgca ttgggaggtg agaggcggga gaaattgaat 300
tcttgttatt gttatctggt tgtgttattc agaagaagtg aacgtcccct cacccccagc 360
gtttcatccg ataggagaaa cccaacgcca atggtagaga ctttttgctg ctgctgcgtc 420
tctcgtcatc tgcgagacgt cattcgcttg tgctcctgcg ggcggttgaa atatgcccaa 480
gatctttccc aatgtagaaa gcttgaagat atataaaaca tgtaaactcg atcaccgtca 540
aaatcgacca gcgcatcgat agcatatata ccaccagttc gctcaacatc tccatggtga 600
ccgatgaggc tggtaatctt tccacttaca atattggaaa attccgtgta tcgttcctgg 660
ggaaagtctc tagaagcaac ctcaagcaac tctcttaact ccagggccgc tctctttcgc 720
tgttcatcac tccgtgatct taaatctgcc acaatgcgat tcaaagcatc aaatgcttga 780
ttagattgtt gtgacat 797
<210> 80
<211> 811
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CGF1/HBF1/LTF1 dsRNA的第一臂的序列，该dsRNA用于同时靶向来自灰葡萄孢的CGF1、HBF1、LTF1基因
<400> 80
atgcatactc catccatcaa tatcttgctc gctgtgggcc ttctcttctc taccccattc 60
acatcagctc ttactattcc ttcgattgac aagaagtcta tcgctggcac aggcatagaa 120
tccattgaga ctcgtgatat tcctgctctc atcaatcgtc accacaccga ggcccagatc 180
gccgctaagg cgggaaaggc aaaaggaaaa ggacagcgcg atgttttaga gagagagccg 240
catcacactg aagcacagat tgcagcaaag aaagcaaaag gatcgagcgc acaacgtaac 300
aatggaaact tttcgaattt ttctgaaatt ctcgtcgatt tcgacaaaga acgtcctaag 360
ctccttcttc cggtatcatt caaagaagat tttatgaaaa aaaaaacaaa gtttgtaatg 420
ttctacgctc acgatcaacc tttgacttca acggattgcc atcacataca caaaattctc 480
ctggcacatt atcaacgatt cattcaagtc taccgtcaac tcgtagacag ctaaaagctg 540
taaaatgcat ggagggtgcg gaaagtggca gtaggtcaag tggcatcctc tccatcatga 600
accgtgaaca tatcgagcgc ataaataccg acacgagata tatgcaatca aatccaatgg 660
ctgcaccacc gactgccagt cctgcgtccg ctcactactc aaacggtgca ccatactccg 720
caggatggcc cagtacttct catggcggtt taatatctcc tccagagtcg cggaggacgt 780
ccaacgacaa agcgcacccg catccattgc a 811
<210> 81
<211> 811
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CGF1/HBF1/LTF1 dsRNA的第二臂的序列，该dsRNA用于同时靶向来自灰葡萄孢的CGF1、HBF1、LTF1基因
<400> 81
tgcaatggat gcgggtgcgc tttgtcgttg gacgtcctcc gcgactctgg aggagatatt 60
aaaccgccat gagaagtact gggccatcct gcggagtatg gtgcaccgtt tgagtagtga 120
gcggacgcag gactggcagt cggtggtgca gccattggat ttgattgcat atatctcgtg 180
tcggtattta tgcgctcgat atgttcacgg ttcatgatgg agaggatgcc acttgaccta 240
ctgccacttt ccgcaccctc catgcatttt acagctttta gctgtctacg agttgacggt 300
agacttgaat gaatcgttga taatgtgcca ggagaatttt gtgtatgtga tggcaatccg 360
ttgaagtcaa aggttgatcg tgagcgtaga acattacaaa ctttgttttt tttttcataa 420
aatcttcttt gaatgatacc ggaagaagga gcttaggacg ttctttgtcg aaatcgacga 480
gaatttcaga aaaattcgaa aagtttccat tgttacgttg tgcgctcgat ccttttgctt 540
tctttgctgc aatctgtgct tcagtgtgat gcggctctct ctctaaaaca tcgcgctgtc 600
cttttccttt tgcctttccc gccttagcgg cgatctgggc ctcggtgtgg tgacgattga 660
tgagagcagg aatatcacga gtctcaatgg attctatgcc tgtgccagcg atagacttct 720
tgtcaatcga aggaatagta agagctgatg tgaatggggt agagaagaga aggcccacag 780
cgagcaagat attgatggat ggagtatgca t 811
<210> 82
<211> 771
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> DCL1/ HBF1/TOR dsRNA的第一臂的序列，该dsRNA用于同时靶向来自灰葡萄孢的DCL1、HBF1、TOR基因
<400> 82
gagtttacat gttttatata tcttcaagct ttctacattg ggaaagatct tgggcatatt 60
tcaaccgccc gcaggagcac aagcgaatga cgtctcgcag atgacgagag acgcagcagc 120
agcaaaaagt ctctaccatt ggcgttgggt ttctcctatc ggatgaaacg ctgggggtga 180
ggggacgttc acttcttctg aataacacaa ccagataaca ataacaagaa ttcaatttct 240
cccgcctctc acctcccaac agatcgagcg cacaacgtaa caatggaaac ttttcgaatt 300
tttctgaaat tctcgtcgat ttcgacaaag aacgtcctaa gctccttctt ccggtatcat 360
tcaaagaaga ttttatgaaa aaaaaaacaa agtttgtaat gttctacgct cacgatcaac 420
ctttgacttc aacggattgc catcacatac acaaaattct cctggcacat tatcaacgat 480
tcattcaagt ctaccgtcaa ctcgtatgca tgtcacaaca atctaatcaa gcatttgatg 540
ctttgaatcg cattgtggca gatttaagat cacggagtga tgaacagcga aagagagcgg 600
ccctggagtt aagagagttg cttgaggttg cttctagaga ctttccccag gaacgataca 660
cggaattttc caatattgta agtggaaaga ttaccagcct catcggtcac catggagatg 720
ttgagcgaac tggtggtata tatgctatcg atgcgctggt cgattttgac g 771
<210> 83
<211> 771
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> DCL1/ HBF1/TOR dsRNA的第二臂的序列，该dsRNA用于同时靶向来自灰葡萄孢的DCL1、HBF1、TOR基因
<400> 83
cgtcaaaatc gaccagcgca tcgatagcat atataccacc agttcgctca acatctccat 60
ggtgaccgat gaggctggta atctttccac ttacaatatt ggaaaattcc gtgtatcgtt 120
cctggggaaa gtctctagaa gcaacctcaa gcaactctct taactccagg gccgctctct 180
ttcgctgttc atcactccgt gatcttaaat ctgccacaat gcgattcaaa gcatcaaatg 240
cttgattaga ttgttgtgac atgcatacga gttgacggta gacttgaatg aatcgttgat 300
aatgtgccag gagaattttg tgtatgtgat ggcaatccgt tgaagtcaaa ggttgatcgt 360
gagcgtagaa cattacaaac tttgtttttt ttttcataaa atcttctttg aatgataccg 420
gaagaaggag cttaggacgt tctttgtcga aatcgacgag aatttcagaa aaattcgaaa 480
agtttccatt gttacgttgt gcgctcgatc tgttgggagg tgagaggcgg gagaaattga 540
attcttgtta ttgttatctg gttgtgttat tcagaagaag tgaacgtccc ctcaccccca 600
gcgtttcatc cgataggaga aacccaacgc caatggtaga gactttttgc tgctgctgcg 660
tctctcgtca tctgcgagac gtcattcgct tgtgctcctg cgggcggttg aaatatgccc 720
aagatctttc ccaatgtaga aagcttgaag atatataaaa catgtaaact c 771
<210> 84
<211> 947
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用于同时靶向来自希金斯刺盘孢的CclA/ ACS1/ ACS2/ ELP1/ ELP2/ MOB2基因的dsRNA的第一臂的序列
<400> 84
atggcgtccg actcgggtac tccccctcct ccttgggagc cgactctgag cggttccctt 60
cctgcctcaa ccgcgatccc gttgaagcgc gccgccctcg aggaggattt tactccctct 120
gtaccatctc ctctcaatcc agacgtccga tcaacaccga tctgaccaaa agccgtgatt 180
ggtggtggca cgaggaggtc gagaagtggc ctgcctactt cccccccgag cgtgtcaact 240
ccgaggaccc cttgttcctc ctctacacct ccggctctac cggtaagccc aaaggtgtca 300
tgcacaccac cggagatgca tgggcgactt acaccctcaa gacgaggtcc tgcgccgttc 360
cctcgaggac cccgaggggt tctgggccca ccaggccgag catctgcact ggcacaagaa 420
accctcgtcc gcattgaaag tctccaaaaa gacgctcaag ggcggcatca gtgcatgcag 480
atctccgaac tcttctccat cctggctgtc gtcggcgttg ccgccgccct ccctcaggct 540
accccgacca cgcccactcc caccagcgcg tcggccgcgg ccacaatttc ggccacctcc 600
tcgccgacct gctcccccgg cccggtcata agcatgcagt tctccatctt caccgtcctt 660
gccgctgctg ccagcttcgc tgttgctctc cctgtctgtg acgccactac cacggccact 720
actaccagcg ccgctgcgaa cccctcccct actaccagcg gtgctgcgaa cccctcccct 780
acttgctcca atggacgacc agggtagctt gaccgacgga gacagcatcc tcaactccta 840
ccatctccct cggcccatgc ctatctggct caactccaac tatggcaagc atattgtcaa 900
gggcaacttc atgaccctca gcgcgagacc caagacggtc gagcagg 947
<210> 85
<211> 947
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用于同时靶向来自希金斯刺盘孢的CclA/ ACS1/ ACS2/ ELP1/ ELP2/ MOB2基因的dsRNA的第二臂的序列
<400> 85
cctgctcgac cgtcttgggt ctcgcgctga gggtcatgaa gttgcccttg acaatatgct 60
tgccatagtt ggagttgagc cagataggca tgggccgagg gagatggtag gagttgagga 120
tgctgtctcc gtcggtcaag ctaccctggt cgtccattgg agcaagtagg ggaggggttc 180
gcagcaccgc tggtagtagg ggaggggttc gcagcggcgc tggtagtagt ggccgtggta 240
gtggcgtcac agacagggag agcaacagcg aagctggcag cagcggcaag gacggtgaag 300
atggagaact gcatgcttat gaccgggccg ggggagcagg tcggcgagga ggtggccgaa 360
attgtggccg cggccgacgc gctggtggga gtgggcgtgg tcggggtagc ctgagggagg 420
gcggcggcaa cgccgacgac agccaggatg gagaagagtt cggagatctg catgcactga 480
tgccgccctt gagcgtcttt ttggagactt tcaatgcgga cgagggtttc ttgtgccagt 540
gcagatgctc ggcctggtgg gcccagaacc cctcggggtc ctcgagggaa cggcgcagga 600
cctcgtcttg agggtgtaag tcgcccatgc atctccggtg gtgtgcatga cacctttggg 660
cttaccggta gagccggagg tgtagaggag gaacaagggg tcctcggagt tgacacgctc 720
gggggggaag taggcaggcc acttctcgac ctcctcgtgc caccaccaat cacggctttt 780
ggtcagatcg gtgttgatcg gacgtctgga ttgagaggag atggtacaga gggagtaaaa 840
tcctcctcga gggcggcgcg cttcaacggg atcgcggttg aggcaggaag ggaaccgctc 900
agagtcggct cccaaggagg agggggagta cccgagtcgg acgccat 947
<210> 86
<211> 792
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CclA/ ACS1/ ACS2 dsRNA的第一臂的序列，该dsRNA用于同时靶向来自希金斯刺盘孢的CclA/ ACS1/ ACS2基因
<400> 86
atggcgtccg actcgggtac tccccctcct ccttgggagc cgactctgag cggttccctt 60
cctgcctcaa ccgcgatccc gttgaagcgc gccgccctcg aggaggattt tactccctct 120
gtaccatctc ctctcaatcc agacgtccga tcaacaccga aacctcaagg cgtcgacgac 180
atgcctgcta agcgcaacaa aaaggagtcg ctgaagaagc gcgagtccaa gggcgctttc 240
ggcggcgaca gcaaccgatc atgaccaaaa gccgtgattg gtggtggcac gaggaggtcg 300
agaagtggcc tgcctacttc ccccccgagc gtgtcaactc cgaggacccc ttgttcctcc 360
tctacacctc cggctctacc ggtaagccca aaggtgtcat gcacaccacc ggaggctacc 420
tggtcggcgc cgccgccacc ggcaagtacg ttttcgacat ccacgacggc gaccgctact 480
tttgtggtgg tgacgttggc tggattaccg gtcacaccta cgttatgcat gggcgactta 540
caccctcaag acgaggtcct gcgccgttcc ctcgaggacc ccgaggggtt ctgggcccac 600
caggccgagc atctgcactg gcacaagaaa ccctcgtccg cattgaaagt ctccaaaaag 660
acgctcaagg gcggcatcac acacgacaca tgggaatggt tcccggacgg cgagatctcg 720
acctgcttca actgcgtcga ccgccacgtc cacgacggca aaggcgatgc cccggcgatc 780
ttctacgaca gc 792
<210> 87
<211> 792
