CN110016519A

CN110016519A - 一种香蕉枯萎菌4号生理小种dcl基因缺失突变体及其小rna

Info

Publication number: CN110016519A
Application number: CN201910362380.6A
Authority: CN
Inventors: 彭军; 曾凡云; 张欣; 漆艳香; 谢培兰; 谢艺贤
Original assignee: CATAS Environment and Plant Protection Institute
Current assignee: CATAS Environment and Plant Protection Institute
Priority date: 2019-04-30
Filing date: 2019-04-30
Publication date: 2019-07-16
Anticipated expiration: 2039-04-30
Also published as: CN110016519B

Abstract

本发明公开了一种香蕉枯萎菌4号生理小种DCL基因缺失突变体及其小RNA。采用同源置换的原理，构建了香蕉枯萎菌Δdcl1、Δdcl2和Δdcl1/2基因缺失突变体，并进行了非生物胁迫测试和致病力分析，结果显示经过荧光增白剂CFW处理后，Δdcl1、Δdcl2、Δdcl1/2突变体更加敏感，生长受到抑制，MgCl₂处理后，Δdcl1突变体、Δdcl2突变体和Δdcl1/2突变体的生长均受到抑制。Δdcl1突变体致病力增强，Δdcl2突变体和Δdcl1/2突变体致病力减弱；此外，结合小RNA深度测序获得各突变体小RNA，为进一步解析香蕉枯萎病的致病机制，开发RNA来源的防控措施等提供理论和技术支撑。

Description

一种香蕉枯萎菌4号生理小种DCL基因缺失突变体及其小RNA

技术领域

本发明涉及一种香蕉枯萎菌4号生理小种DCL基因缺失突变体及其小RNA，属于生物工程技术领域。

背景技术

小RNA，包括miRNA和siRNA，是一类21-24nt长度的小分子非编码RNA，通过剪切靶标mRNA或转录抑制的方式导致序列特异性的转录后基因沉默调控，均由类似RNase III的核酸内切酶Dicer(或Dicer类似蛋白)加工产生。Dicer(DCL)作为一种特异性核糖核酸内切酶参与了小RNA生物合成途径，Dicer的作用机制分两步：第一步，Dicer与dsRNA结合形成酶-dsRNA复合体，在ATP的作用下将dsRNA解螺旋并将其切割产生5'端磷酸基、3'端羟基且含有2nt核苷酸突出的21-24nt小片段siRNAs；第二步，小片段的siRNA与含有PAZ功能域的Argonaute(AGO)蛋白结合形成RNA诱导的沉默复合体(RNA induced silencing complex,RISC)，该复合体具有序列特异性的核酸内切酶活性，能够特异性的降解与siRNA同源的靶标mRNA。

真菌也能编码与植物的miRNA类似的miRNA，命名为microRNA类似小RNAs(microRNA-like RNAs，milRNAs)。milRNAs的生物合成途径与植物和动物的miRNA生物途径有很大的差异，粗糙脉孢菌(N.crassa)中发现的milRNAs长度一般是19-25nt，具有发夹卡结构，形成的milRNAs具有5'末端U的偏好性，能够特异与Argonaute(AGO)蛋白结合发挥功能。粗糙脉孢菌中有四条不同的milRNAs生物形成途径，这些milRNAs通过Dicers、QDE-2、核酸外切酶活性的QIP效应蛋白以及具有RNaseⅢ功能域的线粒体核糖体大亚基MRPL3蛋白(mitochondrial ribosomal protein large subunit,MRPL3)的不同组合而产生，其中包括一条不依赖Dicer的milRNA产生途径(disiRNAs)(Lee et al.,2010)。虽然四种途径中从基因间隔区转录的RNA前体序列长度各异，但都与大多数的植物和动物的miRNA依赖RNAPolymerase II转录不同，粗糙脉孢菌的milRNA主要依赖Pol III转录的(Yang et al.,2013)。milR-1是粗糙脉孢菌中丰度最高的miRNA-like RNAs，Xue et al.(2012)以milR-1为研究对象构建了依赖AGO的milR-1离体生物形成的生物化学研究框架，研究表明milR-1的加工成熟过程可以分为5个步骤，需要QDE-2、Dicer、QIP以及RNA外来复合体(exosome)的共同参与(Xue et al.,2012)。

小RNA在介导病原物-寄主相互作用过程中发挥着重要的作用，病毒、真菌、细菌等能够依靠自身编码的miRNAs或microRNA-likes(milRNAs)抑制寄主防卫相关基因的表达从而促进病原物的侵染。同样，病原真菌编码的siRNA不仅可以靶标寄主mRNA，而且利用小分子RNA作为effector进入植物细胞内部抑制植物免疫防卫反应。灰霉菌(Botrytiscinerea)可以侵染200多种植物，Weiberg et al.(2013)的研究显示灰霉菌能够输送Bc-sRNAs进入寄主细胞通过与AGO1特异性结合抑制AGO1功能，沉默寄主的免疫相关基因促进病原菌侵染。拟南芥的ago1缺失突变体由于丧失了AGO1功能，减少了对灰霉菌的敏感性；相反，灰霉菌的dcl1 dcl2双突变体由于无法加工产生Bc-sRNAs而完全丧失了侵染性。因此，真菌病原物通过转移具有致病力的小RNA效应因子进入寄主细胞通过抑制寄主的防卫反应促进病原菌的侵染，该发现阐释了这种自然发生的跨界RNAi沉默现象作为病原真菌的一种更加高级的致病机制(Weiberg et al.,2013；Wang et al.,2016)。随后，更多的研究进一步证实了跨界基因沉默机制。小麦条锈病(Puccinia striiformis f.sp.tritici，Pst)是小麦的重要病害之一，其自身编码的小RNA是一类重要的致病因子。Pst自身编码的microRNA-like RNA 1(Pst-milR1)仅仅在侵染时诱导表达，通过跨界沉默机制靶向小麦病程相关PR2基因1,3-β-葡聚糖酶(SM638)而促进侵染。在病原菌中沉默Pst-milR1的表达降低了病原菌致病力；反之，在小麦中敲除其靶标PR2基因则增强了小麦对无毒菌株的感病性。此外，Pst-milR1是依赖DCLs加工产生的(Wang et al.,2017)。大丽轮枝菌(Verticillium dahliae)属于半知菌亚门轮枝菌属真菌，寄主范围非常广，可以引起棉花黄萎病。大丽轮枝菌也编码小RNA，最新研究表明大丽轮枝菌编码的VdmilRNA1是不依赖AGOs和DCLs产生的，VdmilR1靶向VdHy1基因的3'UTR区域调控靶标基因的表达。VdmilR1-VdHy1的分子调控不是通过靶标mRNA切割的方式，而是通过增加组蛋白H3K9的甲基化水平以转录抑制的方式进行的(Jin et al.,2019)。

