CN102703448B - 利用人工microRNA培育抗粗缩病玉米的方法及其专用双链RNA - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种利用人工microRNA培育抗粗缩病玉米的方法。首先克隆玉米内源的microRNA，然后以它为模板，以分别含有sequenceA和sequenceB的一对引物进行PCR扩增，将扩增后的序列通过酶切，连接转化到带有强启动子的植物表达载体中；然后将该植物表达载体通过农杆菌侵染或者基因枪的方法导入玉米中，得到得到抗玉米粗缩病的转基因玉米。本发明通过人工microRNA技术培育抗粗缩病玉米新种质，不容易脱靶，安全性高，而且抗病性状可以稳定遗传。

Description

利用人工microRNA培育抗粗缩病玉米的方法及其专用双链RNA

技术领域

本发明涉及一种培育抗粗缩病玉米的方法及其专用双链RNA，尤其涉及利用人工microRNA技术及其双链专用RNA，属于生物技术领域。

背景技术

玉米是我国最重要的粮食作物之一，2008年以来，我国玉米种植面积稳定在4.5亿万亩上下，总产在1.6亿吨左右。然而，随着我国经济发展和人民生活水平的提高，特别是畜牧业和玉米精深加工产业链的延伸和扩涨，我国对玉米的需求将不断增加，目前，我国玉米生产面临巨大的压力，已经出现严重供不应求的局面。另外，玉米病虫害危害日益严重，每年病虫害造成约1000万吨的产量损失，约占玉米总产的7%-10%。其中发生较广、危害较重的是玉米粗缩病。

1949年玉米粗缩病（maizeroughdwarfvirus,MRDV）首次在意大利被发现，此后在阿根廷、法国、西班牙、前南斯拉夫、伊朗等国家都有不同程度的发生。1954年，首次在我国新疆南部、甘肃西部发现MRDV。自20世纪70年代以来，玉米粗缩病在华北、西北和东北的部分地区引发大面积毁种或绝产，成为玉米生产的重要病害。进入90年代，MRDV在我国黄淮海和东北的部分地区危害逐年加重，局部病田病株率达到40%，平均减产10-30%（李怀方等，1996）。1999年在全国玉米种植区造成的危害面积进一步扩大，其中华北地区、江苏沿海地区危害最重。最近几年玉米粗缩病在北方冀、鲁、陕、晋、辽、津等省市暴发成灾，其中山东省自2005年以来已连续4年严重发生，主要发生在临沂、泰安、济宁等鲁南地区，发病率在10%-70%，其中，2007年曲阜市玉米粗缩病发生面积达12万亩，造成2万多亩绝产。2008年山东省因粗缩病造成玉米绝产面积25万亩，病株率在2％-10％之间。2008年安徽宿州、河南东部、河北鹿泉市粗缩病也比较严重。发病较重的品种主要有雅玉12、皖玉7号和郑单958、登海9号。

在我国大部分地区分离到的玉米粗缩病的病原是水稻黑条矮缩病毒（RiceBlack-streakedDwarfVirus，RBSDV），该病毒是一种具有双层衣壳的球形病毒，存在于感病植株叶片凸起部分的细胞中，病毒粒子呈正二十四面体，具有双层外壳。该病毒基因组包含10条线状的双链RNA片段，属于植物呼肠弧病毒组斐济病毒属（王朝辉等2004，方守国等2000，张恒木等2001），玉米粗缩病感病植株扭曲，节间缩短呈丛生状，植株严重矮化，病株株高仅为健康植株株高的1/2。叶片宽短脆硬，叶色浓绿，节间粗短，顶叶密集簇生；叶背、叶鞘及苞叶的叶脉上产生粗细不一的蜡白色条纹状突起，手触时有明显粗糙感。4-5叶前感病植株少有抽穗，7叶后感病植株能抽穗结实，但雄穗发育不良或退化，花粉少；雌穗短小畸形或无雌穗，结实少，果穗小而畸形，严重时不能结实。玉米粗缩病主要通过灰飞虱传播，病毒主要在冬小麦和灰飞虱体内越冬，目前生产上推广品种的抗性大部分处在高感或感病水平，未见抗性较好的品种。目前该病的防治主要靠调整玉米播种期以避开灰飞虱的迁飞高峰期、清除田间杂草切断其侵染循环中的链条等农业措施，结合捕虱灵，植病灵等药化学杀虫防病为主。但是农业措施和药剂处理只能停留在治的水平上，不能从根本上解决玉米粗缩病的危害。

