CN105624170A - OsAGO18蛋白或其编码基因在调控植物对水稻矮缩病毒或其同科病毒的抗性中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了OsAGO18蛋白或其编码基因或含有所述编码基因的重组载体在提高水稻对水稻矮缩病毒或其同科病毒引发的病毒病害抗性中的应用；所述OsAGO18蛋白的氨基酸序列具体为序列表中的序列2或序列4。实验证明，在OsAGO18基因过表达的水稻中植物抗病性增强，相反，ago18突变体的抗病性减弱，表明该基因编码的OsAGO18蛋白在水稻抗水稻矮缩病反应中发挥着重要的作用。

Description

OsAGO18蛋白或其编码基因在调控植物对水稻矮缩病毒或其同科病毒的抗性中的应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及OsAGO18蛋白或其编码基因或含有该编码基因的重组载体在调控植物对水稻矮缩病毒或其同科病毒的抗性中的应用。

背景技术

我国稻、麦生产中发生严重和间歇暴发流行的这些病毒病害，主要由水稻条纹叶枯病毒(RSV)、水稻矮缩病毒(RDV)、水稻黑条矮缩病毒(RBSDV)、南方水稻黑条矮缩病毒(SRBSDV)、水稻锯齿叶矮缩病毒(RRSV)、大麦黄矮病毒(BYDV)和小麦黄花叶病毒(WYMV)所引起，多数病毒除侵染稻、小麦外还可侵染玉米等禾本科作物，玉米对该病毒尤其敏感，例如RBSDV侵染玉米后造成的玉米粗缩病已经成为玉米的主要病毒病害，导致玉米大规模减产。RDV与RBSDV同属于水稻呼肠孤病毒科病毒。由水稻矮缩病毒(RiceDwarfVirus，RDV)引起的病毒病，又称水稻普通矮缩病、普矮、青矮等，靠昆虫介体叶蝉传播。该病广泛分布于日本、朝鲜、尼泊尔、韩国、菲律宾，以及我国浙江、福建、云南、广西、江苏、安徽、江西、湖南、湖北、广东、重庆、四川和贵州等稻区。在云南主要分布在滇中的昆明、玉溪和滇西滇南的德宏和西双版纳等地区。暴发流行时，可导致30％-50％的产量损失，甚至颗粒无收。感染水稻矮缩病的水稻普遍表现为病株矮缩，分蘖增多，叶色浓绿，叶片僵硬，在叶片或叶鞘上出现白色斑点，与叶脉平行排列成虚线状。不同水稻品种发生矮缩病后，症状表现出一定的差异，除植株的矮化为共同特征外，有的品种明显浓绿，无褪绿条斑，而有的品种则成黄化并发症，并有明显的褪绿条斑。水稻矮缩病根据发病时期的不同，其症状略有变化。幼苗期(秧田期)受侵染时，分蘖少，移栽后多枯死。秧苗分蘖期(返青期有效分蘖期无效分蘖期)苗期发病后，导致植株的矮缩僵硬，严重矮化，分蘖增多，叶色浓绿，叶片较短，长度在10cm以下，病株不能抽穗结实。幼穗发育期(分化期形成期完成期)和开花结实期(乳熟期蜡熟期完熟期)发病，叶部有褪绿条斑，虽能抽穗，但结实率低，多秕谷。与水稻条纹叶枯病比较，水稻矮缩病的明显特征是植株矮化，病株在田间表现为成片矮化或随机块状分布。由水稻黑条矮缩病毒(RiceBlack-StreakedDwarfVirus，RBSDV)引起的水稻黑条矮缩病和玉米粗缩病，靠传毒介体灰飞虱传播，两者在我国均于20世纪60年代初发现，前者最早于1963年浙江省余姚县的早稻上发现，同时在上海市嘉定和奉贤县、江苏省的苏州和镇江等水稻专区有局部危害，后者分别于70年代和90年代在华北和西北等地区的玉米上局部流行成灾。水稻黑条矮缩病毒(RBSDV)与水稻矮缩病毒均是呼肠孤病毒科病毒，该病毒为斐济病毒属，病毒全基因组共10个片段。水稻黑条矮缩病和玉米粗缩病的发病症状十分相似，其特征是始病叶以上茎叶短缩而叠层、色泽浓绿，质地僵硬、剑叶短宽而平展，在叶片背部、叶鞘或茎基部生蜡泪状脉肿，先是蜡白色，而后变成黑褐色。分蘖期病株的分蘖矮化丛生、心叶扭曲以及边缘有曲刻(阮义理，陈声祥，林瑞芬，等.水稻黑条矮缩病的研究.浙江农业科学，1984，(4)：185—187；27杨本荣，马巧月.玉米粗缩病的寄主范围研究.植物病理学报，1983，13(3)：1—8)。

在欧洲、南美洲、东南亚以及澳洲侵染玉米引起玉米严重矮化的病毒有玉米粗缩病毒(maizroughdwarfvirus,MRDV)，MRDV与RBSDV同属呼肠孤病毒科，斐济病毒属，基因组为10条双链RNA(Azuhata,F.,Uyeda,I.,Kimura,I.andShikata,E.(1993).Closesimilaritybetweengenomestructuresofriceblack-streakeddwarfandmaizeroughdwarfviruses.J.Gen.Virol.74,1227-1232)。

水稻矮缩病毒(RDV)病毒粒子是一个呈正二十面体对称的球形结构，无脂蛋白外膜，无突起，含有双层外壳蛋白。完整粒子直径为70nm，核心为53nm,外壳和内壳的厚度分别为17nm和7nm。外壳层三角形剖分数为T＝13。在感染的水稻病株中，病毒含量很高，经超薄切片观察，病叶细胞中含有大量的病毒粒体和病毒基质。RDV的基因组总长度为25,617bp,由12条双链RNA组成，根据其在聚丙烯酰胺凝胶电泳上的迁移率由慢到快，依次命名为S1-S12。