探索小RNA在病原真菌与寄主分子互作中的作用机制，能够开发更加有效的防控措施。小RNA依赖Dicer或者Dicer-like(DCL)内切核糖核酸酶切割加工产生，因此，敲除或沉默DCLs基因可以阻止病原菌的小RNA产生从而降低病原菌的致病力。灰霉菌(Botrytiscinerea)含有2个DCLs基因(DCL1和DCL2)，双敲除突变体dcl1dcl2在拟南芥和番茄上的致病力严重下降(Wang et al.,2016,2017)。模式线虫多形螺旋线虫(Heligmosomoidespolygyrus)可以从环境中摄入外源RNA的现象称为环境RNAi，灰霉菌中也存在环境RNAi机制。因此，体外喷施Bc-DCL1/2来源的dsRNA可以有效防控灰霉菌的发生和扩展，低至5ng/μl的dsRNA浓度就可以维持8天的时间，为后续开发RNA来源的植物病原菌防控方法提供了方向(Wang et al.,2017)。应用dsRNA体外喷施具有诸多优点，比如不需要转基因，环境友好并且使用方便等，是防控植物病原真菌的未来发展方向。禾谷镰刀菌(Fusariumgraminearum)和亚洲镰孢菌(Fusarium asiaticum)也有成功应用dsRNA技术的报道(Kochet al.,2016；Song et al.,2018)。

香蕉枯萎病(Fusarium oxysporum f.sp.cubense,Foc)是破坏香蕉维管束导致植株死亡的毁灭性土传病害，其病菌腐生能力很强,在土壤中可长期存活，属于典型的潜伏型侵染。世界植蕉区已发现其有4个生理小种(还可能存在其它小种)，其中1号生理小种(Race1)侵染粉蕉(ABB组)、龙牙蕉(AAB组)类及部分AAA组品种；生理小种2号(Race 2)只侵染杂交三倍体棱香蕉(ABB)，对香蕉栽培品种的危害较小；生理小种3号(Race 3)侵染野生的羯尾蕉属，对香蕉栽培品种不造成危害，在许多地区均有报道；生理小种4号，包括热带4号小种(Tropical race 4,TR4)和亚热带4号小种(Subtropical race 4,ST4)，侵染香牙蕉、龙牙蕉、大蕉，其寄主范围大于生理小种1号。早期外部症状表现不明显，中后期才表现症状，因此，给香蕉产业和香蕉种植者造成巨大的经济损失。香蕉枯萎病对全球香蕉产业造成严重危害和威胁，具有广泛影响并引起普遍关注，但目前尚无有效的防治措施。因此，利用小RNA在枯萎菌-香蕉分子互作中的机制，有望为防控香蕉提供新的理论和技术支撑。

发明内容

本发明通过生物信息学预测funRNA(http://funrna.riceblast.snu.ac.kr)，结合功能域分析软件SMART(Simple Modular Architecture Research Tool)(http://smart.embl.de)，对香蕉枯萎菌4号生理小种(TR4)的2个DCLs基因进行了分析，并对DCLs的敲除突变体进行了非生物胁迫测试和致病力分析；此外，结合小RNA深度测序，对DCLs依赖的小RNA进行了分类鉴定，试图探索小RNA与致病力之间的相互关系，为进一步解析香蕉枯萎病的致病机制，开发RNA来源的防控措施提供理论和技术支撑。

本发明采取的技术方案如下：

一种香蕉枯萎菌4号生理小种DCL基因缺失突变体，通过以下方法获得：

1)构建Foc4 DCL1基因缺失重组DNA片段，采用潮霉素抗性基因HPH，原生质体转化，获得Foc4 DCL1基因缺失突变体，即Δdcl1突变体；还可以采用相同的方法敲除DCL2基因，构建Δdcl2突变体；

2)在Δdcl1突变体的基础上构建Foc4 DCL1/2双基因缺失重组DNA片段，采用新霉素NEO抗性基因，原生质体转化，获得Foc4 DCL1/2双基因缺失突变体，即Δdcl1/2突变体。