近年来，玉米粗缩病毒病原基因组的研究已经取得了丰硕的成果。RBSDV和MRDV的基因组均由10条双链RNA组成，按其在聚丙烯酰胺上迁移距离由小到大计的顺序依次命名为：S1-S10。RBSDV和MRDV基因组片段无论在氨基酸水平还是在核苷酸水平都具有相当高的一致性（秦国正等，2006）。RBSDV的基因组大小为29141nt，是目前斐济病毒属中基因组最大的一个。RBSDV的S1-S6均编码病毒的一个主要蛋白，其中S1可能编码RNA依赖的RNA聚合酶；S2长约3813nt，编码一个有1226个氨基酸组成的蛋白，猜测很可能是核心结构蛋白；S3长3752nt，编码一个有1146个氨基酸组成的蛋白，其编码蛋白可能是病毒粒子的结构蛋白；S4、S5长3617nt、3163nt，功能未知；S6长2645nt，虽然功能未知但利用计算机软件对其二级结构的预测和数据库比较分析表明，其编码蛋白存在高度保守的亲水性结构域及多个跨膜区域，可能具有结合RNA及ATPase活性，这些结果表明，RBSDV的S6基因可能具有编码植物基因沉默抑制子的功能；S7全长大约为2193nt，含有两个开发阅读框（ORF），分别编码约为41Ku和36Ku的蛋白质ORF1和ORF2，目前已经正式ORF1和ORF2均为病毒的非结构蛋白；S8全序列约为1936bp，只含有1个ORF，编码蛋白的分子量约为68Ku，可能是病毒的核心衣壳蛋白；S9全长1900bp，含有2个ORF，其中ORF2保守性极高，编码一种24.2Ku的非结构蛋白。S10全长1819nt，编码病毒63ku的外壳蛋白。截止到2010年6月29日在NCBI注册的RBSDV序列总计有60条，其中20条是从中国玉米、水稻产区分类得到的。RBSDV基因组序列测序及其功能研究的深入，为利用植物基因工程改造玉米优良自交系，培养抗粗缩病玉米新种质奠定了基础。

相比传统杂交育种，利用基因工程技术手段培育抗病品种是彻底解决玉米粗缩病的根本途径，而且与药剂防治相比，它既不用增加生产投资，也没有农药残留污染环境，对防治发生范围广、流行速度快的病害更为有效。

MicroRNA（或称miRNA）是生物体内源的非编码小分子RNA。人工microRNA（ArtificalmiRNA，amiRNA）技术是利用内源miRNA前体骨架，通过替换miRNA序列产生具有新功能的miRNA。最近人工microRNA在抗病育种的潜力逐渐被人们认识，Schwab等利用拟南芥pre-miRNA172和pre-miRNA319做骨架，将miRNA/miRNA*区替换成与目标mRNA互补的片段，形成了artificalmiRNA，在拟南芥中超表达后引起表型的明显改变（Schwab2006），证明amiRNA可以有效沉默单个和多个靶基因，并且在诱导性启动子或组织特异性启动子驱动下均可以特异性地发挥作用；Warthmann等利用水稻osa-MIR528作骨架构建了人工miRNA，成功对水稻靶基因高效干涉（Warthmann）。2006年Niu等通过修饰拟南芥miR159的前体获得了能够分别镖靶P69和HC-Pro的人造miRNAsamiR-P69159和amiR-HC-Pro159，发现表达amiR-P69159和amiR-HC-Pro159的转基因拟南芥能够分别特异抵抗TYMV和TuMV病毒感染（Niu，2006）。2007年Qu等设计了镖靶黄瓜花叶病毒（CMV）的沉默抑制子2b的miRNA并在烟草中表达，获得抗病毒的烟草植株，并且发现烟草的抗性水平和miRNA的表达水平成正相关（Qu，2007）。

