CN104561085A

CN104561085A - OsAGO18基因在提高水稻对水稻条纹叶枯病抗性中的应用

Info

Publication number: CN104561085A
Application number: CN201410068747.0A
Authority: CN
Inventors: 李毅; 戚益军; 吴建国; 杨志蕊; 郑立佳; 魏春红
Original assignee: Peking University
Current assignee: Peking University
Priority date: 2013-10-18
Filing date: 2014-02-27
Publication date: 2015-04-29
Anticipated expiration: 2034-02-27
Also published as: CN104561085B

Abstract

本发明公开了OsAGO18基因在提高水稻对水稻条纹叶枯病抗性中的应用。本发明提供了OsAGO18基因或其编码蛋白或含有所述编码基因的重组载体在调控植物抗水稻条纹叶枯病中的应用；所述基因OsAGO18蛋白的氨基酸序列具体为序列表中的序列2。实验证明，在OsAGO18基因过表达的水稻中植物抗病性增强，相反，ago18突变体的抗病性减弱，表明该基因编码的OsAGO18蛋白在水稻抗水稻条纹叶枯病反应中发挥着重要的作用。

Description

OsAGO18基因在提高水稻对水稻条纹叶枯病抗性中的应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及OsAGO18基因在提高水稻对水稻条纹叶枯病抗性中的应用。

背景技术

水稻条纹叶枯病是由灰飞虱为媒介传播的，由水稻条纹病毒（Rice Stripe Virus，RSV）引起的病毒病，俗称水稻上的癌症。病株常枯孕穗或穗小畸形不实。水稻苗期发病之初在心叶基部呈现断续的黄绿色或黄白色短条斑，以后病斑增大合并，扩展成与叶脉平行的黄绿色条纹，条纹间仍保持绿色；拔节后发病在剑叶下部出现黄绿色条纹，各类型稻均不枯心，但抽穗畸形，结实很少。

水稻条纹病毒（Rice Stripe Virus，RSV），属纤细病毒属（Tenuivirus）的代表种。该病毒具有独特的基因组结构和编码策略，基因组共有四条单链RNA，其中RNA2、RNA3和RNA4均采取双义编码策略，即在RNA的正义链和互补链均有ORF，都可以编码蛋白。RNA2编码NS2和NSvc2蛋白，其功能不详；RNA3编码外壳蛋白NCP和RNA沉默抑制子NS3；RNA4编码的SP为病害特异蛋白，NSvc4为移动蛋白；RNA1只编码一个RdRP蛋白。水稻条纹病毒（RSV）是严重危害我国水稻生产的主要病毒之一。由于对水稻病毒和寄主之间的相互作用机制缺乏系统了解，因而长期以来，尚无法设计出一些能彻底控制病毒病危害的策略。自上世纪七十年代中期以来，分子生物学快速发展，使人们对于病毒基因结构、病毒致病及植物抗病机理等有了一定的了解，并启发了利用基因工程手段防治病毒病的一系列策略，如利用外壳蛋白介导的抗性及利用转录后的基因沉默介导的抗性等。随着病毒全基因组序列的分析完成、部分病毒重要功能基因的解析、水稻高效转基因技术的成熟应用与突变体库的建成以及病毒与寄主相互作用机制，尤其是对转录后基因沉默机制的认识，为从转基因分子水平鉴定病毒基因致病性和其与寄主分子相互作用，以及从基因工程水平实施高效抗病育种提供了创新可能。

突变体是研究功能基因组学的基础，是分离基因和鉴定基因功能的重要途径。自20世纪70年代以来，全球建立了一系列的突变体库。随着水稻全基因组测序工作的完成，水稻突变体已广泛应用于鉴定调控水稻形态和生理性状与基因的连锁分析及其相关基因的克隆和功能研究。与水稻表达谱数据相结合，通过对植物抗病相关基因的突变体进行筛选及转基因植物功能互补分析验证，是研究抗病相关基因及其作用的分子遗传机制的重要途径。

RNA沉默是真核生物基因表达调控的一种非常重要的策略，也是植物抵抗病毒侵染的一个方法。研究病毒和寄主之间在RNA沉默和RNA沉默的抑制对了解真核生物的基因表达调控将有重要的推动作用。该技术目前已被国际研究领域公认并应用于抗病基因工程育种以及功能基因研究。经典遗传学实验材料进行的RNA沉默实验显示了RNA沉默的几个特点：特异、高效、可扩散。与先前的正义或反义RNA技术相比，RNA沉默技术或人工构建miRNA等对同源基因表达的抑制效应至少高10倍以上。如何快速、高效地构建目标基因的反向重复序列，就成了当前利用RNA沉默机制获取对相关病毒免疫的工程植株的关键步骤。

在RNA沉默过程中包含了3个主要元件：分别为DCLs、AGO和RDR，其在植物抗病毒防御中都发挥重要作用。Dicer（DCLs）是一种Ⅲ型内切核酸酶，可以特异性识别生物体内的双链RNA，或单链RNA折叠形成的双链区域，产生长度为20～25nt的小RNA。所有的Dicer都具有一个同源的核酶结构域：RNaseⅢ结构域。这个结构域可以切割双链RNA产生duplex片段，切割产物一般具有5’磷酸集团及具有2个碱基突起的3’末端。大多数病毒在侵染复制过程中都会产生dsRNA形式，而这种dsRNA又会被生物体内的Dicer（DCL2、DCL3和DCL4等）识别并切割生成vsiRNA（virus-derived small interfering RNAs），从而阻断病毒的复制和转录过程。Argonaute（AGO）蛋白，一个RNA结合蛋白，大小在90～100kDa，是RNA沉默过程中的核心组分可以与siRNA，miRNA或piRNA结合，形成有活性的RISC（RNA-induced silencing complex）。RDR，RNA依赖性RNA聚合酶（RNA-dependent RNApolymerase，RDR），以RNA单链为模板合成dsRNA，在DCLs切割下产生small RNAs。最新的研究结果揭示，病毒和宿主RDRs合成的dsRNA作为主要的切割底物，以及源于R Vaistijand Jones DR6介导产生的dsRNA所产生的次级siRNAs具有更加有效的抗病毒反应。然而，这可能不是普遍现象，其结果可能取决于对特定的病毒。在病毒与寄主的长期进化过程中，RNA沉默（RNA silencing）成为植物抵抗病毒侵染的一种保守的防御机制。而作为相互竞争的另一方，病毒也不会坐以待毙，现在认为绝大多数的病毒都会编码一种抑制基因沉默的蛋白因子（VSR），这种蛋白因子通过各种不同的方式作用于RNA沉默通路的不同位点从而抑制RNA沉默对病毒的切割。

