CN114349832A

CN114349832A - 钙调素结合蛋白cold13在调控植物耐冷性中的应用

Info

Publication number: CN114349832A
Application number: CN202011088878.7A
Authority: CN
Inventors: 种康; 刘平平; 张景昱; 刘栋峰
Original assignee: Institute of Botany of CAS
Current assignee: Institute of Botany of CAS
Priority date: 2020-10-13
Filing date: 2020-10-13
Publication date: 2022-04-15
Anticipated expiration: 2040-10-13

Abstract

本发明公开了钙调素结合蛋白COLD13在调控植物耐冷性中的应用。本发明提供了COLD13蛋白或其相关生物材料在调控植物耐冷性中的应用；所述相关生物材料为能够表达所述COLD13蛋白的核酸分子或含有所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组菌或转基因细胞系；所述COLD13蛋白为SEQ ID No.1所示蛋白或其经一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加，或序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且具有相同功能的蛋白，或其N端和/或C端连接标签后得到的融合蛋白。实验证明，COLD13及其编码基因可以调控植物的耐冷性，向植物中导入COLD13的编码基因可以提高植物的耐冷性。本发明对于培育耐冷植物新品种具有重要意义。

Description

钙调素结合蛋白COLD13在调控植物耐冷性中的应用

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，具体涉及钙调素结合蛋白COLD13在调控植物耐冷性中的应用。

背景技术

钙调素结合蛋白(CaM binding protein，CaMBP)，一类能够和钙调素(Calmodulin，CaM)结合的蛋白。1982年发表了关于盘基网柄菌中CaMBPs的第一篇报告，钙调神经磷酸酶(CN)是最早发现并且仍然是特征最丰富的CaMBP之一。随着技术进步，酵母双杂、CaM探针(如35S-CaM和HRP-CaM)、免疫共沉淀和CaM琼脂糖珠分离纯化、微矩阵等方法被用来筛选CaMBP，越来越多CaMBPs被鉴定出来。植物CaM结合蛋白种类多样且数目繁多，据估计，拟南芥全基因组CaMBP的数目达500个，植物中至少有50个功能明确的CaMBP。

CaMBP在植物体内种类繁多如激酶及磷酸酶类、离子通道和膜蛋白类、转录因子等。同时具有各种不同的生理功能，如离子运输、代谢途径、细胞增殖、细胞运动等，在植物生长发育、开花受精以及逆境胁迫等方面发挥重要作用。如在烟草中调控开花的NtCBK1，在拟南芥中调控叶片发育的MYB91，在拟南芥胁迫反应中起作用的CAMTA3。据已有研究报道，已研究报道的50多个钙调素结合蛋白大致可分为激酶磷酸酶类，如水稻中OsMKP1；转录因子和辅助因子类，如拟南芥中的CBP60家族；离子通道和膜蛋白，如拟南芥中的ACA8；代谢酶类，如拟南芥中的CAT3。

发明内容

本发明的目的是提供一种涉及钙调素结合蛋白COLD13在调控植物耐冷性中的应用。

第一方面，本发明要求保护COLD13蛋白或其相关生物材料在调控植物耐冷性中的应用。

其中，所述相关生物材料可为能够表达所述COLD13蛋白的核酸分子或含有所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组菌或转基因细胞系。

所述表达盒是指能够在宿主细胞中表达COLD13的DNA，该DNA不但可包括启动COLD13基因转录的启动子，还可包括终止COLD13转录的终止子。进一步，所述表达盒还可包括增强子序列。可用于本发明的启动子包括但不限于：组成型启动子，组织、器官和发育特异的启动子，和诱导型启动子。启动子的例子包括但不限于：泛生素基因Ubiqutin启动子(pUbi)；花椰菜花叶病毒的组成型启动子35S；来自西红柿的创伤诱导型启动子，亮氨酸氨基肽酶("LAP",Chao等人(1999)Plant Physiol120:979-992)；来自烟草的化学诱导型启动子，发病机理相关1(PR1)(由水杨酸和BTH(苯并噻二唑-7-硫代羟酸S-甲酯)诱导)；西红柿蛋白酶抑制剂II启动子(PIN2)或LAP启动子(均可用茉莉酮酸曱酯诱导)；热休克启动子(美国专利5，187，267)；四环素诱导型启动子(美国专利5，057,422)；种子特异性启动子，如谷子种子特异性启动子pF128(CN101063139B(中国专利2007 1 0099169.7))，种子贮存蛋白质特异的启动子(例如，菜豆球蛋白、napin,oleosin和大豆beta conglycin的启动子(Beachy等人(1985)EMBO J.4:3047-3053))。它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用。此处引用的所有参考文献均全文引用。合适的转录终止子包括但不限于：农杆菌胭脂碱合成酶终止子(NOS终止子)、花椰菜花叶病毒CaMV 35S终止子、tml终止子、豌豆rbcS E9终止子和胭脂氨酸和章鱼氨酸合酶终止子(参见，例如：Odell等人(I⁹⁸⁵)Nature 313:810；Rosenberg等人(1987)Gene,56:125；Guerineau等人(1991)Mol.Gen.Genet,262:141；Proudfoot(1991)Cell,64:671；Sanfacon等人Genes Dev.,5:141；Mogen等人(1990)PlantCell,2:1261；Munroe等人(1990)Gene,91:151；Ballad等人(1989)Nucleic Acids Res.17:7891；Joshi等人(1987)Nucleic Acid Res.,15:9627)。