相比PTGS（RNAi）介导的基因沉默，人工miRNA在培养抗病毒植物上具有其独特的应用优势：（1）RNAi介导的基因沉默依赖DCL4途径，而病毒编码的抑制蛋白（基因沉默抑制子）可以抑制这种沉默，能够抑制RNAi机制的发生。AmiRNA通过DCL1途径，可以避开一些病毒抑制蛋白的拮抗作用；（2）RNAi介导的基因沉默在植物中转录长片段病毒基因组，这些病毒基因组序列可能与植物基因组重组，存在一些生物安全方面的隐患，而amiRNA只引入21个碱基的外源序列，降低了此类风险的发生；（3）田间病毒多是混合侵染，并不是一个纯的株系，而且病毒株系多、变异快，RNAi等方法只能有效抵御部分株系，无法培育一种持久广谱的抗病毒品种，amiRNA可以允许错配的存在，因而科研针对病毒保守区设计amiRNA，使之有效抑制大多数病毒株系，并且当病毒发生突变后仍然能够保持抗病毒能力，从而延长品种的寿命；（4）RNAi介导的基因沉默会产生一系列序列信息不明确的siRNAs，往往造成意外“脱靶”现象和非目标基因的沉默等现象，amiRNA只产生1条miRNA成熟体（maturemiRNA），和靶基因的结合更加精确、高效、可控；（5）低温能够抑制RNAi介导基因沉默的机制，在低温（<15℃）条件下，RNAi转基因种质抗病毒能力明显下降，容易受到病毒的侵染。而研究表明人工miRNA介导的基因沉默在15℃和24℃下没有区别，在低温环境下人工miRNA将更加稳定、高效。

然而在可检索的现有技术中，利用人工microRNA技术提高玉米抗粗缩病的方法还未见报道。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提供了一种利用人工microRNA提高玉米抗粗缩病的方法，并且提供改造microRNA的专用双链RNA序列，实现利用人工miRNA培育抗粗缩病玉米新种质。

本发明的技术方案是：一种利用人工microRNA培育抗粗缩病玉米的专用双链RNA，其特征是，它是由sequenceA和sequenceB组成的双链RNA；所述sequenceA如SEQNO.1-34所述；所述sequenceB的核苷酸序列是与sequenceA反向互补，或者与sequenceA小于4个碱基错配的反向互补序列。

本发明还提供了一种利用人工microRNA培育抗粗缩病玉米的方法，其特征是，首先克隆玉米内源的microRNA，然后以玉米内源的microRNA为模板，以分别含有上述sequenceA和sequenceB的一对引物进行PCR扩增，将扩增后的序列通过酶切，连接转化到带有ubiqutin或者CaMV35S启动子的植物表达载体中；或者或者通过人工合成的方式，直接合成带有sequenceA和sequenceB的人工microRNA前体序列，然后连接转化到带有ubiqutin或者CaMV35S启动子的植物表达载体中；然后将该植物表达载体通过农杆菌侵染或者基因枪的方法导入玉米中，得到抗玉米粗缩病的转基因玉米。

本发明进一步的技术方案是：所述玉米内源的microRNA为zma-MIR159a，所述扩增用的引物为primer7：TGCTCTAGATCGATGCTTTGGGTTTGAAGCG-sequenceB-AGGGTCGTTCCGAAGGG，和primer8：CGCGGATCCGGAGGGGTGGATCAGGATG-sequenceA-GAGAGCGGCCAGCAAGGGGG；PCR反应程序为94℃5min；再94℃50s，54℃45s，72℃1min，30循环；72℃7min。

所述的克隆内源高水平表达的microRNA（zma-MIR159a）的方法是，以玉米总RNA为模板，反转录成cDNA。以primer1：5’-AGTTCCCTCACTCCCCAG-3’（SEQNO.38），primer2：5’-GGACGCAACAAGCAAAAA-3’（SEQNO.39）进行PCR反应，PCR反应程序为94℃5min；再94℃50s，54℃45s，72℃1min，30循环；72℃7min；以扩增后的稀释产物为模板，以primer3：5-’TCGATGCTTTGGGTTTGA-3’（SEQNO.40），primer4：5’-GGAGGGGTGGATCAGGAT-3’（SEQNO.41），以同样的程序进行第二轮扩增，或者不进行第一轮扩增，直接用primer3和primer4进行第二轮扩增。

转基因玉米苗的分子检测方法是：提取转基因苗的总RNA，以反转录后的cDNA为模板，分别以引物（sequenceB，sequenceA），（primer3，sequenceA）和（sequenceB，primer4）进行PCR检测。