在水稻病毒的研究中，最新的研究显示在miRNA水平上水稻矮缩病毒（Rice dwarf virus，RDV）和水稻条纹病毒（Rice stripe virus，RSV）可能在致病机制上存在很大差异，RDV侵染水稻后对水稻miRNA影响并不明显，而RSV决然相反，它不但极大的影响了水稻miRNA的变化，而且还诱导了大量miRNA^*（miRNA star）和新的Phased MicroRNAs的产生，并且这些miRNA^*和Phased MicroRNAs在RSV侵染条件下能够有效调控其靶基因的变化，这些新的发现则告诉我们dsRNA病毒和ssRNA病毒在致病机制上存在明显差异，并且水稻miRNA参与了RSV的抗病毒防御防御（Du et al.,2011）。

Solexa测序技术是深度测序技术中的一种，属于第二代测序技术，它们的兴起与发展为基因组与RNA研究提供了非常好的工具，通过该技术可以高通量测定核苷酸的序列，此方法不仅在小RNA测序中得到广泛应用，而且在研究基因组甲基化，转绿组和基因组重测序中也占据绝对优势。深度测序技术可以揭示RSV和水稻互作过程中的许多信息，比如水稻RNA沉默相关蛋白在抗病防御中的作用。在深度测序前需要构建小RNA库和mRNA库，首先提取分别提取感染RSV的水稻和健康水稻组织中的总RNA，分别构建mRNA和小RNA库，在其两端接上接头，进行逆转录和PCR。得到的cDNA进行深度高通量测序。

随着高通量分子生物学技术的广泛应用，它带给我们将是海量的数据信息，这些信息的分析必需依靠强大的生物信息学平台的支撑。水稻基因组和RSV基因组均已经测序完成，这为我们后续的生物信息学分析提供了很好的数据平台。

发明内容

本发明的目的是提供一种OsAGO18蛋白及其编码基因在调控植物抗水稻条纹叶枯病中的应用。

本发明所提供的应用，具体为如下A或B：

A：蛋白质在如下a1）或a2）中的应用：

a1）调控植物对水稻条纹叶枯病的抗性；

a2）选育对水稻条纹叶枯病抗性增强的植物品种；

所述蛋白质由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成或由序列表中序列4所示的氨基酸序列组成。

B：蛋白质的编码基因或含有所述编码基因的重组载体，在如下a1）或a2）中的应用：

a1）调控植物对水稻条纹叶枯病的抗性；

a2）选育对水稻条纹叶枯病抗性增强的植物品种；

其中，由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成蛋白质命名为OsAGO18蛋白（编码基因为序列1，命名为OsAGO18基因），由序列表中序列4所示的氨基酸序列组成蛋白质则为在OsAGO18蛋白的N端连接了MYC标签后得到的融合蛋白（编码基因为序列3）。

在本发明中，以上所有a1）中的所述调控植物对水稻条纹叶枯病的抗性均具体体现在：促进所述蛋白质或其编码基因的表达，则所述植物对水稻条纹叶枯病抗性增强。以上所有a2）中的所述选育对水稻条纹叶枯病抗性增强的植物品种的方法，均具体可包括将所述蛋白质或其编码基因的表达量较高的植株作为亲本进行杂交的步骤。

本发明的再一个目的是提供一种培育对水稻条纹叶枯病抗性增强的转基因植物的方法。

本发明所提供的培育对水稻条纹叶枯病抗性增强的转基因植物的方法，具体可包括如下步骤：

a）向目的植物中导入由序列表中序列2或序列4所示的氨基酸序列组成的蛋白质的编码基因，得到表达所述编码基因的转基因植物；

b）从步骤a）所得转基因植物中得到与所述目的植物相比，对水稻条纹叶枯病抗性增强的转基因植物。

在上述的应用或方法中，所述蛋白质的编码基因，是如下1）至4）中任一所述的DNA分子：

1）序列表中序列1所示的DNA分子；

2）序列表中序列3所示的DNA分子；

3）在严格条件下与1）或2）所限定的DNA分子杂交且编码所述蛋白质的DNA分子；

4）与1）-3）任一限定DNA分子具有90%以上同源性且编码所述蛋白质的DNA分子。

上述严格条件可为用6×SSC，0.5%SDS的溶液，在65℃下杂交，然后用2×SSC，0.1%SDS和1×SSC，0.1%SDS各洗膜一次。

其中，序列1由3267个核苷酸组成，其中第1-3267位为所述OsAGO18基因的编码序列（ORF），编码序列表中序列2所示的蛋白质，序列2由1088个氨基酸残基组成。序列3由3300个核苷酸组成，其中第1-3300位为编码序列（ORF），编码序列表中序列4所示的融合蛋白，序列4由1099个氨基酸残基组成。

本领域的技术人员懂得，可以通过点突变、添加或缺失基因序列中的一个或多个碱基，影响该基因编码的蛋白功能。因此，本发明应该被理解为包括了对OsAGO18基因进行的上述变异。OsAGO18基因的序列不局限于序列表中序列1所示，还包括将其编码蛋白功能区中某氨基酸残基对应的任一密码子进行突变的DNA序列。主要是将有功能的氨基酸残基突变成一般被认为无特殊功能的丙氨酸。

在所述方法中，所述蛋白质的编码基因是通过含有所述蛋白质的编码基因的重组表达载体导入所述目的植物中的。

所述重组表达载体可用现有的植物表达载体构建。所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等，如pCAMBIA3301、pCAMBIA2300、pCAMBIA2301、pCAMBIA1300、pCAMBIA1301、pWM101、pGreen0029、pBI121、pBin19、pCAMBIA1301-UbiN等或其它衍生植物表达载体。所述植物表达载体还可包含外源基因的3’端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3’端。使用所述基因构建重组表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型、组成型、组织特异型或诱导型启动子，例如花椰菜花叶病毒（CAMV）35S启动子、泛素基因Ubiquitin启动子（pUbi）、胁迫诱导型启动子Rd29A等，它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建重组表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用重组表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因、具有抗性的抗生素标记物或是抗化学试剂标记基因等。也可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。