目前对RDV病毒本身已有了较深入的认识，但对RDV与寄主间的互作了解甚少。这可能与RDV病毒粒子的本身的特性有关，不能进行有效的侵染性克隆，病毒的寄主范围仅限于禾本科植物，不能侵染烟草和拟南芥等容易操作的茄科和十字花科的植物。随着现代分子生物技术的发展和成熟，研究病毒与寄主的互作已经成为当前的热点。2005年Zhu首次揭示RDV致病的矮化机制，RDV编码的P2蛋白与水稻贝克杉烯氧化酶蛋白的互作使水稻赤霉素的合成能力大大下降，使得被RDV感染的水稻植株呈现矮缩症状。另外，贝克杉烯氧化酶可能参与了水稻植保素的合成，P2蛋白与其互作是为了阻止水稻植保素的合成从而使得寄主植物更加适合病毒粒子的复制和侵染(Zhuetal.,2005)。还有值得我们思考的是：外源GA可以减轻水稻矮缩症状并不能绝对的说明赤霉素的降低是水稻矮缩的直接原因，同样外源IAA不能减轻矮缩症状也不能绝对的排除生长素与矮缩症状无关，因为在RDV侵染的水稻中生长素等的信号传导可能也遭到了破坏。Zhou等研究发现RDVP8蛋白与水稻体能的一个乙醇酸氧化酶互作(Zhouetal.,2007)，乙醇酸氧化酶是过氧化物酶体中的一个关键蛋白，P8与其互作可能使得P8也进入过氧化物酶体中，而过氧化物酶体可能是RDV的复制位点。利用水稻全基因组芯片技术对RDV侵染水稻进行了转录谱的分析显示，RDV的侵染水稻后引起了一系列的防御基因的表达，包括PR蛋白，WRKY转录因子等，这表明水稻对RDV的侵染启动了防御反应。有意思的是，在RDV侵染的水稻中，大量的细胞壁合成相关基因和叶绿体功能相关基因的表达显著下降了。细胞壁的合成是植物细胞伸长的关键因素，而细胞的伸长程度又决定了植株的高度，所以这些细胞壁合成相关基因的抑制很可能导致了细胞壁合成的障碍，从而引起了矮缩的症状(Shimizuetal.,2007；Satohetal.,2010)。先前研究显示在RDV侵染水稻后，病毒衍生的vsiRNA明显富集，表明RNA沉默信号通路在水稻抗RDV中发挥着重要的作用(Duetal.,2011)。

RNA沉默是真核生物基因表达调控的一种非常重要的策略，也是植物抵抗病毒侵染的一个方法(vanMierloetal.,2012；Wuetal.,2010b)。研究病毒和寄主之间在RNA沉默和RNA沉默的抑制对了解真核生物的基因表达调控将有重要的推动作用。该技术目前已被国际研究领域公认并应用于抗病基因工程育种以及功能基因研究。经典遗传学实验材料进行的RNA沉默实验显示了RNA沉默的几个特点：特异、高效、可扩散。与先前的正义或反义RNA技术相比，RNA沉默技术或人工构建miRNA等对同源基因表达的抑制效应至少高10倍以上。如何快速、高效地构建目标基因的反向重复序列，就成了当前利用RNA沉默机制获取对相关病毒免疫的工程植株的关键步骤。

在RNA沉默过程中包含了3个主要元件：分别为DCLs、AGO和RDR，其在植物抗病毒防御中都发挥重要作用。Dicer(DCLs)是一种Ⅲ型内切核酸酶，可以特异性识别生物体内的双链RNA，或单链RNA折叠形成的双链区域，产生长度为20～25nt的小RNA。所有的Dicer都具有一个同源的核酶结构域：RNaseⅢ结构域。这个结构域可以切割双链RNA产生duplex片段，切割产物一般具有5’磷酸集团及具有2个碱基突起的3’末端。大多数病毒在侵染复制过程中都会产生dsRNA形式，而这种dsRNA又会被生物体内的Dicer(DCL2、DCL3和DCL4等)识别并切割生成vsiRNA(virus-derivedsmallinterferingRNAs)，从而阻断病毒的复制和转录过程。Argonaute(AGO)蛋白，一个RNA结合蛋白，大小在90～130kDa，是RNA沉默过程中的核心组分可以与siRNA，miRNA或piRNA结合，形成有活性的RISC(RNA-inducedsilencingcomplex)。研究表明，AGO蛋白在参与植物抗病毒过程中发挥着重要的作用。模式生物拟南芥包含10个AGO蛋白，其中AtAGO1蛋白通过结合病毒衍生的vsiRNA而参与植物抗多种病毒的过程(BurgyanandHavelda,2011；Zhangetal.,2006)。另外，AGO2和AGO7也在抗病毒反应中发挥不同的作用(Carbonelletal.,2012；Ding,2010)。目前已知水稻具有19个AGO蛋白，但是关于水稻或其他重要作物AGO蛋白参与抗病毒防御反应的研究还没有报导。RDR，RNA依赖性RNA聚合酶(RNA-dependentRNApolymerase，RDR)，以RNA单链为模板合成dsRNA，在DCLs切割下产生smallRNAs。最新的研究结果揭示，病毒和宿主RDRs合成的dsRNA作为主要的切割底物，以及源于RVaistijandJonesDR6介导产生的dsRNA所产生的次级siRNAs具有更加有效的抗病毒反应。然而，这可能不是普遍现象，其结果可能取决于对特定的病毒。在病毒与寄主的长期进化过程中，RNA沉默(RNAsilencing)成为植物抵抗病毒侵染的一种保守的防御机制。而作为相互竞争的另一方，病毒也不会坐以待毙，现在认为绝大多数的病毒都会编码一种抑制基因沉默的蛋白因子(VSR)，这种蛋白因子通过各种不同的方式作用于RNA沉默通路的不同位点从而抑制RNA沉默对病毒的切割。

突变体是研究功能基因组学的基础，是分离基因和鉴定基因功能的重要途径。自20世纪70年代以来，全球建立了一系列的突变体库。随着水稻全基因组测序工作的完成，水稻突变体已广泛应用于鉴定调控水稻形态和生理性状与基因的连锁分析及其相关基因的克隆和功能研究。与水稻表达谱数据相结合，通过对植物抗病相关基因的突变体进行筛选及转基因植物功能互补分析验证，是研究抗病相关基因及其作用的分子遗传机制的重要途径。

Solexa测序技术是深度测序技术中的一种，属于第二代测序技术，它们的兴起与发展为基因组与RNA研究提供了非常好的工具，通过该技术可以高通量测定核苷酸的序列，此方法不仅在小RNA测序中得到广泛应用，而且在研究基因组甲基化，转绿组和基因组重测序中也占据绝对优势。深度测序技术可以揭示RDV和水稻互作过程中的许多信息，比如水稻RNA沉默相关蛋白在抗病防御中的作用。在深度测序前需要构建小RNA库和mRNA库，首先提取分别提取感染RDV的水稻和健康水稻组织中的总RNA，分别构建mRNA和小RNA库，在其两端接上接头，进行逆转录和PCR。得到的cDNA进行深度高通量测序。

随着高通量分子生物学技术的广泛应用，它带给我们将是海量的数据信息，这些信息的分析必需依靠强大的生物信息学平台的支撑。水稻基因组和RDV基因组均已经测序完成，这为我们后续的生物信息学分析提供了很好的数据平台。