构建含有所述COLD13基因表达盒的重组表达载体。所利用的植物表达载体可为Gateway系统载体或双元农杆菌载体等，如pGWB411、pGWB412、pGWB405、pBin438、pCAMBIA1302、pCAMBIA2301、pCAMBIA1301、pCAMBIA1300、pBI121、pCAMBIA1391-Xa或pCAMBIA1391-Xb。使用GmbHLH664构建重组表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型、组成型、组织特异型或诱导型启动子，如花椰菜花叶病毒(CAMV)35S启动子、泛生素基因Ubiqutin启动子(pUbi)等，它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。

为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GUS基因、萤光素酶基因等)、具有抗性的抗生素标记物(庆大霉素标记物、卡那霉素标记物等)或是抗化学试剂标记基因(如抗除莠剂基因)等。

所述COLD13蛋白可为如下任一所示蛋白质：

(A1)氨基酸序列为SEQ ID No.1的蛋白质；

(A2)将SEQ ID No.1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；

(A3)与(A1)-(A2)中任一所限定的氨基酸序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同一性且具有相同功能的蛋白质；

(A4)在(A1)-(A3)中任一所限定的蛋白质的N端和/或C端连接蛋白标签后得到的融合蛋白。

上述蛋白质中，所述蛋白标签(protein-tag)是指利用DNA体外重组技术，与目的蛋白一起融合表达的一种多肽或者蛋白，以便于目的蛋白的表达、检测、示踪和/或纯化。所述蛋白标签可为Flag标签、His标签、MBP标签、HA标签、myc标签、GST标签和/或SUMO标签等。

上述蛋白质中，同一性是指氨基酸序列的同一性。可使用国际互联网上的同源性检索站点测定氨基酸序列的同一性，如NCBI主页网站的BLAST网页。例如，可在高级BLAST2.1中，通过使用blastp作为程序，将Expect值设置为10，将所有Filter设置为OFF，使用BLOSUM62作为Matrix，将Gap existence cost，Per residue gap cost和Lambda ratio分别设置为11，1和0.85(缺省值)并进行检索一对氨基酸序列的同一性进行计算，然后即可获得同一性的值(％)。

在上述应用中，所述COLD13蛋白或其编码基因在所述植物中的表达量和/或活性提高，植物的耐冷性提高；所述COLD13蛋白或其编码基因在所述植物中的表达量和/或活性降低，植物的耐冷性降低。

第二方面，本发明要求保护COLD13蛋白或其相关生物材料在植物育种中的应用。

所述相关生物材料为能够表达所述COLD13蛋白的核酸分子或含有所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组菌或转基因细胞系。所述COLD13蛋白可为前文(A1)-(A4)中任一所示蛋白质。

进一步地，在所述应用中，可将含有所述COLD13的植物与其它植物进行杂交以培育得到耐冷性提高的植物品种。

第三方面，本发明要求保护一种培育耐冷性提高的植物品种的方法。

本发明所要求保护的培育耐冷性提高的植物品种的方法，可包括使受体植物中COLD13蛋白的表达量和/或活性提高的步骤。所述COLD13蛋白可为前文(A1)-(A4)中任一所示蛋白质。

所述培育耐冷性提高的植物品种的方法可以通过杂交手段实现，也可以通过转基因手段实现。

第四方面，本发明要求保护一种培育耐冷性降低的植物品种的方法。

本发明要求保护的培育耐冷性降低的植物品种的方法，可包括使受体植物中COLD13蛋白的表达量和/或活性降低的步骤。所述COLD13蛋白可为前文(A1)-(A4)中任一所示蛋白质。

所述培育耐冷性降低的植物品种的方法可以通过杂交手段实现，也可以通过基因工程手段实现。

第五方面，本发明要求保护一种培育耐冷性提高的转基因植物的方法。

本发明要求保护的培育耐冷性提高的转基因植物的方法，可包括如下步骤：向受体植物中导入能够表达COLD13蛋白的核酸分子，得到转基因植物；所述转基因植物与所述受体植物相比耐冷性提高。所述COLD13蛋白可为前文(A1)-(A4)中任一所示蛋白质。

在所述方法中，所述能够表达COLD13蛋白的核酸分子可通过重组表达载体的形式导入所述受体植物。

在本发明中，所述重组表达载体中启动所述编码基因转录的启动子为Ubi启动子，终止子为Noster poly A终止子。

上述方法中，其中所述核酸分子(COLD13基因)可先进行如下修饰，再导入所述受体植物中，以达到更好的表达效果：

1)修饰邻近起始甲硫氨酸的基因序列，以使翻译有效起始；例如，利用在植物中已知的有效的序列进行修饰；

2)与各种植物表达的启动子连接，以利于其在植物中的表达；所述启动子可包括组成型、诱导型、时序调节、发育调节、化学调节、组织优选和组织特异性启动子；启动子的选择将随着表达时间和空间需要而变化，而且也取决于靶物种；例如组织或器官的特异性表达启动子，根据需要受体在发育的什么时期而定；尽管证明了来源于双子叶植物的许多启动子在单子叶植物中是可起作用的，反之亦然，但是理想地，选择双子叶植物启动子用于双子叶植物中的表达，单子叶植物的启动子用于单子叶植物中的表达；

3)与适合的转录终止子连接，也可以提高本发明基因的表达效率；例如来源于CaMV的tml，来源于rbcS的E9；任何已知在植物中起作用的可得到的终止子都可以与本发明基因进行连接；

4)引入增强子序列，如内含子序列(例如来源于Adhl和bronzel)和病毒前导序列(例如来源于TMV、MCMV和AMV)。

第六方面，本发明要求保护一种培育耐冷性降低的转基因植物的方法。

本发明要求保护的培育耐冷性降低的转基因植物的方法，可包括如下步骤：对受体植物中能够表达COLD13蛋白的核酸分子进行抑制表达，得到转基因植物；所述转基因植物与所述受体植物相比耐冷性降低。所述COLD13蛋白可为前文(A1)-(A4)中任一所示蛋白质。