在本发明中，所述重组表达载体中启动所述编码基因转录的启动子具体为Actin启动子。

更为具体的，所述重组表达载体为将所述编码基因替换pCam23ACT:OCS载体的酶切位点Sma I和Sal I之间的小片段后得到的重组质粒。在该重组表达载体中，启动所述编码基因转录的启动子为所述Actin启动子。

在上述方法中，将携带有所述编码基因的所述重组表达载体导入所述目的植物，具体可为：通过农杆菌介导法、基因枪法、电击法、花粉管导入法、脂质体融合法以及其他任意可将质粒导入的方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物组织培育成植株。

在上述应用或方法中，所述植物可为单子叶植物或双子叶植物。

所述单子叶植物为禾本科植物。

在本发明中，所述植物为水稻。进一步，水稻品种最好为对RSV敏感的品种，如中花11、秀水11、日本晴、武育粳3号等。

更加具体的，在本发明的一个实施例中，所述植物为水稻品种日本晴。

在上述应用或方法中，所述水稻条纹叶枯病的病原菌具体为水稻条纹病毒（Rice StripeVirus）。

实验证明，本发明发现OsAGO18是一个能够被病毒特异性诱导的抗病基因，在水稻条纹病毒（RSV）侵染水稻ago18突变体后，病毒粒子积累量较水稻野生型明显增加，病症也更加严重，基本无产量；相反，RSV侵染过表达OsAGO18转基因水稻后，病毒粒子积累量明显低于野生型水稻，病症也较轻，发病率下降，表明OsAGO18基因具有提高水稻抗病毒的能力。

附图说明

图1为OsAGO18mRNA在水稻条纹病毒侵染后积累的实验结果。Realtime PCR分析OsAGO18mRNA在RSV侵染后被诱导。其中，WT表示未被RSV侵染的野生型水稻品种日本晴；WT-RSV表示被RSV侵染发病的野生型水稻品种日本晴。以内参基因水稻EF的表达量为1。

图2为OsAGO18蛋白在水稻条纹病毒侵染后积累的实验结果。RSV侵染水稻后OsAGO18蛋白被显著诱导。其中，WT-Mock表示未被RSV侵染的野生型水稻品种日本晴；WT-RSV表示被RSV侵染发病的野生型水稻品种日本晴。

图3为ago18突变体T-DNA插入位置信息与鉴定结果。其中，A为RT-PCR方法鉴定ago18突变体（NF6013），LP+RP表示使用引物对6013_LP/6013_RP进行扩增的结果，LB+RP表示使用引物对tos17_tail6(LB)/6013_RP进行扩增的结果，AGO18表示使用引物对OsAGO18-F/OsAGO18-R进行扩增的结果，Actin表示使用引物对Actin-RT-F/Actin-RT-R进行扩增的结果；B为Tos17插入位点示意图。

图4为实施例2中各水稻品系接种RSV病毒后的病症图。其中，WT-mock表示未被RSV侵染的野生型水稻品种日本晴；WT-RSV表示被RSV侵染发病的野生型水稻品种日本晴；ago18-mock表示未被RSV侵染的ago18突变体纯合子；ago18-RSV表示被RSV侵染的ago18突变体纯合子。

图5为感病ago18突变体水稻中RSV CP mRNA与基因组RNA积累的结果。其中，A为realtime PCR检测RSV外壳蛋白CP mRNA的积累情况；B为mRNA Northern blot检测RSV基因组4条RNA链的积累情况。其中，wt-mock表示未被RSV侵染的野生型水稻品种日本晴；wt-RSV表示被RSV侵染发病的野生型水稻品种日本晴；ago18-mock表示未被RSV侵染的ago18突变体纯合子；ago18-RSV表示被RSV侵染的ago18突变体纯合子。A中，以内参基因水稻EF的表达量为1，^**表示与wt-RSV相比差异极显著（P<0.01）。

图6为OsAGO18过表达转基因水稻的鉴定结果。其中，A为RT-PCR鉴定结果；B为Westernblot鉴定结果。

图7为实施例3中各水稻品系接种RSV病毒后的病症图。其中，Mock表示未被RSV侵染的野生型水稻品种日本晴；WT-RSV表示被RSV侵染发病的野生型水稻品种日本晴；Vector-RSV表示被RSV侵染的转空载体水稻；ago18-RSV示被RSV侵染的ago18突变体纯合子；AGO18OE-5-RSV表示被RSV侵染的转基因水稻株系5#；AGO18OE-2-RSV表示被RSV侵染的转基因水稻株系2#；AGO18OE-1-RSV表示被RSV侵染的转基因水稻株系1#。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

水稻（Oryza.sativa L.）品种日本晴：即日本晴水稻（Oryza sativa L.japonica.cv.Nipponbare），参考文献：水稻品种“日本晴”.农业科技通讯，1973年02期。公众可从北京大学获得。

水稻（Oryza.sativa L.）品种武育粳3号：为水稻条纹病毒（RSV）易感品种，参考文献：武育粳3号土传病害发生特点与防治技术,江苏农业科学，1996年01期。公众可从北京大学。

水稻（Oryza.sativa L.）品种镇稻88：为水稻条纹病毒（RSV）抗感品种。该品种记载于“水稻新品种——镇稻88，农业科技通讯，1998年第05期”一文，公众可从北京大学获得。

水稻条纹病毒（Rice Stripe Virus，RSV）：记载于“蔡小卫,赵俊玲,邵英,桂青清,刘芳.灰飞虱传播水稻条纹病毒的研究综述.中国植保导刊，2011年09期”一文，公众可从北京大学获得。

