CN109641937B - OsAO基因在提高水稻对水稻条纹病毒及水稻黑条矮缩病毒或其同科病毒抗性中的应用 - Google Patents

Abstract

提供了OsAO基因或其编码蛋白或含有所述编码基因的重组载体在调控植物抗水稻条纹叶枯病、水稻黑条矮缩病或由水稻黑条矮缩病毒同科病毒引发的其他水稻和玉米病毒病害中的应用；所述OsAO基因的核苷酸序列具体为序列表中的序列1或2，所述基因编码的OsAO蛋白的氨基酸序列具体为序列表中的序列4。

Description

OsAO基因在提高水稻对水稻条纹病毒及水稻黑条矮缩病毒或 其同科病毒抗性中的应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及OsAO基因在提高水稻对水稻条纹叶枯病及水稻黑条矮缩病抗性中的应用。

背景技术

水稻条纹叶枯病是由灰飞虱为媒介传播的，由水稻条纹病毒(Rice StripeVirus，RSV)引起的病毒病，俗称水稻上的癌症。病株常枯孕穗或穗小畸形不实。水稻苗期发病之初在心叶基部呈现断续的黄绿色或黄白色短条斑，以后病斑增大合并，扩展成与叶脉平行的黄绿色条纹，条纹间仍保持绿色；拔节后发病在剑叶下部出现黄绿色条纹，各类型稻均不枯心，但抽穗畸形，结实很少。

水稻条纹病毒(Rice Stripe Virus，RSV)，属纤细病毒属(Tenuivirus)的代表种。该病毒具有独特的基因组结构和编码策略，基因组共有四条单链RNA，其中RNA2、RNA3和RNA4均采取双义编码策略，即在RNA的正义链和互补链均有ORF，都可以编码蛋白。RNA2编码NS2和NSvc2蛋白，其功能不详；RNA3编码外壳蛋白NCP和RNA沉默抑制子NS3；RNA4编码的SP为病害特异蛋白，NSvc4为移动蛋白；RNA1只编码一个RdRP蛋白。

水稻黑条矮缩病由灰飞虱为媒介传播，由水稻黑条矮缩病毒(Rice black-streaked dwarf virus，RBSDV)引起，主要影响东亚地区的水稻。该病可发生在水稻的整个生长周期内，严重影响水稻的产量。该病在秧田期会导致感病秧苗叶片僵硬直立，叶色墨绿，根系短且少，生长发育停滞；在分蘖期，感病植株会明显矮缩，甚至早枯死亡；在拔节期，感病植株会严重矮缩，发生高位分蘖、茎节倒生、有不定根，茎秆基部表面有纵向瘤状乳白色凸起；在穗期，感病植株会严重矮缩，不抽穗或抽包颈穗，穗小颗粒少，影响水稻产量。

水稻黑条矮缩病毒(Rice black-streaked dwarf virus，RBSDV)，属斐济病毒属，该病毒同时可以侵染玉米和小麦，引发玉米和小麦病毒病害。RBSDV的病毒基因组由10条线性dsRNAs组成，由大到小分别命名为S1～S10。其中S5,S7和S9含有两个ORF，其余只含有一个ORF。该病毒核心颗粒由四个蛋白组成，P1(RNA依赖的RNA聚合酶)，P2(可能是一个核心蛋白)，P3(加帽酶)and P8(小核心蛋白),分别由S1,S2,S3 and S8,编码。P4和P10是两个由S4和S10编码的外层蛋白，P6是一个RNA沉默抑制子可通过与P9-1相互作用加强病症，P7-2在病毒侵染中起作用。侵染玉米引起玉米严重矮化的病毒玉米粗缩病毒(maiz rough dwarfvirus,MRDV)与RBSDV同属呼肠孤病毒科，斐济病毒属，基因组为10条双链RNA(Azuhata,F.,Uyeda,I.,Kimura,I.and Shikata,E.(1993).Close similarity between genomestructures of rice black-streaked dwarf and maize rough dwarfviruses.J.Gen.Virol.74,1227-1232)。玉米粗缩病的病症与水稻黑条矮缩病的病症十分相似，在欧洲、南美洲、东南亚以及澳洲等发病严重的地区造成玉米大量减产。

水稻条纹病毒(RSV)和水稻黑条矮缩病毒(RBSDV)是严重危害我国水稻生产的主要病毒。由于对水稻病毒和寄主之间的相互作用机制缺乏系统了解，因而长期以来，尚无法设计出一些能彻底控制病毒病危害的策略。自上世纪七十年代中期以来，分子生物学快速发展，使人们对于病毒基因结构、病毒致病及植物抗病机理等有了一定的了解，并启发了利用基因工程手段防治病毒病的一系列策略，如利用外壳蛋白介导的抗性及利用转录后的基因沉默介导的抗性等。随着病毒全基因组序列的分析完成、部分病毒重要功能基因的解析、水稻高效转基因技术的成熟应用与突变体库的建成以及病毒与寄主相互作用机制，尤其是对转录后基因沉默机制的认识，为从转基因分子水平鉴定病毒基因致病性和其与寄主分子相互作用，以及从基因工程水平实施高效抗病育种提供了创新可能。

活性氧(ROS)是在植物体内普遍存在的，在植物的正常生长和受到环境胁迫的情况下都会产生ROS产生。在植物代谢过程中产生的ROS包括氧负离子、过氧化氢和羟基自由基。在植物体内，正常情况下ROS的产生部位分布极为广泛包括叶绿体、线粒体、内质网、质膜、过氧化物酶体等，这是因为ROS在正常的氧化还原过程中就会有微量产生，这时的ROS在植物体内充当着第二信使的角色并且会参与到植物细胞一系列的生理过程如：气孔开闭、种子萌发、细胞凋亡等,但是当植物受到环境胁迫时则会产生大量ROS，过量的ROS对于植物有极大危害，一方面ROS会造成植物体内蛋白、脂类等物质的破坏，另一方面则会诱导细胞溶解乃至死亡,因此在植物体内ROS的产生与清除处于一种动态过程，只有及时清除植物体内多余的ROS才能确保植物的正常发育。

抗坏血酸氧化酶(ascorbate oxidase，AO)是含有铜的一种酶，定位于细胞质中并且结合细胞壁，可以氧化抗坏血酸，并且与其它氧化还原反应偶联，因此可以通过金属离子的氧化与还原反应参与到ROS的产生与清除。AO参与到ROS的过程如下：AO可以将抗坏血酸氧化为单脱氢抗坏血酸(MDHA),而抗坏血酸也可以和过氧化氢在过氧化氢酶的作用下产生水，并且此过程伴随着NAD(P)H和NAD(P)的电子传递过程，ROS的产生与清除是由很多个循环参与其中并且这些循环相互关联，AO在这一过程中发挥了重要作用。抗坏血酸氧化酶除了受到Cu2+影响外，Ca2+,Al3+,K+也会影响抗坏血酸氧化酶的活性，并且对酶的活性有着随浓度升高抑制-升高-抑制的变化趋势。

发明内容

本发明的目的是提供一种OsAO蛋白及其编码基因在调控植物抗水稻条纹叶枯病、水稻黑条矮缩病或由水稻黑条矮缩病毒同科病毒引发的其他水稻和玉米病毒病害中的应用。

本发明所提供的应用，具体为如下A或B：

A：蛋白质在如下a1)或a2)中的应用：

a1)调控植物对水稻条纹叶枯病、水稻黑条矮缩病或由水稻黑条矮缩病毒同科病毒引发的其他病毒病害的抗性；

a2)选育对水稻条纹叶枯病、水稻黑条矮缩病或由水稻黑条矮缩病毒同科病毒引发的水稻或玉米病毒病害抗性增强的植物品种；

所述蛋白质由序列表中序列4所示的氨基酸序列组成或具有与序列4相同生物活性且与该序列4的氨基酸一致性在95％以上，优选99％以上的氨基酸序列。这里所述的生物活性是指增强植物对水稻条纹叶枯病、水稻黑条矮缩病或由水稻黑条矮缩病毒同科病毒引发的水稻或玉米病毒病害抗性。

B：蛋白质的编码基因或含有所述编码基因的重组载体，在如下a1)或a2)中的应用：

a1)调控植物对水稻条纹叶枯病、水稻黑条矮缩病或由水稻黑条矮缩病毒同科病毒引发的水稻或玉米病毒病害的抗性；

a2)选育对水稻条纹叶枯病、水稻黑条矮缩病或由水稻黑条矮缩病毒同科病毒引发的水稻或玉米病毒病害抗性增强的植物品种；

所述蛋白质的编码基因，是如下1)至4)中任一所述的DNA分子：

1)序列表中序列1所示的DNA分子；

2)序列表中序列2所示的DNA分子；

3)在严格条件下与1)或2)所限定的DNA分子杂交且编码所述蛋白质的DNA分子；

4)与1)-3)任一限定DNA分子具有90％以上同源性且编码所述蛋白质的DNA分子。

其中，由序列表中序列4所示的氨基酸序列组成蛋白质命名为OsAO蛋白(编码基因为序列1，命名为OsAO基因组序列，或序列2，命名为AO Res基因组序列)。

在本发明中，以上所有a1)中的所述调控植物对水稻条纹叶枯病、水稻黑条矮缩病或由水稻黑条矮缩病毒同科病毒引发的其他水稻和玉米病毒病害病的抗性均具体体现在：促进所述蛋白质或其编码基因的表达，则所述植物对水稻条纹叶枯病、水稻黑条矮缩病或由水稻黑条矮缩病毒同科病毒引发的其他病毒病害抗性增强。以上所有a2)中的所述选育对水稻条纹叶枯病、水稻黑条矮缩病或由水稻黑条矮缩病毒同科病毒引发的其他水稻和玉米病毒病害增强的植物品种的方法，均具体可包括将所述蛋白质或其编码基因的表达量较高的植株作为亲本进行杂交的步骤。