具体的，步骤1)Δdcl1突变体的构建方法为：

第一轮PCR扩增：

左端LB：FOC4基因组DNA为模板，DCL1-LBCK和DCL1-HPH-LB-R为引物，扩增产物大小1699bp；

右端RB：以FOC4基因组DNA为模板，DCL1-HPH-RB-F和DCL1-RBCK为引物，扩增产物大小1920bp；

潮霉素抗性基因HPH：载体质粒DNA为模板，HYG-F和HYG-R为引物，扩增产物大小1376bp；

第二轮PCR扩增：

左端LB+HP：左端LB和潮霉素抗性基因HPH为模板，DCL1-LB-F和HYG-R1为引物，扩增产物大小2310bp；

右端PH+RB：右端RB和潮霉素抗性基因HPH为模板，HYG-F1和DCL1-RB-R，扩增产物大小2269bp；

将第二轮PCR片段回收后导入原生质体进行转化，获得Foc4 DCL1基因缺失突变体，即Δdcl1突变体；

其中，DCL1-LBCK、DCL1-HPH-LB-R、DCL1-HPH-RB-F、DCL1-RBCK、DCL1-LB-F、HYG-R1、HYG-F1和DCL1-RB-R的序列依序如SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ IDNO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10所示。

具体的，步骤1)Δdcl2突变体的构建方法为：

第一轮PCR扩增：

左端LB：FOC4基因组DNA为模板，DCL2-LBCK和DCL2-HPH-LB-R为引物，扩增产物大小1957bp；

右端RB：FOC4基因组DNA为模板，DCL2-HPH-RB-F和DCL2-RBCK为引物，扩增产物大小1837bp；

第二轮PCR扩增：

左端LB+HP：左端LB和潮霉素抗性基因HPH为模板，DCL2-LB-F和HYG-R1为引物，扩增产物大小2682bp；

右端PH+RB：右端RB和潮霉素抗性基因HPH为模板，HYG-F1和DCL2-RB-R为引物，扩增产物大小2103bp；

其中，DCL2-LBCK、DCL2-HPH-LB-R、DCL2-HPH-RB-F、DCL2-RBCK、DCL2-LB-F、HYG-R1、HYG-F1和DCL2-RB-R的序列依序如SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ IDNO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:20所示。

具体的，步骤2)：

第一轮PCR扩增：

左端LB：Δdcl1突变体基因组DNA为模板，DCL2-NEO-LBCK和DCL2-NEO-LB-R为引物，扩增产物大小1881bp；

右端RB：FOC4基因组DNA为模板，DCL2-NEO-RB-F和DCL2-NEO-RBCK为引物，扩增产物大小1973bp；

新霉素NEO抗性基因：载体质粒DNA为模板，NEO-F和NEO-R为引物，扩增产物大小1370bp；

第二轮PCR扩增：

左端LB+NE：左端LB和新霉素NEO抗性基因为模板，DCL2-NEO-LB-F和NEO-R1为引物，扩增产物大小2288bp；

右端EO+RB：右端RB和新霉素NEO抗性基因为模板，NEO-F1和DCL2-NEO-RB-R为引物，扩增产物大小2412bp；

将第二轮PCR片段回收后导入原生质体进行转化，获得Foc4 DCL1/2双基因缺失突变体，即Δdcl1/2突变体；

其中，DCL2-NEO-LBCK、DCL2-NEO-LB-R、DCL2-NEO-RB-F、DCL2-NEO-RBCK、DCL2-NEO-LB-F、NEO-R1、NEO-F1和DCL2-NEO-RB-R的序列依序如SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24和SEQ ID NO:32所示。

本发明还进行了突变体小RNA的深度测序，分析结果显示：相比于Foc4，Δdcl1突变体多产生了如SEQ ID NO:35-48任一项所示序列的特异性小RNA。相比于Foc4，Δdcl2突变体多产生了如SEQ ID NO:49-55任一项所示序列的特异性小RNA。相比于Foc4，Δdcl1/2缺失突变体多产生了如SEQ ID NO:56-60任一项所示序列的特异性小RNA。

突变体非生物胁迫测试和致病力分析结果显示：经过荧光增白剂CFW处理后，Δdcl1突变体、Δdcl2突变体、Δdcl1/2突变体更加敏感，生长受到抑制，MgCl₂处理后，Δdcl1突变体、Δdcl2突变体和Δdcl1/2突变体的生长均受到抑制。Δdcl1突变体致病力增强，Δdcl2突变体和Δdcl1/2突变体致病力减弱。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

本发明采用同源置换的原理，构建了香蕉枯萎菌Δdcl1、Δdcl2和Δdcl1/2突变体，并对DCL基因的敲除突变体进行了非生物胁迫测试和致病力分析，结果显示经过荧光增白剂CFW处理后，Δdcl1、Δdcl2、Δdcl1/2缺失突变体更加敏感，生长受到抑制，MgCl₂处理后，Δdcl1突变体、Δdcl2突变体和Δdcl1/2突变体的生长均受到抑制。Δdcl1突变体致病力增强，Δdcl2突变体和Δdcl1/2突变体致病力减弱；

此外，结合小RNA深度测序获得各突变体小RNA，为进一步解析香蕉枯萎病的致病机制，开发RNA来源的防控措施提供理论和技术支撑。

附图说明

图1为Split-PCR基因敲除示意图；

图2为香蕉枯萎菌Foc4 DCL单基因敲除示意图及阳性转化子PCR鉴定结果图；(A)为DCL1基因敲除示意图；(B)为Δdcl1突变体的PCR检测结果图；(C)为DCL2基因敲除示意图；(D)为Δdcl2突变体PCR检测结果图；

图3为Δdcl1/2双基因敲除示意图及阳性转化子PCR鉴定结果图；(A)为Δdcl1/2双基因敲除示意图；(B)为Δdcl1/2突变体的PCR检测结果图；

图4为Foc4 DCL基因缺失突变体的生物学特性分析结果图；(A)为香蕉枯萎菌Foc4及Δdcl1、Δdcl2、Δdcl1/2突变体PDA平板生长情况；(B)为Foc4 DCLs的功能域分析结果图；(C)为香蕉枯萎菌Foc4及Δdcl1、Δdcl2、Δdcl1/2突变体生长速度测定结果图；(D)为香蕉枯萎菌Foc4及Δdcl1、Δdcl2、Δdcl1/2突变体产孢量测定结果图；