玉米粗缩病毒是造成我国玉米大面积减产甚至绝产的主要病害，由于玉米粗缩病的病原菌主要靠灰飞虱传播，从苗期到成株期均可发病，且感病期越早，发病越重，所以通过喷施农药或者栽培措施优化等方法很难防止玉米粗缩病的发生和危害，所以说提高玉米自身的抗病能力是解决玉米粗缩病危害的根本途径。由于目前缺少对粗缩病高抗的优良自交系，所以通过基因工程手段培养抗病品系将是彻底解决玉米粗缩病的有效途径。

本发明以玉米优良自交系为受体植物，设计了能够干扰玉米粗缩病毒病原菌的人工microRNA载体，通过导入玉米种，成功实现了利用人工miRNA提高玉米对粗缩病的抗性，具有广阔的应用前景。

本发明的优点：

（1）相比传统杂交育种，利用人工microRNA技术手段培育抗病品种是彻底解决玉米粗缩病的根本途径，而且与药剂防治相比，它既不用增加生产投资，也没有农药残留污染环境，对防治发生范围广、流行速度快的病害更为有效。

（2）相比PTGS（RNAi）介导的基因沉默，人工microRNA技术只引入21个碱基的外源序列，不容易造成“脱靶”现象和非目标基因的沉默等现象，生物安全性更高。

（3）本发明中人工microRNA载体的构建，采用玉米自身高水平表达的microRNA的前体作为骨架，和传统的通过引入外源基因改良作物品质有很大不同，一定程度上可以减少引入外源基因造成的不确定表型，另外也可以减少转基因引起的争议。

（4）本发明可以用（sequenceB，sequenceA），（primer3，sequenceA）和（sequenceB，primer4）引物组合对转基因苗进行快速检测。

附图说明：

图1玉米粗缩病毒病原菌S6基因组片段的PCR扩增产物的琼脂糖电泳图谱；其中S6为玉米粗缩病毒病原菌S6基因组片段，Marker为分子量标准DL2000。

图2植物表达载体构建图。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明做进一步说明，但不限于此。

实施例1克隆玉米内源的microRNA（zma-MIR159a）

根据microRNA数据库（http://www.mirbase.org/）中玉米zma-MIR159a（检索号：MI0001809）提供的序列信息提交到NCBI中进行blastN，结果表明zma-MIR159a包含在EST（EE295085）内。根据EST的序列及zma-MIR159a在EST中所在的位置，设计引物primer1：5’-AGTTCCCTCACTCCCCAG-3’（SEQNO.38），primer2：5’-GGACGCAACAAGCAAAAA-3’（SEQNO.39），primer3：5’-TCGATGCTTTGGGTTTGA-3’（SEQNO.40），primer4：5’-GGAGGGGTGGATCAGGAT-3’（SEQNO.41）。

提取玉米优良自交系齐319的总RNA后进行纯化，方法如下：

1.称取0.2g新鲜组织，在液氮中充分研磨至粉末状，研磨中不断缓慢加入液氮，防止材料解冻。

2.将研好的组织迅速转移至预热（65℃）的装有600微升CTAB提取液（2%CTAB，2%PVP，0.1MTris-Cl，2.0MNaCl，25mMEDTA）的EP管中，立即剧烈涡旋振荡30s，使其混匀。

3.65℃水浴2-5min，期间剧烈涡旋振荡3-5次。

4.稍微冷却后加入等体积的氯仿/异戊醇（氯仿：异戊醇=24：1（V/V），下同）涡旋振荡1min,混匀，4℃，12,000rpm离心15min。

5.将上清转移到另一新的EP管中，加入2微升的DNaseI，37℃水浴15min。

6.再加入等体积的氯仿/异戊醇涡旋振荡1min，混匀，4℃，12,000rpm离心15min。

7.将上清转移到另一新的EP管中，加入1/3体积的8MLiCl，使其终浓度为2M，4℃过夜沉淀。

8.4℃，12,000rpm离心20min，弃上清，分别用70%乙醇，无水乙醇洗沉淀，晾干，加30-50微升DEPC-H₂O，溶解沉淀。

9.在微量离心管中加入全部RNA，DNaseIBuffer5ul，DnaseI（5U/ul）5ul，RnaseInhibitor（40u/ul）0.5ul，最后加入DEPCH₂O使总体积达到50ul，37℃反应1个小时。