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CclA/ ACS1/ ACS2 dsRNA的第二臂的序列，该dsRNA用于同时靶向来自希金斯刺盘孢的CclA/ ACS1/ ACS2基因
<400> 87
gctgtcgtag aagatcgccg gggcatcgcc tttgccgtcg tggacgtggc ggtcgacgca 60
gttgaagcag gtcgagatct cgccgtccgg gaaccattcc catgtgtcgt gtgtgatgcc 120
gcccttgagc gtctttttgg agactttcaa tgcggacgag ggtttcttgt gccagtgcag 180
atgctcggcc tggtgggccc agaacccctc ggggtcctcg agggaacggc gcaggacctc 240
gtcttgaggg tgtaagtcgc ccatgcataa cgtaggtgtg accggtaatc cagccaacgt 300
caccaccaca aaagtagcgg tcgccgtcgt ggatgtcgaa aacgtacttg ccggtggcgg 360
cggcgccgac caggtagcct ccggtggtgt gcatgacacc tttgggctta ccggtagagc 420
cggaggtgta gaggaggaac aaggggtcct cggagttgac acgctcgggg gggaagtagg 480
caggccactt ctcgacctcc tcgtgccacc accaatcacg gcttttggtc atgatcggtt 540
gctgtcgccg ccgaaagcgc ccttggactc gcgcttcttc agcgactcct ttttgttgcg 600
cttagcaggc atgtcgtcga cgccttgagg tttcggtgtt gatcggacgt ctggattgag 660
aggagatggt acagagggag taaaatcctc ctcgagggcg gcgcgcttca acgggatcgc 720
ggttgaggca ggaagggaac cgctcagagt cggctcccaa ggaggagggg gagtacccga 780
gtcggacgcc at 792
<210> 88
<211> 792
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ELP1/ ELP2/ MOB2 dsRNA的第一臂的序列，该dsRNA用于同时靶向来自希金斯刺盘孢的ELP1/ ELP2/ MOB2基因
<400> 88
atgcagatct ccgaactctt ctccatcctg gctgtcgtcg gcgttgccgc cgccctccct 60
caggctaccc cgaccacgcc cactcccacc agcgcgtcgg ccgcggccac aatttcggcc 120
acctcctcgc cgacctgctc ccccggcccg gtcattgact acaccgtcgt ctcgggcgac 180
accctgacca tcatctcgca gagattcagc tccggcatct gcaacatcgc cgacgcgagc 240
ggcatcacca accccaactg atcatgcagt tctccatctt caccgtcctt gccgctgctg 300
ccagcttcgc tgttgctctc cctgtctgtg acgccactac cacggccact actaccagcg 360
ccgctgcgaa cccctcccct actaccagcg gtgctgcgaa cccctcccct acttgcggca 420
agcttggaga tttccacaag accaccgtta aggctggcca gaccttgacg accatcgccg 480
agcgcttcca ctccggtatc tgtgacatcg cctggcagaa tgcatggacg accagggtag 540
cttgaccgac ggagacagca tcctcaactc ctaccatctc cctcggccca tgcctatctg 600
gctcaactcc aactatggca agcatattgt caagggcaac ttcatgaccc tcagcgcgag 660
acccaagacg gtcgagcagg gcgagtggat cgctcaccag gtcgtcgagc actacagaaa 720
cctctggaat tttgttcgtg ttctccacga gaaggaggag gatggctcga ctatctgcaa 780
tgccaccacc tg 792
<210> 89
<211> 792
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ELP1/ ELP2/ MOB2 dsRNA的第二臂的序列，该dsRNA用于同时靶向来自希金斯刺盘孢的ELP1、ELP2和MOB2基因
<400> 89
caggtggtgg cattgcagat agtcgagcca tcctcctcct tctcgtggag aacacgaaca 60
aaattccaga ggtttctgta gtgctcgacg acctggtgag cgatccactc gccctgctcg 120
accgtcttgg gtctcgcgct gagggtcatg aagttgccct tgacaatatg cttgccatag 180
ttggagttga gccagatagg catgggccga gggagatggt aggagttgag gatgctgtct 240
ccgtcggtca agctaccctg gtcgtccatg cattctgcca ggcgatgtca cagataccgg 300
agtggaagcg ctcggcgatg gtcgtcaagg tctggccagc cttaacggtg gtcttgtgga 360
aatctccaag cttgccgcaa gtaggggagg ggttcgcagc accgctggta gtaggggagg 420
ggttcgcagc ggcgctggta gtagtggccg tggtagtggc gtcacagaca gggagagcaa 480
cagcgaagct ggcagcagcg gcaaggacgg tgaagatgga gaactgcatg atcagttggg 540
gttggtgatg ccgctcgcgt cggcgatgtt gcagatgccg gagctgaatc tctgcgagat 600
gatggtcagg gtgtcgcccg agacgacggt gtagtcaatg accgggccgg gggagcaggt 660
cggcgaggag gtggccgaaa ttgtggccgc ggccgacgcg ctggtgggag tgggcgtggt 720
cggggtagcc tgagggaggg cggcggcaac gccgacgaca gccaggatgg agaagagttc 780
ggagatctgc at 792
<210> 90
<211> 500
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CFA6/HRPL dsRNA的第一臂的序列，该dsRNA用于同时靶向Pto DC3000的HrpL和Cfa6基因
<400> 90
atgaacaagc gctacggcaa caacttgccg ggatcctgtt gcgcgctgag caaccggatc 60
gactggacgt caccttcgcg cagcacgcca tctggcaaaa aggccgccgt taatcgtttc 120
caatatttct gcaggagtct gcccgtgacc accttcaccg tgcccctgat tctgtcggat 180
gcaagcccca cggcactcgc cgctaccgcg caacgtctgc gcgccgagca cgagacgcgc 240
tccttcgccg ctgatgactg acatcaccgt gcccttccag ctcggaatgc acttcgtctt 300
cccagctttc ctgatacggc tgacgataca ttttgcggaa gtgattgcgg atcaggttca 360
gcgcgatgcc acacagccag gtctgcggtt tgctggcatg ttgaaacttg tgctcgttac 420
gcagggcttc aagaaacacg cactggagaa tgtcatccac atcatcaggg ttcatcaccc 480
gcttttggat aaacgccctg 500
<210> 91
<211> 500
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CFA6/HRPL dsRNA的第二臂的序列，该dsRNA用于同时靶向Pto DC3000的HrpL和Cfa6基因
<400> 91
cagggcgttt atccaaaagc gggtgatgaa ccctgatgat gtggatgaca ttctccagtg 60
cgtgtttctt gaagccctgc gtaacgagca caagtttcaa catgccagca aaccgcagac 120
ctggctgtgt ggcatcgcgc tgaacctgat ccgcaatcac ttccgcaaaa tgtatcgtca 180
gccgtatcag gaaagctggg aagacgaagt gcattccgag ctggaagggc acggtgatgt 240
cagtcatcag cggcgaagga gcgcgtctcg tgctcggcgc gcagacgttg cgcggtagcg 300
gcgagtgccg tggggcttgc atccgacaga atcaggggca cggtgaaggt ggtcacgggc 360
agactcctgc agaaatattg gaaacgatta acggcggcct ttttgccaga tggcgtgctg 420
cgcgaaggtg acgtccagtc gatccggttg ctcagcgcgc aacaggatcc cggcaagttg 480
ttgccgtagc gcttgttcat 500
<210> 92
<211> 348
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> HRPL dsRNA的第一臂的序列，该dsRNA用于靶向Pto DC3000的HrpL基因
<400> 92
ctgatgactg acatcaccgt gcccttccag ctcggaatgc acttcgtctt cccagctttc 60
ctgatacggc tgacgataca ttttgcggaa gtgattgcgg atcaggttca gcgcgatgcc 120
acacagccag gtctgcggtt tgctggcatg ttgaaacttg tgctcgttac gcagggcttc 180
aagaaacacg cactggagaa tgtcatccac atcatcaggg ttcatcaccc gcttttggat 240
aaacgccctg agcatctgaa tctgatcggc cgtcatttgg cgaataccgg cggacgaaga 300
tggctgacgg ggctgggttg agtcgaggat cacaatcttc tgaaacat 348
<210> 93
<211> 348
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> HRPL dsRNA的第二臂的序列，该dsRNA用于靶向Pto DC3000的HrpL基因
<400> 93
atgtttcaga agattgtgat cctcgactca acccagcccc gtcagccatc ttcgtccgcc 60
ggtattcgcc aaatgacggc cgatcagatt cagatgctca gggcgtttat ccaaaagcgg 120
gtgatgaacc ctgatgatgt ggatgacatt ctccagtgcg tgtttcttga agccctgcgt 180
aacgagcaca agtttcaaca tgccagcaaa ccgcagacct ggctgtgtgg catcgcgctg 240
aacctgatcc gcaatcactt ccgcaaaatg tatcgtcagc cgtatcagga aagctgggaa 300
gacgaagtgc attccgagct ggaagggcac ggtgatgtca gtcatcag 348
<210> 94
<211> 400
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> AvrPto/AvrPtoB dsRNA的第一臂的序列，该dsRNA用于靶向Pto DC3000的AvrPto和AvrPtoB基因
<400> 94
atgggaaata tatgtgtcgg cggatccagg atggcccatc aggtgaactc cccagaccga 60
gttagtaaca actcgggtga cgaagataac gtaacgtcca gtcaactgct gagcgtcaga 120
catcaacttg cggagtctgc tggtgtacca agagatcagc atgaatttgt tagtaaccaa 180
gcacctcaaa gcctgagaaa atggcgggta tcaatagagc gggaccatcg ggcgcttatt 240
ttgttggcca cacagacccc gagccagtat cggggcaagc acacggatcc ggcagcggcg 300
ccagctcctc gaacagtccg caggttcagc cgcgaccctc gaatactccc ccgtcgaacg 360
cgcccgcacc gccgccaacc ggacgtgaga ggctttcacg 400
<210> 95
<211> 400
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> AvrPto/AvrPtoB dsRNA的第二臂的序列，该dsRNA用于靶向Pto DC3000的AvrPto和AvrPtoB基因
<400> 95
cgtgaaagcc tctcacgtcc ggttggcggc ggtgcgggcg cgttcgacgg gggagtattc 60
gagggtcgcg gctgaacctg cggactgttc gaggagctgg cgccgctgcc ggatccgtgt 120
gcttgccccg atactggctc ggggtctgtg tggccaacaa aataagcgcc cgatggtccc 180
gctctattga tacccgccat tttctcaggc tttgaggtgc ttggttacta acaaattcat 240
gctgatctct tggtacacca gcagactccg caagttgatg tctgacgctc agcagttgac 300
tggacgttac gttatcttcg tcacccgagt tgttactaac tcggtctggg gagttcacct 360
gatgggccat cctggatccg ccgacacata tatttcccat 400
<210> 96
<211> 752
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CYP51 dsRNA的第一臂的序列，该dsRNA用于靶向禾谷镰刀菌的FgCYP51A、FgCYP51B和FgCYP51C基因
<400> 96
cagcaagttt gacgagtccc tggccgctct ctaccacgac ctcgatatgg gcttcacccc 60
catcaacttc atgcttcact gggcccctct cccctggaac cgtaagcgcg accacgccca 120
gcgcactgtt gccaagatct acatggacac tatcaaggag cgccgcgcca agggcaacaa 180
cgaatccgag catgacatga tgaagcacct tatgaactct cggtccattg acaatccccg 240
tctttggtag cgatgtcgta tacgattgtc ccaactcgaa gctcatggaa caaaagaagt 300
ttgtcaagtt tggccttacg caaaaagcac tcgagtcaca cgtccagtta atcgagcgag 360
aggttcttga ctacgtcgaa actgatccat ccttttctgg cagaactagc accatcgatg 420
tccccaaggc aatggctgag ataacaatct ttactgcctc acgttctttg cagggtgagg 480
aagttcggag aaaactcact gccgagtttg ctgcattgga agcaccgtac aatatggcat 540
cgacccgtac gcttttttct tcgactgcag agataaatac ggcgactgct ttacctttat 600
tctccttggc aaatcaacga ctgtctttct tggtcccaag ggcaatgact ttatcctcaa 660
cggcaaacac gccgatctca acgccgagga cgtttatggg aaacttacca cgcccgtgtt 720
tggtgaggag gttgtttatg actgctccaa tg 752
<210> 97
<211> 752
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CYP51 dsRNA的第二臂的序列，该dsRNA用于靶向禾谷镰刀菌的FgCYP51A、FgCYP51B和FgCYP51C基因
<400> 97
cattggagca gtcataaaca acctcctcac caaacacggg cgtggtaagt ttcccataaa 60
cgtcctcggc gttgagatcg gcgtgtttgc cgttgaggat aaagtcattg cccttgggac 120
caagaaagac agtcgttgat ttgccaagga gaataaaggt aaagcagtcg ccgtatttat 180
ctctgcagtc gaagaaaaaa gcgtacgggt cgatgccata ttgtacggtg cttccaatgc 240
agcaaactcg gcagtgagtt ttctccgaac ttcctcaccc tgcaaagaac gtgaggcagt 300
aaagattgtt atctcagcca ttgccttggg gacatcgatg gtgctagttc tgccagaaaa 360