图5为突变体的非生物胁迫敏感性测定结果图；

图6为突变体致病力测定结果图；(A)为Foc4及Δdcl1、Δdcl2、Δdcl1/2突变体人工接种香蕉后地上部分致病表型；(B)为Foc4及Δdcl1、Δdcl2、Δdcl1/2突变体接种香蕉后，地下部分球茎剖开图；图6右下图为Foc4及Δdcl1、Δdcl2、Δdcl1/2突变体的病情指数分析结果图。

具体实施方式

下面通过具体实施方式结合附图对本发明作进一步详细说明。

本发明实施例所用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

本发明实施例所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例一香蕉枯萎菌Foc4 DCLs基因敲除

香蕉枯萎病菌含有DCL1和DCL2两个DCL蛋白基因，Foc4 DCL单基因敲除采用同源置换的原理，用抗性基因潮霉素B(HPH)基因DNA片段替换目的基因Foc4 DCL1或Foc4 DCL2的DNA片段，图1为Split-PCR基因敲除方法的示意图，后续基因敲除步骤中所用的引物与示意图标记一致。

实施例二Foc4 DCL1基因缺失重组DNA片段构建

Split-PCR基因敲除方法采用二轮PCR扩增重组DNA片段，第一轮PCR扩增三个片段：目的基因上游同源臂DNA序列、抗性基因全长序列以及目的基因下游同源臂DNA序列。第二轮PCR则分别将上、下游同源臂DNA序列与抗性基因DNA混合作为PCR模板，分别扩增上游、下游的缺失重组DNA片段。Foc4 DCL1的基因序号Gene:FOIG_04851，参考NCBI GenBank:JH658277.1的基因组序列，设计引物扩增DCL1基因上、下游的同源臂基因序列(图2-A,B)。具体如下：

第一轮PCR扩增：

左端LB：FOC4基因组DNA为模板，DCL1-LBCK/DCL1-HPH-LB-R为引物，扩增产物大小1699bp；

右端RB：FOC4基因组DNA为模板，DCL1-HPH-RB-F/DCL1-RBCK为引物，扩增产物大小1920bp；

潮霉素抗性基因HPH：HYG-F和HYG-R为引物，载体质粒DNA为模板，扩增产物大小1376bp；

PCR反应程序：95℃，4min，1cycle；94℃，40s，58℃，40s，72℃，1min 30s，32cycles；72℃，10min，1cycle；16℃，hold。

第二轮PCR扩增：

左端重组DNA片段(LB+HP)：DCL1-LB-F和HYG-R1为引物，LB+HPH为模板，扩增产物大小(LB1216+HP1094)2310bp；

右端重组DNA片段(PH+RB)：HYG-F1和DCL1-RB-R，RB+HPH为模板，扩增产物大小(PH748+RB1521)2269bp；

PCR反应程序：95℃，4min，1cycle；94℃，40s，58℃，1min 20s，72℃，2min 30s，32cycles；72℃,10min，1cycle；16℃，hold。

引物序列见表1。将第二轮PCR片段回收后导入原生质体进行同源重组基因敲除(图2-A，B)。

实施例三Foc4 DCL2基因缺失重组DNA片段构建

Foc4 DCL2的基因敲除方法与DCL1相同，所用引物以及说明见表2。Foc4 DCL2的基因序号Gene:FOIG_04495，参考GenBank:JH658276.1基因组序列，设计引物扩增DCL2基因上下同源基因组序列(图2-C,D)。详细操作方法如下：