发明内容

本发明的目的是提供一种OsAGO18蛋白或其编码基因或含有所述编码基因的重组载体在调控植物对水稻矮缩病毒或其同科病毒的抗性中的应用。

本发明所提供的应用，具体如下：

OsAGO18基因或其编码蛋白或含有所述基因的重组载体在如下a1)或a2)中的应用：

a1)调控植物对水稻矮缩病毒或其同科病毒的抗性；

a2)选育对水稻矮缩毒或其同科病毒引发的植物病毒病害抗性增强的植物品种；

所述OsAGO18基因是以下1)～4)项中任何一项所述的DNA分子：

1)序列表中序列1所示的DNA分子；

2)序列表中序列3所示的DNA分子；

3)在严格条件下与1)或2)所限定的DNA分子杂交且编码所述蛋白的DNA分子；

4)与1)-3)任一限定DNA分子具有90％以上，优选95％以上，更优选99％以上同源性且编码所述蛋白的DNA分子。

上述严格条件可为用6×SSC，0.5％SDS的溶液，在65℃下杂交，然后用2×SSC，0.1％SDS和1×SSC，0.1％SDS各洗膜一次。

其中，序列1由3267个核苷酸组成，其中第1-3267位为所述OsAGO18基因的编码序列(ORF)，编码序列表中序列2所示的蛋白，序列2由1088个氨基酸残基组成。序列3由3300个核苷酸组成，其中第1-3300位为编码序列(ORF)，编码序列表中序列4所示的融合蛋白，序列4由1099个氨基酸残基组成。

在本发明中，以上所有a1)中的所述调控植物对水稻矮缩毒或其同科病毒引发的植物病毒病害例如水稻矮缩病和黑条矮缩病的抗性均具体体现在：病原体侵染植物能够诱导该蛋白质及其编码基因的表达；促进所述蛋白质或其编码基因的表达，则所述植物对水稻矮缩病抗性增强。以上所有a2)中的所述选育对水稻矮缩病抗性增强的植物品种的方法，均具体可包括将所述蛋白质或其编码基因的表达量较高的植株作为亲本进行杂交的步骤。

本发明的另一个目的是提供一种培育对水稻矮缩毒或其同科病毒抗性增强的转基因植物的方法。

本发明所提供的培育对水稻矮缩毒或其同科病毒引发的植物病毒病害抗性增强的转基因植物的方法，具体可包括如下步骤：

a)向目的植物中导入由以下1)～4)中任何一项所述的OsAGO18蛋白的编码基因，得到表达所述编码基因的转基因植物：

1)序列表中序列1所示的DNA分子；

2)序列表中序列3所示的DNA分子；

3)在严格条件下与1)或2)所限定的DNA分子杂交且编码所述蛋白的DNA分子；

4)与1)-3)任一限定DNA分子具有90％以上，优选95％以上，更优选99％以上同源性且编码所述蛋白的DNA分子，

b)从步骤a)所得转基因植物中得到与所述目的植物相比，对水稻矮缩毒或其同科病毒抗性增强的转基因植物。

上述严格条件例如可为用6×SSC，0.5％SDS的溶液，在65℃下杂交，然后用2×SSC，0.1％SDS和1×SSC，0.1％SDS各洗膜一次。

其中，序列1由3267个核苷酸组成，其中第1-3267位为所述OsAGO18基因的编码序列(ORF)，编码序列表中序列2所示的蛋白，序列2由1088个氨基酸残基组成。序列3由3300个核苷酸组成，其中第1-3300位为编码序列(ORF)，编码序列表中序列4所示的融合蛋白，序列4由1099个氨基酸残基组成。

优选地，在上述的应用或方法中，所述蛋白由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成或由序列表中序列4所示的氨基酸序列组成。其中，由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成蛋白质命名为OsAGO18蛋白(编码基因为序列1，命名为OsAGO18基因)，由序列表中序列4所示的氨基酸序列组成蛋白质则为在OsAGO18蛋白的N端连接了MYC标签后得到的融合蛋白(编码基因为序列3)。

本领域的技术人员懂得，可以通过点突变、添加或缺失基因序列中的一个或多个碱基，影响该基因编码的蛋白功能。因此，本发明应该被理解为包括了对OsAGO18基因进行的上述变异。OsAGO18基因的序列不局限于序列表中序列1所示，还包括将其编码蛋白功能区中某氨基酸残基对应的任一密码子进行突变的DNA序列。主要是将有功能的氨基酸残基突变成一般被认为无特殊功能的丙氨酸。

在所述方法中，所述蛋白的编码基因是通过含有所述蛋白的编码基因的重组表达载体导入所述目的植物中的。

所述重组表达载体可用现有的植物表达载体构建。所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等，如pCAMBIA3301、pCAMBIA2300、pCAMBIA2301、pCAMBIA1300、pCAMBIA1301、pWM101、pGreen0029、pBI121、pBin19、pCAMBIA1301-UbiN等或其它衍生植物表达载体。所述植物表达载体还可包含外源基因的3’端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3’端。使用所述基因构建重组表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型、组成型、组织特异型或诱导型启动子，例如花椰菜花叶病毒(CAMV)35S启动子、泛素基因Ubiquitin启动子(pUbi)、胁迫诱导型启动子Rd29A等，它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建重组表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用重组表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因、具有抗性的抗生素标记物或是抗化学试剂标记基因等。也可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。

在本发明中，所述重组表达载体中启动所述编码基因转录的启动子具体为Actin启动子。

更为具体的，所述重组表达载体为将所述编码基因替换pCam23ACT:OCS载体的酶切位点SmaI和SalI之间的小片段后得到的重组质粒。在该重组表达载体中，启动所述编码基因转录的启动子为所述Actin启动子。

在上述方法中，将携带有所述编码基因的所述重组表达载体导入所述目的植物，具体可为：通过农杆菌介导法、基因枪法、电击法、花粉管导入法、脂质体融合法以及其他任意可将质粒导入的方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物组织培育成植株。

在上述应用或方法中，所述植物可为单子叶植物或双子叶植物。

所述单子叶植物为禾本科植物。

在本发明中，所述植物为水稻或玉米。进一步，水稻品种最好为对RDV敏感的品种，如中花11、秀水11、日本晴等。

更加具体的，在本发明的一个实施例中，所述植物为水稻品种日本晴。

在上述应用或方法中，所述水稻矮缩病的病原具体为水稻矮缩病毒(RiceDwarfVirus)、水稻黑条矮缩病毒(Riceblack-streakeddwarfvirus)，玉米粗缩病毒(maizroughdwarfvirus)或水稻条纹病毒(Ricestripevirus)。以上所述的同科病毒优先选自水稻黑条矮缩病毒(Riceblack-streakeddwarfvirus),玉米粗缩病毒(maizroughdwarfvirus)或水稻条纹病毒(Ricestripevirus)。

实验证明，本发明发现OsAGO18是一个能够被病毒特异性诱导的抗病基因，在水稻矮缩病毒(RDV)、水稻条纹病毒(RSV)以及水稻黑条矮缩病毒(RBSDV)或玉米粗缩病毒(maizroughdwarfvirus)侵染野生型日本晴水稻后，OsAGO18蛋白表达量明显积累。鉴于上述三类病毒均属植物呼肠孤病毒科，以水稻矮缩病毒为例，当水稻矮缩病毒侵染水稻ago18突变体后，病毒粒子积累量较水稻野生型明显增加，病症也更加严重，基本无产量；相反，RDV侵染过表达OsAGO18转基因水稻后，病毒粒子积累量明显低于野生型水稻，病症也较轻，发病率下降，表明OsAGO18基因具有提高水稻抗病毒的能力。鉴于水稻黑条矮缩病毒同时能够侵染玉米，引起玉米粗缩病，实验结果表明AGO18蛋白或其编码基因能够提高玉米抗由RDV，RBSDV，MRDV等引起的玉米粗缩病的能力。