10.加入50ulDEPCH₂O，混匀。

11.加入等量（100ul）的苯酚/氯仿/已戊醇(25:24:1)，充分混匀。

12.离心，取上层水相到新离心管中。

13.加入等量（100ul）的氯仿/已戊醇（24:1），充分混匀。

14.心取上清（水相）到新的离心管。

15.加入1/10体积(10ul)的3MNaOAC(pH5.2).。

16.加入2.5倍（250ul）的冷无水乙醇，-20℃过夜（或者一个小时以上）。

17.离心回收沉淀，用70%的乙醇清洗，干燥。

20.加入20ulDEPCH₂O溶解后，电泳检测。

玉米cDNA的获得参照Takara公司的反转录试剂盒说明的方法，在500ul离心管中加入oligodTprimer1ul，dNTP1ul，总RNA2ul，DEPCH₂O6ul，混匀后，在PCR仪上65℃温育5min后迅速在冰上冷却，然后再加入5×PrimeScriptIIBuffer4.0ul，RnaseInhibitor0.5ul，PrimeScriptIIRtase1.0ul，最后加入DEPCH₂O，补足20ul，混匀后在PCR仪上进行，42℃,60min；70℃,15min后，冰上冷却。

用稀释5倍的cDNA做模板，以primer1，primer2进行PCR反应，PCR反应程序为94℃5min；再94℃50s，54℃45s，72℃1min，30循环；72℃7min；以扩增后的稀释5倍的产物为模板，以primer3：5’TCGATGCTTTGGGTTTGA3’，primer4：5’GGAGGGGTGGATCAGGAT3’，以同样的程序进行第二轮扩增。或者不进行第一轮扩增，直接用primer3和primer4进行第二轮扩增，扩增产物连接到T载体上进行测序。

实施例2改造microRNA的专用双链RNA序列的获得

根据NCBI中报道的玉米粗缩病毒病原菌-水稻黑条矮缩病毒（RiceBlack-streakedDwarfVirus，RBSDV）基因组片段S6的序列（检索号：AJ409148）设计引物primer5：5’-AAGTTTTTTGAGTCTGAGATA-3’（SEQNO.42），primer6：5’-GACATCAGCTGATTTGAGTC-3’（SEQNO.43）。

收集受到粗缩病危害的玉米病叶，提取总RNA，总RNA提取和纯化方法同实施例1中的方法。将总RNA反转录成cDNA，反转录方法同实施例1，不同之处在于，用随机引物代替了oligodT引物。用cDNA做模板，以primer5，primer6为引物进行PCR程序，PCR反应程序为94℃5min；再94℃50s，54℃45s，72℃3min，32循环；72℃7min。PCR产物在琼脂糖电泳中进行检测，其琼脂糖电泳图谱如图1所示，凝胶电泳回收并纯化目的片段。

将目的片段连接到T载体中，转化感受态细胞，对阳性克隆用M13+引物进行测序，测序后得到玉米粗缩病毒病原菌基因组S6片段（如SEQNO.36-37所述）。将S6片段的序列提交到软件wmd3（http://wmd3.weigelworld.org/cgi-bin/webapp.cgi?page=Home;project=stdwmd），通过和玉米全基因组序列的比对和双链RNA的能量值确定专用的RNA序列，如SEQ1-34所述；详细的具体步骤如下：

（1）凝胶电泳回收并纯化目的片段过程：

紫外灯下检测，切下预期大小的基因片段放入1.5mL离心管中，加入溶胶液300-700ul，55℃保温溶解，期间不断摇动。将含有目的基因的溶解液过柱，经过70%酒精清洗，用20ul双蒸水洗脱。

（2）目的片段连接到T载体的过程：

通过凝胶电泳回收并纯化长度约为2645bp的目的片段，取纯化产物4.0ul，加入pMD18simpleTvector1.0ul混匀，再加入5.0ulSolutionI混匀后，16℃保温1个小时以上，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，挑取阳性克隆进行测序。

（3）感受态细胞的制备和转化的过程：

用无菌接种环挑取-70℃甘油保存的E.coliDH5α，通过划线稀释的方法经37℃培养16-20h后在平板中得到DH5α的单菌落；挑一单菌落于5ml的LB液体培养基，180rpm振荡培养12h；取1mlDH5αLB菌液于100ml的LB液体培养基，180rpm振荡培养到OD值0.4；冰上放置15分钟，无菌条件下倒入50mlBeckman离心管中，4℃，3500rpm离心10min，弃上清；沉淀用30ml冰预冷的0.1MCaCl₂溶液重悬；4℃，3500rpm离心10min，小心倒出上清液；沉淀重悬于2ml冰预冷的含15%甘油0.1MCaCl2溶液；将这些感受态细胞按每份100μl分装。