ggatggatca gtttcgacgt agtcaagaac ctctcgctcg attaactgga cgtgtgactc 420
gagtgctttt tgcgtaaggc caaacttgac aaacttcttt tgttccatga gcttcgagtt 480
gggacaatcg tatacgacat cgctaccaaa gacggggatt gtcaatggac cgagagttca 540
taaggtgctt catcatgtca tgctcggatt cgttgttgcc cttggcgcgg cgctccttga 600
tagtgtccat gtagatcttg gcaacagtgc gctgggcgtg gtcgcgctta cggttccagg 660
ggagaggggc ccagtgaagc atgaagttga tgggggtgaa gcccatatcg aggtcgtggt 720
agagagcggc cagggactcg tcaaacttgc tg 752
<210> 98
<211> 667
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> HRPG/HRPB/HRCC dsRNA的第一臂的序列，该dsRNA用于同时靶向青枯雷尔氏菌的HrpG、HrpB和HrcC基因
<400> 98
cgcatgcctg gccgtgcaga acgtggaatg tgtccggttc gacgatgccc tgacgctgtt 60
gcgtgcacgg cgtaccgagg cattcagtct gctgctgatc gatgcccagc agttccgcag 120
cgcgggacag ctggtgctgt cctggcgcga gtgcaacgcc gacatgtgct ggccgacgct 180
ggtgttcggc cagttcgcag tgaagaagcg gaagaaggct tccgcctggc gcagcgcctg 240
atccgccatt cggatgacgc gcgatcgcta cgccgcggcg gcgagctgct tctcgcgcat 300
ggccgaagac gatggcgcga cctggaccca gcaggtcgag ggcctgatcg gcccgcggct 360
ggctggccac catcgatctg atcatctacg ttttcgccgt gcaggccggc atccgctgct 420
ccaaccgcct gctcgagcat gcgttctggc aatcggccga aatgggcatc tcgacgcagg 480
tcgagggcag cgtgacgggc tcgttcaacg agacgccgca gaagtttctc gaccgcatgg 540
ccggcacgtt cggctttgcg tggtactacg acggcgcggt gctgcgcgtg accagcgcca 600
acgaagcgca gagcgccacc atcgcgctga cccgcgcctc gaccgcgcag gtcaagcggg 660
cgctgac 667
<210> 99
<211> 667
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> HRPG/HRPB/HRCC dsRNA的第二臂的序列，该dsRNA用于同时靶向青枯雷尔氏菌的HrpG、HrpB和HrcC基因
<400> 99
gtcagcgccc gcttgacctg cgcggtcgag gcgcgggtca gcgcgatggt ggcgctctgc 60
gcttcgttgg cgctggtcac gcgcagcacc gcgccgtcgt agtaccacgc aaagccgaac 120
gtgccggcca tgcggtcgag aaacttctgc ggcgtctcgt tgaacgagcc cgtcacgctg 180
ccctcgacct gcgtcgagat gcccatttcg gccgattgcc agaacgcatg ctcgagcagg 240
cggttggagc agcggatgcc ggcctgcacg gcgaaaacgt agatgatcag atcgatggtg 300
gccagccagc cgcgggccga tcaggccctc gacctgctgg gtccaggtcg cgccatcgtc 360
ttcggccatg cgcgagaagc agctcgccgc cgcggcgtag cgatcgcgcg tcatccgaat 420
ggcggatcag gcgctgcgcc aggcggaagc cttcttccgc ttcttcactg cgaactggcc 480
gaacaccagc gtcggccagc acatgtcggc gttgcactcg cgccaggaca gcaccagctg 540
tcccgcgctg cggaactgct gggcatcgat cagcagcaga ctgaatgcct cggtacgccg 600
tgcacgcaac agcgtcaggg catcgtcgaa ccggacacat tccacgttct gcacggccag 660
gcatgcg 667
<210> 100
<211> 705
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> HRPB/HRCC/TssB/XpsR dsRNA的第一臂的序列，该dsRNA用于同时靶向青枯雷尔氏菌的HrpB、HrcC、XpsR和TssB基因
<400> 100
gcgcgatcgc tacgccgcgg cggcgagctg cttctcgcgc atggccgaag acgatggcgc 60
gacctggacc cagcaggtcg agggcctgat cggcccgcgg ctggctggcc accatcgatc 120
tgatcatcta cgttttcgcc gtgcaggccg gcatccgctg ctccaaccgc ctgctcgagc 180
atgcgttctg gcaatcggcc gaaatgggca tctcgacgca ggtcgagggc agcgtgacgg 240
gctcgttcaa cgagacgccg cagaagtttc tcgaccgcat ggccggcacg ttcggctttg 300
cgtggtacta cgacggcgcg gtgctgcgcg tgaccagcgc caacgaagcg cagagcgcca 360
ccatcgcgct gacccgcgcc ggccgcgcgt gcggagaccc atcggcggcc gcagagcgaa 420
tgcgactgga agcattactt tgcggacctg ctctatgcgc cgaacggcgc cgagttcaag 480
ctcagcctgt ttccgctgcc cgcgcagcag atcggcgaca cgccctggtc gcgggcattc 540
cgcgggcagc cggcgatgct tgacaaccaa tccgccgcgc tcgcgcagag cgcaccggca 600
gccgagtccg tcaacctgct cgacgagatc gtcgagcaga gccgcgtcgc caagtcggac 660
gccgagcacg cgcgcgccaa ggacatcatc ggcgagctgg tcaac 705
<210> 101
<211> 705
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> HRPB/HRCC/TssB/XpsR dsRNA的第二臂的序列，该dsRNA用于同时靶向青枯雷尔氏菌的HrpB、HrcC、XpsR和TssB基因
<400> 101
gttgaccagc tcgccgatga tgtccttggc gcgcgcgtgc tcggcgtccg acttggcgac 60
gcggctctgc tcgacgatct cgtcgagcag gttgacggac tcggctgccg gtgcgctctg 120
cgcgagcgcg gcggattggt tgtcaagcat cgccggctgc ccgcggaatg cccgcgacca 180
gggcgtgtcg ccgatctgct gcgcgggcag cggaaacagg ctgagcttga actcggcgcc 240
gttcggcgca tagagcaggt ccgcaaagta atgcttccag tcgcattcgc tctgcggccg 300
ccgatgggtc tccgcacgcg cggccggcgc gggtcagcgc gatggtggcg ctctgcgctt 360
cgttggcgct ggtcacgcgc agcaccgcgc cgtcgtagta ccacgcaaag ccgaacgtgc 420
cggccatgcg gtcgagaaac ttctgcggcg tctcgttgaa cgagcccgtc acgctgccct 480
cgacctgcgt cgagatgccc atttcggccg attgccagaa cgcatgctcg agcaggcggt 540
tggagcagcg gatgccggcc tgcacggcga aaacgtagat gatcagatcg atggtggcca 600
gccagccgcg ggccgatcag gccctcgacc tgctgggtcc aggtcgcgcc atcgtcttcg 660
gccatgcgcg agaagcagct cgccgccgcg gcgtagcgat cgcgc 705
<210> 102
<211> 633
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> HRPG/HRPX/RsmA dsRNA的第一臂的序列，该dsRNA用于同时靶向野油菜黄单胞菌野油菜致病变种的HrpG、HrpX和RsmA基因
<400> 102
gtgatggacg ccgctgcgaa tgaccgccaa ggatcggcat tcgtactgac gcaggacgcg 60
cggctggcat cacagatcaa cgccagcctg gcgactctgg tcccagaggt caccatcttt 120
tcagacgaac tcgaattgct gcgctgcctg cgccactcgc cgtgcgagct tctggttttc 180
gatgcccatt gcgtggcatc ggacgacagt atgatccttt cgacctactt cgcagcgatc 240
tctgcgttgt cttacgcaga ccgtcttccg atctatacga gcaggatgct tgttggtgct 300
tggccacagg gtctgcagca cctccagcaa cgtcgcgagg ggcaggcagc tccggatggc 360
agcgacgacg aagtcgcatt gctgggcgcc agcgccgatg ccttgttgat tctggagtat 420
atgttgatcc tcactcgccg agtaggcgaa accctgatga tcggcgactt ggtcaccgtg 480
accgtgctcg gcgtcaaggg aaatcaggtg cgcattggca ttgacgcgcc taaggatgtt 540
gccgtgcatc gcgaagaaat ctatcagcgc atccagcgcg gtgacgagcc ggttgcgtcc 600
ggtgcgcatc acaacgacga ttgttcggac tga 633
<210> 103
<211> 633
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> HRPG/HRPX/RsmA dsRNA的第二臂的序列，该dsRNA用于同时靶向野油菜黄单胞菌野油菜致病变种的HrpG、HrpX和RsmA基因
<400> 103
tcagtccgaa caatcgtcgt tgtgatgcgc accggacgca accggctcgt caccgcgctg 60
gatgcgctga tagatttctt cgcgatgcac ggcaacatcc ttaggcgcgt caatgccaat 120
gcgcacctga tttcccttga cgccgagcac ggtcacggtg accaagtcgc cgatcatcag 180
ggtttcgcct actcggcgag tgaggatcaa catatactcc agaatcaaca aggcatcggc 240
gctggcgccc agcaatgcga cttcgtcgtc gctgccatcc ggagctgcct gcccctcgcg 300
acgttgctgg aggtgctgca gaccctgtgg ccaagcacca acaagcatcc tgctcgtata 360
gatcggaaga cggtctgcgt aagacaacgc agagatcgct gcgaagtagg tcgaaaggat 420
catactgtcg tccgatgcca cgcaatgggc atcgaaaacc agaagctcgc acggcgagtg 480
gcgcaggcag cgcagcaatt cgagttcgtc tgaaaagatg gtgacctctg ggaccagagt 540
cgccaggctg gcgttgatct gtgatgccag ccgcgcgtcc tgcgtcagta cgaatgccga 600
tccttggcgg tcattcgcag cggcgtccat cac 633
<210> 104
<211> 718
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> NadHb/NadHd/NadHe dsRNA的第一臂的序列，该dsRNA用于同时靶向野油菜黄单胞菌野油菜致病变种（以及可能靶向其他黄单胞菌属物种）的NadHb、NadHd和NadHe基因
<400> 104
aacagaagaa gggagcgctg gaatgggagt gattcagacc ctggatcgtc tgatgaccaa 60
cccgatgccg gaaggccggg tcgaagacat cctgcgcccg gaaggcgaaa acccgttgct 120
cgaaaagggc tacgtgacca ccagcgtcga tgcgctgttg aactgggcgc gtacaggttc 180
gatgtggccg atgacctttg gtctggcctg ctgtgcagtc gagatgatgc agatcgtgag 240
tgagtaccgc caggcaaccg atgccttcgc gagcaatcct gtggaaagca agcaggaaat 300
ccgcaattac acgatgaact tcggcccgca gcatcctgcg gcgcacggcg tattgcgcct 360
gatcctggaa atggacggcg aaaccgtggt gcgtgccgac ccgcatatcg gcctgctgca 420
ccgtggcacc gagaagctgg ccgagtccaa gccgttcaac cagtcggttc cgtacagcat 480
cgacgggtaa tttcgaagcg gcgcgcgacg tcgatccgca ggtagtgctg agcgacaaga 540
cgcgcgcgca catcgatcat tggctgagca agttcccgcc cgaccgcaag cgttcggccg 600
tgttgcaggg tctgcatgcc gcgcaggaac agaaccaggg ttggttgacc gacgagctga 660
tcgtgggcgt ggccaagtat ctggagctgc cgccggtgtg ggcctacgaa gtggggct 718
<210> 105
<211> 718
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> NadHb/NadHd/NadHe dsRNA的第二臂的序列，该dsRNA用于同时靶向野油菜黄单胞菌野油菜致病变种（以及可能靶向其他黄单胞菌属物种）的NadHb、NadHd和NadHe基因。
<400> 105
tcagccactt cgtaggccca caccggcggc agctccagat acttggccac gcccacgatc 60
agctcgtcgg tcaaccaacc ctggttctgt tcctgcgcgg catgcagacc ctgcaacacg 120
gccgaacgct tgcggtcggg cgggaacttg ctcagccaat gatcgatgtg cgcgcgcgtc 180
ttgtcgctca gcactacctg cggatcgacg tcgcgcgccg cttcgaaatt acccgtcgat 240
gctgtacgga accgactggt tgaacggctt ggactcggcc agcttctcgg tgccacggtg 300
cagcaggccg atatgcgggt cggcacgcac cacggtttcg ccgtccattt ccaggatcag 360
gcgcaatacg ccgtgcgccg caggatgctg cgggccgaag ttcatcgtgt aattgcggat 420
ttcctgcttg ctttccacag gattgctcgc gaaggcatcg gttgcctggc ggtactcact 480
cacgatctgc atcatctcga ctgcacagca ggccagacca aaggtcatcg gccacatcga 540
acctgtacgc gcccagttca acagcgcatc gacgctggtg gtcacgtagc ccttttcgag 600
caacgggttt tcgccttccg ggcgcaggat gtcttcgacc cggccttccg gcatcgggtt 660
ggtcatcaga cgatccaggg tctgaatcac tcccattcca gcgctccctt cttcctgc 718
<210> 106
<211> 677
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> DnaA/DnaE1/DnaE2 dsRNA的第一臂的序列，该dsRNA用于同时靶向野油菜黄单胞菌野油菜致病变种（以及可能靶向其他物种）的DnaA、DnaE1和DnaE2基因
<400> 106
aacaatgctt ggccccgctg tctggaacgt ctcgaagctg aattcccgcc cgaggatgtc 60
cacacctggt tgaaacccct gcaggccgaa gatcgcggcg acagcatcgt gctgtacgcg 120
ccgaacgcct tcattgttga gcaggtccgc gagcgatacc tgccgcgcat ccgcgagttg 180
ctggcatatt tcgccggcaa tggcgaggtg gcgctggcgg tcggctcccg tcgatcgcgc 240