附图说明

图1为AGO18蛋白在水稻矮缩病毒、水稻黑条矮缩病毒以及水稻条纹病毒侵染野生型日本晴水稻后积累的实验结果。Westernblot分析AGO18蛋白水平在多种病毒侵染后诱导。其中，Mock表示为被病毒侵染的野生型水稻品种日本晴；RDV表示被RDV侵染发病的野生型水稻品种日本晴；RBSDV表示被RBSDV侵染发病的野生型水稻品种日本晴；RSV表示RSV侵染发病的野生型水稻品种日本晴；Tubulin是上样control。

图2为OsAGO18mRNA在水稻矮缩病毒侵染后积累的实验结果。RealtimePCR分析OsAGO18mRNA在RDV侵染后被诱导。其中，Mock表示未被RDV侵染的野生型水稻品种日本晴；RDV表示被RDV侵染发病的野生型水稻品种日本晴。以内参基因水稻EF的表达量为1。

图3为ago18突变体T-DNA插入位置信息与鉴定结果。其中，A为RT-PCR方法鉴定ago18突变体(NF6013)，LP+RP表示使用引物对6013_LP/6013_RP进行扩增的结果，LB+RP表示使用引物对tos17_tail6(LB)/6013_RP进行扩增的结果，AGO18表示使用引物对OsAGO18-F/OsAGO18-R进行扩增的结果，Actin表示使用引物对Actin-RT-F/Actin-RT-R进行扩增的结果；B为Tos17插入位点示意图。

图4为实施例2中各水稻品系接种RDV病毒后的病症图。其中，WT-mock表示未被RDV侵染的野生型水稻品种日本晴；WT-RDV表示被RDV侵染发病的野生型水稻品种日本晴；ago18-mock表示未被RDV侵染的ago18突变体纯合子；ago18-RDV表示被RDV侵染的ago18突变体纯合子。

图5为感病ago18突变体水稻中RDV基因组RNA积累的结果。其中，WT-mock表示未被RDV侵染的野生型水稻品种日本晴；WT-RDV表示被RDV侵染发病的野生型水稻品种日本晴；ago18-mock表示未被RDV侵染的ago18突变体纯合子；ago18-RDV表示被RDV侵染的ago18突变体纯合子。

图6为OsAGO18过表达转基因水稻的鉴定结果。其中，A为RT-PCR鉴定结果；B为Westernblot鉴定结果。

图7为实施例3中各水稻品系接种RDV病毒后的病症图。其中，Mock表示未被RDV侵染的野生型水稻品种日本晴；WT-RDV表示被RDV侵染发病的野生型水稻品种日本晴；Vector-RDV表示被RDV侵染的转空载体水稻；ago18-RDV示被RDV侵染的ago18突变体纯合子；AGO18OE-5-RDV表示被RDV侵染的转基因水稻株系5#；AGO18OE-2-RDV表示被RDV侵染的转基因水稻株系2#；AGO18OE-1-RDV表示被RDV侵染的转基因水稻株系1#。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

水稻(Oryza.sativaL.)品种日本晴：即日本晴水稻(OryzasativaL.japonica.cv.Nipponbare)，参考文献：水稻品种“日本晴”.农业科技通讯，1973年02期。公众可从北京大学获得。

水稻矮缩病毒(RiceDwarfVirus，RDV)：记载于“张仲凯，方琦，魏春红，丁铭，董佳红，俞立，李毅.水稻矮缩病毒云南、浙江分离株侵染水稻植株的细胞病理比较研究.电子显微学报，2006年第25卷第2期”一文，公众可从北京大学获得。

水稻黑条矮缩病毒(RiceBlack-StreakedDwarfVirus，RBSDV)：记载于“陈声祥，张巧艳.我国水稻黑条矮缩病与玉米粗缩病研究进展.植物保护学报，2005年第32卷第1期”一文，公众可从北京大学获得。

水稻条纹病毒(RiceStripeVirus，RSV)：记载于“蔡小卫,赵俊玲,邵英,桂青清,刘芳.灰飞虱传播水稻矮缩病毒的研究综述.中国植保导刊，2011年09期”一文，公众可从北京大学获得。

农杆菌EHA105：记载于“Zhuetal.,2005.TheRiceDwarfVirusP2Proteininteractswithent-KaureneOxidasesinvivo,leadingtoreducedbiosynthesisofGibberellinsandricedwarfsymptoms.PlantPhysiology.139:1935-1945.”一文，公众可从北京大学获得。

pEASY-simple-T1载体：北京全式金生物技术有限公司产品，其产品目录号为CT111-01。

pCam23ACT:OCS载体：记载于“LiangWuetal.,2009.RiceMrcroRNAEffectorComplexesandTargets.PlantCell.21(11):3421-3435.”一文，公众可从北京大学获得。

实施例1、发现OsAGO18基因能够被水稻多种病毒诱导表达

本实施例中所涉及的OsAGO18基因来源于水稻(Oryza.sativaL.)，OsAGO18基因的cDNA序列如序列表中序列1所示，序列1由3267个核苷酸组成，其中第1-3267位为编码序列(ORF)；序列1编码序列表中序列2所示的蛋白质，序列2由1088个氨基酸残基组成。

一、OsAGO18蛋白在水稻矮缩病毒、水稻黑条矮缩病毒以及水稻条纹病毒侵染后积累

取被水稻矮缩病毒(RDV)、水稻黑条矮缩病毒(RBSDV)以及水稻条纹病毒(RSV)侵染发病的野生型水稻(Oryza.sativaL.)品种日本晴和对照组水稻(未被水稻矮缩病毒侵染的野生型水稻品种日本晴)叶片为材料，利用2×SDS上样缓冲液提取总蛋白，采用Westernblot方法检测OsAGO18蛋白在两水稻中的积累情况。具体如下：

(1)SDS-PAGE电泳操作流程及注意事项参见《蛋白质的SDS－PAGE凝胶电泳》：

(2)SDS-PAGE凝胶转膜：

1)将蛋白胶放于玻璃板上，测量大小，剪取相同大小的PVDF膜，做好标记，将膜放于100％甲醇内浸润超过10秒；

2)剪取相同大小的六块滤纸，三张一份，与胶和PVDF膜放于转膜缓冲液内平衡超过10分钟；

3)在转膜缓冲液中将三张一份的滤纸放于最底层，依次放上蛋白胶、PVDF膜、另外三张滤纸，对齐后一手捏紧一角，另一手挤压滤纸，除去所有气泡，调整角度，重新挤压气泡；