本发明的再一个目的是提供一种培育对水稻条纹叶枯病、水稻黑条矮缩病或由水稻黑条矮缩病毒同科病毒引发的其他水稻和玉米病毒病害抗性增强的转基因植物的方法。

本发明所提供的培育对水稻条纹叶枯病、水稻黑条矮缩病或由水稻黑条矮缩病毒同科病毒引发的其他水稻和玉米病毒病害抗性增强的转基因植物的方法，具体可包括如下步骤：

a)向目的植物中导入蛋白质的编码基因所示，得到表达所述编码基因的转基因植物；

b)从步骤a)所得转基因植物中得到与所述目的植物相比，对水稻条纹叶枯病、水稻黑条矮缩病或由水稻黑条矮缩病毒同科病毒引发的水稻或玉米病毒病害抗性增强的转基因植物，

其中，所述蛋白质的编码基因，是如下1)至4)中任一所述的DNA分子：

1)序列表中序列1所示的DNA分子；

2)序列表中序列2所示的DNA分子；

3)在严格条件下与1)或2)所限定的DNA分子杂交且编码所述蛋白质的DNA分子；

4)与1)-3)任一限定DNA分子具有90％以上同源性且编码所述蛋白质的DNA分子。

上述严格条件例如可为用6×SSC，0.5％SDS的溶液，在65℃下杂交，然后用2×SSC，0.1％SDS和1×SSC，0.1％SDS各洗膜一次。

其中，序列1由5472个核苷酸组成，其中第1-5472位为所述OsAO基因的编码序列包含5’UTR、外含子、内含子和3’UTR，其中第3741-3761所述OsAO基因的miR528 target序列，即序列3所示序列的靶序列，编码序列表中序列4所示的蛋白质；序列2由5472个核苷酸组成，1-5472位为所述OsAO基因的编码序列包含5’UTR、外含子、内含子和3’UTR，其中第3741-3761所述OsAO基因的miR528 target序列突变后的序列，即不再是序列3所示序列的靶序列。序列3由21个核苷酸组成，为成熟miR528序列；序列4由633个氨基酸组成，为OsAO基因编码的蛋白序列；序列5由15个氨基酸组成，是序列4所示蛋白的多肽位点；序列6由3000个核苷酸组成，是所述基因OsAO的内源启动子。

本领域的技术人员懂得，可以通过点突变、添加或缺失基因序列中的一个或多个碱基，影响该基因编码的蛋白功能。因此，本发明应该被理解为包括了对OsAO基因进行的上述变异。OsAO基因的序列不局限于序列表中序列1所示，还包括将其编码蛋白功能区中某氨基酸残基对应的任一密码子进行突变的DNA序列。主要是将有功能的氨基酸残基突变成一般被认为无特殊功能的丙氨酸。

在所述方法中，所述蛋白质的编码基因是通过含有所述蛋白质的编码基因的重组表达载体导入所述目的植物中的。

所述重组表达载体可用现有的植物表达载体构建。所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等，如pCAMBIA3301、pCAMBIA2300、pCAMBIA2301、pCAMBIA1300、pCAMBIA 1301、pWM101、pGreen0029、pBI121、pBin19、pCAMBIA1301-UbiN等或其它衍生植物表达载体。所述植物表达载体还可包含外源基因的3’端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3’端。使用所述基因构建重组表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型、组成型、组织特异型或诱导型启动子，例如花椰菜花叶病毒(CAMV)35S启动子、泛素基因Ubiquitin启动子(pUbi)、胁迫诱导型启动子Rd29A等，它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建重组表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用重组表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因、具有抗性的抗生素标记物或是抗化学试剂标记基因等。也可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。

在本发明中，所述重组表达载体中启动所述编码基因转录的启动子具体为OsAO基因的内源启动子，序列6所示。

更为具体的，所述重组表达载体为将所述编码基因及其启动子构建到pCam1300表达载体上得到的重组质粒。在该重组表达载体中，启动所述编码基因转录的启动子为所述基因OsAO的内源启动子，序列6所示。

在上述方法中，将携带有所述编码基因的所述重组表达载体导入所述目的植物，具体可为：通过农杆菌介导法、基因枪法、电击法、花粉管导入法、脂质体融合法以及其他任意可将质粒导入的方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物组织培育成植株。

在上述应用或方法中，所述植物可为单子叶植物或双子叶植物。

所述单子叶植物为禾本科植物。

在本发明中，所述植物为水稻。进一步，水稻品种最好为对RSV和RBSDV敏感的品种，如中花11、dongjin、日本晴(NPB)、武育粳3号等。

更加具体的，在本发明的一个实施例中，所述植物的背景为日本晴，即如未做具体说明，所用转基因材料的背景为日本晴水稻。

在上述应用或方法中，所述水稻条纹叶枯病的病原菌具体为水稻条纹病毒(RiceStripe Virus)，所述水稻黑条矮缩病的病原菌具体为水稻黑条矮缩病毒(Rice black-streaked dwarf virus)。

在本发明中所用的miR528OE水稻以及mir528突变体水稻均来自中科院遗传发育所曹晓峰院士课题组。

实验证明，本发明发现OsAO是一个能够被RSV和RBSDV病毒诱导的抗病基因，在水稻条纹病毒(RSV)及水稻黑条矮缩病毒(RBSDV))侵染侵染过表达OsAO转基因水稻后，病毒各个RNA链积累量明显低于野生型水稻，病症也较轻，发病率下降，表明OsAO基因具有提高水稻抗病毒的能力。

本发明发现OsAO是一个能够被病毒特异性诱导的抗病基因，在水稻条纹病毒(RSV)、水稻黑条矮缩病毒(RBSDV),玉米粗缩病毒(maiz rough dwarf virus)侵染野生型日本晴水稻后，OsAO蛋白表达量明显积累。鉴于上述水稻黑条矮缩病毒与玉米粗缩病毒均属植物呼肠孤病毒科，文中实例以水稻条纹病毒和水稻黑条矮缩病毒为例，当病毒侵染水稻miR528OE水稻即，AO表达较少的水稻株系后，病毒粒子积累量较水稻野生型明显增加，病症也更加严重，基本无产量；相反，RSV和RBSDV侵染过表达OsAO转基因水稻后，病毒粒子积累量明显低于野生型水稻，病症也较轻，发病率下降，表明OsAO基因具有提高水稻抗病毒的能力。鉴于水稻黑条矮缩病毒同时能够侵染玉米，引起玉米粗缩病，实验结果表明AO蛋白或其编码基因能够提高玉米抗由RBSDV、MRDV等引起的玉米粗缩病的能力。

附图说明

图1为OsAO的mRNA在水稻条纹病毒和水稻黑条矮缩病毒侵染后积累的实验结果。Realtime PCR分析OsAOmRNA在RSV和RBSDV侵染后被诱导。其中，Mock表示未被RSV或RBSDV侵染的野生型水稻品种日本晴；RSV表示被RSV侵染发病的野生型水稻品种日本晴，RBSDV表示被RBSDV侵染发病的野生型水稻品种日本晴；内参基因为OsEF-1α，所述结果为相对于Mock的表达，即定义Mock表达量为1。

图2为OsAO蛋白在水稻条纹病毒和水稻黑条矮缩病毒侵染后积累的实验结果。其中，Mock表示未被RSV或RBSDV侵染的野生型水稻品种日本晴；RSV表示被RSV侵染发病的野生型水稻品种日本晴；RBSDV表示被RBSDV侵染发病的野生型水稻品种日本晴；Actin为内参蛋白。

图3为AO在病毒侵染后相对酶活性测定结果。其中，Mock表示未被RSV或RBSDV侵染的野生型水稻品种日本晴；RSV表示被RSV侵染发病的野生型水稻品种日本晴；RBSDV表示被RBSDV侵染发病的野生型水稻品种日本晴；所述结果以Mock中AO酶活为100％。

图4为NPB、pAO:AO和pAO:AO-Res转基因水稻株系在RSV侵染后OsAO的mRNA相对表达量。NPB为野生型水稻日本晴，pAO:AO和pAO:AO-Res为日本晴背景的转基因水稻。未受侵染水稻中pAO:AO和pAO:AO-Res株系相对于NPB而言OsAO表达量显著增强。RSV侵染后OsAO表达量显著上升。M代表未受病毒侵染的水稻，R代表受RSV侵染的水稻。内参基因为OsEF-1α，所述结果为相对于Mock的表达，即定义Mock表达量为1。

图5为NPB、pAO:AO和pAO:AO-Res转基因水稻株系在RSV侵染后OsAO的相对酶活性。NPB为野生型水稻pAO:AO和pAO:AO-Res为NPB背景的转基因水稻。未受侵染水稻中pAO:AO和pAO:AO-Res株系相对于NPB而言OsAO活性显著增强。RSV侵染后OsAO活性显著上升。M代表未受病毒侵染的水稻，R代表受RSV侵染的水稻。

图6为NPB、pAO:AO和pAO:AO-Res转基因水稻株系在RSV侵染后OsAO蛋白的相对表达量。NPB为野生型水稻，pAO:AO和pAO:AO-Res为NPB背景的转基因水稻。未受侵染水稻中pAO:AO和pAO:AO-Res株系相对于NPB而言OsAO蛋白表达量显著增强。RSV侵染后OsAO蛋白表达量显著上升。M代表未受病毒侵染的水稻，R代表受RSV侵染的水稻。以α-Tubulin为内参蛋白。

图7为实施例3中各水稻品系接种RSV病毒后的病症图。其中，Mock表示未被RSV侵染的野生型水稻品种日本晴；RSV-infected表示被RSV侵染发病的水稻品NPB为野生型水稻，pAO:AO和pAO:AO-Res为NPB背景的转基因水稻。pAO:AO和pAO:AO-Res侵染RSV病毒后的症状相对于野生型水稻NPB明显减弱。

图8为实施例3中各水稻品系接种RSV病毒后的RSV病毒的积累量。Mock表示未被RSV侵染的野生型水稻品种日本晴；RSV-infected表示被RSV侵染发病的水稻。NPB为野生型水稻，pAO:AO和pAO:AO-Res为NPB背景的转基因水稻。侵染RSV病毒后pAO:AO和pAO:AO-Res的RSV病毒四条RNA链的积累相对于野生型水稻NPB减少。

图9为实施例3中各水稻品系接种RBSDV病毒后的病症图。Mock为未受RBSDV侵染的水稻。RBSDV-infected 为RBSDV侵染的水稻。DJ和NPB为野生型水稻，miR528OE为miRNA528的过表达转基因水稻，背景为NPB。mir528为microRNA528的突变体水稻，水稻背景为DJ；pAO:AO-Res为NPB背景的转基因水稻。

图10为实施例3中各水稻品系接种RBSDV病毒后四条代表性病毒RNA链的积累量。DJ和NPB为野生型水稻，miR528OE为miRNA528的过表达转基因水稻，背景为NPB。mir528为miRNA528的突变体水稻，水稻背景为DJ；pAO:AO-Res为NPB背景的转基因水稻。S1，S2，S6，S10为RBSDV的四条代表性病毒链。内参基因为OsEF-1α，所述结果为相对于NPB的表达，即定义NPB-RBSDV中各个链的表达量为1。