gaagccttcc tcaagccgtt ggcccaggtg gtcaatgtcg tcgaacggcg tcagacattg 300
ccggtactgg cgaacttgct ggtgcaggtg aacaacggcc agctgtcgct gacggggacc 360
gacctggaag tcgaaatgat ctcgcgcacc atggtcgagg acgcccagga cggcgaaacc 420
acgatcccgg cgcgcaagct gttcgacatc ctggcatatg tccacttccc gcttcgtcca 480
tctgcacgtc cacaccgagt tctcgttggc ggattccacc atccgcgtgc ccgagaaacc 540
ggatcaggct gacccgaaaa aagccaagca ggccaacctg ctgagccgcg cggtcgaact 600
cgacttgccc gcgctggcgg tcaccgacct gaacaacctg ttcgccctgg tcaagttcta 660
caaggccgcc gaaggct 677
<210> 107
<211> 677
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> DnaA/DnaE1/DnaE2 dsRNA的第二臂的序列，该dsRNA用于同时靶向野油菜黄单胞菌野油菜致病变种（以及可能靶向其他黄单胞菌属物种）的DnaA、DnaE1和DnaE2基因
<400> 107
tcagttcggc ggccttgtag aacttgacca gggcgaacag gttgttcagg tcggtgaccg 60
ccagcgcggg caagtcgagt tcgaccgcgc ggctcagcag gttggcctgc ttggcttttt 120
tcgggtcagc ctgatccggt ttctcgggca cgcggatggt ggaatccgcc aacgagaact 180
cggtgtggac gtgcagatgg acgaagcggg aagtggacat atgccaggat gtcgaacagc 240
ttgcgcgccg ggatcgtggt ttcgccgtcc tgggcgtcct cgaccatggt gcgcgagatc 300
atttcgactt ccaggtcggt ccccgtcagc gacagctggc cgttgttcac ctgcaccagc 360
aagttcgcca gtaccggcaa tgtctgacgc cgttcgacga cattgaccac ctgggccaac 420
ggcttgagga aggcttcgcg cgatcgacgg gagccgaccg ccagcgccac ctcgccattg 480
ccggcgaaat atgccagcaa ctcgcggatg cgcggcaggt atcgctcgcg gacctgctca 540
acaatgaagg cgttcggcgc gtacagcacg atgctgtcgc cgcgatcttc ggcctgcagg 600
ggtttcaacc aggtgtggac atcctcgggc gggaattcag cttcgagacg ttccagacag 660
cggggccaag catctgc 677
<210> 108
<211> 884
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Br1A2/stuA/F1bc/pks1/PPT1 dsRNA的第一臂的序列，该dsRNA用于同时靶向来自小麦叶枯病菌的Br1A2/stuA/F1bc/pks1/PPT1基因
<400> 108
atgccaccac cgcagccacg atccgtgcag cccgaaacat tcctcctgga ccaggatgca 60
cagcagagct tgcctcaaga ttcagtggtc gcgctgcagc aggtggacaa tctgaaatac 120
tttctcatat ctgctcctgt ggactggaga caagactcgt actgcaggag agatcagttc 180
cttcgaccag accggacaag tcgcgccgca tggtatgaag cctagggtca ctgcgacctt 240
gtgggaagat gagggtagct tgtgcttcca ggtagaagcg aacggcgtgt gcgtcgcgcg 300
gcgcgaagac aaccacatga tcaatggcac gaaactgttg aacgatgcat ggcaaccatg 360
gccgtcgaca accgccaaca attcagcagc atgggtggct acgacgcaaa gttctacccg 420
cacccgccgc agttcacgaa tccttggacg tctggggctt ccaacccaag tcaaatgtac 480
gcgacatcca tgccacatac atcaggtggc agcgatgcgc gggtgcatgt cgaacatact 540
tctcttcggc gatcaaaccg ccgaacaata cccgctcctc catcgaatcg ttctccgaaa 600
ggacaatgtc ttgctgctca gctttgtcga gcgttgcgct cttgctctcc gcgaagagac 660
tcgcaccctg tcccgaagcc aacgcgaagt gatgccggac taagcatggc ccaacaactg 720
cagtcgctgt cagacagcct gccgagtgtc tcgactctgg tcaatggaat aaccaacgcc 780
ttccacaatg ccacatctct ggtcagtggc gctccgcacg ctggcgaaat tacctgctgg 840
ctgatcgata ctcgaaagct gtggcctgga accaaaatct ggga 884
<210> 109
<211> 884
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Br1A2/stuA/F1bc/pks1/PPT1 dsRNA的第二臂的序列，该dsRNA用于同时靶向来自小麦叶枯病菌的Br1A2/stuA/F1bc/pks1/PPT1基因
<400> 109
tcccagattt tggttccagg ccacagcttt cgagtatcga tcagccagca ggtaatttcg 60
ccagcgtgcg gagcgccact gaccagagat gtggcattgt ggaaggcgtt ggttattcca 120
ttgaccagag tcgagacact cggcaggctg tctgacagcg actgcagttg ttgggccatg 180
cttagtccgg catcacttcg cgttggcttc gggacagggt gcgagtctct tcgcggagag 240
caagagcgca acgctcgaca aagctgagca gcaagacatt gtcctttcgg agaacgattc 300
gatggaggag cgggtattgt tcggcggttt gatcgccgaa gagaagtatg ttcgacatgc 360
acccgcgcat cgctgccacc tgatgtatgt ggcatggatg tcgcgtacat ttgacttggg 420
ttggaagccc cagacgtcca aggattcgtg aactgcggcg ggtgcgggta gaactttgcg 480
tcgtagccac ccatgctgct gaattgttgg cggttgtcga cggccatggt tgccatgcat 540
cgttcaacag tttcgtgcca ttgatcatgt ggttgtcttc gcgccgcgcg acgcacacgc 600
cgttcgcttc tacctggaag cacaagctac cctcatcttc ccacaaggtc gcagtgaccc 660
taggcttcat accatgcggc gcgacttgtc cggtctggtc gaaggaactg atctctcctg 720
cagtacgagt cttgtctcca gtccacagga gcagatatga gaaagtattt cagattgtcc 780
acctgctgca gcgcgaccac tgaatcttga ggcaagctct gctgtgcatc ctggtccagg 840
aggaatgttt cgggctgcac ggatcgtggc tgcggtggtg gcat 884
<210> 110
<211> 796
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Br1A2/stuA/F1bc dsRNA的第一臂的序列，该dsRNA用于同时靶向来自小麦叶枯病菌的Br1A2/stuA/F1bc基因
<400> 110
atgccaccac cgcagccacg atccgtgcag cccgaaacat tcctcctgga ccaggatgca 60
cagcagagct tgcctcaaga ttcagtggtc gcgctgcagc aggtggacaa tctgaaatac 120
tttctcatat ctgctcctgt ggactggaga caagactcgt actgcaggag atttctcttg 180
ccaaccggcg aatacgtgtc ttgcgtgtta tggaacaatc tcttccacat ctccgggacc 240
gacattgtcc gatgcttgtc gttccgtttc gatcgttcct tcgaccagac cggacaagtc 300
gcgccgcatg gtatgaagcc tagggtcact gcgaccttgt gggaagatga gggtagcttg 360
tgcttccagg tagaagcgaa cggcgtgtgc gtcgcgcggc gcgaagacaa ccacatgatc 420
aatggcacga aactgttgaa cgttgccggg atgacacgcg gtcggcgcga tggcatcttg 480
aagagcgaga agactcgcca tgtggtcaag attggtccga tgcacctcaa aggtgatgct 540
ggcaaccatg gccgtcgaca accgccaaca attcagcagc atgggtggct acgacgcaaa 600
gttctacccg cacccgccgc agttcacgaa tccttggacg tctggggctt ccaacccaag 660
tcaaatgtac gcgacatcca tgccacatac atcaggtggc agcgatgcgc ggtacgtcca 720
ggcgcccaat gtttctgctg catacggtgg tagcatccca gctcccgcta tggcatcagg 780
tatagatcta ctggac 796
<210> 111
<211> 796
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Br1A2/stuA/F1bc dsRNA的第二臂的序列，该dsRNA用于同时靶向来自小麦叶枯病菌的Br1A2/stuA/F1bc基因
<400> 111
gtccagtaga tctatacctg atgccatagc gggagctggg atgctaccac cgtatgcagc 60
agaaacattg ggcgcctgga cgtaccgcgc atcgctgcca cctgatgtat gtggcatgga 120
tgtcgcgtac atttgacttg ggttggaagc cccagacgtc caaggattcg tgaactgcgg 180
cgggtgcggg tagaactttg cgtcgtagcc acccatgctg ctgaattgtt ggcggttgtc 240
gacggccatg gttgccagca tcacctttga ggtgcatcgg accaatcttg accacatggc 300
gagtcttctc gctcttcaag atgccatcgc gccgaccgcg tgtcatcccg gcaacgttca 360
acagtttcgt gccattgatc atgtggttgt cttcgcgccg cgcgacgcac acgccgttcg 420
cttctacctg gaagcacaag ctaccctcat cttcccacaa ggtcgcagtg accctaggct 480
tcataccatg cggcgcgact tgtccggtct ggtcgaagga acgatcgaaa cggaacgaca 540
agcatcggac aatgtcggtc ccggagatgt ggaagagatt gttccataac acgcaagaca 600
cgtattcgcc ggttggcaag agaaatctcc tgcagtacga gtcttgtctc cagtccacag 660
gagcagatat gagaaagtat ttcagattgt ccacctgctg cagcgcgacc actgaatctt 720
gaggcaagct ctgctgtgca tcctggtcca ggaggaatgt ttcgggctgc acggatcgtg 780
gctgcggtgg tggcat 796
<210> 112
<211> 782
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> stuA/pks1/PPT1 dsRNA的第一臂的序列，该dsRNA用于同时靶向来自小麦叶枯病菌的stuA/ /pks1/PPT1基因
<400> 112
agttccttcg accagaccgg acaagtcgcg ccgcatggta tgaagcctag ggtcactgcg 60
accttgtggg aagatgaggg tagcttgtgc ttccaggtag aagcgaacgg cgtgtgcgtc 120
gcgcggcgcg aagacaacca catgatcaat ggcacgaaac tgttgaacgt tgccgggatg 180
acacgcggtc ggcgcgatgg catcttgaag agcgagaaga ctcgccatgt ggtcaagatt 240
ggtccgatgc acctcaaaga tcatgtcgaa catacttctc ttcggcgatc aaaccgccga 300
acaatacccg ctcctccatc gaatcgttct ccgaaaggac aatgtcttgc tgctcagctt 360
tgtcgagcgt tgcgctcttg ctctccgcga agagactcgc accctgtccc gaagccaacg 420
cgaagtgatg ccggacttcc tcaccctcag caatctgatc gaggcatact accagaaggg 480
tgaaaaagtc ctcatgttgg aatcagcatt tcttacgatt gcatgctggc ccaacaactg 540
cagtcgctgt cagacagcct gccgagtgtc tcgactctgg tcaatggaat aaccaacgcc 600
ttccacaatg ccacatctct ggtcagtggc gctccgcacg ctggcgaaat tacctgctgg 660
ctgatcgata ctcgaaagct gtggcctgga accaaaatct gggatgctcc tggcgcagca 720
gaagccatgg gtttgatttc tgtggccgag cagaatgcca tctcgacgaa gatgttcatt 780
ca 782
<210> 113
<211> 782
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> stuA/pks1/PPT1 dsRNA的第二臂的序列，该dsRNA用于同时靶向来自小麦叶枯病菌的stuA/ /pks1/PPT1基因
<400> 113
tgaatgaaca tcttcgtcga gatggcattc tgctcggcca cagaaatcaa acccatggct 60
tctgctgcgc caggagcatc ccagattttg gttccaggcc acagctttcg agtatcgatc 120
agccagcagg taatttcgcc agcgtgcgga gcgccactga ccagagatgt ggcattgtgg 180
aaggcgttgg ttattccatt gaccagagtc gagacactcg gcaggctgtc tgacagcgac 240
tgcagttgtt gggccagcat gcaatcgtaa gaaatgctga ttccaacatg aggacttttt 300
cacccttctg gtagtatgcc tcgatcagat tgctgagggt gaggaagtcc ggcatcactt 360
cgcgttggct tcgggacagg gtgcgagtct cttcgcggag agcaagagcg caacgctcga 420
caaagctgag cagcaagaca ttgtcctttc ggagaacgat tcgatggagg agcgggtatt 480
gttcggcggt ttgatcgccg aagagaagta tgttcgacat gatctttgag gtgcatcgga 540
ccaatcttga ccacatggcg agtcttctcg ctcttcaaga tgccatcgcg ccgaccgcgt 600
gtcatcccgg caacgttcaa cagtttcgtg ccattgatca tgtggttgtc ttcgcgccgc 660
gcgacgcaca cgccgttcgc ttctacctgg aagcacaagc taccctcatc ttcccacaag 720
gtcgcagtga ccctaggctt cataccatgc ggcgcgactt gtccggtctg gtcgaaggaa 780
ct 782
<210> 114
<211> 795
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 几丁质酶/激发素/葡聚糖酶抑制因子、转谷氨酰胺酶激发子/分泌蛋白dsRNA的第一臂的序列，该dsRNA用于同时靶向产生由PITG_17947、PITG_10772、PITG_13671、PITG_16956、PITG_00891定义的蛋白的基因
<400> 114
atgaaattcg tcggggttat cgcgtcaagt cttctggttg tgccttctgc ggtctctggt 60
gacgctgata gctcgagttt cgcgctcttc ttcgatcagg atcgtttcca ggaggttttc 120