农杆菌EHA105：记载于“Zhu et al.,2005.The Rice Dwarf Virus P2 Protein interacts withent-Kaurene Oxidases in vivo,leading to reduced biosynthesis of Gibberellins and rice dwarfsymptoms.Plant Physiology.139:1935-1945.”一文，公众可从北京大学获得。

pEASY-simple-T1载体：北京全式金生物技术有限公司产品，其产品目录号为CT111-01。

pCam23ACT:OCS载体：记载于“Liang Wu et al.,2009.Rice MrcroRNA Effector Complexesand Targets.Plant Cell.21(11):3421-3435.”一文，公众可从北京大学获得。。

实施例1、发现OsAGO18基因能够被水稻条纹病毒诱导表达

本实施例中所涉及的OsAGO18基因来源于水稻（Oryza.sativa L.），OsAGO18基因的cDNA序列如序列表中序列1所示，序列1由3267个核苷酸组成，其中第1-3267位为编码序列（ORF）；序列1编码序列表中序列2所示的蛋白质，序列2由1088个氨基酸残基组成。

一、OsAGO18基因mRNA在水稻条纹病毒侵染后积累

取被水稻条纹病毒（RSV）侵染发病的野生型水稻（Oryza.sativa L.）品种日本晴和对照组水稻（未被水稻条纹病毒侵染的野生型水稻品种日本晴）各0.5g，在液氮中研磨后，依照Invitrogen公司的TRIzol Reagent说明书（Invitrogen Trizol Reagent，cat No.15596-018）提取总RNA。测定总RNA浓度后，取10μg总RNA，按照RQ1 Dnase（Promega，货号：M610A）的说明书对总RNA中的水稻基因组DNA进行消化。消化反应体系：总RNA10μg，10×Dnase缓冲液10μl，DNase10μl，DEPC水补足100μl。将整个消化反应体系于37℃孵育35min。孵育后向体系中加入4μl RQ1 DNase终止反应液，65℃孵育10min，使DNase灭活。

消化基因组DNA后，再利用氯仿抽提法浓缩总RNA，测定RNA浓度，取2μg RNA参照Invitrogen公司的SuperScript II逆转录酶进行反转录，所用引物为16个核苷酸的Oligod（T）引物，具体方法参见invitrogen M-MLV Reverse Transcriptase（货号：28025-021）。以反转录获得水稻cDNA为模板，利用realtime PCR的方法对OsAGO18基因的转录水平进行检测，实验方法参照TOYOBO SYBRGreen Realtime PCR Master Mix（货号QPK-201）说明书，引物为：

OsAGO18-F：5’-TGTTCGTCCAGGCACAGTAG-3’（序列1的第2901-2920位）；

OsAGO18-R：5’-GCGGTGAAGTTGTTGTCGTC-3’（序列1的第3022-3041位的反向互补序列）。

内参基因为水稻EF，引物为：

OsEF-1a-F：5’-GCACGCTCTTCTTGCTTTCACTCT-3’；

OsEF-1a-R：5’-AAAGGTCACCACCATACCAGGCTT-3’。

数据处理方法，参照bio-rad公司CFX96型号实时定量荧光PCR仪自带软件CFX manager^TMSoftware（Version2.1）。

结果如图1所示，可见在mRNA水平上，OsAGO18基因在RSV侵染水稻后明显富集，表明RSV侵染水稻后能够诱导OsAGO18基因的表达，使该基因的转录水平提高。

二、OsAGO18蛋白在水稻条纹病毒侵染的水稻中积累

以被水稻条纹病毒（RSV）侵染发病的野生型水稻（Oryza.sativa L.）品种日本晴和对照组水稻（未被水稻条纹病毒侵染的野生型水稻品种日本晴）的叶片为实验材料，利用2×SDS上样缓冲液提取总蛋白，采用Western blot方法检测OsAGO18蛋白在两水稻中的积累情况。具体如下：

（1）SDS-PAGE电泳操作流程及注意事项参见《蛋白质的SDS－PAGE凝胶电泳》：

（2）SDS-PAGE凝胶转膜：

1)将蛋白胶放于玻璃板上，测量大小，剪取相同大小的PVDF膜，做好标记，将膜放于100％甲醇内浸润超过10秒；

2)剪取相同大小的六块滤纸，三张一份，与胶和PVDF膜放于转膜缓冲液内平衡超过10分钟；

3)在转膜缓冲液中将三张一份的滤纸放于最底层，依次放上蛋白胶、PVDF膜、另外三张滤纸，对齐后一手捏紧一角，另一手挤压滤纸，除去所有气泡，调整角度，重新挤压气泡；

4)将转膜槽放于冰盒内，灌注转膜缓冲液，将中间固定好蛋白胶和PVDF膜的双层滤纸放于海绵夹层中，置于转膜模具内，之后将PVDF膜朝向正极放入转膜槽内中，根据目的蛋白大小选择合适电流和时间恒流转膜；

（3）蛋白质的免疫检测：

1）取出PVDF膜放于平皿中，加入约25ml PBS-T，脱色摇床上摇动洗膜5分钟；

2）在平皿内加入50ml封闭液（含5％脱脂奶粉的50ml PBS-T），脱色摇床摇动将膜封闭过夜；

3）大体积（约30ml）PBS-T洗膜5分钟，洗2次；

4）将膜放于三面剪开的杂交袋中，热封两边后按每平方厘米0.1ml加入稀释好的一抗（利用特异性较高的多肽AGO18N，即序列5所示多肽，作为免疫原，免疫兔子，制备获得的抗水稻OsAGO18蛋白的多克隆抗体），封闭最后一边，室温反应2小时；其中一抗稀释液为含0.25%BSA的PBS-T，一抗的稀释比例取决于所用抗体的效价和转到膜上目的蛋白的量，期间要至少每隔5分钟混匀一次杂交袋；

5）剪开杂交袋，将膜放于平皿内加入20ml PBS-T洗10分钟，洗3次；后用20ml TBS-T洗膜10分钟，洗2次；

7）依照一抗反应的方法，将膜放于新的杂交袋中，加入稀释好的二抗（兔抗，Promega公司，货号：0000089056）在杂交袋中反应1小时，二抗稀释液为含0.25%BSA的TBS-T；

8）20ml TBS-T漂洗10分钟，漂洗4次；

9）利用Western blot显影kit（Immobilon^TM Western：MILLIPORE上海贸易有限公司，货号：1305701）进行显影，利用柯达X-OMAT BT医用X射线胶片检测结果；