4)将转膜槽放于冰盒内，灌注转膜缓冲液，将中间固定好蛋白胶和PVDF膜的双层滤纸放于海绵夹层中，置于转膜模具内，之后将PVDF膜朝向正极放入转膜槽内中，根据目的蛋白大小选择合适电流和时间恒流转膜；

(3)蛋白质的免疫检测：

1)取出PVDF膜放于平皿中，加入约25mlPBS-T，脱色摇床上摇动洗膜5分钟；

2)在平皿内加入50ml封闭液(含5％脱脂奶粉的50mlPBS-T)，脱色摇床摇动将膜封闭过夜；

3)大体积(约30ml)PBS-T洗膜5分钟，洗2次；

4)将膜放于三面剪开的杂交袋中，热封两边后按每平方厘米0.1ml加入稀释好的一抗(利用特异性较高的多肽AGO18N，即序列5所示多肽，作为免疫原，免疫兔子，制备获得的抗水稻OsAGO18蛋白的多克隆抗体)，封闭最后一边，室温反应2小时；其中一抗稀释液为含0.25％BSA的PBS-T，一抗的稀释比例取决于所用抗体的效价和转到膜上目的蛋白的量，期间要至少每隔5分钟混匀一次杂交袋；

5)剪开杂交袋，将膜放于平皿内加入20mlPBS-T洗10分钟，洗3次；后用20mlTBS-T洗膜10分钟，洗2次；

7)依照一抗反应的方法，将膜放于新的杂交袋中，加入稀释好的二抗(兔抗，Promega公司，货号：0000089056)在杂交袋中反应1小时，二抗稀释液为含0.25％BSA的TBS-T；

8)20mlTBS-T漂洗10分钟，漂洗4次；

9)利用Westernblot显影kit(Immobilon^TMWestern：MILLIPORE上海贸易有限公司，货号：1305701)进行显影，利用柯达X-OMATBT医用X射线胶片检测结果；

(4)实验所需试剂：

1)2×SDS上样缓冲液10mL：甘油2Ml；溴酚蓝0.0202g；1MTris-HCl(pH6.8)1mL；β-巯基乙醇0.14mL；10％SDS4mL；加ddH₂O至10mL，保存于-20℃。

2)转膜缓冲液1L：39mM甘氨酸：2.9g；Tris5.8g；SDS0.37g；甲醇：200ml。

3)碱性磷酸酶缓冲液100ml：100mMNaCl；5mMMgCl₂；100mMTris-ClpH9.5。

4)PBS-T1LpH7.5：1M磷酸二氢钠31.6ml；1M磷酸氢二钠68.4mlTween200.1％1ml；水900ml；调pH后定容1L。

5)TBS-T1LpH7.6：Tris2.42g；NaCl8g；Tween201ml；水900ml；调pH后定容1L。

6)封闭液100ml：100mlTBS-T内加入5克脱脂奶粉。

7)抗稀释液100ml：100mlPBS-T内加入0.25克BSA。

Westernblot实验以tubulin蛋白为内参，其一抗为Tubulin单克隆抗体(鼠源，Sigma公司，货号：T6793)；二抗为鼠抗anti-mouse(Promega公司，货号：0000089661)。

如图1结果所示，OsAGO18蛋白在侵染的水稻材料中明显积累，表明不同的病毒侵染均可以诱导OsAGO18蛋白的积累，OsAGO18蛋白可能参与了水稻抗多种病毒的防御反应。

二、OsAGO18基因mRNA在水稻矮缩病毒侵染后积累

取被水稻矮缩病毒(RDV)侵染发病的野生型水稻(Oryza.sativaL.)品种日本晴和对照组水稻(未被水稻矮缩病毒侵染的野生型水稻品种日本晴)各0.5g，在液氮中研磨后，依照Invitrogen公司的TRIzolReagent说明书(InvitrogenTrizolReagent，catNo.15596-018)提取总RNA。测定总RNA浓度后，取10μg总RNA，按照RQ1Dnase(Promega，货号：M610A)的说明书对总RNA中的水稻基因组DNA进行消化。消化反应体系：总RNA10μg，10×Dnase缓冲液10μl，DNase10μl，DEPC水补足100μl。将整个消化反应体系于37℃孵育35min。孵育后向体系中加入4μlRQ1DNase终止反应液，65℃孵育10min，使DNase灭活。

消化基因组DNA后，再利用氯仿抽提法浓缩总RNA，测定RNA浓度，取2μgRNA参照Invitrogen公司的SuperScriptII逆转录酶进行反转录，所用引物为16个核苷酸的Oligod(T)引物，具体方法参见invitrogenM-MLVReverseTranscriptase(货号：28025-021)。以反转录获得水稻cDNA为模板，利用realtimePCR的方法对OsAGO18基因的转录水平进行检测，实验方法参照TOYOBOGreenRealtimePCRMasterMix(货号QPK-201)说明书，引物为：

OsAGO18-F：5’-TGTTCGTCCAGGCACAGTAG-3’(序列1的第2901-2920位)；

OsAGO18-R：5’-GCGGTGAAGTTGTTGTCGTC-3’(序列1的第3022-3041位的反向互补序列)。

内参基因为水稻EF，引物为：

OsEF-1a-F：5’-GCACGCTCTTCTTGCTTTCACTCT-3’；

OsEF-1a-R：5’-AAAGGTCACCACCATACCAGGCTT-3’。

数据处理方法，参照bio-rad公司CFX96型号实时定量荧光PCR仪自带软件CFXmanager^TMSoftware(Version2.1)。

结果如图2所示，可见在mRNA水平上，OsAGO18基因在RDV侵染水稻后明显富集，表明RDV侵染水稻后能够诱导OsAGO18基因的表达，使该基因的转录水平提高。

实施例2、OsAGO18基因参与水稻抗RDV防御反应

一、ago18水稻突变体纯合子的获得

ago18突变体种子(NF6013)在Tos17数据库中购买

(https://tos.nias.affrc.go.jp/～miyao/pub/tos17/)。

T-DNA插入序列为：

tos17_tail6(LB)：5’-AGGTTGCAAGTTAGTTAAGA-3’。

插入位点如图3中B所示。

利用数据库中提供的方法鉴定ago18突变体的纯合子

(https://pc7080.abr.affrc.go.jp/cgibin/tos17/ricegenome.cgi？action＝getTarget&chr＝7&pos＝16895280&primer＝y&version＝7)。

以上述鉴定得到的水稻ago18突变体(NF6013)纯合子的cDNA为模板，以6013_LP/6013_RP引物对、tos17_tail6(LB)/6013_RP引物对、OsAGO18-F/OsAGO18-R引物对，分别进行半定量RT-PCR反应。同时设置野生型水稻(Oryza.sativaL.)品种日本晴作为对照。