第一轮PCR扩增：

左端LB:DCL2-LBCK和DCL2-HPH-LB-R为引物，FOC4基因组DNA为模板，扩增产物大小1957bp；

右端RB:DCL2-HPH-RB-F和DCL2-RBCK为引物，FOC4基因组DNA为模板，扩增产物大小1837bp；

HPH片段：HYG-F和HYG-R为引物，载体质粒DNA为模板，扩增产物大小1376bp；

第二轮PCR扩增：

左端(LB+HP)：DCL2-LB-F和HYG-R1为引物，LB+HPH为模板，扩增产物大小(LB1588+HP1094)2682bp；

右端(PH+RB)：HYG-F1和DCL2-RB-R，RB+HPH为模板，扩增产物大小(PH748+RB1355)2103bp。

详细引物序列及其说明见表1。将第二轮PCR片段回收后导入原生质体进行同源重组基因敲除(图2-C，D)。

实施例四Foc4 DCL1/2双基因缺失重组DNA片段构建

Foc4 DCL1/2双基因敲除突变体是在Δdcl1突变体的基础上进行的，采用新霉素NEO抗性基因，方便Δdcl1/2的转化子筛选(图3-A,B)。

第一轮PCR扩增：

左端LB:DCL2-NEO-LBCK和DCL2-NEO-LB-R为引物，Δdcl1突变体基因组DNA为模板，扩增产物大小1881bp；

右端RB:DCL2-NEO-RB-F和DCL2-NEO-RBCK为引物，Δdcl1突变体基因组DNA为模板，扩增产物大小1973bp；

新霉素NEO抗性基因：NEO-F和NEO-R为引物，载体质粒DNA为模板，扩增产物大小1370bp；

第二轮PCR扩增：

左端(LB+NE)：DCL2-NEO-LB-F和NEO-R1为引物，LB+NEO为模板，扩增产物大小(LB1388+NE900)2288bp；

右端(EO+RB)：NEO-F1和DCL2-NEO-RB-R，RB+NEO为模板，扩增产物大小(EO976+RB1436)2412bp。

引物序列见表1。将第二轮PCR片段回收后导入原生质体进行同源重组基因敲除(图3-A,B)。

实施例五PEG介导的原生质体转化

1)原生质体制备

取5-10块Foc4菌丝块(培养7-10d，大小5mm)，加入到100ml的PDB中，28℃，150rpm摇培4-5d。3层擦镜纸过滤，收集滤液中的分生孢子。取5-10ml分生孢子液，加入200ml的PDB中，28℃，150rpm摇培12-18h。将培养好的菌液通过4层纱布过滤，适量0.7M NaCl(8.18gNaCl，H₂O to 200ml)溶液冲洗，收集鲜嫩菌丝，将菌丝转入50ml离心管中。加入8-10ml酶解液(储存液浓度为20mg/ml，工作浓度为10mg/ml，称取崩溃酶后用0.7M NaCl溶解，定容)。涡旋，使菌体散开与酶解液充分接触，30℃，80-100rpm，温浴3-4h。酶解结束后，加入0.7MNaCl到50ml离心管稀释酶解液，颠倒混匀后三层檫镜纸过滤，用适量0.7M NaCl冲洗滤纸；4℃，4000rpm离心15min后收集原生质体。用10-20ml的STC(21.86g Sorbitol；1.0ml of 1MTris-Hcl pH 7.5；0.735g CaCl₂·2H₂O,H₂O to 100ml)充分溶解沉淀，4000rpm，15min离心，弃上清。加入大概400μl STC充分溶解沉淀，STC的量根据沉淀的量决定，保证原生质体的浓度能够达到10⁷个/ml，将其置于1.5ml的离心管中。

2)原生质体转化

将原生质体分装，保证无菌操作。将原生质体(大概200μl)与上游重组DNA片段(100μl)和下游重组DNA片段(100μl)于1.5ml离心管中混匀(轻旋一下)，室温放置时间20min。将小离心管中的液体转移至尖端离心管中(标有准确刻度50ml的)，逐滴加入400μlPEG(30g PEG4000，0.5ml 1M Tris-Hcl pH 7.5，0.735g CaCl₂·2H₂O，H₂O to 50ml)，盖上盖轻旋一下，冰浴15min。加入800μl PEG(逐滴加入，此步即可不在冰上进行，室温即可)，轻旋一下，混匀，室温置20min后加入2ml RB后28℃培养箱中培养2h后，在尖端离心管中加入RA培养基(Glucose 10g；KCl 0.52g；MgSO₄·7H₂O 0.52g；KH₂PO₄ 0.25g；Sorbitol 218.5g(1.2M/L)；NaNO₃ 6g；1％的Agar)，定容至50ml，分转成5个培养皿28℃培养箱中培养24h后，在培养基表面覆盖一层PDA(50μg/ml含潮霉素)做为筛选置于培养箱中培养。

实施例六、基因缺失突变体的鉴定

以转化子的基因组DNA为模板，利用四对引物分别扩增上游重组DNA序列、下游重组DNA序列、所用抗性筛选基因序列、目的基因自身特异性序列，共同用于鉴定转化子(详细见敲除突变体引物设计及其说明)。阳性转化子应该符合以下PCR扩增条件：上、下游基因重组DNA序列扩增阳性、抗性基因PCR阳性、目的基因特异检测引物扩增阴性。四对引物检测阳性转化子的PCR结果(图2、图3)说明，基因缺失突变体的上游和下游引物组合扩增产物说明转化子上、下游序列发生置换，目的靶标基因自身特异性引物未能扩增出条带说明目标基因序列与抗性基因序列发生同源重组替换。

表1、香蕉枯萎菌Foc4 DCL基因单、双敲除引物序列一览表

试验例香蕉枯萎菌缺失突变体的生物学及功能分析

试验例1、生长速度测定

取培养7d的Foc4、Δdcl1、Δdcl2、Δdcl1/2突变体，用5mm打孔器打取菌丝块，接种于PDA平板(Φ＝60mm)中，28℃中倒置培养7d，以平皿中间菌饼处划十字线，每个平皿记录两个数据，三个重复，分别于1dpi、3dpi、5dpi以及7dai测量菌落直径，测量其生长速度，以5dpi测量的数据进行数据分析。接种5d后Δdcl1、Δdcl2、Δdcl1/2突变体长满整个平板，菌落直径分别为7.4cm、7.2cm、7.1cm，而野生株菌落直径为7.5cm，突变体生长速度与野生菌株Foc4无显著差别(图4-A,C)。

采用在线蛋白功能域分析软件SMART，导入香蕉枯萎菌的DCLs基因序列，Foc4DCLs的功能域分析显示与拟南芥，稻瘟病，禾谷镰刀菌的DCLs基因具有相似的功能域；(图4-B)。

试验例2、产孢量测定

取培养7d的香蕉枯萎病Foc4、Δdcl1、Δdcl2、Δdcl1/2突变体，用直径5mm的打孔器打取菌饼，转接于直径为9cm的PDA平板中，28℃培养7d。用直径5mm的打孔器沿着菌落半菌打取菌饼6个，转入2ml EP管中，加入2个直径5mm的钢珠，放入高通量组织研磨仪中，以50HZ频率进行震荡120s，往研磨好的菌组织中加入1ml ddH₂O，室温下，150rpm摇1h，使孢子充分释放。取孢子悬液200μl，进行10倍稀释，将稀释好的孢子悬液用血球计数板计数，每个菌株三个重复，进行产孢量测定(图4-D)。结果显示各突变体产孢量减少。