（4）实验所需试剂：

1）2×SDS上样缓冲液10mL：甘油2Ml；溴酚蓝0.0202g；1MTris-HCl（pH6.8）1mL；β-巯基乙醇0.14mL；10%SDS4mL；加ddH₂O至10mL，保存于-20℃。

2）转膜缓冲液1L：39mM甘氨酸：2.9g；Tris 5.8g；SDS 0.37g；甲醇：200ml。

3）碱性磷酸酶缓冲液100ml：100mM NaCl；5mM MgCl₂；100mM Tris-Cl pH9.5。

4）PBS-T1L pH7.5：1M磷酸二氢钠31.6ml；1M磷酸氢二钠68.4mlTween 20 0.1%1ml；水900ml；调pH后定容1L。

5）TBS-T 1L pH7.6：Tris 2.42g；NaCl 8g；Tween 20 1ml；水900ml；调pH后定容1L。

6）封闭液100ml：100ml TBS-T内加入5克脱脂奶粉。

7）抗稀释液100ml：100ml PBS-T内加入0.25克BSA。

Western blot实验以tubulin蛋白为内参，其一抗为Tubulin单克隆抗体（鼠源，Sigma公司，货号：T6793）；二抗为鼠抗anti-mouse（Promega公司，货号：0000089661）。

实验结果如图2所示，OsAGO18蛋白在对照组水稻（未被水稻条纹病毒侵染的野生型水稻品种日本晴）中含量较低，但在被水稻条纹病毒（RSV）侵染发病的野生型水稻（Oryza.sativaL.）品种日本晴中可以观察到OsAGO18蛋白的含量较高，说明OsAGO18蛋白也能在水稻条纹病毒（RSV）侵染的条件下富集。

实施例2、OsAGO18基因参与水稻抗RSV防御反应

一、ago18水稻突变体纯合子的获得

ago18突变体种子（NF6013）在Tos17数据库中购买

（https://tos.nias.affrc.go.jp/～miyao/pub/tos17/）。

T-DNA插入序列为：

tos17_tail6(LB)：5’-AGGTTGCAAGTTAGTTAAGA-3’。

插入位点如图3中B所示。

利用数据库中提供的方法鉴定ago18突变体的纯合子

（https://pc7080.abr.affrc.go.jp/cgibin/tos17/ricegenome.cgi?action=getTarget&chr=7&pos=16895280&primer=y&version=7）。

以上述鉴定得到的水稻ago18突变体（NF6013）纯合子的cDNA为模板，以6013_LP/6013_RP引物对、tos17_tail6(LB)/6013_RP引物对、OsAGO18-F/OsAGO18-R引物对，分别进行半定量RT-PCR反应。同时设置野生型水稻（Oryza.sativa L.）品种日本晴作为对照。

引物序列如下：

6013_LP：5’-GATCGAGGGAACTCGACAAG-3’；

6013_RP：5’-CAAGATCAACTCCACGCAAA-3’。

tos17_tail6(LB)、OsAGO18-F和OsAGO18-R序列见上文。

以Actin为内参，引物如下：

Actin-RT-F：5’-CTTCGTCTCGACCTTGCTGGG-3’；

Actin-RT-R：5’-GAGAAACAAGCAGGAGGACGG-3’。

结果如图3中A所示，由图可见水稻ago18突变体（NF6013）纯合子仅采用引物对tos17_tail6(LB)/6013_RP可以扩增相应的目的条带，而采用6013_LP/6013_RP引物对和OsAGO18-F/OsAGO18-R引物对均未扩增出相应的目的条带。而作为对照的野生型水稻（Oryza.sativa L.）品种日本晴采用6013_LP/6013_RP引物对和OsAGO18-F/OsAGO18-R引物对均扩增出相应的目的条带，但采用tos17_tail6(LB)/6013_RP引物对未扩增出相应的目的条带。与预期结果一致。

二、OsAGO18基因参与水稻抗RSV防御反应

1、RSV侵染ago18突变体水稻后，水稻发病率提高，症状加重

以带RSV病毒的灰飞虱侵染同时期（分蘖期）的野生型水稻（Oryza.sativa L.）品种日本晴、水稻（Oryza.sativa L.）品种武育粳3号、水稻（Oryza.sativa L.）品种镇稻88和步骤一获得的ago18突变体纯合子（实验组）。以无毒灰飞虱侵染相应的水稻作为对照组。

2周后检测水稻发病情况（水稻发病情况鉴定参照文献《稻麦主要病毒病识别与控制》一书中第一章），分别统计实验组与对照组的发病率。统计发病率的同时，观察水稻发病后的表型在不同的实验组之间的区别。

实验组中，各水稻品系的发病率统计结果如表1所示。可见，RSV病毒侵染ago18突变体以及易感水稻品种武育粳3号后，水稻发病率较高；而RSV病毒侵染抗感水稻品种镇稻88后，水稻发病率较低。与预期结果一致。进一步，各水稻品系接种RSV病毒后的病症图如图4所示，RSV侵染ago18突变体后，心叶退绿条带较野生型明显增多。

表1 RSV侵染各水稻品系后发病率统计

水稻品系	N^a	D^b	P^c
				日本晴	31	10	32.3%
ago18突变体	83	70	84.3%
				武育粳3号(易感cv.^d)	34	24	70.6%
镇稻88(抗感cv.^d）	32	2	6.3%

注：a:被观测的水稻总株数；b:侵染两周后具发病表型的水稻株数；c:发病水稻占全部被侵染水稻的比例；d:昆虫介体无水稻品系偏好性对照。

2、实时定量荧光PCR方法检测病毒CP蛋白在发病的ago18突变体水稻中的积累

取步骤1中获得的发病的野生型水稻品种日本晴和发病的ago18突变体水稻叶片各0.5g，在液氮中研磨后，依照Invitrogen公司的TRIzol Reagent说明书（Invitrogen Trizol Reagent，cat No.15596-018）提取总RNA。测定总RNA浓度后，取10μg总RNA，按照RQ1 Dnase（Promega，货号：M610A）的说明书对总RNA中的水稻基因组DNA进行消化，具体同实施例1步骤一。