ccggacgctg tggagctcta caacttcaac ggtcttgtgg gatcatggcc aagttcactc 180
tcgctgtttc gacgcttctt gtcgcgtcgg ctgccgtctc ggcccacgag gggcacgacc 240
actcgtcgtc gacccacgac gaacatgagc actcaggctc tgccgcttca ggcaccgttg 300
gttcggagtg ctcgatgccc atgaagatca tctctgctgt cgccgcctcc tcaattgcgc 360
ttggagccgt ctctgccact actgaccatg tcagccgaat gctggttctt ggtggagcag 420
ttgttcccag cggcacgaag acgtacacga ccggaatccg ccctaccatt gatggcggtg 480
ccgtcgagaa gattacaaag ccttcctccg ttccaggttg acgcgctatc ccttccggat 540
ctctagatcg actctctttg caacatggta ttctcgccca gcacctatct cgtctccgct 600
gccgtcgctg tcgtggcgct gcagatgcag caagcgtgga gcagcgactt gtttattcaa 660
caatgcaacc ttatttgcta gtagcgacat tactgggtgc tgccacgacg gcaaatgcaa 720
ttccagtgca cttcaacaat cactgcaatg ctgcaattga gctgtacaac aacacataca 780
tcgaggtgat caatc 795
<210> 115
<211> 795
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 几丁质酶/激发素/葡聚糖酶抑制因子、转谷氨酰胺酶激发子/分泌蛋白dsRNA的第二臂的序列，该dsRNA用于同时靶向产生由PITG_17947、PITG_10772、PITG_13671、PITG_16956、PITG_00891定义的蛋白的基因
<400> 115
gattgatcac ctcgatgtat gtgttgttgt acagctcaat tgcagcattg cagtgattgt 60
tgaagtgcac tggaattgca tttgccgtcg tggcagcacc cagtaatgtc gctactagca 120
aataaggttg cattgttgaa taaacaagtc gctgctccac gcttgctgca tctgcagcgc 180
cacgacagcg acggcagcgg agacgagata ggtgctgggc gagaatacca tgttgcaaag 240
agagtcgatc tagagatccg gaagggatag cgcgtcaacc tggaacggag gaaggctttg 300
taatcttctc gacggcaccg ccatcaatgg tagggcggat tccggtcgtg tacgtcttcg 360
tgccgctggg aacaactgct ccaccaagaa ccagcattcg gctgacatgg tcagtagtgg 420
cagagacggc tccaagcgca attgaggagg cggcgacagc agagatgatc ttcatgggca 480
tcgagcactc cgaaccaacg gtgcctgaag cggcagagcc tgagtgctca tgttcgtcgt 540
gggtcgacga cgagtggtcg tgcccctcgt gggccgagac ggcagccgac gcgacaagaa 600
gcgtcgaaac agcgagagtg aacttggcca tgatcccaca agaccgttga agttgtagag 660
ctccacagcg tccgggaaaa cctcctggaa acgatcctga tcgaagaaga gcgcgaaact 720
cgagctatca gcgtcaccag agaccgcaga aggcacaacc agaagacttg acgcgataac 780
cccgacgaat ttcat 795
<210> 116
<211> 781
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 几丁质酶/激发素/葡聚糖酶抑制因子dsRNA的第一臂的序列，该dsRNA用于同时靶向产生由来自葡萄生单轴霉的PITG_17947、PITG_10772、PITG_13671定义的蛋白的基因
<400> 116
atgaaattcg tcggggttat cgcgtcaagt cttctggttg tgccttctgc ggtctctggt 60
gacgctgata gctcgagttt cgcgctcttc ttcgatcagg atcgtttcca ggaggttttc 120
ccggacgctg tggagctcta caacttcaac ggtcttgtgg atgcggccag caagtacagc 180
gaattcgcta atacgggcaa cgacgacaat gacaagcgtg agctggcagc gttcctggct 240
caaacagctc acgagtgcgg atcatggcca agttcactct cgctgtttcg acgcttcttg 300
tcgcgtcggc tgccgtctcg gcccacgagg ggcacgacca ctcgtcgtcg acccacgacg 360
aacatgagca ctcaggctct gccgcttcag gcaccgttgg ttcggagtgc tcggccgacg 420
tgagcgaggc gttcatcgcg actgtcgaca acagcaccta cttcgaaacg tgcgcagaag 480
gcatgacctt caacatcacg tcggtcttcg acgtactcaa atgcgccatg aagatcatct 540
ctgctgtcgc cgcctcctca attgcgcttg gagccgtctc tgccactact gaccatgtca 600
gccgaatgct ggttcttggt ggagcagttg ttcccagcgg cacgaagacg tacacgaccg 660
gaatccgccc taccattgat ggcgacaatt tttgcggagg atcgctgatc tccccaacgc 720
atgttcttac gacgacggcg tgtcttcgtg gtatcaagcc gccgaattgg gtgtctgtgg 780
g 781
<210> 117
<211> 781
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 几丁质酶/激发素/葡聚糖酶抑制因子dsRNA的第二臂的序列，该dsRNA用于同时靶向产生由来自葡萄生单轴霉的PITG_17947、PITG_10772、PITG_13671定义的蛋白的基因
<400> 117
cccacagaca cccaattcgg cggcttgata ccacgaagac acgccgtcgt cgtaagaaca 60
tgcgttgggg agatcagcga tcctccgcaa aaattgtcgc catcaatggt agggcggatt 120
ccggtcgtgt acgtcttcgt gccgctggga acaactgctc caccaagaac cagcattcgg 180
ctgacatggt cagtagtggc agagacggct ccaagcgcaa ttgaggaggc ggcgacagca 240
gagatgatct tcatggcgca tttgagtacg tcgaagaccg acgtgatgtt gaaggtcatg 300
ccttctgcgc acgtttcgaa gtaggtgctg ttgtcgacag tcgcgatgaa cgcctcgctc 360
acgtcggccg agcactccga accaacggtg cctgaagcgg cagagcctga gtgctcatgt 420
tcgtcgtggg tcgacgacga gtggtcgtgc ccctcgtggg ccgagacggc agccgacgcg 480
acaagaagcg tcgaaacagc gagagtgaac ttggccatga tccgcactcg tgagctgttt 540
gagccaggaa cgctgccagc tcacgcttgt cattgtcgtc gttgcccgta ttagcgaatt 600
cgctgtactt gctggccgca tccacaagac cgttgaagtt gtagagctcc acagcgtccg 660
ggaaaacctc ctggaaacga tcctgatcga agaagagcgc gaaactcgag ctatcagcgt 720
caccagagac cgcagaaggc acaaccagaa gacttgacgc gataaccccg acgaatttca 780
t 781
<210> 118
<211> 767
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 葡聚糖酶抑制因子、转谷氨酰胺酶激发子/分泌蛋白dsRNA的第一臂的序列，该dsRNA用于同时靶向产生由来自葡萄生单轴霉的PITG_13671、PITG_16956、PITG_00891定义的蛋白的基因
<400> 118
gccatgaaga tcatctctgc tgtcgccgcc tcctcaattg cgcttggagc cgtctctgcc 60
actactgacc atgtcagccg aatgctggtt cttggtggag cagttgttcc cagcggcacg 120
aagacgtaca cgaccggaat ccgccctacc attgatggcg acaatttttg cggaggatcg 180
ctgatctccc caacgcatgt tcttacgacg acggcgtgtc ttcgtggtat caagccgccg 240
aattgggtgt ctgtgggcac gatctcgtcg agaagattac aaagccttcc tccgttccag 300
gttgacgcgc tatcccttcc ggatctctag atcgactctc tttgcaacat ggtattctcg 360
cccagcacct atctcgtctc cgctgccgtc gctgtcgtgg cgctgcagat gcagcacgct 420
tctgccgcgt cgctgtacta cggagtgacc accgtgtcaa agacggccga tacgatctcc 480
aaatcgtcac catttgctgg tggcgaagtt cctgaccagg attatgcgtg gagcagcgac 540
ttgtttattc aacaatgcaa ccttatttgc tagtagcgac attactgggt gctgccacga 600
cggcaaatgc aattccagtg cacttcaaca atcactgcaa tgctgcaatt gagctgtaca 660
acaacacata catcgaggtg atcaatccag gcagcaccac tactcgcaat cttgaggagg 720
gattcagtgg gatgtttcgg aacggatgga atccccaagc aacacgt 767
<210> 119
<211> 767
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 葡聚糖酶抑制因子、转谷氨酰胺酶激发子/分泌蛋白dsRNA的第二臂的序列，该dsRNA用于同时靶向产生由来自葡萄生单轴霉的PITG_13671、PITG_16956、PITG_00891定义的蛋白的基因
<400> 119
acgtgttgct tggggattcc atccgttccg aaacatccca ctgaatccct cctcaagatt 60
gcgagtagtg gtgctgcctg gattgatcac ctcgatgtat gtgttgttgt acagctcaat 120
tgcagcattg cagtgattgt tgaagtgcac tggaattgca tttgccgtcg tggcagcacc 180
cagtaatgtc gctactagca aataaggttg cattgttgaa taaacaagtc gctgctccac 240
gcataatcct ggtcaggaac ttcgccacca gcaaatggtg acgatttgga gatcgtatcg 300
gccgtctttg acacggtggt cactccgtag tacagcgacg cggcagaagc gtgctgcatc 360
tgcagcgcca cgacagcgac ggcagcggag acgagatagg tgctgggcga gaataccatg 420
ttgcaaagag agtcgatcta gagatccgga agggatagcg cgtcaacctg gaacggagga 480
aggctttgta atcttctcga cgagatcgtg cccacagaca cccaattcgg cggcttgata 540
ccacgaagac acgccgtcgt cgtaagaaca tgcgttgggg agatcagcga tcctccgcaa 600
aaattgtcgc catcaatggt agggcggatt ccggtcgtgt acgtcttcgt gccgctggga 660
acaactgctc caccaagaac cagcattcgg ctgacatggt cagtagtggc agagacggct 720
ccaagcgcaa ttgaggaggc ggcgacagca gagatgatct tcatggc 767
<210> 120
<211> 934
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> GyrB/ FusA/ MreB/HrpG/PhoP/FhaB dsRNA的第一臂的序列，该dsRNA用于同时靶向来自柑橘黄单胞柑橘溃疡病菌的GyrB/ FusA/ MreB/HrpG/PhoP/FhaB基因
<400> 120
tgaccgacga acaaaacacc ccgccaacac ccaacggcac ctacgactcc agcaagatca 60
ccgtgctgcg tggcctggaa gccgttcgca agcgccccgg catgtatatc ggcgacgtcc 120
atgacggcac cggcctgcat cacatggtgt gatcgtggcc cgcaccaccc ctatcgagcg 180
ttaccgcaac ttcggcatca tggcccacat tgatgccggc aagaccacca cgtccgaacg 240
catcctgttc tacaccggtg tgagtcacaa gatcggcgaa gtccatgacg gcgctgcagt 300
gatgatgcat gttcaagaaa ctccgcggca tgttctccaa cgacctgtcc atcgatttgg 360
gcacggccaa tacgctgatc tacgtgcgcg gacagggcat cgtgctgaac gagccgtcgg 420
tggttgcggt gcgtcaggat cgcgcgatcg gcggcacgcg gtgcatgaac gaccactctc 480
cccccaacgc cggatcggtg ttcctgttga cgcaggatgc gcgcctggtc tcgcaggtca 540
acgccagcct cgcaccgctt gcgcgcaatg tctcgacctt ttccgatgaa ctggagcttt 600
tgcggacgct gcggcattca agcatgcgta tccttttggt cgaagacgaa gctccgctgc 660
gcgaaaccct tgcggcgcgc ctgaagcgcg aaggctttgc ggtcgacgct gcacaggacg 720
gcgaagaagg cctctacatg ggccgtgaag tgccatttga tgtcggcatc atcgtccaat 780
ggacaacgaa gcgatgcgcg tgcgtggtta cctggccgag cagggcaagc gtgcgcttgc 840
actgttgctg tgctgcacga ccacctggac atcgtttcca gcatgggcgc aggttgcgcc 900
aaccgccaac cctgcagggc agacgcccgg tcag 934
<210> 121
<211> 934
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> GyrB/ FusA/ MreB/HrpG/PhoP/FhaB dsRNA的第二臂的序列，该dsRNA用于同时靶向来自柑橘黄单胞柑橘溃疡病菌的GyrB/ FusA/ MreB/HrpG/PhoP/FhaB基因
<400> 121
ctgaccgggc gtctgccctg cagggttggc ggttggcgca acctgcgccc atgctggaaa 60
cgatgtccag gtggtcgtgc agcacagcaa cagtgcaagc gcacgcttgc cctgctcggc 120
caggtaacca cgcacgcgca tcgcttcgtt gtccattgga cgatgatgcc gacatcaaat 180
ggcacttcac ggcccatgta gaggccttct tcgccgtcct gtgcagcgtc gaccgcaaag 240
ccttcgcgct tcaggcgcgc cgcaagggtt tcgcgcagcg gagcttcgtc ttcgaccaaa 300
aggatacgca tgcttgaatg ccgcagcgtc cgcaaaagct ccagttcatc ggaaaaggtc 360
gagacattgc gcgcaagcgg tgcgaggctg gcgttgacct gcgagaccag gcgcgcatcc 420
tgcgtcaaca ggaacaccga tccggcgttg gggggagagt ggtcgttcat gcaccgcgtg 480
ccgccgatcg cgcgatcctg acgcaccgca accaccgacg gctcgttcag cacgatgccc 540
tgtccgcgca cgtagatcag cgtattggcc gtgcccaaat cgatggacag gtcgttggag 600
aacatgccgc ggagtttctt gaacatgcat catcactgca gcgccgtcat ggacttcgcc 660