试验例3、非生物胁迫敏感性测定

将摇培3d的香蕉枯萎病Foc4及Δdcl1、Δdcl2、Δdcl1/2突变体孢子悬液的孢子浓度分别用无菌水调节至浓度为2×10⁷、2×10⁶、2×10⁵、2×10⁴个/ml，分装至1.5ml的无菌EP管中，4℃保存备用。将MM培养基分别加入非生物胁迫因子，调节至浓度为：1.0MGlucose、200μg/ml CR、400μg/ml CFW、1.0M Sorbitol、0.7M NaCl、1.0M KCl、0.1M MgCl₂。做成MM平板(Φ＝15cm)，在MM平板底部均匀划线成1.5×1.5cm小格，备用。将梯度浓度的孢子悬液分别取2.0μl滴加到MM平板的小格中，28℃倒置培养观察缺失突变体的非生物胁迫敏感性。

抑制率(％)＝(对照组菌落直径-试验组菌落直径)/对照组菌落直径×100。

结果如图5所示，经过荧光增白剂CFW细胞壁完整性相关的胁迫因子处理后，Δdcl1、Δdcl2、Δdcl1/2缺失突变体更加敏感。金属阳离子MgCl₂处理后，Δdcl1、Δdcl2、Δdcl1/2缺失突变体的生长受到抑制，而其他非生物胁迫因子，包括渗透压胁迫因子以及细胞壁完整性相关的胁迫因子等对Δdcl1、Δdcl2、Δdcl1/2缺失突变体均无显著影响。

试验例4、突变体致病力测定

分别取培养7d的Foc4及Δdcl1、Δdcl2、Δdcl1/2突变体，用5mm打孔器打取菌丝块3块，加入200ml的PDB培养基中，28℃，150rpm摇培3d，3层擦镜纸过滤，收集分生孢子液，5000rpm离心10min，用无菌水调节孢子悬液浓度至2×10⁶个/ml。采用盆栽伤根淋灌法测定菌株的致病性。Foc4与突变体均处理15株巴西蕉苗，每株苗浇20mL孢子悬浮液，以无菌水作为对照，3次重复。按照常规方法栽培管理，30天后纵向切开巴西蕉球茎，观察球茎褐变程度及外部叶片黄化情况，参考Mohamed等的病情调查分级标准，记录每株蕉苗的发病级别并进行病情指数的统计分析。

病情指数计算公式：

病情指数＝Σ(病级株数×代表数值)/(株数总和×发病最重级的代表数值)×100％

致病力测定结果：阴性对照(水处理)，不接种枯萎病菌的情况下，香蕉苗生长健壮，没有枯萎病害发生。阳性对照，接种野生菌株Foc4，香蕉球茎出现明显的黄褐色症状，病情指数65.83；接种Δdcl1突变株后香蕉病情指数加重73.75高于野生株Foc4，表明Δdcl1突变株致病力增强；而接种Δdcl2、Δdcl1/2缺失突变体的病情指数下降，分别为62.5和59.17，低于野生株Foc4(图6)。

表2、香蕉枯萎病外部症状和球茎症状的分级标准

实施例七、香蕉枯萎菌缺失突变体的小RNA测序

1、缺失突变体小RNA测序

分别取培养7d的Foc4及Δdcl1、Δdcl2、Δdcl1/2突变体的菌丝用于小RNA测序。提取RNA检测合格后，以1.5μg的量作为RNA样本起始量，用水补充体积至6μl，使用smallRNA Sample Pre Kit试剂盒进行文库构建。由于Small RNA的5'端有磷酸基团，3'端有羟基，利用T4 RNA Ligase 1和T4 RNA Ligase 2(truncated)分别在small RNA 3'端和5'端连接上接头，反转录合成cDNA，PCR扩增，采用胶分离技术筛选目的片段，切胶回收得到的片段即为small RNA文库。用HiSeq2500进行高通量测序，测序读长为single-end(SE)50nt。以NCBI公布的Foc4基因组序列

ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/all/GCA_000149955.2_ASM14995v2/GCA_000149955.2_ASM14995v2_genomic.fna.gz，以及Fol基因组序列

ftp://ftp.ensemblgenomes.org/pub/release-20/fungi/fasta/fusarium_oxysporum/dna/为参考序列进行小RNA的比对分析。

2、小RNA测序数据分析方法

使用指定的Fusarium_oxysporum作为参考基因组进行序列比对后的结果如下，由于Dicer酶和DCL酶的特异性，最终生成的成熟milRNA长度主要集中在20nt到24nt的范围内，其中植物的miRNA以21nt或24nt为主，而动物的miRNA以22nt为主。Dicer酶和DCL酶在识别和切割前体miRNA时，5’端首位碱基对U具有很强的偏向性。通过对miRNA的碱基偏好性分析，获得典型的miRNA碱基比例。对各样本中miRNA进行表达量的统计，并用TPM算法对表达量进行归一化处理。TPM归一化处理公式为：TPM＝Readcount×10⁶/Mapped Reads(表3)。

表3、小RNA测序数据与参考基因组比对后miRNA预测结果一览表

3、小RNA测序数据分析结果

相对于野生型Foc4，Δdcl1突变体多产生了如表4所示的特异性小RNA，Δdcl2突变体多产生了如表5所示的特异性小RNA，Δdcl1/2突变体多产生了如表6所示的特异性小RNA。