其中，所述对受体植物中能够表达COLD13蛋白的核酸分子进行抑制表达可通过任何能够实现这一目的的技术手段实现，如通过序列特异核酸酶(如CRISPR/Cas9核酸酶)对所述核酸分子进行特异性剪切，从而降低其在所述受体植株中的表达。

在本发明中，具体是通过CRISPER/Cas9技术实现的；以SEQ ID No.3所示DNA片段存在的中符合5’-N_X-NGG-3’或5’-CCN-N_X-3’序列排列规则的片段为靶序列；N表示A、G、C和T中的任一种，14≤X≤30，且X为整数，N_X表示X个连续的脱氧核糖核苷酸。更加具体的，在本发明的具体实施方式中，所述靶序列具体为

靶点一：5’-CCCCCCTTAAGGTAGCCATATAC-3’或

5’-GTATATGGCTACCTTAAGGGGGG-3’；

靶点二：5’-CCATCCCCATGCGATCCTGTATA-3’或

5’-TATACAGGATCGCATGGGGATGG-3’。

在上述方法中，将重组表达载体或基因编辑载体导入所述受体植物，具体可为：通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物组织培育成植株。

上述方法中，所述转基因植物理解为不仅包含第一代到第二代转基因植物，也包括其子代。对于转基因植物，可以在该物种中繁殖该基因，也可用常规育种技术将该基因转移进入相同物种的其它品种，特别包括商业品种中。所述转基因植物包括种子、愈伤组织、完整植株和细胞。

在上述各方面中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA等。

进一步地，所述能够表达COLD13蛋白的核酸分子可为如下任一所示DNA分子：

(B1)SEQ ID No.2(cDNA)和SEQ ID No.3(基因组)所示的DNA分子；

(B2)在严格条件下与(B1)限定的DNA分子杂交且编码所述COLD13蛋白的DNA分子；

(B3)与(B1)或(B2)限定的DNA序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同一性且编码所述COLD13蛋白的DNA分子。

上述核酸分子中，所述严格条件可为如下：50℃，在7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5M Na₃PO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，2×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M Na₃PO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，1×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M Na₃PO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，0.5×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M Na₃PO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，0.1×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M Na₃PO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在65℃，0.1×SSC，0.1％SDS中漂洗；也可为：在6×SSC，0.5％SDS的溶液中，在65℃下杂交，然后用2×SSC，0.1％SDS和1×SSC，0.1％SDS各洗膜一次。

上述核酸分子中，同源性是指核苷酸序列的同一性。可使用国际互联网上的同源性检索站点测定核苷酸序列的同一性，如NCBI主页网站的BLAST网页。例如，可在高级BLAST2.1中，通过使用blastp作为程序，将Expect值设置为10，将所有Filter设置为OFF，使用BLOSUM62作为Matrix，将Gap existence cost，Per residue gap cost和Lambda ratio分别设置为11，1和0.85(缺省值)并进行检索一对核苷酸序列的同一性进行计算，然后即可获得同一性的值(％)。

上述核酸分子中，所述95％以上的同源性可为至少96％、97％、98％的同一性。所述90％以上的同源性可为至少91％、92％、93％、94％的同一性。所述85％以上的同源性可为至少86％、87％、88％、89％的同一性。所述80％以上的同源性可为至少81％、82％、83％、84％的同一性。

在上述各方面中，所述植物可为单子叶植物或双子叶植物。

进一步地，所述单子叶植物可为禾本科植物。

更进一步地，所述禾本科植物可为水稻。

在本发明的具体实施方式中，所述水稻具体为水稻品种Nipponbare(Oryzasativa L.ssp.japonica cv Nipponbare,NIP)。

实验证明，COLD13及其编码基因可以调控植物的耐冷性：向植物中导入COLD13的编码基因可以提高植物的耐冷性：

1)冷胁迫前，野生型植物与COLD13基因过表达株系的生长状况及存活率基本无差异，冷胁迫后，与野生型植物相比，COLD13基因过表达株系的耐冷性显著高于野生型。

2)冷胁迫前，野生型植物与目的植物中COLD13的表达受到抑制植株生长状况及存活率基本无差异，冷胁迫后，与野生型相比，目的植物中COLD13的表达受到抑制植株耐冷性下降，表现为存活率显著低于野生型。

本发明对于培育耐冷植物新品种具有重要意义。

附图说明

图1为克隆到COLD13的cDNA条带。

图2为pUN-OsCOLD13示意图和CRISPR/Cas9突变体中COLD13突变靶点位置及突变形式示意图。A为pUN-OsCOLD13示意图。B为CRISPR/Cas9突变体中COLD13突变靶点位置及突变形式示意图。突变体株系突变位点位于第一外显子上，突变形式为缺少6个碱基。方框代表编码钙调素结合结构域序列，锥形处代表突变靶点，突变位点测序峰图。

图3为COLD13在NIP、OE1/OE2中基因表达情况。bar为SD。

图4为COLD13 CRISPR突变体材料及过表达材料耐低温表型分析。A为生长到三叶期的水稻野生型(WT)和COLD13 CRISPR突变体(L1)幼苗在4℃冷处理96h，恢复生长两周，bars＝5cm；恢复生长两周后的野生型与L1突变体的存活率，存活率为重复8次平均值，bars代表SD。B为生长到三叶期的水稻野生型(WT)和COLD13过表达材料(OE1)幼苗在4℃冷处理108h，恢复生长两周，bars＝5cm；恢复生长两周后的野生型与OE1的存活率，存活率为重复3次平均值，bars代表SD。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、COLD13及其编码基因可以提高水稻的耐冷性