消化基因组DNA后，进行反转录，具体同实施例1步骤一。以反转录获得水稻cDNA为模板，利用realtime PCR的方法对RSV CP基因进行检测，实验方法参照TOYOBO SYBRGreenRealtime PCR Master Mix（货号QPK-201）说明书，引物为：

CP-F：5’-ATGGGCACCAACAAGCCAG-3’；

CP-R：5’-GACTTAGGGAGTGAGTTGTG-3’。

内参基因为水稻EF，引物为：

OsEF-1a-F：5’-GCACGCTCTTCTTGCTTTCACTCT-3’；

OsEF-1a-R：5’-AAAGGTCACCACCATACCAGGCTT-3’。

数据处理方法，参照bio-rad公司CFX96型号实时定量荧光PCR仪自带软件CFX manager^TMSoftware（Version2.1）提供的通用2^-△△C(t)方法。

结果如图5中A所示，在mRNA水平上，RSV CP基因在发病的ago18突变体水稻中明显富集，与步骤1中测得的ago18突变体较野生型水稻品种日本晴更感病，抗病性减弱相一致。

3、Northern blot实验检测RSV基因组RNA链在发病水稻中的积累情况

以步骤1中获得的发病的野生型水稻品种日本晴、发病的ago18突变体水稻、未发病的野生型水稻品种日本晴、未发病的ago18突变体水稻为实验材料。分别取各水稻材料叶片2g，在液氮中研磨成粉末，依照Invitrogen公司的TRIzol Reagent说明书（Invitrogen Trizol Reagent，cat No.15596-018）提取总RNA，测定浓度后，备用。

A.在通风厨内制备1.2%的琼脂糖甲醛变性胶120ml：87.6ml DEPC水中加入1.44g琼脂糖，微波炉加热使琼脂糖融化，后冷却至温度为60℃左右，后加入12ml 10×mops母液和20.4ml甲醛。摇晃混合均匀后，迅速倒入胶槽内并插入梳子。

B.在10-20μg的RNA样品中加入RNA loading buffer，100℃加热10分钟，后放置在冰上变性2-3min，上样前离心1-2min。

C.移液器将变性后的样品加入到冷却好的琼脂糖甲醛变性胶中，电泳液为1×mops溶液，电压100V，电泳3-4个小时。切胶并放于20×SSC溶液平衡10-20min。

D.电泳完毕用两种方法转膜：真空转移法和毛细管转移。毛细管转移的基本方法：在培养皿倒入20×SSC溶液，在玻璃板上搭上2-3层的滤纸形成纸桥。再把胶放在纸桥上，PDVF膜放在胶的上面，再放上3层滤纸以及10-25cm后的吸水纸。再上压重物，转膜24-36小时。真空转移的方法原理和毛细管转移一样，使用抽真空仪器，较快溶液转移的速度。

E.紫外交联：能量为1800对膜进行交联。之后可放80℃烤膜30min。处理好的膜可用亚甲基蓝染色，及检测之前步骤中RNA的有无降解及上样量是否一致。染色得到的rRNA的条带可用作control。

F.将膜放于含有预杂液（Sigma公司，货号为SLBG7228V）的杂交瓶，65℃条件下预杂1-2小时。

G.将标记好的探针（用于扩增四条RNA链探针的引物序列见下文）放置于100℃变性10min，后放置于冰上3min冷却。将其添加到预杂液中，65℃条件下杂交过夜（24小时以上）。标记探针随机引物法反应体系参照TAKARA公司探针标记试剂盒提供的方法（货号D6045）：

ddH₂O补加体积到50μl	29μl
		Labeling 5×buffer	10μl
未标记的dNTPs混合物	2μl
		变性的RNA模板（30-50ng）	1μl
BSA	2μl
		α-32P dCTP（50μCi，3000Ci/mmol）	5μl
DNA聚合酶I Klenow大片段（5U）	1μl

扩增四条RNA链探针所用的引物如下所示（5’-3’）：

RSV-RNA1-F：5’-GCACCCAATAGGTATCTCCTTGAT-3’；

RSV-RNA1-R：5’-CAAATGACCCTACTAGATGGACGA-3’。

RSV-RNA2-F：5’-CAACCACCCTTATCACAAACTTCA-3’；

RSV-RNA2-R：5’-CACCAATACCTTTCCCTGACACCC-3’。

RSV-RNA3-F：5’-TATATGGGCACCAACAAGCCAGCC-3’；

RSV-RNA3-R：5’-TATGACTTAGGGAGTGAGTTGTGCAGT-3’。

RSV-RNA4-F：5’-GCTTCACCACACCGAACTCCTTCT-3’；

RSV-RNA4-R：5’-GTTACGATTG ACCAAGCTGCCACA-3’。

H.杂交完毕，用2×洗膜液（2×SSC，加入SDS至终浓度为1g/L）在65℃洗膜两次，每次20分钟。然后用0.1×洗膜液（0.1×SSC，加入SDS至终浓度为1g/L），65℃洗膜1次，约20分钟。

I.膜晾干，并用保鲜膜包好，检测放射强度。压片（X光片或磷屏），时间根据放射强度决定压片时间长短。

实验同时以rRNA作为对照。

实验结果如图5中B所示，RSV基因组四条RNA链在ago18突变体水稻中富集量均高于野生型水稻日本晴，这进一步表明RSV在ago18突变体中复制量增加。与步骤1中测得的ago18突变体较野生型水稻品种日本晴更感病，抗病性减弱相一致。

以上结果均证明，OsAGO18基因参与水稻抗病毒防御反应，水稻失去该基因后更加容易感病，且病症更加严重，病毒粒子复制量增加。

实施例3、过表达OsAGO18的转基因水稻抗病性增强

一、OsAGO18基因植物表达载体的构建

1、水稻cDNA模板的获得

依照说明书，用Invitrogen公司的TRIzol Reagent提取日本晴水稻（Oryza sativa L.japonica.cv.Nipponbare）总RNA，用该公司的SuperScript II逆转录酶进行逆转录。逆转录所用引物为16个核苷酸的Oligod（T）引物，最终获得逆转录所得的水稻cDNA模板。