引物序列如下：

6013_LP：5’-GATCGAGGGAACTCGACAAG-3’；

6013_RP：5’-CAAGATCAACTCCACGCAAA-3’。

tos17_tail6(LB)、OsAGO18-F和OsAGO18-R序列见上文。

以Actin为内参，引物如下：

Actin-RT-F：5’-CTTCGTCTCGACCTTGCTGGG-3’；

Actin-RT-R：5’-GAGAAACAAGCAGGAGGACGG-3’。

结果如图3中A所示，由图可见水稻ago18突变体(NF6013)纯合子仅采用引物对tos17_tail6(LB)/6013_RP可以扩增相应的目的条带，而采用6013_LP/6013_RP引物对和OsAGO18-F/OsAGO18-R引物对均未扩增出相应的目的条带。而作为对照的野生型水稻(Oryza.sativaL.)品种日本晴采用6013_LP/6013_RP引物对和OsAGO18-F/OsAGO18-R引物对均扩增出相应的目的条带，但采用tos17_tail6(LB)/6013_RP引物对未扩增出相应的目的条带。与预期结果一致。

二、OsAGO18基因参与水稻抗RDV防御反应

1、RDV侵染ago18突变体水稻后，水稻发病率提高，症状加重

以带RDV病毒的叶蝉侵染同时期(分蘖期)的野生型水稻(Oryza.sativaL.)品种日本晴和步骤一获得的ago18突变体纯合子(实验组)。以无毒叶蝉侵染相应的水稻作为对照组。

2周后检测水稻发病情况(水稻发病情况鉴定参照文献《稻麦主要病毒病识别与控制》一书中第二章)，分别统计实验组与对照组的发病率。统计发病率的同时，观察水稻发病后的表型在不同的实验组之间的区别。

实验组中，各水稻品系的发病率统计结果如表1所示。可见，RDV病毒侵染ago18突变体后，水稻发病率较高；而RDV病毒侵染野生型水稻后，水稻发病率较低。与预期结果一致。进一步，各水稻品系接种RDV病毒后的病症图如图4所示，RDV侵染ago18突变体后，水稻植株更加矮小，在叶片或叶鞘上出现的白色斑点增多。

表1RDV侵染各水稻品系后发病率统计

水稻品系	Na	Db	Pc
				日本晴	30	22	73.3％
ago18突变体	30	26	86.7％

注：a:被观测的水稻总株数；b:侵染两周后具发病表型的水稻株数；c:发病水稻占全部被侵染水稻的比例。

2、Northernblot实验检测RDV基因组RNA链在发病水稻中的积累情况

以步骤1中获得的发病的野生型水稻品种日本晴、发病的ago18突变体水稻、未发病的野生型水稻品种日本晴、未发病的ago18突变体水稻为实验材料。分别取各水稻材料叶片2g，在液氮中研磨成粉末，依照Invitrogen公司的TRIzolReagent说明书(InvitrogenTrizolReagent，catNo.15596-018)提取总RNA，测定浓度后，备用。

A.在通风厨内制备1.2％的琼脂糖甲醛变性胶120ml：87.6mlDEPC水中加入1.44g琼脂糖，微波炉加热使琼脂糖融化，后冷却至温度为60℃左右，后加入12ml10×mops母液和20.4ml甲醛。摇晃混合均匀后，迅速倒入胶槽内并插入梳子。

B.在10-20μg的RNA样品中加入RNAloadingbuffer，100℃加热10分钟，后放置在冰上变性2-3min，上样前离心1-2min。

C.移液器将变性后的样品加入到冷却好的琼脂糖甲醛变性胶中，电泳液为1×mops溶液，电压100V，电泳3-4个小时。切胶并放于20×SSC溶液平衡10-20min。

D.电泳完毕用两种方法转膜：真空转移法和毛细管转移。毛细管转移的基本方法：在培养皿倒入20×SSC溶液，在玻璃板上搭上2-3层的滤纸形成纸桥。再把胶放在纸桥上，PDVF膜放在胶的上面，再放上3层滤纸以及10-25cm后的吸水纸。再上压重物，转膜24-36小时。真空转移的方法原理和毛细管转移一样，使用抽真空仪器，较快溶液转移的速度。

E.紫外交联：能量为1800对膜进行交联。之后可放80℃烤膜30min。处理好的膜可用亚甲基蓝染色，及检测之前步骤中RNA的有无降解及上样量是否一致。染色得到的rRNA的条带可用作control。

F.将膜放于含有预杂液(Sigma公司，货号为SLBG7228V)的杂交瓶，65℃条件下预杂1-2小时。

G.将标记好的探针(用于扩增RDV的三条RNA片段探针的引物序列见下文)放置于100℃变性10min，后放置于冰上3min冷却。将其添加到预杂液中，65℃条件下杂交过夜(24小时以上)。标记探针随机引物法反应体系参照TAKARA公司探针标记试剂盒提供的方法(货号D6045)：

ddH2O补加体积到50μl	29μl
		Labeling 5×buffer	10μl
未标记的dNTPs混合物	2μl
		变性的RNA模板(30-50ng)	1μl
BSA	2μl
		α-32P dCTP(50μCi，3000Ci/mmol)	5μl
DNA聚合酶I Klenow大片段(5U)	1μl

扩增四条RNA链探针所用的引物如下所示(5’-3’)：

RDV-S2-F：5’-CCGGGACGTGCCAAACCGTGAAC-3’；

RDV-S2-R：5’-ACGCCATCAACAGAGCAGAATCCATTA-3’。

RDV-S8-F：5’-TCAATAGCGATACCAAGCCTACCGTTTC-3’；

RDV-S8-R：5’-ATCGATGTCGGGGTCTGAGTTATCGAGTTCAAT-3’。

RDV-S11-F：5’-CATGCCATGGCAATGAGTGGAACATTACCCTTG-3’；

RDV-S11-R：5’-AGAATGCGGCCGCTTACTTACGCTTTGATTTGCGAG-3’。

H.杂交完毕，用2×洗膜液(2×SSC，加入SDS至终浓度为1g/L)在65℃洗膜两次，每次20分钟。然后用0.1×洗膜液(0.1×SSC，加入SDS至终浓度为1g/L)，65℃洗膜1次，约20分钟。

I.膜晾干，并用保鲜膜包好，检测放射强度。压片(X光片或磷屏)，时间根据放射强度决定压片时间长短。

实验同时以rRNA作为对照。

实验结果如图5中B所示，RDV基因组三个RNA片段在ago18突变体水稻中富集量均高于野生型水稻日本晴，这进一步表明RDV在ago18突变体中复制量增加。与步骤1中测得的ago18突变体较野生型水稻品种日本晴更感病，抗病性减弱相一致。

以上结果均证明，OsAGO18基因参与水稻抗病毒防御反应，水稻失去该基因后更加容易感病，且病症更加严重，病毒粒子复制量增加。

实施例3、过表达OsAGO18的转基因水稻抗病性增强

一、OsAGO18基因植物表达载体的构建

1、水稻cDNA模板的获得

依照说明书，用Invitrogen公司的TRIzolReagent提取日本晴水稻(OryzasativaL.japonica.cv.Nipponbare)总RNA，用该公司的SuperScriptII逆转录酶进行逆转录。逆转录所用引物为16个核苷酸的Oligod(T)引物，最终获得逆转录所得的水稻cDNA模板。