gatcttgtga ctcacaccgg tgtagaacag gatgcgttcg gacgtggtgg tcttgccggc 720
atcaatgtgg gccatgatgc cgaagttgcg gtaacgctcg ataggggtgg tgcgggccac 780
gatcacacca tgtgatgcag gccggtgccg tcatggacgt cgccgatata catgccgggg 840
cgcttgcgaa cggcttccag gccacgcagc acggtgatct tgctggagtc gtaggtgccg 900
ttgggtgttg gcggggtgtt ttgttcgtcg gtca 934
<210> 122
<211> 793
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> GyrB/ RbfA/MreB dsRNA的第一臂的序列，该dsRNA用于同时靶向来自柑橘黄单胞柑橘溃疡病菌的GyrB/ RbfA/ MreB基因
<400> 122
atgaccgacg aacaaaacac cccgccaaca cccaacggca cctacgactc cagcaagatc 60
accgtgctgc gtggcctgga agccgttcgc aagcgccccg gcatgtatat cggcgacgtc 120
catgacggca ccggcctgca tcacatggtg ttcgaggtgg tcgacaactc ggtcgacgaa 180
gcccttgccg ggcatgccga cgacatcgtg gtaaagatca tggccgatgg ctcggtggca 240
gtttccgaca acgggcgcgg cgtgccggat catgccaacc aaatcattcc atcgcaccga 300
ccgcgtatct gcgcaggtgc gtcgcgacct cggcacgatc gtgcacgcgg ccgtgcgcga 360
ccatggcctg ccgtcggtca gcgtgtcaga cgtcgaaatc agtcgcgacc tggcgcacgc 420
caaggtcttc gtcaccgcgc tgcagcagga gcgttcggcc gaagcggtca aggggctcaa 480
ggaaatcgcc ggccagctgc gtacgcagtt ggcgcgcgcg aatgcatgtt caagaaactc 540
cgcggcatgt tctccaacga cctgtccatc gatttgggca cggccaatac gctgatctac 600
gtgcgcggac agggcatcgt gctgaacgag ccgtcggtgg ttgcggtgcg tcaggatcgc 660
gcgatcggcg gcacgcgctc ggtcgctgcc gtcggtgcgg aggccaagca gatgctcggc 720
cgtacccccg gccacatcac caccattcgc ccgatgaagg acggcgtcat cgccgacttc 780
acctacaccg aag 793
<210> 123
<211> 793
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> GyrB/ RbfA/MreB dsRNA的第二臂的序列，该dsRNA用于同时靶向来自柑橘黄单胞柑橘溃疡病菌的GyrB/ RbfA/ MreB基因
<400> 123
cttcggtgta ggtgaagtcg gcgatgacgc cgtccttcat cgggcgaatg gtggtgatgt 60
ggccgggggt acggccgagc atctgcttgg cctccgcacc gacggcagcg accgagcgcg 120
tgccgccgat cgcgcgatcc tgacgcaccg caaccaccga cggctcgttc agcacgatgc 180
cctgtccgcg cacgtagatc agcgtattgg ccgtgcccaa atcgatggac aggtcgttgg 240
agaacatgcc gcggagtttc ttgaacatgc attcgcgcgc gccaactgcg tacgcagctg 300
gccggcgatt tccttgagcc ccttgaccgc ttcggccgaa cgctcctgct gcagcgcggt 360
gacgaagacc ttggcgtgcg ccaggtcgcg actgatttcg acgtctgaca cgctgaccga 420
cggcaggcca tggtcgcgca cggccgcgtg cacgatcgtg ccgaggtcgc gacgcacctg 480
cgcagatacg cggtcggtgc gatggaatga tttggttggc atgatccggc acgccgcgcc 540
cgttgtcgga aactgccacc gagccatcgg ccatgatctt taccacgatg tcgtcggcat 600
gcccggcaag ggcttcgtcg accgagttgt cgaccacctc gaacaccatg tgatgcaggc 660
cggtgccgtc atggacgtcg ccgatataca tgccggggcg cttgcgaacg gcttccaggc 720
cacgcagcac ggtgatcttg ctggagtcgt aggtgccgtt gggtgttggc ggggtgtttt 780
gttcgtcggt cat 793
<210> 124
<211> 779
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> HrpG/PhoP/ FtsZ dsRNA的第一臂的序列，该dsRNA用于同时靶向来自柑橘黄单胞柑橘溃疡病菌的HrpG/ PhoP/ FtsZ基因
<400> 124
atgaacgacc actctccccc caacgccgga tcggtgttcc tgttgacgca ggatgcgcgc 60
ctggtctcgc aggtcaacgc cagcctcgca ccgcttgcgc gcaatgtctc gaccttttcc 120
gatgaactgg agcttttgcg gacgctgcgg cattcgccgt gcgagctgct gatcttcgat 180
gccagctgtg tcgccgccga tgacagttca ctgctggcct ggcagcgctg ccatagcggc 240
cagcccagat catgcgtatc cttttggtcg aagacgaagc tccgctgcgc gaaacccttg 300
cggcgcgcct gaagcgcgaa ggctttgcgg tcgacgctgc acaggacggc gaagaaggcc 360
tctacatggg ccgtgaagtg ccatttgatg tcggcatcat cgaccttggc ttgcccaaga 420
tgtcggggat ggagctgatc aaggccttgc gcgatgaggg caagaagttt ccggtgctga 480
tcctgaccgc gcgctcgagc tggcaggaca atgcatggca catttcgaac tgattgaaaa 540
aatggctccc aacgcggtca tcaaggtggt tggcgtcggc ggcggcggtg gcaatgccgt 600
cgcgcacatg gtcaacacca acgtcgatgg cgtggaattc atcaccgcca acaccgactc 660
gcaggcgatc aagaactgcg gcgccaagct gcagctgcag ctcggcacca acgtcaccaa 720
gggcctgggc gcaggcgcca atccggaagt cggccgtcag gctgcgctgg aagatcgcg 779
<210> 125
<211> 779
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> HrpG/PhoP/ FtsZ dsRNA的第二臂的序列，该dsRNA用于同时靶向来自柑橘黄单胞柑橘溃疡病菌的HrpG/ PhoP/ FtsZ基因
<400> 125
cgcgatcttc cagcgcagcc tgacggccga cttccggatt ggcgcctgcg cccaggccct 60
tggtgacgtt ggtgccgagc tgcagctgca gcttggcgcc gcagttcttg atcgcctgcg 120
agtcggtgtt ggcggtgatg aattccacgc catcgacgtt ggtgttgacc atgtgcgcga 180
cggcattgcc accgccgccg ccgacgccaa ccaccttgat gaccgcgttg ggagccattt 240
tttcaatcag ttcgaaatgt gccatgcatt gtcctgccag ctcgagcgcg cggtcaggat 300
cagcaccgga aacttcttgc cctcatcgcg caaggccttg atcagctcca tccccgacat 360
cttgggcaag ccaaggtcga tgatgccgac atcaaatggc acttcacggc ccatgtagag 420
gccttcttcg ccgtcctgtg cagcgtcgac cgcaaagcct tcgcgcttca ggcgcgccgc 480
aagggtttcg cgcagcggag cttcgtcttc gaccaaaagg atacgcatga tctgggctgg 540
ccgctatggc agcgctgcca ggccagcagt gaactgtcat cggcggcgac acagctggca 600
tcgaagatca gcagctcgca cggcgaatgc cgcagcgtcc gcaaaagctc cagttcatcg 660
gaaaaggtcg agacattgcg cgcaagcggt gcgaggctgg cgttgacctg cgagaccagg 720
cgcgcatcct gcgtcaacag gaacaccgat ccggcgttgg ggggagagtg gtcgttcat 779
<210> 126
<211> 798
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> FhaB/FusA/MreB dsRNA的第一臂的序列，该dsRNA用于同时靶向来自柑橘黄单胞柑橘溃疡病菌的HrpG/ PhoP/ FtsZ基因
<400> 126
atggacaacg aagcgatgcg cgtgcgtggt tacctggccg agcagggcaa gcgtgcgctt 60
gcactgttgc tgtgctgcac gaccacctgg acatcgtttc cagcatgggc gcaggttgcg 120
ccaaccgcca accctgcagg gcagacgccc ggtcagcagg tcgctgccaa tggtgtgccg 180
gtggtggaca tcgtcgcgcc caatgcacgc ggcatttcgc acaaccgcta cagcaacttc 240
aatgtcggcc cgaatgggct gatcctcgat cgtggcccgc accaccccta tcgagcgtta 300
ccgcaacttc ggcatcatgg cccacattga tgccggcaag accaccacgt ccgaacgcat 360
cctgttctac accggtgtga gtcacaagat cggcgaagtc catgacggcg ctgcagtgat 420
ggactggatg gagcaggagc aggagcgtgg tatcaccatc acctccgctg cgaccaccgc 480
gttctggtcg ggtatggaca agtccatgcc gcagcaccgc ttcaacatca tcgacacatg 540
catgttcaag aaactccgcg gcatgttctc caacgacctg tccatcgatt tgggcacggc 600
caatacgctg atctacgtgc gcggacaggg catcgtgctg aacgagccgt cggtggttgc 660
ggtgcgtcag gatcgcgcga tcggcggcac gcgctcggtc gctgccgtcg gtgcggaggc 720
caagcagatg ctcggccgta cccccggcca catcaccacc attcgcccga tgaaggacgg 780
cgtcatcgcc gacttcac 798
<210> 127
<211> 798
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> FhaB/FusA/MreB dsRNA的第二臂的序列，该dsRNA用于同时靶向来自柑橘黄单胞柑橘溃疡病菌的FhaB/FusA/ MreB基因
<400> 127
gtgaagtcgg cgatgacgcc gtccttcatc gggcgaatgg tggtgatgtg gccgggggta 60
cggccgagca tctgcttggc ctccgcaccg acggcagcga ccgagcgcgt gccgccgatc 120
gcgcgatcct gacgcaccgc aaccaccgac ggctcgttca gcacgatgcc ctgtccgcgc 180
acgtagatca gcgtattggc cgtgcccaaa tcgatggaca ggtcgttgga gaacatgccg 240
cggagtttct tgaacatgca tgtgtcgatg atgttgaagc ggtgctgcgg catggacttg 300
tccatacccg accagaacgc ggtggtcgca gcggaggtga tggtgatacc acgctcctgc 360
tcctgctcca tccagtccat cactgcagcg ccgtcatgga cttcgccgat cttgtgactc 420
acaccggtgt agaacaggat gcgttcggac gtggtggtct tgccggcatc aatgtgggcc 480
atgatgccga agttgcggta acgctcgata ggggtggtgc gggccacgat cgaggatcag 540
cccattcggg ccgacattga agttgctgta gcggttgtgc gaaatgccgc gtgcattggg 600
cgcgacgatg tccaccaccg gcacaccatt ggcagcgacc tgctgaccgg gcgtctgccc 660
tgcagggttg gcggttggcg caacctgcgc ccatgctgga aacgatgtcc aggtggtcgt 720
gcagcacagc aacagtgcaa gcgcacgctt gccctgctcg gccaggtaac cacgcacgcg 780
catcgcttcg ttgtccat 798
<210> 128
<211> 784
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> GyrB/ FusA/ZipA dsRNA的第一臂的序列，该dsRNA用于同时靶向来自野油菜黄单胞菌莴苣致病变种的GyrB、FusA、ZipA基因
<400> 128
atgaccgaag atcaaacacc ccgaccacac ccaacagcac ctacgattcc agcaagatca 60
ccgtgctgcg tggcctggaa gccgtccgca agcgccccgg catgtacatc ggcgatgtcc 120
atgacggcac cggcctgcat cacatggtgt tcgaggtggt cgacaactcg gtcgacgagg 180
ccctggccgg ccatgccgac gacatcgtgg tcaagatcct ggtcgatggc tcggtcgccg 240
tgtcggataa cggccgcgga tcgtggccgc aaccaacccc tatcgagcgt taccgcaact 300
tcggcatcat ggctcacatc gatgccggca agaccaccac ctccgagcgc atcctgtttt 360
acaccggcgt cagtcacaag atcggcgaag tccatgacgg cgccgcggtg atggactgga 420
tggagcagga gcaggagcgt ggtatcacca tcacctccgc tgccaccacc gcgttctggt 480
cgggtatgga caagtccatg ccgcagcatc gcctcaacat catgcatgtc cgaacatggc 540
catgatccgg atcgggatcc tgatcgctgg actgctgctg gtcgcggcca tcttcctgtt 600
tggtcgcccg aaaaaatcgc cgcaagggcg ccgggtcgac aaggacgacg ggcagccgcg 660
cgaacgccgc gagccggtga tttccggcga gcctggggtg gagggcgacc cgttcaagcg 720
cactgaaggc gccgagcaga gcgaactcaa tctggacgat gccgatgcgg ccggcggcaa 780
cgat 784
<210> 129
<211> 784
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> GyrB/ FusA/ZipA dsRNA的第二臂的序列，该dsRNA用于同时靶向来自野油菜黄单胞菌莴苣致病变种的GyrB、FusA、ZipA基因
<400> 129
atcgttgccg ccggccgcat cggcatcgtc cagattgagt tcgctctgct cggcgccttc 60
agtgcgcttg aacgggtcgc cctccacccc aggctcgccg gaaatcaccg gctcgcggcg 120
ttcgcgcggc tgcccgtcgt ccttgtcgac ccggcgccct tgcggcgatt ttttcgggcg 180
accaaacagg aagatggccg cgaccagcag cagtccagcg atcaggatcc cgatccggat 240
catggccatg ttcggacatg catgatgttg aggcgatgct gcggcatgga cttgtccata 300
cccgaccaga acgcggtggt ggcagcggag gtgatggtga taccacgctc ctgctcctgc 360
tccatccagt ccatcaccgc ggcgccgtca tggacttcgc cgatcttgtg actgacgccg 420