将连接产物加入到感受态细胞中，稍稍混匀，冰上静置0.5h，42℃热激90S，加入600ul的LB溶液，37℃摇菌复苏1h，取100ul均匀涂到含有抗生素的LB固体平板上，37℃培养过夜。

实施例3过量表达载体的构建

植物表达载体的构建过程如图2所示：

根据玉米zma-MIR159a的前体序列以及专用双链RNA的序列，设计引物primer7：TGCTCTAGATCGATGCTTTGGGTTTGAAGCG-sequenceB-AGGGTCGTTCCGAAGGG（SEQNO.44），和primer8：CGCGGATCCGGAGGGGTGGATCAGGATG-sequenceA-GAGAGCGGCCAGCAAGGGGG（SEQNO.45）；其中下划线序列为酶切位点，sequenceA和sequenceB序列为专用双链RNA序列及其反向互补序列。如sequenceA：TCATACGAGCTAAATCGACAG，sequenceB：GTCGATTTAGCTCGTATGAGA。

以玉米zma-MIR159a为模板，用引物primer7和primer8进行PCR反应。PCR反应程序为94℃5min；再94℃50s，54℃45s，72℃1min，30循环；72℃7min。将扩增后的序列连接到T载体中，提取质粒通过XbaI和BamHI双酶切，连接转化到带有ubiqutin或者CaMV35S启动子的植物表达载体中。连接和转化的过程同实施例2，详细的具体步骤如下：

酶切的过程：

在1.5mL离心管中先后加入ddH₂O21.5ul，质粒5.0ul，BufferK1.5ul，BamHI1.0ul，XbaI1.0ul，混匀，37℃酶切过夜，电泳后回收目的片段，回收过程同实施例2。

质粒提取过程（上海生工质粒提取试剂盒）：

（1）取1.5-5ml过夜培养的菌液，12,000rpm离心2min，收集菌体，倒尽或吸干培养基。

（2）在菌体沉淀中加入250μlSolutionⅠ，吸打或震荡至彻底悬浮菌体。

（3）加入250μlSolutionⅡ，立即温和颠倒离心管5-10次混匀，室温静置2-4min。

（4）加入350μlSolutionⅢ，立即温和颠倒离心管5-10次充分混匀。

（5）12,000rpm离心10min，将上清全部小心移入吸附柱中，8,000rpm离心30sec。倒掉收集管中的液体，将吸附柱放入同一个收集管中。

（6）向吸附柱中加入500μl漂洗液（WashSolution），10,000rpm离心1min，倒掉收集管的液体，将吸附柱放入同一收集管。

（7）重复步骤（6）一次。

（9）将空吸附柱和收集管放入离心机，12,000rpm离心2min。

（10）将吸附柱放入干净的1.5ml离心管中，在吸附膜中央加入30-50μl洗脱液（ElutionBuffer），室温静置2min，10,000rpm离心1min。将所得的质粒DNA溶液置于-20℃保存或用于后续试验。

实施例4：转化玉米优良自交系

玉米幼胚的获得和遗传转化：

取受粉后9-14d玉米优良自交系齐319的幼胚，先用70%乙醇消毒3min，再用2%(有效氯)的次氯酸钠消毒30min，用无菌水冲洗干净，剥取幼胚，置于固体培养基上(N6盐，N6维生素，蔗糖20g/L，葡萄糖10g/L，脯氨酸2.94g/L，酸解酪蛋白100mg/L，2mg/L2,4-D，pH5.8)上，26℃下暗培养2-3d；转移至高渗培养基（N6+0.4g甘露醇）上培养4-8小时，用基因枪轰击；转移至高渗培养基上16-24h，然后转移至N6培养基（N6盐+N6维生素+铁盐+2.9g/L脯氨酸+100mg/L水解酪蛋白+2.4mg/L2,4D+20克葡萄糖+8mg/LAgNO₃）上恢复培养2-3d；移至选择培养基（N6+Kan）上4-6周，每两周继代一次；移至MSO分化培养基（MS大量盐+MS微量盐+N6维生素+铁盐+30g/L蔗糖）；经过生根和壮苗后将转化苗移入营养钵。