本涉及一种来源于粳稻Nipponbare(Oryza sativa spp japonica cvNipponbare，NIP)的耐冷相关蛋白，其名称为COLD13，其氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。COLD13基因的cDNA序列如SEQ ID No.2所示，基因组序列如SEQ ID No.3所示。

一、编码基因COLD13的克隆

为获得编码基因COLD13的CDS序列，设置5′引物(ATGGAGATGCTTGAGGAGAT)，3′引物(CTAAAGTCCCCTGAACCTGC)。提取粳稻Nipponbare全株RNA，RT-PCR反转录成为cDNA，运用合成好的引物PCR扩增出CDS序列。具体步骤如下：

1、植物RNA提取

植物RNA提取过程使用的试剂盒为Magen公司的HiPure Plant RNA Mini Kit。使用的试剂、研钵、试管和枪头等均为RNase-free，防止RNase污染从而降解RNA。收集生长到三叶期的粳稻Nipponbare样品，迅速放置液氮中避免RNA降解，用研钵样品迅速研磨成细小的粉末，并转移至1.5mL离心管中；加入500μL Buffer RL，涡旋震荡充分打散样品，室温静置3分钟；室温14000×g离心5分钟；将离心后的上清转移到gDNA Filter Column过滤柱中，过滤柱放入2mL收集管中，14000×g离心2分钟；在过滤后的溶液中加入250μL的无水乙醇，吹吸混匀；取上一部中700μL滤液转移至HiPure RNA Mini Column过滤柱中，过滤柱放入2mL收集管，14000×g离心1分钟，弃废液；加入500μL Buffer RW1，12000×g离心1分钟，弃废液；加入500μL Buffer RW2(已加入适量无水乙醇)，12000×g离心1分钟，弃废液；12000×g离心2分钟，去除残留的乙醇；将过滤柱转移至一个干净的1.5mL RNase-free离心管中，滴加30-50μL的RNase-free ddH₂O至膜中央，室温静置2分钟后12000×g离心2分钟；将提取成功的RNA保存于-80℃备用。

2、RT-PCR反转录为cDNA

使用赛默飞公司的High Capacity cDNA Reverse Transcription Kits进行反转录第一链cDNA的合成。所有操作均在冰上进行。取备用待反转录的RNA 2μg，加RNase-freeH₂O至10μL；使用试剂盒内的试剂配制2×RT master mix，于冰上温和混匀，成分如下：10×RT Buffer 2.0μL；25×dNTP Mix 0.8μL；10×RT Random Primers 2.0μL；MultiScribe^TMReverse Transcriptase 1.0μL；RNase抑制剂1.0μL；Nuclease-free H₂O3.2μL。

将2×RT master mix和RNA混合，按照25℃10min→37℃120min→85℃5min，4℃的条件进行反转录；将反转录得到的cDNA保存于-20℃备用。

3、PCR扩增

取上述cDNA模板，按照以下体系进行PCR扩增：10μL 2×Taq聚合酶(北京康为世纪生物科技有限公司)、7μL ddH₂O、2μL cDNA、0.5μL 5′引物、0.3μL 3′引物(引物序列如前所述)。设定程序95℃2min(预变性)，进入循环95℃30S(变性)→57℃30S(复性)→72℃1min(延伸)循环次数为35次，后进入72℃(终延伸)10min。

将PCR产物进行1％的琼脂糖凝胶电泳分离。得到如图1所示的大概为1629bp左右的条带。使用OMEGA DNA胶回收试剂盒(北京鸿跃创新科技有限公司)进行凝胶回收，得到的产物进一测序分析，所得序列结果与编码COLD13的核酸分子序列(SEQ ID No.2)一致，为基因COLD13的CDS序列。

二、重组载体的构建

1、pUN1301的构建

以玉米基因组DNA为模板，以带有Hind III识别位点的5′引物(GGAAGCTTCTGCAGTGCAGCGTGACCCGG)和带有BamHI识别位点的3′引物(CGGGATCCAAGTAACACCAAACAACAGGG)为引物，进行PCR扩增，PCR反应条件为：先94℃3分钟；再94℃45秒，62℃45秒，72℃2分钟，共35个循环，最后72℃10分钟。反应结束后，对PCR产物进行0.8％琼脂糖凝胶电泳检测，回收长度约为2kb的扩增片段，此片段为含有玉米泛素启动子(将其命名为UbiPro，其序列为序列表中SEQ ID No.4的第9-1993位)的DNA片段。

用限制性内切酶Sac I和EcoR I将Noster poly A终止序列从质粒载体pBI121(北京拜尔迪生物技术有限公司，目录号：MP-091)上切下，连接到载体pUC19(北京百泰克生物技术有限公司，目录号：DP7801)的Sac I和EcoR I位点间，得到重组载体，命名为pUC19-Noster。然后分别用限制性内切酶HindIII和BamHI对pUC19-Noster与上述含有玉米泛素启动子的DNA片段UbiPro进行双酶切，回收载体骨架与带有粘性末端的UbiProDNA片段，并将二者进行连接，得到重组载体，经测序验证正确后将该重组载体命名为pUN19。

用限制性内切酶EcoR I和HindIII对pUN19进行双酶切，将得到的含有UbiPro和Noster poly A的DNA片段命名为UbiPro-Noster；用限制性内切酶EcoR I和HindIII对pCAMBIA1301(Biovector Co.,LTD公司目录号Biovec-11)进行双酶切，将得到的骨架载体与UbiPro-Noster连接，得到重组载体，经测序验证正确后将该重组载体命名为pUN1301。