2、水稻OsAGO18基因的获得

以步骤1获得的水稻cDNA为模板，用如下引物对进行PCR扩增。

AGO18cds-F：5’-ATAATGGCGAGCCGAGGAGGAGGC-3’(该序列的第4-24位为序列1的第1-21位，前三位的ATA为保护碱基)；

AGO18cds-R：5’-GACCTAGCAAAAGAACATGGACTTTTTC-3’(该序列的第4-28位为序列1的第3243-3267位的反向互补序列，前三位的ATA为保护碱基)。

PCR得到片段后，将全长的序列连接pEASY-simple-T1载体上，转化大肠杆菌，提质粒进行测序。将经测序表明在pEASY-simple-T1载体中正向连入“ATA+序列1+GTC”所示DNA片段后的重组质粒命名为pEASY-OsAGO18。

3、OsAGO18基因植物表达载体的构建

以步骤2获得的重组质粒pEASY-OsAGO18为模板，以如下引物进行PCR扩增。

AGO18cds-Sma1-MYC-F：5’-ATAcccgggATGGAGCAGAAGCTGATCTCAGAG GAGGACCTG-ATGGCGAGCCGAGGAGGAGGC-3’(下划线小写字母部分为SmaI的识别序列，下划线大写字母部分为MYC标签序列，-后的序列为序列1的第1-21位)；

AGO18cds-Sal1-R：5’-GACgtcgacCTAGCAAAAGAACATGGACTTTTTC-3’(下划线小写字母部分为SalI的识别序列，-后的序列为序列1的第3243-3267位的反向互补序列)。

将PCR产物用SmaI和SalI酶切(NEB公司产品，货号分别为：R0141和R0138)，胶回收后与经过同样双酶切的pCam23ACT:OCS载体的骨架大片段相连，得到重组质粒。

将经SmaI和SalI双酶切初步鉴定正确的重组质粒(得到大小约为10300bp和3300bp的条带)送样测序。将经测序表明将pCam23ACT:OCS载体的酶切位点SmaI和SalI之间的小片段替换为序列表中序列3所示DNA片段的重组质粒命名为pCambia2300-Actin-MYC-OsAGO18。序列3与序列1相比，在序列1所示的OsAGO18基因的5’端多出了MYC标签序列。序列3编码序列表中序列4所示的蛋白质(MYC标签与OsAGO18的融合蛋白)。

在重组表达载体pCambia2300-Actin-MYC-OsAGO18中，启动序列3所示DNA片段转录的启动子为Actin启动子。

二、过量表达转OsAGO18基因水稻的获得

1、愈伤组织的诱导培养

将日本晴水稻(OryzasativaL.japonica.cv.Nipponbare，以下简称为野生型水稻)种子去壳，先用70％(体积分数)乙醇浸泡10min，再用0.1％(体积分数)升汞浸泡30min；进行表面除菌。用大量无菌水洗去种子表面的溶液，用无菌滤纸吸去种子表面的水分。将种子置于成熟胚愈伤诱导培养基(培养基配方见下文)平板上，用Parafilm膜封闭平皿边缘，于26℃温箱内避光培养。大约15天后，小心取下长出的愈伤组织，转移到成熟胚继代培养基(培养基配方见下文)上，同样条件继续进行培养。每两周需进行一次继代培养。用于转化时，需挑选继代培养5天左右、呈淡黄色的颗粒状愈伤组织。

其中，所需要的培养基配方如下：

a)NB基本培养基：

b)成熟胚愈伤诱导培养基和继代培养基：

2、农杆菌的培养

将步骤一获得的重组表达载体pCambia2300-Actin-MYC-OsAGO18电转入农杆菌EHA105中，筛选能够在加了抗生素利福平和卡那霉素的LB平板上生长，而且以引物AGO18-PCR-F和AGO18-PCR-R进行PCR扩增，得到793bp的PCR产物的为阳性菌，将其命名为EHA105/pCambia2300-Actin-MYC-OsAGO18。

AGO18-PCR-F：5’-CCCAACTATTATATTTGGTGCTGAT-3’(序列1的第2475-2499位)；

AGO18-PCR-R：5’-CTAGCAAAAGAACATGGACTTTTTC-3’(序列1的第3243-3267位的反向互补序列)。

将重组农杆菌EHA105/pCambia2300-Actin-MYC-OsAGO18在含有抗生素(50mg/LKan，50mg/LRif)的LB平板上划线，28℃培养2天。挑取单菌落接入液体LB培养基中，28℃振荡培养至OD₆₀₀约为0.5，加入乙酰丁香酮至终浓度100mM，得到用于转化水稻愈伤组织的农杆菌悬液。

3、水稻愈伤组织与农杆菌的共培养

将步骤1准备好的继代愈伤组织放入灭过菌的锥形瓶中，倒入步骤2获得的农杆菌悬液使之浸没愈伤组织。室温放置20min，并不时轻轻晃动使愈伤组织与菌液充分接触。用无菌的镊子轻轻取出愈伤组织，放于无菌滤纸上吸去多余的菌液，转移到铺有一层无菌滤纸的共培养培养基(培养基配方见下文)平板上。28℃暗培养2-3天，得到经过共培养的愈伤组织。

4、抗性愈伤组织的筛选与分化

将经过共培养的愈伤组织用适量无菌水清洗，除去表面残余的农杆菌，放在筛选培养基(培养基配方见下文)上，26℃避光培养进行筛选，两周后转移到新的筛选培养基上继续筛选两周。挑选经过两轮筛选后状态较好的愈伤组织，将其转移到分化培养基(培养基配方见下文)平板上，先避光培养3天，然后再转至光照培养箱中(15h/day)进行光照培养。一个月后可见分化出的小苗。当分化的小苗长至约2cm时，将其转移到锥形瓶中的生根培养基(培养基配方见下文)上，继续培养两周左右。选择长势较好、根系发达的小苗，用自来水洗去根部的培养基后移栽入土壤中，收取种子，得到T₀代转OsAGO18基因水稻种子。

其中所需要的培养基配方如下：

a)共培养培养基：

(注意：液体共培养培养基中不添加2,4-D)

b)筛选培养基：

c)分化培养基：

d)生根培养基：

采用同样的方法，将pCam23ACT:OCS空载体转入野生型水稻中，得到转空载体水稻，作为对照。

三、OsAGO18基因过表达的水稻抗RDV能力增强。

1、OsAGO18转基因水稻的鉴定

将步骤二获得的T₀代转OsAGO18基因水稻种子播种，获得T₁代水稻幼苗，从中随机选取6株，编号为1#、2#、3#、4#、5#和6#。取部分叶片，在液氮中研磨，一部分做半定量RT-PCR，一部分做Westernblot鉴定。