基因枪用金粉母液和子弹的制备：

取10mg的金粉，用70%的乙醇洗3次，每次10000rpm离心1分钟，家1ml灭菌水振荡2分钟，制成10mg/ml的金粉储存液；取300ul的金粉储藏液，14000rpm离心30秒，弃上清。加入150ul的水将金粉悬浮，在振荡器上边轻微震荡边往里加入1ug/ul的质粒30ul，再加入新配制的60ul的0.1M亚精胺，再加入150ul2.5M的CaCl2，高速涡旋3分钟，将离心管放在冰上约2分钟让金粉自动沉淀一会儿，10000rpm离心10秒（这样可以得到非常好的沉淀），去掉上清，加100%酒精750ul，高速涡旋，然后将离心管放在冰上约2分钟金粉自动沉淀一会，10000rpm离心10秒，去掉上清，用300ul无水乙醇悬浮，分装成110ul每管（防止挥发），准备打枪。

实施例5：转基因玉米苗的分子检测

提取转基因苗的总RNA（提取方法同实施例1），以反转录后的cDNA为模板，分别以（sequenceB，sequenceA），（primer3，sequenceA）和（sequenceB，primer4）进行PCR检测。PCR程序同实施例1。

实施例6：转基因苗的抗病性检测

通过人工接种方法对PCR检测为阳性的T0代转化苗（齐319，郑58共两个品种，每个品种转基因玉米幼苗各20株，对照组非转基因玉米幼苗各20株）进行人工接种鉴定，从玉米矮缩病重病区采集发病植株，将灰飞虱在毒源上饲喂获毒，移入带有玉米幼苗的烧杯中饲养（循回时间12-17d，有效接种强度10-20头/株，接种时间48-72h和玉米接种龄期2叶龄），渡过循环期，检测完单头灰飞虱携带病原菌情况后，对转基因玉米幼苗和非转基因玉米幼苗进行人工接种检测。结果表明，转基因株系的发病率（两个品种转基因植株发病率均≤20%）显著低于对照组（两个品种非转基因植株发病率均≥50%），且转基因玉米植株较对照组抗病性明显增强。

主要参考文献：

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Claims (3)

1.一种利用人工microRNA培育抗粗缩病玉米的方法，其特征是，首先克隆玉米内源的zma-MIR159a，然后以玉米内源的zma-MIR159a为模板，以分别含有sequenceA和sequenceB的一对引物进行PCR扩增，将扩增后的序列通过酶切，连接转化到带有ubiqutin或者CaMV35S启动子的植物表达载体中；或者通过人工合成的方式，直接合成带有sequenceA和sequenceB的人工zma-MIR159a前体序列，然后连接转化到带有ubiqutin或者CaMV35S启动子的植物表达载体中；然后将该植物表达载体通过农杆菌侵染或者基因枪的方法导入玉米中，得到抗玉米粗缩病的转基因玉米；所述sequenceA如SEQNO.1所述；所述sequenceB的核苷酸序列是与sequenceA反向互补。

2.如权利要求1所述的一种利用人工microRNA培育抗粗缩病玉米的方法，其特征是，

所述扩增用的引物为primer7：TGCTCTAGATCGATGCTTTGGGTTTGAAGCG-sequenceB-AGGGTCGTTCCGAAGGG，和primer8：CGCGGATCCGGAGGGGTGGATCAGGATG-sequenceA-GAGAGCGGCCAGCAAGGGGG；PCR反应程序为94℃5min；再94℃50s，54℃45s，72℃1min，30循环；72℃7min。

3.如权利要求2所述的一种利用人工microRNA培育抗粗缩病玉米的方法，其特征是，所述克隆zma-MIR159a的方法是，以玉米总RNA为模板，反转录成cDNA；然后以primer1：5’-AGTTCCCTCACTCCCCAG-3’，primer2：5’-GGACGCAACAAGCAAAAA-3’进行PCR反应，PCR反应程序为94℃5min；再94℃50s，54℃45s，72℃1min，30循环；72℃7min；以扩增后的稀释产物为模板，以primer3：5-’TCGATGCTTTGGGTTTGA-3’，primer4：5’-GGAGGGGTGGATCAGGAT-3’，以同样的程序进行第二轮扩增，或者不进行第一轮扩增，直接用所述primer3和primer4进行第二轮扩增。