图11为实施例3中各水稻品系接种RBSDV病毒后OsAO的mRNA相对表达量。NPB、DJ为野生型水稻，miR528OE为microRNA528的过表达转基因水稻，背景为NPB。mir528为microRNA528的突变体水稻，水稻背景为DJ；pAO:AO-Res为NPB背景的转基因水稻。M代表未受病毒侵染的水稻，R代表受RBSDV侵染的水稻。

图12为实施例3中各水稻品系接种RBSDV病毒后OsAO的相对活性。DJ和NPB为野生型水稻，miR528OE为miRNA528的过表达转基因水稻，背景为NPB。mir528为miRNA528的突变体水稻，水稻背景为DJ；pAO:AO-Res为NPB背景的转基因水稻。未受侵染水稻中pAO:AO-Res和mir528水稻株系相对于野生型而言OsAO酶活性显著增强，miR528OE水稻株系相对于野生型而言OsAO酶活性显著降低。RBSDV侵染后OsAO的酶活性显著上升。M代表未受病毒侵染的水稻，R代表受RBSDV侵染的水稻。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

水稻(Oryza.sativa L.)品种日本晴：即日本晴水稻(Oryza sativaL.japonica.cv.Nipponbare)，参考文献：水稻品种“日本晴”.农业科技通讯，1973年02期。公众可从北京大学获得。

水稻(Oryza.sativa L.)品种DJ,即Dongjin水稻(Oryza sativaL.japonica.cv.Dongjin)为突变体研究所用到的水稻T-DNA插入突变体的野生型对照，来自韩国水稻突变体库RISD(http://www.postech.ac.kr/life/pfg/risd/)。

水稻(Oryza.sativa L.)品种武育粳3号：为水稻条纹病毒(RSV)易感品种，参考文献：武育粳3号土传病害发生特点与防治技术,江苏农业科学，1996年01期。公众可从北京大学。

水稻(Oryza.sativa L.)品种镇稻88：为水稻条纹病毒(RSV)抗感品种。该品种记载于“水稻新品种——镇稻88，农业科技通讯，1998年第05期”一文，公众可从北京大学获得。

水稻条纹病毒(Rice Stripe Virus，RSV)：记载于“蔡小卫,赵俊玲,邵英,桂青清,刘芳.灰飞虱传播水稻条纹病毒的研究综述.中国植保导刊，2011年09期”一文，公众可从北京大学获得。

pAO:AO和pAO:AO-Res转基因水稻背景为日本晴，记载于遗传发育所曹晓峰课题组杨荣新博士论文《水稻miRNA528功能研究》，2012.10，公众可从北京大学获得。

水稻黑条矮缩病毒(Rice Black-Streaked Dwarf Virus，RBSDV)：记载于“陈声祥，张巧艳.我国水稻黑条矮缩病与玉米粗缩病研究进展.植物保护学报，2005年第32卷第1期”一文，公众可从北京大学获得。

农杆菌EHA105：记载于“Zhu et al.,2005.The Rice Dwarf Virus P2 Proteininteracts with ent-Kaurene Oxidases in vivo,leading to reduced biosynthesisof Gibberellins and rice dwarf symptoms.Plant Physiology.139:1935-1945.”一文，公众可从北京大学获得。

pCam1300载体：记载于“Jianguo Wu &Zhirui Yang et al.,2015.Viral-inducible Argonaute18 confers broad-spectrum virus resistance in rice bysequestering a host microRNA.Elife.2015Feb 17；4.”一文，公众可从北京大学获得。

实施例1、发现OsAO基因能够被水稻条纹病毒和水稻黑条矮缩病毒诱导表达

本实施例中所涉及的OsAO基因来源于水稻(Oryza.sativa L.)，OsAO基因的基因组编码序列如序列表中序列1所示，序列1由5472个核苷酸组成；序列1编码序列表中序列4所示的蛋白质，序列4由633个氨基酸残基组成。另外，pAO:AO-Res转基因株系的OsAO基因的编码序列为序列2所示，编码蛋白序列如序列4所示。

一、OsAO基因mRNA在水稻条纹病毒侵染后积累

取被水稻条纹病毒(RSV)及水稻黑条矮缩病毒侵染发病的野生型水稻(Oryza.sativa L.)品种日本晴和对照组水稻(未被水稻条纹病毒侵染的野生型水稻品种日本晴)各0.5g，在液氮中研磨后，依照Invitrogen公司的TRIzol Reagent说明书(Invitrogen Trizol Reagent，cat No.15596-018)提取总RNA。测定总RNA浓度后，取10μg总RNA，按照RQ1 Dnase(Promega，货号：M610A)的说明书对总RNA中的水稻基因组DNA进行消化。消化反应体系：总RNA10μg，10×Dnase缓冲液10μl，DNase10μl，DEPC水补足100μl。将整个消化反应体系于37℃孵育35min。孵育后向体系中加入4μl RQ1 DNase终止反应液，65℃孵育10min，使DNase灭活。

消化基因组DNA后，再利用氯仿抽提法浓缩总RNA，测定RNA浓度，取2μg RNA参照Invitrogen公司的SuperScript II逆转录酶进行反转录，所用引物为16个核苷酸的Oligod(T)引物，具体方法参见invitrogen M-MLV Reverse Transcriptase(货号：28025-021)。以反转录获得水稻cDNA为模板，利用realtime PCR的方法对OsAO基因的转录水平进行检测，实验方法参照TOYOBO

Green Realtime PCR Master Mix(货号QPK-201)说明书，引物为：

AO-qRT-F：5’-CGAGAACGTGGAGACCTGCGTCGA-3’；

AO-qRT-R：5’-CCACCACCGTCATCTTGTGCCCTTG-3’。

内参基因为水稻EF，引物为：

OsEF-1a-F：5’-GCACGCTCTTCTTGCTTTCACTCT-3’；

OsEF-1a-R：5’-AAAGGTCACCACCATACCAGGCTT-3’。

数据处理方法，参照bio-rad公司CFX96型号实时定量荧光PCR仪自带软件CFXmanager^TM Software(Version2.1)。

结果如图1所示，可见在mRNA水平上，OsAOOsAO基因在RSV和RBSDV侵染水稻后明显富集，表明RSV和RBSDV侵染水稻后能够诱导OsAO基因的表达，使该基因的转录水平提高。

二、OsAO蛋白在水稻条纹病毒和水稻黑条矮缩病毒侵染的水稻中积累

以被水稻条纹病毒(RSV)及水稻黑条矮缩病毒(RBSDV)侵染发病的野生型水稻(Oryza.sativa L.)品种日本晴和对照组水稻(未被水稻条纹病毒和水稻黑条矮缩病毒侵染的野生型水稻品种日本晴)的叶片为实验材料，利用2×SDS上样缓冲液提取总蛋白，采用Western blot方法检测OsAO蛋白在两水稻中的积累情况。具体如下：

(1)SDS-PAGE电泳操作流程及注意事项参见《蛋白质的SDS－PAGE凝胶电泳》：

SDS-PAGE凝胶转膜：

待电泳结束后，取出凝胶玻璃板，用起胶器撬开玻璃板，将目的条带以外的多余的胶切掉，将要转膜的胶放入转膜buffer中。裁取比胶稍大一点的ECL膜，和两块厚滤纸，在转膜buffer中浸透，在半干转仪上，先放一张滤纸，再依次放ECL膜、蛋白胶、另外一张滤纸，放置过程中注意用玻璃棒赶走气泡。将转膜槽盖子盖好，设置转膜条件为恒压15V，转膜时间90min(根据蛋白大小确定转膜时间)；

1)转膜结束后取一方皿，倒入封闭液(用TBST配制的5％牛奶)，将膜放入方皿中，室温封闭1hr或4℃封闭过夜；

2)更换新的牛奶，加入相应的一抗(或直接用回收的一抗)，室温反应2hr或4℃过夜；

3)回收一抗，用TBST洗膜3～4次，每次5min；

4)最后一次倒掉TBST洗膜液，加入新的含相应二抗的牛奶，室温反应1hr；

5)TBST洗膜3～4次，每次5min；

6)将二抗上偶联的酶所对应的底物kit(Immobilon^TM Western：MILLIPORE上海贸易有限公司，货号：1305701)进行显影，加到膜上，反应1min后，将膜上多余液体吸尽，尽量不要让膜干掉，尽快用保鲜膜包好，放到暗夹中，用X光片曝光，显影，最后将好的片子扫描，保存。

(2)实验所需试剂：

1)2×SDS上样缓冲液10mL：甘油2Ml；溴酚蓝0.0202g；1MTris-HCl(pH6.8)1mL；β-巯基乙醇0.14mL；10％SDS 4mL；加ddH₂O至10mL，保存于-20℃。

2)转膜缓冲液1L：39mM甘氨酸：2.9g；Tris5.8g；SDS0.37g；甲醇：200ml。

3)碱性磷酸酶缓冲液100ml：100mM NaCl；5mM MgCl₂；100mM Tris-Cl pH9.5。

4)TBS-T 1L pH 7.6：Tris 2.42g；NaCl8g；Tween 20 1ml；水900ml；调pH后定容1L。

6)封闭液100ml：100ml TBS-T内加入5克脱脂奶粉。

Western blot实验以Actin蛋白为内参，其一抗为Actin单克隆抗体(鼠源，Sigma公司，货号：T6793)；二抗为鼠抗anti-mouse(Promega公司，货号：0000089661)。

实验结果如图2所示，OsAO蛋白在对照组水稻(未被水稻条纹病毒或水稻黑条矮缩病毒侵染的野生型水稻品种日本晴)中含量较低，但在被水稻条纹病毒(RSV)或水稻黑条矮缩病毒(RBSDV)侵染发病的野生型水稻(Oryza.sativa L.)品种日本晴中可以观察到OsAO蛋白的含量较高，说明OsAO蛋白也能在水稻条纹病毒(RSV)及水稻黑条矮缩病毒(RBSDV)侵染的条件下富集。

三、AO酶活在水稻条纹病毒及水稻黑条矮缩病毒侵染后酶活性增加

以被水稻条纹病毒(RSV)及水稻黑条矮缩病毒(RBSDV)侵染发病的野生型水稻(Oryza.sativa L.)品种日本晴和对照组水稻(未被水稻条纹病毒和水稻黑条矮缩病毒侵染的野生型水稻品种日本晴)的叶片为实验材料，测定AO的蛋白酶活方法如下：