2、pUN-OsCOLD13-2的构建

将上述获得的编码基因COLD13的CDS序列连接到T载体(北京东方顺科生物科技有限公司)上。以带有BamHI识别序列的5′引物(序列：CGGGATCCATGGAGATGCTTGAGGAGAT)和带有KpnI识别序列的3′引物(序列：GGGGTACCCTAAAGTCCCCTGAACCTGC)进行PCR扩增。PCR反应条件为：先94℃3分钟；再94℃15秒，62℃15秒，72℃1分钟，共35个循环，最后72℃10分钟。反应结束后，对PCR产物进行0.8％琼脂糖凝胶电泳检测，表明得到长度约为1629bp的扩增片段(如图1)，与预期结果相符合，回收该目的片段并且测序，将在SEQ ID No.2的两端分别添加上BamHI识别序列及其保护碱基与KpnI识别序列及其保护碱基的DNA片段命名为DNA片段1。

分别用限制性内切酶BamHI和KpnI对pUN1301与DNA片段1进行双酶切，回收载体骨架与DNA片段I的酶切产物，并将二者进行连接，得到重组载体，将经测序验证正确后的重组载体命名为pUN-OsCOLD13(示意图如图2中A)。

pUN-OsCOLD13是COLD13基因表达载体，用玉米泛素启动子(UbiPro)启动基因COLD13的表达、用Noster poly A终止其表达。

3、CRISPR/Cas9载体构建

oligo引物：

5’端引物：

5’-GCAGGTCTCATGTGCCCCCCTTAAGGTAGCCATATACGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTT-3’。

3’端引物：

5’-GCAGGTCTCTAAAACTATACAGGATCGCATGGGGATGGTGCCACGGATCATCTGCA-3’。

将两条oligo引物用ddH₂O溶解至浓度为10μM，各取10μL混合，95℃变性3min，以0.2℃/s降温到20℃，得到oligo二聚体。

取2μL BGK03载体(记载在如下文献中：Yuming Lu et al.,Genome-wideTargeted Mutagenesis in Rice Using the CRISPR/Cas9 System.Molecular Plant,2017Sep12；10(9):1242-1245.)，用BasI酶进行酶切，酶切体系如下：

37℃酶切2小时，酶切产物用0.8％琼脂糖凝胶电泳进行分离，切下15,000bp线性化的BGK03大片段进行回收，最终产物30μL的ddH₂O溶解，得到线性化的BGK03载体。

取oligo二聚体3μL，BGK03载体1μL，T4连接酶1μL，T4连接酶缓冲液1μL，补水至总体积10μL。室温连接1h后转化大肠杆菌DH5α感受态细胞。经卡那霉素的抗性平板进行筛选，第二天挑取生长的阳性克隆，提取质粒后经测序验证，将其命名为pTYCRISPR-COLD13。

三、重组菌的构建

将按照步骤二得到的pUN-OsCOLD13导入农杆菌EHA105(Biovector Co.,LTD公司目录号Biovec-11)中，得到重组菌，将该重组菌命名为EHA105/pUN-OsCOLD13；将步骤二的pTYCRISPR-COLD13导入农杆菌EHA105中，得到重组菌，将该重组菌命名为EHA105/pTYCRISPR-COLD13。

同时设置向农杆菌EHA105中导入pUN1301质粒的空载对照，所得重组菌命名为EHA105/pUN1301；以及向农杆菌EHA105中导入pTYCRISPR质粒的空载对照，所得重组菌命名为EHA105/pTYCRISPR。

四、转基因水稻的构建及鉴定

1、转基因水稻的构建

将步骤三得到的EHA105/pUN-OsCOLD13、EHA105/pTYCRISPR-COLD13导入粳稻Nipponbare(Oryza sativa spp japonica cv Nipponbare，NIP)的愈伤组织中，再用含300mg/L头孢霉素的无菌水洗涤4-5遍，无菌滤纸吸干后转至N₆D₂S₁培养基上，筛选一代；两周后，转移至N₆D₂S₂培养基上筛选二代(2周/代)；取出经过3代筛选生长旺盛的抗性愈伤组织，转移至分化培养基(1)，上，在分化培养箱(光周期设定为12小时光照，12小时黑暗，白天28℃，夜晚25℃)中培养7天；然后转移至分化培养基(2)上，在分化培养箱中培养至产生再生苗。再生的植株在生根壮苗培养基上生根壮苗；待小苗长至10厘米左右时，打开容器封口膜，炼苗2-3天，然后将小苗移入人工气候室栽培，获得共24棵T0代转EHA105/pUN-OsCOLD13水稻、获得共29棵T0代转EHA105/pTYCRISPR-COLD13水稻。

同时设置向水稻NIP中导入EHA105/pUN1301的空载对照，以及向水稻NIP中导入EHA105/pTYCRISPR的空载对照。

上述方法中，所用培养基如表1。

表1培养基

2、转基因水稻的鉴定

步骤一获得24棵T0代转pUN-OsCOLD13水稻，29棵T0代转pTYCRISPR-COLD13水稻。剪取水稻叶片2cm左右，提取DNA。植物DNA的提取方法参考康润诚业生物科技有限公司(Genstar)的植物基因组DNA提取试剂盒的说明书进行，具体操作如下：剪取1cm²的水稻叶片于2mL离心管内，加入直径6mm的小钢珠，用研样器将叶片研成粉末；加入300μL DNA提取液，与粉末混匀，在65℃孵育20-30分钟；加入24：1氯仿异戊醇300μL，剧烈振荡混匀后，12000×g离心10分钟；将上清转移到干净的1.5mL离心管中，注意不要吸到下方沉淀；加入500μL无水乙醇，上下颠倒混匀，放在-20℃沉淀20分钟；12000×g离心5分钟，弃去液体；加入500μL浓度为70％的酒精，12000×g离心5分钟，弃去液体；将离心管放在37℃烘箱中烘干多余水分和酒精，加入40μL ddH₂O；将提取成功的DNA保存于-20℃。