gtgtaaaaca ggatgcgctc ggaggtggtg gtcttgccgg catcgatgtg agccatgatg 480
ccgaagttgc ggtaacgctc gataggggtt ggttgcggcc acgatccgcg gccgttatcc 540
gacacggcga ccgagccatc gaccaggatc ttgaccacga tgtcgtcggc atggccggcc 600
agggcctcgt cgaccgagtt gtcgaccacc tcgaacacca tgtgatgcag gccggtgccg 660
tcatggacat cgccgatgta catgccgggg cgcttgcgga cggcttccag gccacgcagc 720
acggtgatct tgctggaatc gtaggtgctg ttgggtgtgg tcggggtgtt tgatcttcgg 780
tcat 784
<210> 130
<211> 663
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> avrPTO/avrPTOB/HopT1-1 dsRNA的第一臂的序列，该dsRNA用于同时靶向来自丁香假单胞菌pto DC3000菌株的avrPTO/avrPTOB/HopT1-1基因
<400> 130
atgggaaata tatgtgtcgg cggatccagg atggcccatc aggtgaactc cccagaccga 60
gttagtaaca actcgggtga cgaagataac gtaacgtcca gtcaactgct gagcgtcaga 120
catcaacttg cggagtctgc tggtgtacca agagatcagc atgaatttgt tagtaaccaa 180
gcacctcaaa gcctgagaaa atggcgggta tcaatagagc gggaccatcg ggcgcttatt 240
ttgttggcca cacagacccc gagccagtat cggggcaagc acacggatcc ggcagcggcg 300
ccagctcctc gaacagtccg caggttcagc cgcgaccctc gaatactccc ccgtcgaacg 360
cgcccgcacc gccgccaacc ggacgtgaga ggctttcacg atgcatgaaa acagtcagca 420
atcactcgat acccagtaca aatctcgtcg tggatgcggg aacggaaact tcggcgcaga 480
aatcccagcc ggtttgcagc gaaatccagc gtaacagcaa gatcgaaaaa gcagtcatcg 540
aacacattgc cgaccacccg gcagcgaaaa tgacaataag cgcgctggtt gacacgttga 600
cagacgtttt tgtcagggct catggggagg ttaaggggtg ggccgaaatc gtccaggcag 660
tct 663
<210> 131
<211> 663
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> avrPTO/avrPTOB/HopT1-1 dsRNA的第二臂的序列，该dsRNA用于同时靶向来自丁香假单胞菌pto DC3000菌株的avrPTO/avrPTOB/HopT1-1基因
<400> 131
agactgcctg gacgatttcg gcccacccct taacctcccc atgagccctg acaaaaacgt 60
ctgtcaacgt gtcaaccagc gcgcttattg tcattttcgc tgccgggtgg tcggcaatgt 120
gttcgatgac tgctttttcg atcttgctgt tacgctggat ttcgctgcaa accggctggg 180
atttctgcgc cgaagtttcc gttcccgcat ccacgacgag atttgtactg ggtatcgagt 240
gattgctgac tgttttcatg catcgtgaaa gcctctcacg tccggttggc ggcggtgcgg 300
gcgcgttcga cgggggagta ttcgagggtc gcggctgaac ctgcggactg ttcgaggagc 360
tggcgccgct gccggatccg tgtgcttgcc ccgatactgg ctcggggtct gtgtggccaa 420
caaaataagc gcccgatggt cccgctctat tgatacccgc cattttctca ggctttgagg 480
tgcttggtta ctaacaaatt catgctgatc tcttggtaca ccagcagact ccgcaagttg 540
atgtctgacg ctcagcagtt gactggacgt tacgttatct tcgtcacccg agttgttact 600
aactcggtct ggggagttca cctgatgggc catcctggat ccgccgacac atatatttcc 660
cat 663
<210> 132
<211> 668
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> rpoB/rpoC/fusA dsRNA的第一臂的序列，该dsRNA用于同时靶向来自PtoDC3000的rpoB、RpoC和fusA基因
<400> 132
cgtatccgca aggactttag caagttgccg gacgtaatgg atgtgccgta tctcttggcc 60
atccagctgg attcgtatcg cgaattcctg caggcgggag cgaccaaaga tcagttccgc 120
gacgtcggtc tgcatgcagc cttcaaatcc gttttcccga tcatcagcta ctccggcaat 180
gctgcgctgg agtatgtagg ttatcgcttg ggcgagatct tgaaagacct actgaatttg 240
ctgaaaaacc agggtcaagt cgaagagttc gacgcaatcc gtatcggact tgcatcgcct 300
gagatgatcc gctcttggtc gttcggtgaa gttaaaaagc cggaaaccat caactaccgt 360
acgttcaagc ctgagcgtga cggtctgttc tgcgccaaga tctttggtcc ggtaaaagat 420
tacgagtgcc tgtgcggtaa gtacaagatg catggctcgt actactccga ttagccgtta 480
ccgtaacatc ggtatcgtcg ctcacgtgga tgctggtaaa accaccacca ccgagcgcgt 540
ccttttttac accggcaaaa gccacaaaat gggcgaggtg catgatggcg ccgcgaccac 600
ggactggatg gttcaggagc aggagcgtgg tattaccatt acttctgctg ctatcactgc 660
cttttggc 668
<210> 133
<211> 668
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> rpoB/rpoC/fusA dsRNA的第二臂的序列，该dsRNA用于同时靶向来自PtoDC3000的rpoB、RpoC和fusA基因
<400> 133
gccaaaaggc agtgatagca gcagaagtaa tggtaatacc acgctcctgc tcctgaacca 60
tccagtccgt ggtcgcggcg ccatcatgca cctcgcccat tttgtggctt ttgccggtgt 120
aaaaaaggac gcgctcggtg gtggtggttt taccagcatc cacgtgagcg acgataccga 180
tgttacggta acggctaatc ggagtagtac gagccatgca tcttgtactt accgcacagg 240
cactcgtaat cttttaccgg accaaagatc ttggcgcaga acagaccgtc acgctcaggc 300
ttgaacgtac ggtagttgat ggtttccggc tttttaactt caccgaacga ccaagagcgg 360
atcatctcag gcgatgcaag tccgatacgg attgcgtcga actcttcgac ttgaccctgg 420
tttttcagca aattcagtag gtctttcaag atctcgccca agcgataacc tacatactcc 480
agcgcagcat tgccggagta gctgatgatc gggaaaacgg atttgaaggc tgcatgcaga 540
ccgacgtcgc ggaactgatc tttggtcgct cccgcctgca ggaattcgcg atacgaatcc 600
agctggatgg ccaagagata cggcacatcc attacgtccg gcaacttgct aaagtccttg 660
cggatacg 668
<210> 134
<211> 673
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> secE/rpoA/rplQ dsRNA的第一臂的序列，该dsRNA用于同时靶向来自PtoDC3000的secE、RpoA和rplQ基因
<400> 134
tgaatcccaa ggctgaagca tcagactctc gctttgattt gctgaaatgg ctcctggtag 60
tcattttggt agtcgtgggt gttgtcggta atcagtatta ctctgctgag ccgatcctgt 120
accgtgttct cgctctcctt gtgattgccg cagcagctgc atttgtagcg ctgcagactg 180
gcaagggcaa agctttcttc gttttggcga aagaagcgcg tgcagagatg atctgcagat 240
ttcggtaaat gagttcctga caccccgcca cattgatgtg caggttgtca gtccaacccg 300
cgccaaaatc actctcgagc ctctcgagcg tggtttcggc cataccctgg gcaacgcgct 360
tcgccgcatt ttgttgtcct ccatgcccgg ctgtgcagta gtcgaggccg agattgacgg 420
tgtactccat gagtacagcg ccatcgaagg tgtaatgcat gcgtcatcgt aaaagtggac 480
gtcacctgag ccgtaccagc tctcaccgta aagccatgtt tcaaaacatg gcggtgtcgc 540
tgttcgagca cgagctgatc aaaactaccc tgccgaaagc caaggaactg cgccgcgttg 600
ccgagccgct gatcaccctg gccaaggaag acagtgttgc taaccgtcgt ctggctttcg 660
accgtactcg ttc 673
<210> 135
<211> 673
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> secE/rpoA/rplQ dsRNA的第二臂的序列，该dsRNA用于同时靶向来自PtoDC3000的secE、RpoA和rplQ基因
<400> 135
gaacgagtac ggtcgaaagc cagacgacgg ttagcaacac tgtcttcctt ggccagggtg 60
atcagcggct cggcaacgcg gcgcagttcc ttggctttcg gcagggtagt tttgatcagc 120
tcgtgctcga acagcgacac cgccatgttt tgaaacatgg ctttacggtg agagctggta 180
cggctcaggt gacgtccact tttacgatga cgcatgcatt acaccttcga tggcgctgta 240
ctcatggagt acaccgtcaa tctcggcctc gactactgca cagccgggca tggaggacaa 300
caaaatgcgg cgaagcgcgt tgcccagggt atggccgaaa ccacgctcga gaggctcgag 360
agtgattttg gcgcgggttg gactgacaac ctgcacatca atgtggcggg gtgtcaggaa 420
ctcatttacc gaaatctgca gatcatctct gcacgcgctt ctttcgccaa aacgaagaaa 480
gctttgccct tgccagtctg cagcgctaca aatgcagctg ctgcggcaat cacaaggaga 540
gcgagaacac ggtacaggat cggctcagca gagtaatact gattaccgac aacacccacg 600
actaccaaaa tgactaccag gagccatttc agcaaatcaa agcgagagtc tgatgcttca 660
gccttgggat tca 673
<210> 136
<211> 217
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> fusA dsRNA的第一臂的序列，该dsRNA用于靶向来自Pto DC3000的fusA基因
<400> 136
atggctcgta ctactccgat tagccgttac cgtaacatcg gtatcgtcgc tcacgtggat 60
gctggtaaaa ccaccaccac cgagcgcgtc cttttttaca ccggcaaaag ccacaaaatg 120
ggcgaggtgc atgatggcgc cgcgaccacg gactggatgg ttcaggagca ggagcgtggt 180
attaccatta cttctgctgc tatcactgcc ttttggc 217
<210> 137
<211> 217
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> fusA dsRNA的第二臂的序列，该dsRNA用于靶向来自Pto DC3000的fusA基因
<400> 137
gccaaaaggc agtgatagca gcagaagtaa tggtaatacc acgctcctgc tcctgaacca 60
tccagtccgt ggtcgcggcg ccatcatgca cctcgcccat tttgtggctt ttgccggtgt 120
aaaaaaggac gcgctcggtg gtggtggttt taccagcatc cacgtgagcg acgataccga 180
tgttacggta acggctaatc ggagtagtac gagccat 217
<210> 138
<211> 221
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> gyrB dsRNA的第一臂的序列，该dsRNA用于靶向来自Pto DC3000的gyrB基因
<400> 138
agcgaaaacc aaacgtacga ctcgtccagc attaaagtgc tgaaaggact tgatgccgta 60
cgcaagcgtc ccggaatgta catcggtgat acagacgatg gcagcggtct gcaccatatg 120
gtgttcgagg tggttgataa ctcgatcgac gaagcattgg caggccattg cgacgacatc 180
agcatcatca tccatccaga cgaatctatc accgtgcgcg a 221
<210> 139
<211> 221
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> gyrB dsRNA的第二臂的序列，该dsRNA用于靶向来自Pto DC3000的gyrB基因
<400> 139
tcgcgcacgg tgatagattc gtctggatgg atgatgatgc tgatgtcgtc gcaatggcct 60
gccaatgctt cgtcgatcga gttatcaacc acctcgaaca ccatatggtg cagaccgctg 120
ccatcgtctg tatcaccgat gtacattccg ggacgcttgc gtacggcatc aagtcctttc 180
agcactttaa tgctggacga gtcgtacgtt tggttttcgc t 221
<210> 140
<211> 442
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> fusA/gyrB dsRNA的第一臂的序列，该dsRNA用于同时靶向来自Pto DC3000的fusA和gyrB基因
<400> 140
atggctcgta ctactccgat tagccgttac cgtaacatcg gtatcgtcgc tcacgtggat 60
gctggtaaaa ccaccaccac cgagcgcgtc cttttttaca ccggcaaaag ccacaaaatg 120
ggcgaggtgc atgatggcgc cgcgaccacg gactggatgg ttcaggagca ggagcgtggt 180
attaccatta cttctgctgc tatcactgcc ttttggcgat cagcgaaaac caaacgtacg 240
actcgtccag cattaaagtg ctgaaaggac ttgatgccgt acgcaagcgt cccggaatgt 300
acatcggtga tacagacgat ggcagcggtc tgcaccatat ggtgttcgag gtggttgata 360
actcgatcga cgaagcattg gcaggccatt gcgacgacat cagcatcatc atccatccag 420
acgaatctat caccgtgcgc ga 442
<210> 141
<211> 442
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> fusA/gyrB dsRNA的第二臂的序列，该dsRNA用于同时靶向来自Pto DC3000的fusA和gyrB基因
<400> 141
tcgcgcacgg tgatagattc gtctggatgg atgatgatgc tgatgtcgtc gcaatggcct 60