2、水稻OsAGO18基因的获得

以步骤1获得的水稻cDNA为模板，用如下引物对进行PCR扩增。

AGO18cds-F：5’-ATAATGGCGAGCCGAGGAGGAGGC-3’（该序列的第4-24位为序列1的第1-21位，前三位的ATA为保护碱基）；

AGO18cds-R：5’-GACCTAGCAAAAGAACATGGACTTTTTC-3’（该序列的第4-28位为序列1的第3243-3267位的反向互补序列，前三位的ATA为保护碱基）。

PCR得到片段后，将全长的序列连接pEASY-simple-T1载体上，转化大肠杆菌，提质粒进行测序。将经测序表明在pEASY-simple-T1载体中正向连入“ATA+序列1+GTC”所示DNA片段后的重组质粒命名为pEASY-OsAGO18。

3、OsAGO18基因植物表达载体的构建

以步骤2获得的重组质粒pEASY-OsAGO18为模板，以如下引物进行PCR扩增。

AGO18cds-Sma 1-MYC-F：5’-ATA cccggg ATG GAG CAG AAG CTG ATC TCA GAG GAG GAC CTG-ATG GCG AGC CGA GGA GGA GGC-3’（下划线小写字母部分为Sma I的识别序列，下划线大写字母部分为MYC标签序列，-后的序列为序列1的第1-21位）；

AGO18cds-Sal 1-R：5’-GAC gtcgac CTAGCAAAAGAACATGGACTTTTTC-3’（下划线小写字母部分为Sal I的识别序列，-后的序列为序列1的第3243-3267位的反向互补序列）。

将PCR产物用SmaI和SalI酶切（NEB公司产品，货号分别为：R0141和R0138），胶回收后与经过同样双酶切的pCam23ACT:OCS载体的骨架大片段相连，得到重组质粒。

将经SmaI和SalI双酶切初步鉴定正确的重组质粒（得到大小约为10300bp和3300bp的条带）送样测序。将经测序表明将pCam23ACT:OCS载体的酶切位点Sma I和Sal I之间的小片段替换为序列表中序列3所示DNA片段的重组质粒命名为pCambia2300-Actin-MYC-OsAGO18。序列3与序列1相比，在序列1所示的OsAGO18基因的5’端多出了MYC标签序列。序列3编码序列表中序列4所示的蛋白质（MYC标签与OsAGO18的融合蛋白）。

在重组表达载体pCambia2300-Actin-MYC-OsAGO18中，启动序列3所示DNA片段转录的启动子为Actin动子。

二、过量表达转OsAGO18基因水稻的获得

1、愈伤组织的诱导培养

将日本晴水稻（Oryza sativa L.japonica.cv.Nipponbare，以下简称为野生型水稻）种子去壳，先用70%（体积分数）乙醇浸泡10min，再用0.1%（体积分数）升汞浸泡30min；进行表面除菌。用大量无菌水洗去种子表面的溶液，用无菌滤纸吸去种子表面的水分。将种子置于成熟胚愈伤诱导培养基（培养基配方见下文）平板上，用Parafilm膜封闭平皿边缘，于26℃温箱内避光培养。大约15天后，小心取下长出的愈伤组织，转移到成熟胚继代培养基（培养基配方见下文）上，同样条件继续进行培养。每两周需进行一次继代培养。用于转化时，需挑选继代培养5天左右、呈淡黄色的颗粒状愈伤组织。

其中，所需要的培养基配方如下：

a)NB基本培养基：

b)成熟胚愈伤诱导培养基和继代培养基：

2、农杆菌的培养

将步骤一获得的重组表达载体pCambia2300-Actin-MYC-OsAGO18电转入农杆菌EHA105中，筛选能够在加了抗生素利福平和卡那霉素的LB平板上生长，而且以引物AGO18-PCR-F和AGO18-PCR-R进行PCR扩增，得到793bp的PCR产物的为阳性菌，将其命名为EHA105/pCambia2300-Actin-MYC-OsAGO18。

AGO18-PCR-F：5’-CCCAACTATTATATTTGGTGCTGAT-3’（序列1的第2475-2499位）；

AGO18-PCR-R：5’-CTAGCAAAAGAACATGGACTTTTTC-3’（序列1的第3243-3267位的反向互补序列）。

将重组农杆菌EHA105/pCambia2300-Actin-MYC-OsAGO18在含有抗生素（50mg/L Kan，50mg/L Rif）的LB平板上划线，28℃培养2天。挑取单菌落接入液体LB培养基中，28℃振荡培养至OD₆₀₀约为0.5，加入乙酰丁香酮至终浓度100mM，得到用于转化水稻愈伤组织的农杆菌悬液。

3、水稻愈伤组织与农杆菌的共培养

将步骤1准备好的继代愈伤组织放入灭过菌的锥形瓶中，倒入步骤2获得的农杆菌悬液使之浸没愈伤组织。室温放置20min，并不时轻轻晃动使愈伤组织与菌液充分接触。用无菌的镊子轻轻取出愈伤组织，放于无菌滤纸上吸去多余的菌液，转移到铺有一层无菌滤纸的共培养培养基（培养基配方见下文）平板上。28℃暗培养2-3天，得到经过共培养的愈伤组织。

4、抗性愈伤组织的筛选与分化

将经过共培养的愈伤组织用适量无菌水清洗，除去表面残余的农杆菌，放在筛选培养基（培养基配方见下文）上，26℃避光培养进行筛选，两周后转移到新的筛选培养基上继续筛选两周。挑选经过两轮筛选后状态较好的愈伤组织，将其转移到分化培养基（培养基配方见下文）平板上，先避光培养3天，然后再转至光照培养箱中（15h/day）进行光照培养。一个月后可见分化出的小苗。当分化的小苗长至约2cm时，将其转移到锥形瓶中的生根培养基（培养基配方见下文）上，继续培养两周左右。选择长势较好、根系发达的小苗，用自来水洗去根部的培养基后移栽入土壤中，收取种子，得到T₀代转OsAGO18基因水稻种子。