1)抗坏血酸氧化酶提取液制备：

将100mg植物茎叶组织在液氮中研磨成粉末，加入1mL10mM PBS(pH6.5)溶解，在震荡混合仪上充分震荡。冰上放置20min，每5min震荡一次。4℃，15000g，20min离心，收集上清到新管。上清即是抗坏血酸氧化酶提取液，放置冰上备用。

2)抗坏血酸氧化酶活性测定：

取10μL提取液，加入80μL 10mM PBS(pH5.6)和10μL 2mM L-AsA(左旋抗坏血酸)溶液，混成mix，用Thermo全波长酶标仪测定A265吸光值。每个样品做3～5个重复，以不加提取液的组作为空白组，比较A265吸光值的减少量。消光系数为14.3cm-1mM-1。

实验结果如图3所示，OsAO蛋白在对照组水稻(未被水稻条纹病毒和水稻黑条矮缩病毒侵染的野生型水稻品种日本晴)中含量较低，但在被水稻条纹病毒(RSV)或水稻黑条矮缩病毒侵染发病的野生型水稻(Oryza.sativa L.)品种日本晴中可以观察到OsAO蛋白的酶活性较高，说明OsAO蛋白的酶活性能在水稻条纹病毒(RSV)及水稻黑条矮缩病毒(RBSDV)侵染的条件下增强。

实施例2、过表达OsAO的转基因水稻抗水稻条纹叶枯病能力增强

一、pAO:AO和AO-Res转基因水稻AO的积累量明显高于野生型水稻日本晴(NPB)

1、pAO:AO和AO-Res转基因水稻mRNA水平明显高于野生型

取pAO:AO和AO-Res转基因水稻以及野生型的部分叶片，在液氮中研磨后提取total RNA，进行实时定量荧光PCR检测AO的mRNA水平，方法参照实施例1步骤一进行。

引物序列如下

AO-qRT-F：5’-CGAGAACGTGGAGACCTGCGTCGA-3’；

AO-qRT-R：5’-CCACCACCGTCATCTTGTGCCCTTG-3’。

以Actin为内参，引物如下：

内参基因为水稻EF，引物为：

OsEF-1a-F：5’-GCACGCTCTTCTTGCTTTCACTCT-3’；

OsEF-1a-R：5’-AAAGGTCACCACCATACCAGGCTT-3’。

结果如图4所示，由图可见，与未转基因的野生型水稻(Oryza.sativa L.)品种日本晴相比，pAO:AO和AO-Res转基因水稻植株中OsAO基因的表达量更高，尤其pAO:AO-Res株系。

2、病毒侵染pAO:AO和AO-Res转基因水稻后AO的mRNA水平明显升高。

以带RSV或不带毒的灰飞虱侵染同时期(分蘖期)的未转基因的野生型水稻品种日本晴、pAO:AO和pAO:AO-Res转基因水稻株系，其中以无毒灰飞虱侵染相应的水稻作为对照组。取侵染后的以及对照组的pAO:AO和AO-Res转基因水稻以及野生型的部分叶片，在液氮中研磨后提取total RNA，进行实时定量荧光PCR检测AO的mRNA水平，方法参照实施例1步骤一进行。

结果如图4所示，由图可见，与未侵染的对照组水稻相比，侵染后的所有株系AO的mRNA水平均有所升高，尤其pAO:AO和AO-Res转基因水稻植株。

3、pAO:AO和AO-Res转基因水稻AO的相对酶活明显高于野生型水稻日本晴(NPB)

具体操作参见实施例1步骤三进行。

结果如图5所示，由图可见，与未转基因的野生型水稻(Oryza.sativa L.)品种日本晴相比，pAO:AO和AO-Res转基因水稻植株中OsAO相对酶活明显增高，尤其pAO:AO-Res株系。同时，病毒侵染后，OsAO的酶活也显著增加。

4、pAO:AO和AO-Res转基因水稻OsAO的相蛋白积累量明显高于野生型水稻日本晴(NPB)

具体操作参见实施例1步骤三进行。

结果如图6所示，由图可见，与未转基因的野生型水稻(Oryza.sativa L.)品种日本晴相比，pAO:AO和AO-Res转基因水稻植株中OsAO蛋白积累明显增多，尤其pAO:AO-Res株系。同时，病毒侵染后，AO的蛋白积累量也显著上调。

二、pAO:AO和AO-Res转基因水稻对RSV的抗性增强

1、RSV侵染pAO:AO和AO-Res转基因水稻后，病症减轻，发病率明显降低

以带RSV病毒的灰飞虱侵染同时期(分蘖期)的未转基因的野生型水稻品种日本晴、pAO:AO和pAO:AO-Res转基因水稻株系，以无毒灰飞虱侵染相应的水稻作为对照组。

2周后检测水稻发病情况(水稻发病情况鉴定参照文献《稻麦主要病毒病识别与控制》一书中第1.1章)，分别统计实验组与对照组的发病率。统计发病率的同时，观察水稻发病后的表型在不同的实验组之间的区别。

实验组中，各水稻品系的发病率统计结果如表1所示。由表可见，RSV病毒侵染pAO:AO和pAO:AO-Res转基因水稻株系后水稻植株的发病率均显著低于RSV病毒侵染未转基因的野生型水稻品种日本晴后水稻植株的发病率。进一步，各水稻品系接种RSV病毒后的病症图如图7所示，RSV侵染pAO:AO和pAO:AO-Res转基因水稻株系后，病症较野生型水稻明显变轻，退绿条纹减少，发病的叶片减少。

表1RSV侵染OsAO过和OsAO-Res表达水稻后发病率统计

注：a:被观测的水稻总株数；b:侵染两周后具发病表型的水稻株数；c:发病水稻占全部被侵染水稻的比例；d:昆虫介体无水稻品系偏好性对照。

以上实验结果表明，pAO:AO和pAO:AO-Res转基因水稻株系中OsAO基因的过表达增强了植物的抗病性，使水稻不易被RSV侵染。

2、Northern blot实验检测RSV基因组RNA链在发病水稻中的积累情况

以步骤1中获得的发病的野生型水稻品种日本晴、发病的pAO:AO和pAO:AO-Res转基因水稻、未发病的野生型水稻品种日本晴、未发病的pAO:AO和pAO:AO-Res转基因水稻为实验材料。分别取各水稻材料叶片2g，在液氮中研磨成粉末，依照Invitrogen公司的TRIzolReagent说明书(Invitrogen Trizol Reagent，cat No.15596-018)提取总RNA，测定浓度后，备用。

A.在通风厨内制备1.2％的琼脂糖甲醛变性胶120ml：87.6ml DEPC水中加入1.44g琼脂糖，微波炉加热使琼脂糖融化，后冷却至温度为60℃左右，后加入12ml 10×mops母液和20.4ml甲醛。摇晃混合均匀后，迅速倒入胶槽内并插入梳子。

B.在10-20μg的RNA样品中加入RNA loading buffer，100℃加热10分钟，后放置在冰上变性2-3min，上样前离心1-2min。

C.移液器将变性后的样品加入到冷却好的琼脂糖甲醛变性胶中，电泳液为1×mops溶液，电压100V，电泳3-4个小时。切胶并放于20×SSC溶液平衡10-20min。

D.电泳完毕用两种方法转膜：真空转移法和毛细管转移。毛细管转移的基本方法：在培养皿倒入20×SSC溶液，在玻璃板上搭上2-3层的滤纸形成纸桥。再把胶放在纸桥上，PDVF膜放在胶的上面，再放上3层滤纸以及10-25cm后的吸水纸。再上压重物，转膜24-36小时。真空转移的方法原理和毛细管转移一样，使用抽真空仪器，较快溶液转移的速度。

E.紫外交联：能量为1800对膜进行交联。之后可放80℃烤膜30min。处理好的膜可用亚甲基蓝染色，及检测之前步骤中RNA的有无降解及上样量是否一致。染色得到的rRNA的条带可用作control。

F.将膜放于含有预杂液(Sigma公司，货号为SLBG7228V)的杂交瓶，65℃条件下预杂1-2小时。

G.将标记好的探针(用于扩增四条RNA链探针的引物序列见下文)放置于100℃变性10min，后放置于冰上3min冷却。将其添加到预杂液中，65℃条件下杂交过夜(24小时以上)。标记探针随机引物法反应体系参照TAKARA公司探针标记试剂盒提供的方法(货号D6045)：

扩增四条RNA链探针所用的引物如下所示(5’-3’)：

RSV-RNA1-F：5’-GCACCCAATAGGTATCTCCTTGAT-3’；

RSV-RNA1-R：5’-CAAATGACCCTACTAGATGGACGA-3’。

RSV-RNA2-F：5’-CAACCACCCTTATCACAAACTTCA-3’；

RSV-RNA2-R：5’-CACCAATACCTTTCCCTGACACCC-3’。

RSV-RNA3-F：5’-TATATGGGCACCAACAAGCCAGCC-3’；

RSV-RNA3-R：5’-TATGACTTAGGGAGTGAGTTGTGCAGT-3’。

RSV-RNA4-F：5’-GCTTCACCACACCGAACTCCTTCT-3’；

RSV-RNA4-R：5’-GTTACGATTG ACCAAGCTGCCACA-3’。

H.杂交完毕，用2×洗膜液(2×SSC，加入SDS至终浓度为1g/L)在65℃洗膜两次，每次20分钟。然后用0.1×洗膜液(0.1×SSC，加入SDS至终浓度为1g/L)，65℃洗膜1次，约20分钟。

I.膜晾干，并用保鲜膜包好，检测放射强度。压片(X光片或磷屏)，时间根据放射强度决定压片时间长短。

实验同时以rRNA作为对照。

J.实验结果如图8所示，RSV基因组四条RNA链在pAO:AO和pAO:AO-Res转基因水稻株系富集量均低于野生型水稻日本晴，这进一步表明RSV在pAO:AO和pAO:AO-Res转基因水稻株系中复制量增加相对较少。与步骤1中测得的pAO:AO和pAO:AO-Res转基因水稻株系较野生型水稻品种日本晴更抗病，抗病性增强的结果相一致。

K.以上结果均证明，OsAO基因参与水稻抗水稻条纹病毒防御反应，在水稻中过表达该基因后植物更加抗病，病症减弱，病毒粒子复制量减少。

实施例3、过表达OsAO的转基因水稻抗水稻黑条矮缩病能力增强

一、pAO:AO-Res转基因株系以及mir528突变体水稻对RBSDV抗性增强

1、RBSDV侵染pAO:AO-Res转基因株系以及mir528突变体水稻后，病症减轻，发病率明显降低

以带RBSDV病毒的灰飞虱侵染同时期(分蘖期)的未转基因的野生型水稻品种日本晴、pAO:AO-Res转基因水稻株系、miR528OE水稻以及mir528突变体水稻和突变体水稻野生型DJ，以无毒灰飞虱侵染相应的水稻作为对照组。