为鉴定重组质粒pTYCRISPR-COLD13是否成功转入水稻中并且引起水稻基因COLD13相应靶点位置碱基发生突变，根据数据库分析结果，在包含两个靶点的DNA序列内设置引物，5′引物(AAAGACCTGCAAAGGGTGC)，3′引物(CTGGCTGGTGAAGGCGAAT)。进行PCR扩增，设定程序：95℃2min(预变性)，进入循环95℃30S(变性)→59℃30S(复性)→72℃1min(延伸)循环次数为35次，后进入72℃(终延伸)10min。PCR产物琼脂糖凝胶电泳，发现明显条带后送公司测序，结果共鉴定出18株COLD13相应靶点位置碱基发生突变的水稻，将这18棵幼苗移至温室栽培，按照不同株系收种，得到COLD13相应靶点位置碱基发生突变的水稻的T1代COLD13种子。在此基础上经过海南繁种得到的纯合COLD13相应靶点位置碱基发生突变的水稻T2代植株。所选取进一步进行表型观察的纯合突变形式如图2中B所示。

3、定量PCR鉴定转基因水稻及COLD13

使用Applied biosystems实时荧光定量PCR仪检测不同情况下植物中基因的表达量。在Genscript网站根据基因序列设计特异引物：

5′引物(ATTTTAGGCTGCAAGGTGG)，3′引物(TGGGGATGGATTGAGATTC)以水稻18S作为内参均一数据，采用Comparative Ct的方法处理数据，检测目的基因的表达量。

分别提取三叶期野生型NIP、纯合T2代CRISPR/Cas9突变体、T2代转pUN-OsCOLD13的水稻RNA，反转录为cDNA，对三种不同材料中COLD13基因的表达丰度(即相对表达量，Relative mRNA level)进行检测。将反转录的cDNA稀释30-50倍备用。15μL反应体系中成分如下：7.5μL 2×SYBR Green Mix、0.25μL 10μM正向引物、0.25μL 10μM反向引物、3μL cDNA模板、4μL ddH₂O(每个样品设置三次重复，加样过程使用光滑不挂壁的枪头以减少误差)。加样完成后，按照如下程序进行反应：95℃3min，进入循环95℃15s→55℃15s→72℃15s，45个循环，95℃30s，55℃30s。

结果如图3所示，与野生型NIP相比，T2代转pUN-OsCOLD13(OE1、OE2)的水稻中COLD13基因的表达丰度有明显的上调，说明T2代转pUN-OsCOLD13的水稻中目的基因(COLD13基因)在转录水平已经成功表达。实验重复三次，每次每个株系随机取4棵水稻三叶期幼苗的全苗进行提取RNA，再反转录得到cDNA进行定量PCR实验。

五、水稻的低温耐受性检测

实验重复三次，每次重复实验的具体步骤如下：

将T2代转pUN-OsCOLD13水稻的株系OE1的种子，纯合T2代CRISPR/Cas9突变体(L1)的种子，野生型NIP的种子分别在水中37℃萌发后，分别置于木村B培养液里，在光照培养箱中(光强为10000μmol/m²/s，光照时间为16h/d，温度为30℃)培养至三叶期；再将三叶期幼苗的根置于4℃低温循环冷水浴(水温4℃±1℃)中处理，突变体材料(L1)及其野生型对照处理4天、过表达材料(OE1)及其野生型对照处理4天半(光强为10000μmol/m²/s，光照时间为16h/d)，然后转移至木村B培养液中，于光照培养箱(光强为10000μmol/m²/s，光照时间为16h/d，温度为30℃)恢复生长2周，照相、统计存活率。不同种材料和株系各处理24株幼苗。

实验同时设置pUN1301空载组和pTYCRISPR空载组。

如图4中A所示，冷处理前，野生型NIP相比，纯合T2代CRISPR/Cas9突变体L1的生长状况基本无差异；经冷胁迫和恢复生长后，野生型的平均存活率为84.17％，纯合T2代CRISPR/Cas9突变体L1平均存活率为12.1％，由此可以看出，纯合T2代CRISPR/Cas9变体对低温敏感，COLD13正调控水稻对低温信号的响应。

如图4中B所示，冷处理前，野生型NIP相比，T2代转pUN-OsCOLD13(OE1)的生长状况基本无差异；经冷胁迫和恢复生长后，野生型NIP的存活率为15％，T2代转pUN-OsCOLD13的COLD13-OE1株系平均存活率为84.4％。由此可以看出，T2代转pUN-OsCOLD13材料COLD13-OE1对低温耐受性升高，COLD13正调控水稻对低温信号的响应。

两组空载对照与野生型NIP的耐冷表型和存活率统计结果均基本一致，无统计学差异。

因此可以看出，在NIP中过表达COLD13使NIP的耐冷性增强；在NIP中敲除COLD13使NIP耐冷性降低。表明，COLD13及其基因可以调控水稻的耐冷性。

上述实施例中的木村B培养液，1L木村B培养液由1ml大量元素母液、1ml微量元素母液、1ml铁盐母液、1ml硅酸钠母液与蒸馏水组成，用6mol/L HCl调木村B培养液pH值为5.8；木村B母液购于北京酷来搏科技有限公司。

大量元素母液：1L(1000×)

微量元素母液：1L(1000×)

铁盐母液：1L(1000×)

Na₂·EDTA 7.45g

FeSO₄·7H₂O 5.57g

硅酸钠母液：1L(1000×)

Na₂SiO₃ 200g

以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

<110> 中国科学院植物研究所

<120> 钙调素结合蛋白COLD13在调控植物耐冷性中的应用

<130> GNCLN202373

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 542

<212> PRT

<213> Oryza sativa L.