表4

表5

表6

以上内容是结合具体的实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换。

序列表

<110> 中国热带农业科学院环境与植物保护研究所

<120> 一种香蕉枯萎菌4号生理小种DCL基因缺失突变体及其小RNA

<160> 60

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 22

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

cttggctgga gctagtggag gt 22

<210> 2

<211> 23

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

cccggtcggc atctactcta ttc 23

<210> 3

<211> 20

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ccaggctatg gtcccaagaa 20

<210> 4

<211> 44

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

acctccacta gctccagcca agcaagagtc cgctacaatc tcaa 44

<210> 5

<211> 43

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

gaatagagta gatgccgacc gggagcgtta gaagcgtaga caa 43

<210> 6

<211> 21

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

caacaaacaa gacctcctct c 21

<210> 7

<211> 23

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

gcaaagagtc tatcgtgtga gcc 23

<210> 8

<211> 20

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

ggatgcctcc gctcgaagta 20

<210> 9

<211> 20

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

cgttgcaaga cctgcctgaa 20

<210> 10

<211> 22

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

cggtaaagga ttgggattgt tg 22

<210> 11

<211> 20

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

gacagacgtc gcggtgagtt 20

<210> 12

<211> 21

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

tctggaccga tggctgtgta g 21

<210> 13

<211> 22

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

gtctctctct ttctgctgac cg 22

<210> 14

<211> 22

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

tcaaggctgg gattcaactt ac 22

<210> 15

<211> 20

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

agcattcgtc aactttgcca 20

<210> 16

<211> 44

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

acctccacta gctccagcca agtccatcag cactcacatc actc 44

<210> 17

<211> 47

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

gaatagagta gatgccgacc ggggcatcac taaacactcc tccttgt 47

<210> 18

<211> 21

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

gagggtgaga tgaacggtga c 21

<210> 19

<211> 20

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

acgcttggag agaatgcgag 20

<210> 20

<211> 21

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

agccatcagt cgtaagagca a 21

<210> 21

<211> 22

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

cacctcattc gctcactcta cg 22

<210> 22

<211> 20

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

atcacaaccc gacttccagc 20

<210> 23

<211> 24

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 23

tctagattaa cgcttacaat ttcc 24

<210> 24

<211> 22

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 24

tcagaagaac tcgtcaagaa gg 22

<210> 25

<211> 21

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 25

cagcagatgt aatagtcgcc g 21

<210> 26

<211> 42

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 26

gaaattgtaa gcgttaatct agccttgatg ccctccttat cc 42

<210> 27

<211> 42

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 27

ccttcttgac gagttcttct gattgagagt gcggagggac tg 42

<210> 28

<211> 20

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 28

gagggtgaga tgaacggtga 20

<210> 29

<211> 24

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 29

cgacttacac aaatacatcc tccc 24

<210> 30

<211> 22

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 30

gagcaaggtg agatgacagg ag 22

<210> 31

<211> 22

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 31

caccactcga tccgtcacca ac 22

<210> 32

<211> 23

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 32

cgtctttgtc tccatcaact tcg 23

<210> 33

<211> 20

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 33

gaatgtcgtc aagcgggaac 20

<210> 34

<211> 20

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 34

cgaccaccaa gcgaaacatc 20

<210> 35

<211> 22

<212> DNA/RNA

<213> 香蕉枯萎菌(Fusarium oxysporum)

<400> 35

atctcaggtt cgtcagccca tg 22

<210> 36

<211> 22

<212> DNA/RNA

<213> 香蕉枯萎菌(Fusarium oxysporum)

<400> 36

atctcaggtt cgtcagccca tg 22

<210> 37

<211> 21

<212> DNA/RNA

<213> 香蕉枯萎菌(Fusarium oxysporum)

<400> 37

agaatcctga tgatgctgca t 21

<210> 38

<211> 22

<212> DNA/RNA

<213> 香蕉枯萎菌(Fusarium oxysporum)

<400> 38

tttggcacca tgggactcta at 22

<210> 39

<211> 25

<212> DNA/RNA

<213> 香蕉枯萎菌(Fusarium oxysporum)

<400> 39

tatacggatg cgatgacgat cggct 25

<210> 40

<211> 23

<212> DNA/RNA

<213> 香蕉枯萎菌(Fusarium oxysporum)

<400> 40

agagcgtgtg gagaagagag acg 23

<210> 41

<211> 24

<212> DNA/RNA

<213> 香蕉枯萎菌(Fusarium oxysporum)

<400> 41

accaaaccau accagaugcu uaca 24

<210> 42

<211> 21

<212> DNA/RNA

<213> 香蕉枯萎菌(Fusarium oxysporum)

<400> 42

uaagaaaucg aucuagugua u 21

<210> 43

<211> 18

<212> DNA/RNA

<213> 香蕉枯萎菌(Fusarium oxysporum)

<400> 43

uucaagugaa aaaggacu 18

<210> 44

<211> 18

<212> DNA/RNA

<213> 香蕉枯萎菌(Fusarium oxysporum)

<400> 44

uaaacaaggu ugagggcu 18

<210> 45

<211> 24

<212> DNA/RNA

<213> 香蕉枯萎菌(Fusarium oxysporum)

<400> 45

accaaaccau accagaugcu uaca 24

<210> 46

<211> 18

<212> DNA/RNA

<213> 香蕉枯萎菌(Fusarium oxysporum)

<400> 46

uucaagugaa aaaggacu 18

<210> 47

<211> 18

<212> DNA/RNA

<213> 香蕉枯萎菌(Fusarium oxysporum)

<400> 47

uucaagugaa aaaggacu 18

<210> 48

<211> 20

<212> DNA/RNA

<213> 香蕉枯萎菌(Fusarium oxysporum)

<400> 48

ucauguggac gcuaucaacc 20

<210> 49

<211> 22

<212> DNA/RNA

<213> 香蕉枯萎菌(Fusarium oxysporum)

<400> 49

gtaaggatta agattaaatg tt 22

<210> 50

<211> 24

<212> DNA/RNA

<213> 香蕉枯萎菌(Fusarium oxysporum)