2周后检测水稻发病情况(水稻发病情况鉴定参照文献《稻麦主要病毒病识别与控制》一书中第1.3章)，分别统计实验组与对照组的发病率。统计发病率的同时，观察水稻发病后的表型在不同的实验组之间的区别。

实验组中，各水稻品系的发病率统计结果如表2所示。由表可见，RBSDV病毒侵染pAO:AO-Res转基因水稻株系以及AO表达量较高的mir528突变体后水稻植株的发病率均显著低于RBSDV侵染的野生型水稻品种日本晴和DJ。进一步，各水稻品系接种RBSDV病毒后的病症图如图9所示，RBSDV侵染AO表达量较高的株系，即mir528突变体和pAO:AO-Res转基因水稻株系后，病症较野生型水稻明显变轻，尤其pAO:AO-Res转基因株系，植株矮化减弱甚至无矮化。

表2 RSV侵染OsAO过和OsAO-Res表达水稻后发病率统计

水稻品系	N<sup>a</sup>	D<sup>b</sup>	P<sup>c</sup>
				NPB	75	55	73.33％
DJ	73	52	71.93％
				miR528OE#1	73	62	84.93％
miR528OE#2	73	60	82.19％
				mir528	75	39	52％
pAO:AO-Res#1	75	31	41.33％
				pAO:AO-Res#2	75	31	41.33％

2、RBSDV侵染pAO:AO-Res转基因株系以及mir528突变体水稻后，病毒积累量较少

以步骤1中获得的发病的野生型水稻品种日本晴和DJ、发病的pAO:AO-Res转基因水稻、发病的mir528突变体以及miR528OE株系与未发病的各个株系为实验材料。分别取各水稻材料叶片2g，在液氮中研磨成粉末，依照Invitrogen公司的TRIzol Reagent说明书(Invitrogen Trizol Reagent，cat No.15596-018)提取总RNA，为进一步进行qRT-PCR检测RBSDV四条基因组RNA链S1，S2，S6以及S10的积累量做准备，具体实验步骤参照实例1步骤一。

实验中所用到的引物序列如下所示(5’-3’)：

RBSDV-S1-F：5’-AACCCAGTCAAGACGCTCA-3’；

RBSDV-S1-R：5’-CGACATCAAATGAAGCACCT-3’。

RBSDV-S2-F：5’-TGTGATAACAGAATGACGGC-3’；

RBSDV-S2-R：5’-CTTCGGTCGGACAATACAC-3’。

RBSDV-S6-F：5’-TCAGCAGTCTTGGGTTGAT-3’；

RBSDV-S6-R：5’-CAGTTTCAGCAGAGTAACGC-3’。

RBSDV-S10-F：5’-ATTGGCGAAGTGTTGAGC-3’；

RBSDV-S10-R：5’-CGGGTGCTAAATGAAATGC-3’。

结果如图10所示，在AO表达量相对较高的pAO:AO-Res转基因水稻和mir528突变体中，病毒RNA链的积累均较野生型少，而在AO表达量相对较低的miR528OE水稻株系中，病毒四条RNA链的积累量均较野生型高，这与图9所示观察到的表型是一致的。

二、RBSDV侵染水稻后，OsAO的积累量以及OsAO蛋白的酶活均上调

1、RBSDV侵染不同株系的水稻后，OsAO的mRNA水平均上调以步骤一中获得的发病的野生型水稻品种日本晴和DJ、发病的pAO:AO-Res转基因水稻、发病的mir528突变体以及miR528OE株系与未发病的各个株系为实验材料。分别取各水稻材料叶片2g，在液氮中研磨成粉末，依照Invitrogen公司的TRIzol Reagent说明书(Invitrogen Trizol Reagent，catNo.15596-018)提取总RNA，为进一步进行qRT-PCR检测OsAO的mRNA积累量做准备，具体实验步骤参照实例1步骤一。

结果如图11所示，OsAO的mRNA水平在RBSDV侵染后显著上调，表明OsAO在植物在RBSDV侵染中被诱导表达。

2、RBSDV侵染不同株系的水稻后，OsAO的相对酶活增强

以步骤一中获得的发病的野生型水稻品种日本晴和DJ、发病的pAO:AO-Res转基因水稻、发病的mir528突变体以及miR528OE株系与未发病的各个株系为实验材料，检测各个材料中OsAO的相对酶活，具体实验步骤参照实例1步骤一。

结果如图12所示，OsAO的酶活在RBSDV侵染后显著增强，这表明OsAO的确在RBSDV的侵染过程中发挥功能。

综合上述实验结果，表明OsAO在植物抗RBSDV过程中发挥功能，能够增强植物对水稻黑条矮缩病毒的抗性。

序列表

<110> 北京大学

<120> OsAO基因在提高水稻对水稻条纹病毒及水稻黑条矮缩病毒或其同科病毒抗性中的应用

<130> 1901022P

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 5472

<212> DNA

<213> 稻(Oryza.sativa L.)