<400> 1

Met Glu Met Leu Glu Glu Met Arg Arg Met Leu Lys Gly Gln Asn Glu

1 5 10 15

Lys Ile Glu Ser Met Tyr Arg Glu Asn Gln Glu Leu Arg Glu Lys Val

20 25 30

Ser Phe Leu Thr Ala Asp Ile Thr Arg Leu Gly Gly Tyr Leu Gln Gln

35 40 45

Ser Pro Ala Pro Arg Met Leu Ser Asp Gln Asn Ser Ser Met Gln Leu

50 55 60

Arg Leu Gln Phe Val Asn Ser Cys Ser Asn Ser Lys Tyr Ser Thr Arg

65 70 75 80

Lys Ile Glu Ala Asp Asp Glu Thr Pro Leu Lys Val Ala Ile Tyr Asp

85 90 95

His Asn Asn Glu Ile Met Thr Cys Glu Pro Phe Ser Ser Met Arg Val

100 105 110

His Ile Val Ala Ile His Gly Asp Phe Asp Asp Asp His Lys Gly His

115 120 125

Trp Thr Glu Glu His Phe Arg Ser Lys Ile Val Thr Gly Arg Pro Gly

130 135 140

Lys Glu His Leu Leu Ser Gly Lys Leu Tyr Phe Arg Leu Gln Gly Gly

145 150 155 160

Val Gly Tyr Leu Asn Ser Ala Lys Phe Gln Asp Asn Ser Ser Phe Val

165 170 175

Pro Ser Lys Arg Leu Lys Leu Gly Val Met Ala Ala Asp Glu Arg Ile

180 185 190

Ser Gln Arg Ile Gln Glu Gly Ile Thr Glu Ser Phe Ala Val Lys Asp

195 200 205

Val Arg Gly Tyr Ser Thr Lys Lys Asn Leu Asn Pro Ser Pro Cys Asp

210 215 220

Pro Val Tyr Lys Leu Asn Lys Ile Ala Met Asn Gly Asp Arg His Lys

225 230 235 240

Leu Leu Glu Lys Asn Gly Ile Lys Thr Val Gly Asp Phe Leu Ser Phe

245 250 255

Tyr Asp Arg Ser Pro Glu Asp Leu Arg Lys Ile Leu Gly Lys Ile Ser

260 265 270

Asp Gln Asp Trp Glu Thr Ile Ile Ser His Ala Gln Lys Cys Thr Pro

275 280 285

Arg Pro Gly Ile Tyr Ser Ser Cys Ile Gln Glu Arg Asn Gly Ser Asp

290 295 300

Glu His Gln Thr Phe Ser Lys Ser Asn Gly Ser Cys Tyr Leu Lys Gly

305 310 315 320

Ser Cys Ser Glu Gln Pro Ser Ser Met Leu Arg Lys Gln Leu Asp Val

325 330 335

Gln Val Val Arg Gln Gln Thr Ser Ser Val Cys Asn Gly Leu Gln Ser

340 345 350

Gly Ala Ser Leu Gly Asn Leu Pro Ser Lys Ser Lys Leu Gln Gln Ser

355 360 365

Thr Ser Asn Gln Ser Val Thr Pro Arg Glu Leu Glu Ser Phe Gln Val

370 375 380

Ala Asn Glu Glu Val Leu Ser Ile Arg Asn Glu Ala Ser Ser Val Pro

385 390 395 400

Ser Met Asp Asn Asn Thr Leu Gly Gly Ser Ser Thr Gln Gln Gln Cys

405 410 415

Phe Leu Glu His Asn Thr Thr Ser Glu Ser Asp Gly Asn Ser Phe Leu

420 425 430

Pro Gly Asn Pro Ser Thr Asp Asp Ala Val Arg Asp His Leu Ala Glu

435 440 445

Leu Glu Lys Ala Leu Leu Glu Asp Glu Ser Trp Gly Asp Phe Asp Phe

450 455 460

Asn Glu Ala Trp Ala Asn Pro Tyr Ser Ala Val Glu His Ser Thr Gly

465 470 475 480

Leu Ser Ser Val Asn Gly Ala His Asn Asn Asn Ile Asn His Gly Gly

485 490 495

Leu Ser Ala Ala Ser Glu Ala Gly Ser Val Ser Tyr Gly Gly Leu Ser

500 505 510

Pro Pro Val Ser Glu Val Gly Ser Arg Arg Tyr Met Gly Tyr Ser Pro

515 520 525

Ser Pro Ala Ser Lys Pro Trp Ser Cys Arg Phe Arg Gly Leu

530 535 540

<210> 2

<211> 1629

<212> DNA

<213> Oryza sativa L.