gccaatgctt cgtcgatcga gttatcaacc acctcgaaca ccatatggtg cagaccgctg 120
ccatcgtctg tatcaccgat gtacattccg ggacgcttgc gtacggcatc aagtcctttc 180
agcactttaa tgctggacga gtcgtacgtt tggttttcgc tgatcgccaa aaggcagtga 240
tagcagcaga agtaatggta ataccacgct cctgctcctg aaccatccag tccgtggtcg 300
cggcgccatc atgcacctcg cccattttgt ggcttttgcc ggtgtaaaaa aggacgcgct 360
cggtggtggt ggttttacca gcatccacgt gagcgacgat accgatgtta cggtaacggc 420
taatcggagt agtacgagcc at 442
<210> 142
<211> 229
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> secE dsRNA的第一臂的序列，该dsRNA用于靶向来自Pto DC3000的secE基因
<400> 142
tgaatcccaa ggctgaagca tcagactctc gctttgattt gctgaaatgg ctcctggtag 60
tcattttggt agtcgtgggt gttgtcggta atcagtatta ctctgctgag ccgatcctgt 120
accgtgttct cgctctcctt gtgattgccg cagcagctgc atttgtagcg ctgcagactg 180
gcaagggcaa agctttcttc gttttggcga aagaagcgcg tgcagagat 229
<210> 143
<211> 229
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> secE dsRNA的第二臂的序列，该dsRNA用于靶向来自Pto DC3000的secE基因
<400> 143
atctctgcac gcgcttcttt cgccaaaacg aagaaagctt tgcccttgcc agtctgcagc 60
gctacaaatg cagctgctgc ggcaatcaca aggagagcga gaacacggta caggatcggc 120
tcagcagagt aatactgatt accgacaaca cccacgacta ccaaaatgac taccaggagc 180
catttcagca aatcaaagcg agagtctgat gcttcagcct tgggattca 229
<210> 144
<211> 475
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> gyrB/hrpL dsRNA的第一臂的序列，该dsRNA用于同时靶向来自Pto DC3000的gyrB和hrpL基因
<400> 144
agcgaaaacc aaacgtacga ctcgtccagc attaaagtgc tgaaaggact tgatgccgta 60
cgcaagcgtc ccggaatgta catcggtgat acagacgatg gcagcggtct gcaccatatg 120
gtgttcgagg tggttgataa ctcgatcgac gaagcattgg caggccattg cgacgacatc 180
agcatcatca tccatccaga cgaatctatc accgtgcgcg agatcctgat gactgacatc 240
accgtgccct tccagctcgg aatgcacttc gtcttcccag ctttcctgat acggctgacg 300
atacattttg cggaagtgat tgcggatcag gttcagcgcg atgccacaca gccaggtctg 360
cggtttgctg gcatgttgaa acttgtgctc gttacgcagg gcttcaagaa acacgcactg 420
gagaatgtca tccacatcat cagggttcat cacccgcttt tggataaacg ccctg 475
<210> 145
<211> 475
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> gyrB/hrpL dsRNA的第二臂的序列，该dsRNA用于同时靶向来自Pto DC3000的gyrB和hrpL基因
<400> 145
cagggcgttt atccaaaagc gggtgatgaa ccctgatgat gtggatgaca ttctccagtg 60
cgtgtttctt gaagccctgc gtaacgagca caagtttcaa catgccagca aaccgcagac 120
ctggctgtgt ggcatcgcgc tgaacctgat ccgcaatcac ttccgcaaaa tgtatcgtca 180
gccgtatcag gaaagctggg aagacgaagt gcattccgag ctggaagggc acggtgatgt 240
cagtcatcag gatctcgcgc acggtgatag attcgtctgg atggatgatg atgctgatgt 300
cgtcgcaatg gcctgccaat gcttcgtcga tcgagttatc aaccacctcg aacaccatat 360
ggtgcagacc gctgccatcg tctgtatcac cgatgtacat tccgggacgc ttgcgtacgg 420
catcaagtcc tttcagcact ttaatgctgg acgagtcgta cgtttggttt tcgct 475
<210> 146
<211> 673
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> dnaA/dnaN/gyrB dsRNA的第一臂的序列，该dsRNA用于同时靶向来自PtoDC3000的dnaA、dnaN和gyrB基因
<400> 146
gtgtcagtgg aactttggca gcagtgcgtg gagcttttgc gcgacgagct gccggcccag 60
caattcaaca cttggatccg tccgctacag gtcgaagccg aaggcgacga gttgcgtgtg 120
tacgcaccca accgctttgt tctcgattgg gtcaatgaaa aatacctcgg ccgtttgctt 180
gagcttctcg gcgaacgtgg tcaaggcatg gcgcccgctg atcatgcatt tcaccattca 240
acgcgaagcc ctgttgaaac ccctgcaatt ggtcgccggc gtggtagaac gccgccagac 300
cttgccggtt ctttccaatg tgcttctggt cgtgcaaggc cagcagctgt cgctgaccgg 360
tactgacctg gaagtcgagc tggttggccg tgttcagctg gaagagcctg ccgaacctgg 420
ggaaatcacc gttcccgcgc gcaagcttat gcagcgaaaa ccaaacgtac gactcgtcca 480
gcattaaagt gctgaaagga cttgatgccg tacgcaagcg tcccggaatg tacatcggtg 540
atacagacga tggcagcggt ctgcaccata tggtgttcga ggtggttgat aactcgatcg 600
acgaagcatt ggcaggccat tgcgacgaca tcagcatcat catccatcca gacgaatcta 660
tcaccgtgcg cga 673
<210> 147
<211> 673
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> dnaA/dnaN/gyrB dsRNA的第二臂的序列，该dsRNA用于同时靶向来自PtoDC3000的dnaA、dnaN和gyrB基因
<400> 147
tcgcgcacgg tgatagattc gtctggatgg atgatgatgc tgatgtcgtc gcaatggcct 60
gccaatgctt cgtcgatcga gttatcaacc acctcgaaca ccatatggtg cagaccgctg 120
ccatcgtctg tatcaccgat gtacattccg ggacgcttgc gtacggcatc aagtcctttc 180
agcactttaa tgctggacga gtcgtacgtt tggttttcgc tgcataagct tgcgcgcggg 240
aacggtgatt tccccaggtt cggcaggctc ttccagctga acacggccaa ccagctcgac 300
ttccaggtca gtaccggtca gcgacagctg ctggccttgc acgaccagaa gcacattgga 360
aagaaccggc aaggtctggc ggcgttctac cacgccggcg accaattgca ggggtttcaa 420
cagggcttcg cgttgaatgg tgaaatgcat gatcagcggg cgccatgcct tgaccacgtt 480
cgccgagaag ctcaagcaaa cggccgaggt atttttcatt gacccaatcg agaacaaagc 540
ggttgggtgc gtacacacgc aactcgtcgc cttcggcttc gacctgtagc ggacggatcc 600
aagtgttgaa ttgctgggcc ggcagctcgt cgcgcaaaag ctccacgcac tgctgccaaa 660
gttccactga cac 673
<210> 148
<211> 758
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> HrpR/ GyrB/ RpoD dsRNA的第二臂的序列，该dsRNA用于同时靶向来自丁香假单胞菌猕猴桃致病变种的HrpR、GyrB、RpoD基因
<400> 148
cagccgcttc ttctgcggct gcctcgtcgg tatcggcgtc ggccagcatc aaggcgtccg 60
catccggagc actctcgtgt accgggatcc ccatgtcgtt gatcatgcgg atgatgtctt 120
ccacctgctc gggatctgaa atatcctcgg gcaggtggtc gttgacctct gcgtaagtca 180
gatatttctg ctcacgaccc agggtgatca actctttgat acgagactgc tgttgcgctt 240
ttccggacat gcatcgtcta ccggaatacc gcggccgttg tcgcgcacgg tgatagattc 300
gtctggatgg atgatgatgc tgatgtcgtc gcaatggcct gccaatgctt cgtcgatcga 360
gttatcaacc acctcgaaca ccatatggtg cagaccgctg ccatcgtctg tatcaccgat 420
gtacattccg ggacgcttgc gtacggcatc aagtcctttc agcactttaa tgctggacga 480
gtcgtacgtt tggttttcgc tcatgatccc aggtacaacg tgccaccact ggaggcctct 540
atgtagccct cgcgagcccg gcatacgccg gtgaatgcgc cgttgaccac accgaataac 600
tggctctctg ccagcgactc gggaatggct gcgcagttca tgcccacaaa gggtcccgac 660
ctgctggaca actcgtgaat gcggttggcc agtgtgtcct tgccggtgcc ggtttccccg 720
cacaacagca agtccatatc caggaacgcg ctattcat 758
<210> 149
<211> 1410
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 来自矮牵牛（Petunia）查耳酮合酶基因CHSA的特定内含子序列的序列
<400> 149
ggcgcgccca atcgatgatt taaatgtgta agaatttctt atgttacatt attacattca 60
acgttttatc ttaattggct cttcatttga ttgaaatttg acaattattt cttgtttttt 120
tttttgtcac actctttttg ggttggggtg gccgacgaat tgtgggaagg tagaaagagg 180
ggaggacttt tgttatactc cattagtaat tactgtttcc gtttcaattt atgtgacaat 240
atttcctttt tagtcggttc caaaagaaaa tgtcagcatt ataaacaatt taattttgaa 300
attacaattt tgccattaat aaaatgattt acaaccacaa aagtatctat gagcctgttt 360
gggtgggctt ataagcagct tattttaagt ggcttataag tcaaaaagtg acattttttg 420
agaagttaga aaatcctaac ttctcaaaaa gtagctttta agccacttat gacttataag 480
tccaaaaatt tttaagttac caaacatata ttaatgggtt tataagctta taagccactt 540
ttaagctcac ccaaacgggt tctatgtctc actttagact acaaatttta aaagtcttca 600
tttatttctt aatctccgtg gcgagtaaaa ctataacaca taaagtgaaa cggagggaat 660
aagatggagt cataaactaa tccaaatcta tactctctcc gttaatttgt tttttagttt 720
gatttggtac attaataaaa cagatttttc gaaggttata aacacagaca gatgtttccc 780
agcgagctag caaaattcca agatttctgt cgaaaattcg tgtgtttcta gctagtactt 840
gatgttatct ttaacctttt agtaattttt tgtccttttc tttctatttt tcatcttaca 900
atgaattatg agcaagttcc ttaagtagca tcacacgtga gatgtttttt atgatattga 960
ctaaatccaa tctttaccat tccttaacta gtaaaataca acacatgtta attgatacat 1020
tgcttaacac tgaggttaga aaattttaga aattagttgt ccaaatgctt tgaaattaga 1080
aatctttaat cccttatttt tttttaaaat gttttttctc actccaaaga aagagaaact 1140
gacatgaaag ctcaaaagat catgaatctt actaactttg tggaactaaa tgtacatcag 1200
aatgtttctg acatgtgaaa atgaaagctc ttaattttct tcttttattt attgagggtt 1260
tttgcatgct atgcattcaa tttgagtact ttaaagcacc tataaacact tacttacact 1320
tgccttggag tttatgtttt agtgttttct tcacatcttt tttggtcaat ttgcaggtat 1380
ttggatccta ggtgagtcta gaggcgcgcc 1410

Claims (16)

1.一种用于生产功能性干扰小RNA的方法，所述方法至少包括以下步骤：
a)用包含至少一个目标基因的至少一个片段的siRNA或miRNA前体转化小球藻(Chlorella)细胞，以及
b)在合适的条件下培养所述小球藻细胞，以使它们表达所述前体并释放靶向所述至少一个基因片段的细胞外囊泡(EV)包埋的功能性小iRNA。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述siRNA或miRNA前体是长单链或双链RNA分子，优选长双链RNA分子。
3.根据权利要求1-2所述的方法，其中所述基因片段在50和3000bp之间。
4.根据权利要求1-3所述的方法，其进一步包括从所述小球藻细胞回收所述小iRNA的步骤。
5.根据权利要求1-3所述的方法，其进一步包括回收细胞外培养基中由所述小球藻细胞释放的细胞外囊泡(EV)的步骤。
6.根据权利要求1-5所述的方法，其中所述目标基因是卵菌基因、病毒基因、细菌基因或真菌基因。
7.小球藻衍生的EV，其通过权利要求5所述的方法获得，所述EV含有靶向所述至少一个目标基因中的一个或数个区域的功能性小iRNA群体。
8.根据权利要求7所述的小球藻衍生的EV，其中所述功能性小iRNA群体靶向至少一个病毒基因中的一个或数个区域。
9.根据权利要求7所述的小球藻衍生的EV，其中所述功能性小iRNA群体靶向至少一个细菌基因中的一个或数个区域。
10.一种用于治疗植物的寄生感染和/或感染性疾病的方法，所述方法包括使用如权利要求7-9中所定义的小球藻衍生的EV。
11.一种植物治疗组合物，其含有有效量的如权利要求7-10所定义的小球藻衍生的EV以及农艺上可接受的载体。
12.重组小球藻细胞，其表达包含至少一个目标基因的至少一个片段的siRNA或miRNA前体，所述小球藻细胞释放靶向所述至少一个基因片段的EV包埋的功能性小iRNA。
13.根据权利要求1-6所述的方法或根据权利要求12所述的重组小球藻细胞，其中所述siRNA前体具有选自SEQ ID NO：1-148的序列。
14.SEQ ID NO：1-148的siRNA前体中的任一种在小球藻细胞中生产功能性小iRNA群体的用途。
15.一种多功能平台，其用于高通量生产EV包埋的功能性干扰小RNA，所述平台使用如权利要求12所定义的重组小球藻细胞。
16.一种植物治疗组合物，其包含如权利要求12所定义的重组小球藻细胞，优选配制为粉末。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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