(1)半定量RT-PCR

从T₁代转OsAGO18基因水稻幼苗中提取RNA，并反转录得到cDNA。以cDNA为模板，以OsAGO18-F/OsAGO18-R引物对进行半定量RT-PCR反应。同时设置未转基因的野生型水稻(Oryza.sativaL.)品种日本晴以及步骤二获得的转空载体水稻作为对照。

引物序列如下：

OsAGO18-F：5’-TGTTCGTCCAGGCACAGTAG-3’(序列1的第2901-2920位)；

OsAGO18-R：5’-GCGGTGAAGTTGTTGTCGTC-3’(序列1的第3022-3041位的反向互补序列)。

以Actin为内参，引物如下：

Actin-RT-F：5’-CTTCGTCTCGACCTTGCTGGG-3’；

Actin-RT-R：5’-GAGAAACAAGCAGGAGGACGG-3’。

结果如图6中A所示，由图可见，与未转基因的野生型水稻(Oryza.sativaL.)品种日本晴相比，6个T₁代转OsAGO18基因水稻植株中OsAGO18基因的表达量更高。而转空载体水稻植株中OsAGO18基因的表达量与未转基因的野生型水稻(Oryza.sativaL.)品种日本晴相比基本一致，无统计学意义。

RT-PCR检测中OsAGO18mRNA明显积累的株系作为RT-PCR阳性苗。

(2)Westernblot鉴定

具体操作参见实施例1步骤一进行。

结果如图6中B所示，由图可见，与未转基因的野生型水稻(Oryza.sativaL.)品种日本晴相比，6个T₁代转OsAGO18基因水稻植株中OsAGO18蛋白的表达量更高。而转空载体水稻植株中OsAGO18蛋白的表达量与未转基因的野生型水稻(Oryza.sativaL.)品种日本晴相比基本一致(含量较低，基本检测不到OsAGO18的表达)，无统计学意义。

Westernblot检测结果中，蛋白条带较野生型明显积累(野生型水稻在非侵染条件下，基本检测不到OsAGO18的表达)的株系为westernblot阳性苗。

2、RDV侵染OsAGO18过表达水稻后，水稻发病率降低，病症减轻

以带RDV病毒的叶蝉侵染同时期(分蘖期)的未转基因的野生型水稻品种日本晴以及经步骤1鉴定阳性的T₁代转OsAGO18基因水稻株系1#、2#和5#，以及步骤二获得的转空载体水稻(实验组)。以无毒叶蝉侵染相应的水稻作为对照组。

2周后检测水稻发病情况(水稻发病情况鉴定参照文献《稻麦主要病毒病识别与控制》一书中第二章)，分别统计实验组与对照组的发病率。统计发病率的同时，观察水稻发病后的表型在不同的实验组之间的区别。

实验组中，各水稻品系的发病率统计结果如表2所示。由表可见，RDV病毒侵染T₁代转OsAGO18基因水稻株系1#、2#和5#后水稻植株的发病率均显著低于RDV病毒侵染未转基因的野生型水稻品种日本晴后水稻植株的发病率。进一步，各水稻品系接种RDV病毒后的病症图如图7所示，RDV侵染OsAGO18转基因阳性株系后，病症较野生型水稻明显变轻，沿叶脉分布的白斑减少，矮缩减弱，发病的叶片减少。与之相对应，RDV侵染ago18突变体水稻后，沿叶脉分布的白斑明显增多，叶片浓绿，植株矮缩明显。

表2RDV侵染OsAGO18过表达水稻后发病率统计

水稻品系	Na	Db	Pc
				WT	30	23	76.7％
AGO18OE-5#	30	4	13.3％
				AGO18OE-2#	30	7	23.3％
AGO18OE-1#	30	5	16.7％

注：a:被观测的水稻总株数；b:侵染两周后具发病表型的水稻株数；c:发病水稻占全部被侵染水稻的比例；AGO18OE-5#、AGO18OE-2#和AGO18OE-1#分别表示被RDV侵染的转基因水稻株系5#、2#和1#。

以上实验结果表明，OsAGO18过表达后增强了植物的抗病性，使水稻不易被RDV侵染。

Claims (10)

1.OsAGO18基因或其编码蛋白或含有该基因的重组载体在如下a1)或a2)中的应用：

a1)调控植物对水稻矮缩病毒或其同科的病毒的抗性；

a2)选育对水稻矮缩病毒或其同科病毒引发的病毒病害抗性增强的植物品种；

所述OsAGO18蛋白的编码基因是如下1)至4)中任一所述的DNA分子：

1)序列表中序列1所示的DNA分子；

2)序列表中序列3所示的DNA分子；

3)在严格条件下与1)或2)所限定的DNA分子杂交且编码所述蛋白质的DNA分子；

4)与1)-3)任一限定的DNA分子具有90％以上同源性且编码所述蛋白质的DNA分子。

2.培育对水稻矮缩病毒或其同科病毒引发的病毒病害抗性增强的转基因植物的方法，包括如下步骤：

a)向目的植物中导入由如下1)～4)项中任何一项所述的OsAGO18蛋白的编码基因，得到表达所述编码基因的转基因植物：

1)序列表中序列1所示的DNA分子；

2)序列表中序列3所示的DNA分子；

3)在严格条件下与1)或2)所限定的DNA分子杂交且编码所述蛋白质的DNA分子；

4)与1)-3)任一限定的DNA分子具有90％以上同源性且编码所述蛋白质的DNA分子，

b)从步骤a)所得转基因植物中得到与所述目的植物相比，对水稻矮缩病抗性增强的转基因植物。

3.根据权利要求1所述的应用，或权利要求2所述的方法，其特征在于：所述OsAGO18蛋白由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成或由序列表中序列4所示的氨基酸序列组成。

4.根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于：所述编码基因是通过含有所述蛋白质的编码基因的重组表达载体导入所述目的植物中的。

5.根据权利要求2-4中任一项所述的方法，其特征在于：所述重组表达载体中启动所述编码基因转录的启动子为Actin启动子。

6.根据权利要求1所述的应用或权利要求2-5中任一项所述的方法，其特征在于：所述同科的病毒选自水稻黑条矮缩病毒、玉米粗缩病毒或水稻条纹病毒。

7.根据权利要求1-6中任一所述的应用或方法，其特征在于：所述植物为单子叶植物或双子叶植物。

8.根据权利要求7所述的应用或方法，其特征在于：所述单子叶植物为禾本科植物。

9.根据权利要求8所述的应用或方法，其特征在于：所述禾本科植物为水稻或玉米，优选水稻品种中花11、秀水11、日本晴。

10.根据权利要求2-9中任一所述的应用或方法，其特征在于：水稻矮缩病毒或其同科病毒引发的病毒病害选自水稻矮缩病、水稻黑条矮缩病或水稻条纹叶枯病。