<400> 1

atagtgtagc atagctcact tccaagagcc tcgtgacaca caccactcac tatactggcc 60

cctcctcctc ctcggagatc gagccggcca gccatggcgg ccgccgtgca gctgctcgtc 120

gtcgccgccg ccgccgccat ggcggcggcg tgctgcgccg gcatggcggc ggcggcggcg 180

acggtggagg tgacgtggga cgtggagtac gtactgtggg cgccggactg ccagcagcgg 240

gtgatgatcg ggataaacgg caggttcccg gggcccaaca tcaccgcgcg cgccggcgac 300

gtgatcagcg tcaccatgaa caacaagatg cacaccgagg gcgtcgtcat ccactggcac 360

ggcatcagac aggtactagt acactctact ggtagcatag tgaccggaca aagttttaca 420

atcatacagt tccttctttt ttttttttca agtcgaaacc aacgttatac tttctccata 480

taaaaaaaat atatgagatt ttgggtggat gggacacatc ctagtgcaac gaatctgaac 540

cgtctatcca cccaaaatcc cttatatatt aagacggaga gagtatatag ttattcggtc 600

catactagaa tataataact tcttatgttt aatataataa cttcttgtgt ttaacttttt 660

attaaaatat aatattttat cttaaaatat aacaacttta tcgatataac ttgacaaatg 720

tatatacttc ctccgtttca aaatgtaagt cattctaact tttcccacat tcatattcat 780

gttaataaat ctagataaat atatatgtat tcgttaatat caatatgaat atgggaaatg 840

ttagaatgac ttacatgtga aacggatgga gtacatggat tctctttagt ctcagcgaat 900

cataagtatt tctctttttt tctctatcta ctttcacata tcaactaatc attatcatta 960

gtcatataat tttatttact ttattaatct agtgtcaccg cctcgaactg gccactggtt 1020

ttctagcaac ccctaaaaca ggaaaacacg aagaagattt tatttttgaa caggaaaagc 1080

tcaaagtaaa ttgtcgtgtg tttgaaaaga aaaggcacaa actaataaag cgggtctatc 1140

tggattctgg aaccacccac actgcaccac cgtcagtgtc gcttccgaag ttgcgagaaa 1200

caactttgct ttagaataac ttgttctctt tttaaaaaaa tacagtttgt gaaaaaaaaa 1260

tcgtagttta acttaacttt gtaacagagt ataagcccta ctctgctttt atattttcct 1320

tttatgcact aaccagctcg agcacagcct aaaacttaag aaaaaaaatt atgattctta 1380

agaggcatgg agaggtatta ataacttttg aagtatagtt ttttttatct tctcgtagta 1440

ttgagaagtg gcaaattttg tacttaactg tgtaaaaaat agtacctctc attttcttct 1500

caaagaacta taaatttact caaaacaaca taaactgagt agaaactaga aaggtcatgc 1560

attttactta ctataacagt aatctaaact actacacaac tacgagtttt ataattctag 1620

aatgaatata atgaaaaatg atgtaaaatc aattaccacg catgcagttt ggcacgccgt 1680

gggcggacgg gacggcatcg atatcccagt gcgcagtgaa cccgggcgag acgttcgtct 1740

acaagttcgt cgccgacaag ccgggcacct acttctacca cggccacttc gggatgcagc 1800

gcgccgcggg cctgtacggt tccctcatcg tcctcgactc gccggagcag cccgagccgt 1860

tccgccacca gtacgacgac ggcggcgagc tccccatgat gctcctcagc gactggtggc 1920

accagaacgt ctacgcccag gccgccggac tcgacggcaa ggacaggcac ttcgagtgga 1980

tcggcgagcc ccaggtaaat aaaaaaacac atcgccgccg tcgtcatcgt cgccgccatc 2040

tccggtgata gagaaccatg tcgataaaga aggcacgatg ggtcacccgt gccttcaggc 2100

cggcacggca cggctcgact cgcctcgggc cgtgcctagc ccgtgtcggg cggcccttat 2160

ggccatctat accggtgagt gctaacagtt agttttttgc aaattgtaga cgatcttgat 2220

caatgggaga ggacagttcg agtgcacgct ggggccagcg aggaagagct ttgagaagct 2280

cctcaacgag aacgtggaga cctgcgtcga cgaccagaag atgtgcagcg accaggagaa 2340

gtgcctgagg aggagcgagt gcgggccgta ctgccccagg agccagtgcg cccctgtcgt 2400

gttcaatgtc gagcagggga agacttaccg ccttaggatc gccagcacca cctccctttc 2460

tctcctcaac gtcaagattc aaggggtaag ataattcaat gttttttatg gattgtattt 2520

tttagattgt acgaaagacg cacgtatact atcatgatgt ataataaggg agcataaatg 2580

taagtatact gatttaatca cgctcgaaaa tatatgaatg agtgtcggtc atcatcttca 2640

acagtagctt gatgtgactt gttgtaacaa tttcaatgaa attgaagaaa ttttgcaaat 2700

ggtaaaattt tggcagcaca agatgacggt ggtggaggcc gacgggaacc acgtggagcc 2760

gttcgtggtc gacgacatcg acatctactc cggcgagagc tactccgtcc tcctcaaggc 2820

cgaccagaag ccggcgagct actggatctc cgtcggcgtc agggggcgcc accccaagac 2880

ggtgccggcg ctcgccatcc tcagctacgg caacggcaac gcggcgccgc cgccgctcca 2940

gctgcccgcc ggcgagcccc ccgtgacgcc ggcgtggaac gacacacagc gcagcaaggc 3000

cttcacctac agcatcaggg cgcgcaagga caccaaccgg ccgccgccgg cggccgccga 3060

ccggcagatc gtcctgctca acacgcagaa cctcatggac gggcgctaca ggtggtccat 3120

caacaacgtg tccctgacgc tgccggcgac gccgtacctg ggcgccttcc accacggcct 3180

ccaggacagc gcgttcgacg cgtccggcga gccgccggcg gcgttcccgg aggactacga 3240

cgtgatgagg ccgccggcga acaacgcgac gacggcgagc gacagggtgt tccggctgcg 3300

acacggcggc gtggtggacg tggtgctcca gaacgccaac atgctgaggg aggaggtgag 3360

cgagacgcac ccgtggcacc tccacggcca cgacttctgg gtgctcggct acggcgacgg 3420

ccggtacgac ccggcggcgc acgcggcggg gctcaacgcc gccgacccgc cgctgcggaa 3480

cacggcggtg gtcttcccgc acgggtggac ggcgcttcgg ttcgtcgcca acaacaccgg 3540

cgcgtgggcg ttccactgcc acatcgagcc gcacctccac atgggcatgg gcgtcgtctt 3600

cgtcgagggg gaggacagga tgcacgagct cgacgtgccc aaggacgcca tggcgtgcgg 3660

cctcgtcgcc aggacggccg ccacgccgct caccccggca acgccgctgc ctccgtcgcc 3720

ggcgccggcg ccatgagctc ctcctcagca tgcccattcc agttaaatgc catttttgcc 3780

gtaacattgt gattggccac tgcgaaataa gatcactcac tgatgaagag tggtttagat 3840

tgtttggtca tatgcatgct caataatctc atgtaactaa gaaataatgt ccatgtttgc 3900

taattaagat gattgtgtaa tattgttgca atgtacacca aaaatattgc acggtgttgc 3960

tggcaaagag tggacaccca gcacaagcaa atctccagct agtggatagc aaaccatgat 4020

aaagtacgta tgttcgaatg tgatatgcct caaatctcca gaaaaagaaa tatgtgaagc 4080

cgtaagataa agagacatgg aatattacaa gaagcactca aacatcttca gagttacaaa 4140

attcatgtca cgctacaggg agtatcaaga actctcttga acatcaggca attcttacct 4200

cctaccagac tacatgttct accaaaaacc atccaatccg gtcgcacatc ccacttccat 4260

ttatatatgt taattgggag acaccattgt atcacatttg tagcagatga tgtttcgagc 4320

tgtctcatca gtcgatcttc acagaagcat atatcttcct cacgaaccag aagcaagcat 4380

agaagccaat ggtaccagtc agcacgaaga aagcatacga gatgatcagc atgtaaccaa 4440

agtagagaat gcctgaaaca agcttcgtga tctccagctt gttgaagaag tagaagatgg 4500

cataagcaaa aagatacagt gctgaagagc cagcagtcag gtatgctctc caccaccagt 4560

gatagtcctc gctgcatagt tggaagtagc agagcacaat tgtgatctca gcacaagtaa 4620

cgatgaggat gatgaagact atgaagagga agccgaagat gtagtagaac tggttcagcc 4680

agattgatgt cagaatgaag aagagctcga tgaagacagc gccaaatggc aatatgccac 4740

cagcaagtat tgagaaagct ggctgcaggt accatgcctg ctcaggaatt tgcctgggaa 4800

tcttgtttgt cttcactggg tcctcaatgg ctggctgctt gaagcccaag aaacttccaa 4860

caaagactag cggcacagag atgccaaacc aaaggaggaa cagagcaaac attgttccaa 4920

agggaactgc acctgatgat ttctcacccc agatcagggc atttaggaag aaaaagagtg 4980

caaagattat accaggaaac ataaaggcag tcttgagggt gattttcttc cattcagtgc 5040

ctttgaacat cttatatagg cgagatgagg tgtatcctgc caatacaccc atgaacaccc 5100

acagaaggac catagcagtc attagtccac cacggtttgc aggggacaag aatccaagta 5160

gcgcaaacat catggttacc agtgtcattc caaagaactg cacaccagtt ccaacataaa 5220

cacaaaggag gcctgagtgg acaggtggcc tgaagacatc accatgcact aacttccagc 5280

cagtttcttc ctgggcctca tcctggttgt caagctgatt atagtttgca atatccttgt 5340

aaagagttct catcatgatc atggctacca tgccagaaag gaaaaggaca atcatcagtg 5400

agttaatgat tgagaaccaa tggatctggc tatcacttga aagaagatag acatcccaac 5460

gagatgccca ta 5472

<210> 2

<211> 5472

<212> DNA

<213> 稻(Oryza.sativa L.)