其中所需要的培养基配方如下：

a)共培养培养基：

（注意：液体共培养培养基中不添加2,4-D）

b)筛选培养基：

c)分化培养基：

d)生根培养基：

采用同样的方法，将pCam23ACT:OCS空载体转入野生型水稻中，得到转空载体水稻，作为对照。

三、OsAGO18基因过表达的水稻抗RSV能力增强。

1、OsAGO18转基因水稻的鉴定

将步骤二获得的T₀代转OsAGO18基因水稻种子播种，获得T₁代水稻幼苗，从中随机选取6株，编号为1#、2#、3#、4#、5#和6#。取部分叶片，在液氮中研磨，一部分做半定量RT-PCR，一部分做Western blot鉴定。

（1）半定量RT-PCR

从T₁代转OsAGO18基因水稻幼苗中提取RNA，并反转录得到cDNA。以cDNA为模板，以OsAGO18-F/OsAGO18-R引物对进行半定量RT-PCR反应。同时设置未转基因的野生型水稻（Oryza.sativa L.）品种日本晴以及步骤二获得的转空载体水稻作为对照。

引物序列如下：

OsAGO18-F：5’-TGTTCGTCCAGGCACAGTAG-3’（序列1的第2901-2920位）；

以Actin为内参，引物如下：

Actin-RT-F：5’-CTTCGTCTCGACCTTGCTGGG-3’；

Actin-RT-R：5’-GAGAAACAAGCAGGAGGACGG-3’。

结果如图6中A所示，由图可见，与未转基因的野生型水稻（Oryza.sativa L.）品种日本晴相比，6个T₁代转OsAGO18基因水稻植株中OsAGO18基因的表达量更高。而转空载体水稻植株中OsAGO18基因的表达量与未转基因的野生型水稻（Oryza.sativa L.）品种日本晴相比基本一致，无统计学意义。

RT-PCR检测中OsAGO18mRNA明显积累的株系作为RT-PCR阳性苗。

（2）Western blot鉴定

具体操作参见实施例1步骤二进行。

结果如图6中B所示，由图可见，与未转基因的野生型水稻（Oryza.sativa L.）品种日本晴相比，6个T₁代转OsAGO18基因水稻植株中OsAGO18蛋白的表达量更高。而转空载体水稻植株中OsAGO18蛋白的表达量与未转基因的野生型水稻（Oryza.sativa L.）品种日本晴相比基本一致（含量较低，基本检测不到OsAGO18的表达），无统计学意义。

Western blot检测结果中，蛋白条带较野生型明显积累（野生型水稻在非侵染条件下，基本检测不到OsAGO18的表达）的株系为western blot阳性苗。

2、RSV侵染OsAGO18过表达水稻后，水稻发病率降低，病症减轻

以带RSV病毒的灰飞虱侵染同时期（分蘖期）的未转基因的野生型水稻品种日本晴、水稻（Oryza.sativa L.）品种武育粳3号、水稻（Oryza.sativa L.）品种镇稻88、经步骤1鉴定阳性的T₁代转OsAGO18基因水稻株系1#、2#和5#，以及步骤二获得的转空载体水稻（实验组）。以无毒灰飞虱侵染相应的水稻作为对照组。

实验组中，各水稻品系的发病率统计结果如表2所示。由表可见，RSV病毒侵染T₁代转OsAGO18基因水稻株系1#、2#和5#后水稻植株的发病率均显著低于RSV病毒侵染未转基因的野生型水稻品种日本晴后水稻植株的发病率。进一步，各水稻品系接种RSV病毒后的病症图如图7所示，RSV侵染OsAGO18转基因阳性株系后，病症较野生型水稻明显变轻，退绿条纹减少，发病的叶片减少。与之相对应，RSV侵染ago18突变体水稻后，心叶退绿条带较野生型明显增多，且发病叶片较多，株高较矮。

表2 RSV侵染OsAGO18过表达水稻后发病率统计

水稻品系	N^a	D^b	P^c
				WT	97	47	48.5%
AGO18OE-5#	56	12	21.4%
				AGO18OE-2#	67	17	25.4%
AGO18OE-1#	59	19	32.2%
				武育粳3号(易感cv.^d)	34	24	70.6%
镇稻88(抗感cv.^d）	32	2	6.3%

注：a:被观测的水稻总株数；b:侵染两周后具发病表型的水稻株数；c:发病水稻占全部被侵染水稻的比例；d:昆虫介体无水稻品系偏好性对照。AGO18OE-5#、AGO18OE-2#和AGO18OE-1#分别表示被RSV侵染的转基因水稻株系5#、2#和1#。

以上实验结果表明，OsAGO18过表达后增强了植物的抗病性，使水稻不易被RSV侵染。

Claims

1.蛋白质在如下a1）或a2）中的应用：

a1）调控植物对水稻条纹叶枯病的抗性；

a2）选育对水稻条纹叶枯病抗性增强的植物品种；

2.蛋白质的编码基因或含有所述编码基因的重组载体在如下a1）或a2）中的应用：

a1）调控植物对水稻条纹叶枯病的抗性；

a2）选育对水稻条纹叶枯病抗性增强的植物品种；

3.培育对水稻条纹叶枯病抗性增强的转基因植物的方法，包括如下步骤：

4.根据权利要求1或2所述的应用，或权利要求3所述的方法，其特征在于：所述蛋白质的编码基因是如下1）至4）中任一所述的DNA分子：

1）序列表中序列1所示的DNA分子；

2）序列表中序列3所示的DNA分子；

4）与1）-3）任一限定的DNA分子具有90%以上同源性且编码所述蛋白质的DNA分子。

5.根据权利要求3或4所述的方法，其特征在于：所述编码基因是通过含有所述蛋白质的编码基因的重组表达载体导入所述目的植物中的。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述重组表达载体中启动所述编码基因转录的启动子为Actin启动子。

7.根据权利要求1-6中任一所述的应用或方法，其特征在于：所述植物为单子叶植物或双子叶植物。

8.根据权利要求7所述的应用或方法，其特征在于：所述单子叶植物为禾本科植物。

9.根据权利要求8所述的应用或方法，其特征在于：所述禾本科植物为水稻。

10.根据权利要求1-9中任一所述的应用或方法，其特征在于：所述水稻条纹叶枯病的病原菌为水稻条纹病毒。