<400> 50

tttcgacaag taattccgac cgga 24

<210> 51

<211> 21

<212> DNA/RNA

<213> 香蕉枯萎菌(Fusarium oxysporum)

<400> 51

tggacaactg aggttcctgc t 21

<210> 52

<211> 23

<212> DNA/RNA

<213> 香蕉枯萎菌(Fusarium oxysporum)

<400> 52

tagctgggca tgatctgatg agc 23

<210> 53

<211> 21

<212> DNA/RNA

<213> 香蕉枯萎菌(Fusarium oxysporum)

<400> 53

attggaggac tttgggggag c 21

<210> 54

<211> 23

<212> DNA/RNA

<213> 香蕉枯萎菌(Fusarium oxysporum)

<400> 54

ccatgcaacc tggcctaggc tct 23

<210> 55

<211> 24

<212> DNA/RNA

<213> 香蕉枯萎菌(Fusarium oxysporum)

<400> 55

actatggtct gtgaggatgg caac 24

<210> 56

<211> 22

<212> DNA/RNA

<213> 香蕉枯萎菌(Fusarium oxysporum)

<400> 56

tcacaaatct ataatatgca gg 22

<210> 57

<211> 21

<212> DNA/RNA

<213> 香蕉枯萎菌(Fusarium oxysporum)

<400> 57

attggaggac tttgggggag c 21

<210> 58

<211> 21

<212> DNA/RNA

<213> 香蕉枯萎菌(Fusarium oxysporum)

<400> 58

aagggacagg gagggtcgtg g 21

<210> 59

<211> 21

<212> DNA/RNA

<213> 香蕉枯萎菌(Fusarium oxysporum)

<400> 59

aggaggtgga agcatttgtg a 21

<210> 60

<211> 22

<212> DNA/RNA

<213> 香蕉枯萎菌(Fusarium oxysporum)

<400> 60

tcaacaggcc aagatcagct ct 22

Claims

1.一种香蕉枯萎菌4号生理小种DCL基因缺失突变体，其特征在于，通过以下方法获得：

1)构建Foc4DCL1基因缺失重组DNA片段，采用潮霉素抗性基因HPH，原生质体转化，获得Foc4DCL1基因缺失突变体，即Δdcl1突变体；还可以采用相同的方法敲除DCL2基因，构建Δdcl2突变体；

2)在Δdcl1突变体的基础上构建Foc4DCL1/2双基因缺失重组DNA片段，采用新霉素NEO抗性基因，原生质体转化，获得Foc4DCL1/2双基因缺失突变体，即Δdcl1/2突变体。

2.根据权利要求1所述的香蕉枯萎菌4号生理小种DCL基因缺失突变体，其特征在于，步骤1)Δdcl1突变体的构建方法为：

第一轮PCR扩增：

第二轮PCR扩增：

右端PH+RB：右端RB和潮霉素抗性基因HPH为模板，HYG-F1和DCL1-RB-R为引物，扩增产物大小2269bp；

将第二轮PCR片段回收后导入原生质体进行转化，获得Foc4DCL1基因缺失突变体，即Δdcl1突变体；

其中，DCL1-LBCK、DCL1-HPH-LB-R、DCL1-HPH-RB-F、DCL1-RBCK、DCL1-LB-F、HYG-R1、HYG-F1和DCL1-RB-R的序列依序如SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10所示。

3.根据权利要求1所述的香蕉枯萎菌4号生理小种DCL基因缺失突变体，其特征在于，步骤1)Δdcl2突变体的构建方法为：

第一轮PCR扩增：

第二轮PCR扩增：

4.根据权利要求1所述的香蕉枯萎菌4号生理小种DCL基因缺失突变体，其特征在于，步骤2)：

第一轮PCR扩增：

第二轮PCR扩增：

将第二轮PCR片段回收后导入原生质体进行转化，获得Foc4DCL1/2双基因缺失突变体，即Δdcl1/2突变体；

其中，DCL2-NEO-LBCK、DCL2-NEO-LB-R、DCL2-NEO-RB-F、DCL2-NEO-RBCK、DCL2-NEO-LB-F、NEO-R1、NEO-F1和DCL2-NEO-RB-R的序列依序如SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ IDNO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24和SEQ ID NO:32所示。

5.根据权利要求1所述的香蕉枯萎菌4号生理小种DCL基因缺失突变体，其特征在于，相比于Foc4，Δdcl1突变体多产生了如SEQ ID NO:35-48任一项所示序列的特异性小RNA。

6.根据权利要求1所述的香蕉枯萎菌4号生理小种DCL基因缺失突变体，其特征在于，相比于Foc4，Δdcl2突变体多产生了如SEQ ID NO:49-55任一项所示序列的特异性小RNA。

7.根据权利要求1所述的香蕉枯萎菌4号生理小种DCL基因缺失突变体，其特征在于，相比于Foc4，Δdcl1/2缺失突变体多产生了如SEQ ID NO:56-60任一项所示序列的特异性小RNA。

8.根据权利要求1所述的香蕉枯萎菌4号生理小种DCL基因缺失突变体，其特征在于，经过荧光增白剂CFW处理后，Δdcl1突变体、Δdcl2突变体、Δdcl1/2突变体更加敏感，生长受到抑制，MgCl₂处理后，Δdcl1突变体、Δdcl2突变体和Δdcl1/2突变体的生长均受到抑制。

9.根据权利要求1所述的香蕉枯萎菌4号生理小种DCL基因缺失突变体，其特征在于，Δdcl1突变体致病力增强，Δdcl2突变体和Δdcl1/2突变体致病力减弱。