<400> 2

atagtgtagc atagctcact tccaagagcc tcgtgacaca caccactcac tatactggcc 60

cctcctcctc ctcggagatc gagccggcca gccatggcgg ccgccgtgca gctgctcgtc 120

gtcgccgccg ccgccgccat ggcggcggcg tgctgcgccg gcatggcggc ggcggcggcg 180

acggtggagg tgacgtggga cgtggagtac gtactgtggg cgccggactg ccagcagcgg 240

gtgatgatcg ggataaacgg caggttcccg gggcccaaca tcaccgcgcg cgccggcgac 300

gtgatcagcg tcaccatgaa caacaagatg cacaccgagg gcgtcgtcat ccactggcac 360

ggcatcagac aggtactagt acactctact ggtagcatag tgaccggaca aagttttaca 420

atcatacagt tccttctttt ttttttttca agtcgaaacc aacgttatac tttctccata 480

taaaaaaaat atatgagatt ttgggtggat gggacacatc ctagtgcaac gaatctgaac 540

cgtctatcca cccaaaatcc cttatatatt aagacggaga gagtatatag ttattcggtc 600

catactagaa tataataact tcttatgttt aatataataa cttcttgtgt ttaacttttt 660

attaaaatat aatattttat cttaaaatat aacaacttta tcgatataac ttgacaaatg 720

tatatacttc ctccgtttca aaatgtaagt cattctaact tttcccacat tcatattcat 780

gttaataaat ctagataaat atatatgtat tcgttaatat caatatgaat atgggaaatg 840

ttagaatgac ttacatgtga aacggatgga gtacatggat tctctttagt ctcagcgaat 900

cataagtatt tctctttttt tctctatcta ctttcacata tcaactaatc attatcatta 960

gtcatataat tttatttact ttattaatct agtgtcaccg cctcgaactg gccactggtt 1020

ttctagcaac ccctaaaaca ggaaaacacg aagaagattt tatttttgaa caggaaaagc 1080

tcaaagtaaa ttgtcgtgtg tttgaaaaga aaaggcacaa actaataaag cgggtctatc 1140

tggattctgg aaccacccac actgcaccac cgtcagtgtc gcttccgaag ttgcgagaaa 1200

caactttgct ttagaataac ttgttctctt tttaaaaaaa tacagtttgt gaaaaaaaaa 1260

tcgtagttta acttaacttt gtaacagagt ataagcccta ctctgctttt atattttcct 1320

tttatgcact aaccagctcg agcacagcct aaaacttaag aaaaaaaatt atgattctta 1380

agaggcatgg agaggtatta ataacttttg aagtatagtt ttttttatct tctcgtagta 1440

ttgagaagtg gcaaattttg tacttaactg tgtaaaaaat agtacctctc attttcttct 1500

caaagaacta taaatttact caaaacaaca taaactgagt agaaactaga aaggtcatgc 1560

attttactta ctataacagt aatctaaact actacacaac tacgagtttt ataattctag 1620

aatgaatata atgaaaaatg atgtaaaatc aattaccacg catgcagttt ggcacgccgt 1680

gggcggacgg gacggcatcg atatcccagt gcgcagtgaa cccgggcgag acgttcgtct 1740

acaagttcgt cgccgacaag ccgggcacct acttctacca cggccacttc gggatgcagc 1800

gcgccgcggg cctgtacggt tccctcatcg tcctcgactc gccggagcag cccgagccgt 1860

tccgccacca gtacgacgac ggcggcgagc tccccatgat gctcctcagc gactggtggc 1920

accagaacgt ctacgcccag gccgccggac tcgacggcaa ggacaggcac ttcgagtgga 1980

tcggcgagcc ccaggtaaat aaaaaaacac atcgccgccg tcgtcatcgt cgccgccatc 2040

tccggtgata gagaaccatg tcgataaaga aggcacgatg ggtcacccgt gccttcaggc 2100

cggcacggca cggctcgact cgcctcgggc cgtgcctagc ccgtgtcggg cggcccttat 2160

ggccatctat accggtgagt gctaacagtt agttttttgc aaattgtaga cgatcttgat 2220

caatgggaga ggacagttcg agtgcacgct ggggccagcg aggaagagct ttgagaagct 2280

cctcaacgag aacgtggaga cctgcgtcga cgaccagaag atgtgcagcg accaggagaa 2340

gtgcctgagg aggagcgagt gcgggccgta ctgccccagg agccagtgcg cccctgtcgt 2400

gttcaatgtc gagcagggga agacttaccg ccttaggatc gccagcacca cctccctttc 2460

tctcctcaac gtcaagattc aaggggtaag ataattcaat gttttttatg gattgtattt 2520

tttagattgt acgaaagacg cacgtatact atcatgatgt ataataaggg agcataaatg 2580

taagtatact gatttaatca cgctcgaaaa tatatgaatg agtgtcggtc atcatcttca 2640

acagtagctt gatgtgactt gttgtaacaa tttcaatgaa attgaagaaa ttttgcaaat 2700

ggtaaaattt tggcagcaca agatgacggt ggtggaggcc gacgggaacc acgtggagcc 2760

gttcgtggtc gacgacatcg acatctactc cggcgagagc tactccgtcc tcctcaaggc 2820

cgaccagaag ccggcgagct actggatctc cgtcggcgtc agggggcgcc accccaagac 2880

ggtgccggcg ctcgccatcc tcagctacgg caacggcaac gcggcgccgc cgccgctcca 2940

gctgcccgcc ggcgagcccc ccgtgacgcc ggcgtggaac gacacacagc gcagcaaggc 3000

cttcacctac agcatcaggg cgcgcaagga caccaaccgg ccgccgccgg cggccgccga 3060

ccggcagatc gtcctgctca acacgcagaa cctcatggac gggcgctaca ggtggtccat 3120

caacaacgtg tccctgacgc tgccggcgac gccgtacctg ggcgccttcc accacggcct 3180

ccaggacagc gcgttcgacg cgtccggcga gccgccggcg gcgttcccgg aggactacga 3240

cgtgatgagg ccgccggcga acaacgcgac gacggcgagc gacagggtgt tccggctgcg 3300

acacggcggc gtggtggacg tggtgctcca gaacgccaac atgctgaggg aggaggtgag 3360

cgagacgcac ccgtggcacc tccacggcca cgacttctgg gtgctcggct acggcgacgg 3420

ccggtacgac ccggcggcgc acgcggcggg gctcaacgcc gccgacccgc cgctgcggaa 3480

cacggcggtg gtcttcccgc acgggtggac ggcgcttcgg ttcgtcgcca acaacaccgg 3540

cgcgtgggcg ttccactgcc acatcgagcc gcacctccac atgggcatgg gcgtcgtctt 3600

cgtcgagggg gaggacagga tgcacgagct cgacgtgccc aaggacgcca tggcgtgcgg 3660

cctcgtcgcc aggacggccg ccacgccgct caccccggca acgccgctgc ctccgtcgcc 3720

ggcgccggcg ccatgagctc cacgtcacga aactcatcca agttaaatgc catttttgcc 3780

gtaacattgt gattggccac tgcgaaataa gatcactcac tgatgaagag tggtttagat 3840

tgtttggtca tatgcatgct caataatctc atgtaactaa gaaataatgt ccatgtttgc 3900

taattaagat gattgtgtaa tattgttgca atgtacacca aaaatattgc acggtgttgc 3960

tggcaaagag tggacaccca gcacaagcaa atctccagct agtggatagc aaaccatgat 4020

aaagtacgta tgttcgaatg tgatatgcct caaatctcca gaaaaagaaa tatgtgaagc 4080

cgtaagataa agagacatgg aatattacaa gaagcactca aacatcttca gagttacaaa 4140

attcatgtca cgctacaggg agtatcaaga actctcttga acatcaggca attcttacct 4200

cctaccagac tacatgttct accaaaaacc atccaatccg gtcgcacatc ccacttccat 4260

ttatatatgt taattgggag acaccattgt atcacatttg tagcagatga tgtttcgagc 4320

tgtctcatca gtcgatcttc acagaagcat atatcttcct cacgaaccag aagcaagcat 4380

agaagccaat ggtaccagtc agcacgaaga aagcatacga gatgatcagc atgtaaccaa 4440

agtagagaat gcctgaaaca agcttcgtga tctccagctt gttgaagaag tagaagatgg 4500

cataagcaaa aagatacagt gctgaagagc cagcagtcag gtatgctctc caccaccagt 4560

gatagtcctc gctgcatagt tggaagtagc agagcacaat tgtgatctca gcacaagtaa 4620

cgatgaggat gatgaagact atgaagagga agccgaagat gtagtagaac tggttcagcc 4680

agattgatgt cagaatgaag aagagctcga tgaagacagc gccaaatggc aatatgccac 4740

cagcaagtat tgagaaagct ggctgcaggt accatgcctg ctcaggaatt tgcctgggaa 4800

tcttgtttgt cttcactggg tcctcaatgg ctggctgctt gaagcccaag aaacttccaa 4860

caaagactag cggcacagag atgccaaacc aaaggaggaa cagagcaaac attgttccaa 4920

agggaactgc acctgatgat ttctcacccc agatcagggc atttaggaag aaaaagagtg 4980

caaagattat accaggaaac ataaaggcag tcttgagggt gattttcttc cattcagtgc 5040

ctttgaacat cttatatagg cgagatgagg tgtatcctgc caatacaccc atgaacaccc 5100

acagaaggac catagcagtc attagtccac cacggtttgc aggggacaag aatccaagta 5160

gcgcaaacat catggttacc agtgtcattc caaagaactg cacaccagtt ccaacataaa 5220

cacaaaggag gcctgagtgg acaggtggcc tgaagacatc accatgcact aacttccagc 5280

cagtttcttc ctgggcctca tcctggttgt caagctgatt atagtttgca atatccttgt 5340

aaagagttct catcatgatc atggctacca tgccagaaag gaaaaggaca atcatcagtg 5400

agttaatgat tgagaaccaa tggatctggc tatcacttga aagaagatag acatcccaac 5460

gagatgccca ta 5472

<210> 3

<211> 21

<212> RNA

<213> 稻(Oryza.sativa L.)

<400> 3

gaggagacgu acggggaagg u 21

<210> 4

<211> 633

<212> PRT

<213> 稻(Oryza.sativa L.)

<400> 4

Met Ala Ala Ala Val Gln Leu Leu Val Val Ala Ala Ala Ala Ala Met

1 5 10 15

Ala Ala Ala Cys Cys Ala Gly Met Ala Ala Ala Ala Ala Thr Val Glu

20 25 30

Val Thr Trp Asp Val Glu Tyr Val Leu Trp Ala Pro Asp Cys Gln Gln

35 40 45

Arg Val Met Ile Gly Ile Asn Gly Arg Phe Pro Gly Pro Asn Ile Thr

50 55 60

Ala Arg Ala Gly Asp Val Ile Ser Val Thr Met Asn Asn Lys Met His

65 70 75 80

Thr Glu Gly Val Val Ile His Trp His Gly Ile Arg Gln Phe Gly Thr

85 90 95

Pro Trp Ala Asp Gly Thr Ala Ser Ile Ser Gln Cys Ala Val Asn Pro

100 105 110

Gly Glu Thr Phe Val Tyr Lys Phe Val Ala Asp Lys Pro Gly Thr Tyr

115 120 125

Phe Tyr His Gly His Phe Gly Met Gln Arg Ala Ala Gly Leu Tyr Gly

130 135 140

Ser Leu Ile Val Leu Asp Ser Pro Glu Gln Pro Glu Pro Phe Arg His

145 150 155 160

Gln Tyr Asp Asp Gly Gly Glu Leu Pro Met Met Leu Leu Ser Asp Trp

165 170 175

Trp His Gln Asn Val Tyr Ala Gln Ala Ala Gly Leu Asp Gly Lys Asp

180 185 190

Arg His Phe Glu Trp Ile Gly Glu Pro Gln Thr Ile Leu Ile Asn Gly

195 200 205

Arg Gly Gln Phe Glu Cys Thr Leu Gly Pro Ala Arg Lys Ser Phe Glu

210 215 220

Lys Leu Leu Asn Glu Asn Val Glu Thr Cys Val Asp Asp Gln Lys Met

225 230 235 240

Cys Ser Asp Gln Glu Lys Cys Leu Arg Arg Ser Glu Cys Gly Pro Tyr

245 250 255

Cys Pro Arg Ser Gln Cys Ala Pro Val Val Phe Asn Val Glu Gln Gly

260 265 270

Lys Thr Tyr Arg Leu Arg Ile Ala Ser Thr Thr Ser Leu Ser Leu Leu

275 280 285

Asn Val Lys Ile Gln Gly His Lys Met Thr Val Val Glu Ala Asp Gly

290 295 300

Asn His Val Glu Pro Phe Val Val Asp Asp Ile Asp Ile Tyr Ser Gly

305 310 315 320

Glu Ser Tyr Ser Val Leu Leu Lys Ala Asp Gln Lys Pro Ala Ser Tyr

325 330 335

Trp Ile Ser Val Gly Val Arg Gly Arg His Pro Lys Thr Val Pro Ala

340 345 350

Leu Ala Ile Leu Ser Tyr Gly Asn Gly Asn Ala Ala Pro Pro Pro Leu

355 360 365

Gln Leu Pro Ala Gly Glu Pro Pro Val Thr Pro Ala Trp Asn Asp Thr

370 375 380

Gln Arg Ser Lys Ala Phe Thr Tyr Ser Ile Arg Ala Arg Lys Asp Thr

385 390 395 400

Asn Arg Pro Pro Pro Ala Ala Ala Asp Arg Gln Ile Val Leu Leu Asn

405 410 415

Thr Gln Asn Leu Met Asp Gly Arg Tyr Arg Trp Ser Ile Asn Asn Val

420 425 430

Ser Leu Thr Leu Pro Ala Thr Pro Tyr Leu Gly Ala Phe His His Gly

435 440 445

Leu Gln Asp Ser Ala Phe Asp Ala Ser Gly Glu Pro Pro Ala Ala Phe

450 455 460

Pro Glu Asp Tyr Asp Val Met Arg Pro Pro Ala Asn Asn Ala Thr Thr

465 470 475 480

Ala Ser Asp Arg Val Phe Arg Leu Arg His Gly Gly Val Val Asp Val

485 490 495

Val Leu Gln Asn Ala Asn Met Leu Arg Glu Glu Val Ser Glu Thr His

500 505 510

Pro Trp His Leu His Gly His Asp Phe Trp Val Leu Gly Tyr Gly Asp

515 520 525

Gly Arg Tyr Asp Pro Ala Ala His Ala Ala Gly Leu Asn Ala Ala Asp

530 535 540

Pro Pro Leu Arg Asn Thr Ala Val Val Phe Pro His Gly Trp Thr Ala

545 550 555 560

Leu Arg Phe Val Ala Asn Asn Thr Gly Ala Trp Ala Phe His Cys His

565 570 575

Ile Glu Pro His Leu His Met Gly Met Gly Val Val Phe Val Glu Gly

580 585 590

Glu Asp Arg Met His Glu Leu Asp Val Pro Lys Asp Ala Met Ala Cys

595 600 605

Gly Leu Val Ala Arg Thr Ala Ala Thr Pro Leu Thr Pro Ala Thr Pro

610 615 620

Leu Pro Pro Ser Pro Ala Pro Ala Pro

625 630

<210> 5

<211> 15

<212> PRT

<213> Artificial Sequence(人工序列)

<400> 5

Asp Ser Pro Glu Gln Pro Glu Pro Phe Arg His Gln Tyr Asp Asp

1 5 10 15

<210> 6

<211> 4600

<212> DNA

<213> 稻(Oryza.sativa L.)

<400> 6

acataggatc ctaaaagagt tgtggcgatt tgggacctag atgacatacc cctacaagag 60

tctaaggacc gcccgtgcac tttataaaaa atatatatat agcttccaat atatcccaat 120

tcccaaaaca atcaagatga aaactaaaaa aaagaaaaga aaagaaaagg aaccagtgca 180

tgcatgcatg aatatgcagg ggtgagctgg tgtgcatgca tgtgtttccg agtgtgcgcc 240

acatgagtct cgcgcgcgag atagcaaacc cgtgttgagt ttatcttaat ttctttttgt 300

ttgatggatt ggttaaattt ggacttagtt tgagtgagat gcatgacata acatagatat 360

ataagtacat tgaatcagtg ctgaaccttt cttttttccc tcctaagatt gtccacaact 420

gcttatatgg tttttgtgcg agggggggat cgacacgtca gtaccacatc gtctagcgct 480

gcacaggtac agtagcagct agcgctacct tacaacgtcg gatcgcagca agatccggca 540

cgcgctgtct cgctacagcg aaatggctgc agcgctcgat gtaagtatag ctaactactg 600

gctctaattc atctataacc aatctaatag cttatttata taatagtaca tactatacta 660

ttaatacctg gttccacatg tcatacacac cttgcgtctt gaagtccgtg ctatagctgg 720

ctataaattt gtagcccgct gctcttctct ctccttattt atcttcttaa aatatatttg 780

cagctggctt attgtacctg ctctaaacgc tacgtacaca gtacgtgcca cgcgtacggc 840

cggtagggcc ctatatgttc ccgacgccta ctaccgaaca cagttgataa gatgagttta 900

tggatatgaa atagatagaa tgaagaagag agaaacgtct atatgttaat taagcttaat 960

attggttttt aagtgtttac aaaaggaaat ttgttataat atgagaatgc gtaaagtaaa 1020

agaaagctaa tttataattc ttttggtgca ttaatttttc gagtgtttgt aaacctgttg 1080

ttgtaagaga atatatattg aacgaactaa acgtccaaac aaggctttac tttcaggatt 1140

agactaaaat agctactttc ctttaggctt gttaatttaa tttagtcttt tatatttttt 1200

atctctttct taaatggcta cttcgttaga aaggttgcaa ggttattgat ggaaactaga 1260

aaaagttgtc tattgggttg gtaatgatcg actttaggcc tgggttgtct agctacatgc 1320

aacccgtgac tagaatcccg ggtgtatttt cacagacgtg tcttcaaata aataaaggga 1380

tgtcatcaaa ataatttttg tagtgcaata aattatgtca ttggaaaagg attaagaata 1440

tatcatgtca gtattacgga ttaggtatat cttctatact tgaattccta accgccatac 1500

cacataccta atataaagta tgcttataag agaatataat agataagaaa gaaaactctt 1560

tccacggaaa taaaaggtat cggacttcga ccaaggaaag caatgtctta tatatatccg 1620

tattctataa aagctccccg agttttactt ggacaagaag ttgcatatat ccatataaat 1680

acaaaactcc ttaggaggaa gtcgatcata agttagccac gagccacatt gagaatcact 1740

cacgaggaaa tcgatcgcta gccaccaact ccaagtcatt agattagtta gcttaactta 1800

aggctgtgtt cttttgaagg ggttgggaac ccctcccctc cgcacgaaaa acggagtgat 1860

agattaacat gtgattaatt aagtattagc tataaaaaat taaaaaatag attaatatga 1920

cttttaaaaa caaatttctt atataaactt tttataaaac gtgtaccatt tagcgggttt 1980

aaaaagcgtg cacgcgaaaa acgagggagg tgggttggga acccatggag aagaacacag 2040

cctattatac ctatctgaga tgtcaaacca gtataaaatt ccttatcttc cgtctatttt 2100

gttgtaatct cgcgtatacc ctggcatcaa tgtttcttat actatacaaa taccgttatc 2160

gggtatagca ctttgatata ttgaaagatg ggataataag tcacgtactc ctctgggaaa 2220

tgaccagctt aaaagctaac aaaattcaca ttagttagtg agtacctttt ctggaccgtg 2280

gttataagct tctttagcaa tagctaccat atatgtgtgt cgtcagtgtg tgcttgtaac 2340

tttgcaagtt gtaacaaatg gctagttagc tcatatatgg tacatcttta ggtggatatg 2400

taagataata ttcctacaat tgtaacaatt tgctactccc tttgtttcaa aataaaataa 2460

tttttagcat tcaaaatttg tcttaaaata taacaactta tatacctata ttttcttctc 2520

aaccaatcac aacctttcac cattcaaatt attcaattat ttctcttctc aatcaatcat 2580

aacctcctcc gattgaattt caactgattt cttaatatcc gtgtctaatc ctaaaacttc 2640

ttatatttag aacgaatgta tggtattatg gtactactat ctatggcctc gtttagttgg 2700

ggaaaatttt tgggtttggt tgtcacatca gatataccga cacacattta aagtattaaa 2760

cgtagtctaa taacagaaca aattatagat tccgccagaa aaatgcgaga cgaatttatt 2820

aagcctaaat aatccattat tagcaaaagt ttaatgtagc accacattgt caaatcatgg 2880

cacaattagg cttaaaagat tcgtctcgca atttacacgc aatctgtgta attggttttt 2940

tttcttacat ttaatactcc atgcatgtgt acaaacattc gatgtggcag cgtgtttttg 3000

ttctgggaac taaacagagc ctatatatgc agatttacta ctggagaagt gatttttgct 3060

aggtcggctg atagactaaa aattgttttt aagtcccggt taaaattttt ttgatcttta 3120

gtcccggttg gtgttaccaa ccgagtaaag attatttaga tctttaatcc cggttggtat 3180

tatcaaacgg gagtaaaaat ccatctttaa atatttctct cccatctccg atcgattaag 3240

tcccagacga gactttcctc ctcaccgaga tatttaaata agatcggatc ataccctctc 3300

ctcctacccc ttagatcccc ttcctcctcc cctcccctct cttcctcccc ttcctcctcc 3360

cctcccctct tctccccctc ctcccctccc atccggcgga caacggcgac aagctggcgg 3420

ccagcgggcg gtggggccac gcacggcggt gcccggcggg gccacgcatg gggctgcagg 3480

cggcaggcgg cagccgtggc gagtggcggc aggcggcggc cgtggcaggc ggcggcagct 3540

ggcgggaggg gaggcgcgca tgcataggcc gggcgccctc tcctctaccg gtgtcccttt 3600

tttttatata atttgtgatt cattgatatg tataatttct ttttttttag aatttgtgat 3660

tcattacatg gatctgatat gtataatctg tgatgtattt gatttgtgtg tattttttta 3720

ggatttgtga tgtatttgat ttgtgtgtat aagtaactta ggatttgtga tgtgaataat 3780

ttgggatgtt actttgattt gaggatatgc gtggcactcg atttgggaga aaatataagg 3840

attaactcta gcaagtagca aagaaacaat aaaaaaaaaa agaaaagggg accaaccgga 3900

actgtcacta ctctctcttt agtcccggtt ggtgtaaaga ttcaacttta ctcctggtta 3960

tttcacccgg gattaaagat gggtatcttt agtcccggat ttatagcctc ggttaaaaaa 4020

ccgagactac agggggtccc aaccggaatt acaaacggtt tctccggtag tgattgttca 4080

tcaatgattg ctgacacata attgacaact ttggaattat attaggggca tgctgccccc 4140

atggacgaac gagcaagact aagacgttat cggtcagtaa tgtccacaca cgaggtatat 4200

caagtgaaaa ccatcgaata aataaaaact catcaaaatt agatttaaag ttctcaatct 4260

tctaaagaaa attcctagag atacgtatag gcatgaaatc ttgagcccaa ttaaccttca 4320

tttgaagaaa aaaggtatta ttcatcttaa aacagtttgg ctttgaccaa agttaaaatg 4380

tcttataacc taaaacggag ggagtattac acagcaacca agtactacaa acaagcagaa 4440

aatttcgtgc tcaaggaatc tcccatatca gcatgtttcc aaacataaca gaaatttaat 4500

ttacacccta cttaatttta ttacccctca caaaacatga ataaccaatg cagctaatct 4560

gggcacacct atatataaag aaagaaagca tggcctcccc 4600

Claims (9)

1.蛋白质在如下a1)或a2)中的应用：

a1)调控植物对水稻条纹叶枯病或水稻黑条矮缩病的抗性；

a2)选育对水稻条纹叶枯病或水稻黑条矮缩病抗性增强的植物品种；

所述蛋白质由序列表中序列4所示的氨基酸序列组成，其中所述植物为水稻。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述水稻条纹叶枯病的病原菌为水稻条纹病毒，水稻黑条矮缩病的病原体为水稻黑条矮缩病毒，两个病毒的传毒介体均为灰飞虱。

3.蛋白质的编码基因或含有所述编码基因的重组载体在如下a1)或a2)中的应用：

a1)调控植物对水稻条纹叶枯病或水稻黑条矮缩病的抗性；

a2)选育对水稻条纹叶枯病或水稻黑条矮缩病抗性增强的植物品种；

所述蛋白质的编码基因是如下1)至2)中任一项的DNA分子：

1)序列表中序列1所示的DNA分子；

2)序列表中序列2所示的DNA分子，其中所述植物为水稻。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述水稻条纹叶枯病的病原菌为水稻条纹病毒，水稻黑条矮缩病的病原体为水稻黑条矮缩病毒，两个病毒的传毒介体均为灰飞虱。

5.培育对水稻条纹叶枯病或水稻黑条矮缩病抗性增强的转基因植物的方法，包括如下步骤：

a)向目的植物中导入蛋白质的编码基因，编码获得的蛋白序列为序列4所示的氨基酸组成，得到表达所述编码基因的转基因植物；

b)从步骤a)所得转基因植物中得到与所述目的植物相比，对水稻条纹叶枯病或水稻黑条矮缩病抗性增强的转基因植物，其中所述植物为水稻。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述蛋白质的编码基因是如下1)至2)中任一项的DNA分子：

1)序列表中序列1所示的DNA分子；

2)序列表中序列2所示的DNA分子。

7.根据权利要求5或6所述的方法，其特征在于：所述编码基因是通过含有所述蛋白质的编码基因的重组表达载体导入所述目的植物中的。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述重组表达载体中启动所述编码基因转录的启动子为序列5所示的内源启动子。

9.根据权利要求5或6所述的方法，其特征在于：所述水稻条纹叶枯病的病原菌为水稻条纹病毒，水稻黑条矮缩病的病原体为水稻黑条矮缩病毒，两个病毒的传毒介体均为灰飞虱。

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