<400> 2

atggagatgc ttgaggagat gcgaagaatg ctgaaggggc aaaacgagaa gattgaatcc 60

atgtataggg agaatcaaga actcagagaa aaggtttcct tcctaacagc ggatataacc 120

agacttggtg gttaccttca gcaatcccct gcccctagga tgttatctga tcagaatagc 180

agtatgcaac ttcgattgca atttgtgaat tcatgcagta acagtaagta ctcaacacgt 240

aaaattgaag cagatgacga gacccccctt aaggtagcca tatacgatca taacaacgag 300

atcatgactt gtgaaccatt ttcttcaatg agagttcaca ttgtagcaat tcatggtgac 360

tttgacgatg atcataaagg ccactggact gaagaacact ttcgtagtaa aatagtaact 420

ggacgacctg gaaaagaaca tttattatct gggaagctgt attttaggct gcaaggtggt 480

gtgggttatc taaacagtgc caaattccaa gacaattcca gttttgttcc aagcaaaaga 540

ttgaagttgg gggtcatggc tgctgatgaa agaatctctc aaagaattca ggaaggaata 600

actgaatctt ttgctgtaaa ggatgttcgg ggatactcaa caaaaaagaa tctcaatcca 660

tccccatgcg atcctgtata caaactgaat aaaattgcaa tgaacggaga tagacacaag 720

ttactagaga agaatggtat caagacagtg ggggattttt tgtctttcta tgatagaagt 780

cctgaagatc tgcgtaaaat tttgggaaag atttctgacc aagattggga aacaatcatt 840

agtcacgctc agaaatgcac tccaagacca ggaatttact ctagttgcat acaagagagg 900

aatgggtctg acgaacatca gacattttct aaaagcaatg gcagttgtta ccttaagggg 960

tcatgctcag agcaaccaag ctctatgctg cgaaaacaac ttgatgtcca agtagtacgc 1020

cagcaaactt cttcagtgtg taatggactt caatctggtg catcactagg gaatctgcca 1080

agtaagtcca agttgcaaca aagtacttcg aaccagagcg tgactccccg tgaacttgag 1140

agcttccaag ttgccaatga ggaagttttg tccataagaa atgaggcttc gtcagttcca 1200

tccatggata ataatacctt aggagggtct agcacacagc aacagtgttt tttggaacac 1260

aacacaacat ctgaatctga tgggaattca ttcttacctg gtaatccatc cacggacgac 1320

gccgtcagag atcatctagc agagctggaa aaagctctcc ttgaagatga gtcatggggt 1380

gactttgatt tcaatgaagc ttgggcaaat ccctacagtg cagtggagca tagcacgggg 1440

ctttcttctg tcaatggagc acataataat aatattaacc acggtggact ttcagctgcc 1500

agtgaagcag gcagtgtaag ctatggcgga ctttcaccac ctgtcagtga agtagggagt 1560

agaaggtata tggggtattc gccttcacca gccagcaaac cctggagctg caggttcagg 1620

ggactttag 1629

<210> 3

<211> 6162

<212> DNA

<213> Oryza sativa L.

<400> 3

aagcgaatca ctggcttccg tcttgccgcc ggtggggtgc gcgccgccgc cggcgaggac 60

gaggggaagc atggcgggcg gagaccgatg cggcctagcg ccctggtggt actggtactc 120

tatggagtgg agcacctcgg cgattgagga gctccctgag cacttgccca cgcgccgcta 180

cccgtcgccg catctcggcg tctagctgct ggcgcagcga tggcgcgcgc ggcggtcggc 240

cagagctaga tcggcggagc ctcctccatc tgtgctcacc agctgcagga cgcgtggtat 300

gcgccatgaa gtgggcaaag accgcgggga gcgacgcagc agaggtgttc ggagaaatgt 360

cgcactggca gtcggcagag acgcggacgc ggtcgtcggt ctagtccaag aaaaggatcc 420

cgcacctcaa ctgctcatca tactggtaag tctcgcagag tccaattcta tttttttttt 480

caaaaacaaa tgcacaaatg tttgatctgc accatcgaac tccatattaa catgcgggct 540

gcttattaaa ttagagattt cgagtgcggt agtagaaata gaattttggt tcatttcctc 600

tcagaaagtg aaacgaaagc ttcgtgtgaa aagtatcagt tgaaaaaaaa aagcatctgg 660

aagcggtttt ggtgttccag atcgacattt ccaaaaccaa aaccgtgtta ggatttggga 720

ggccgaccaa ccactatccg ctatgtttct ccacatacca gaagtatgaa ccattcagta 780

gtgccatgca ttatcttcac tcttaagttt cttgtagcat ccagcaaaac actgttttgt 840

gaagaaaaat acatttggcc aagttcgttt gtcaaaggaa gattacacga gctttcttgt 900

ccttccctca ccatataggt cagcttctcc gcaaaacgaa acaaaccttc atccaccgtt 960

cttttcatcc aacctctgga ggtccaggca atgtctctac ctcggcatca caattgggag 1020

gagaatgatg atggggccga aggattgcgc cgatcacctc cgggaaagcg accccggtgc 1080

tcctgcagat ttgagtgagc tcactcgtac aatcttgccc ctcctatttt tttaggttct 1140

ctcatcattc ttttttttta tctgtacagg caggatgtgg tttcatctca tccaaatgct 1200

cttttacttg ttatcaaaac ttagaattta caaggaattt agttgttcat gccgtcattg 1260

caagtaaacc aataagtcca tttttcttgg ctaaccaatt gtatcttctt ctggataaat 1320

tcatcatatg ccactgtgat tattttttaa aggagctcat tcccttactt gccccttttc 1380

ttttacatat gctgacctct gatttgcaaa tacgtttcac ctgcaatctc ctggaaggac 1440

aatctagcaa aataaacttc ccccacaaaa ttaaaaaaag atgatagcta ttaagttgaa 1500

cttgaaacga aaatttctct attaggctat taagttgagg aatagacctt atttttctta 1560

ttattcttat tccaacaaat gatagtgaca ggcagatgga gatgcttgag gagatgcgaa 1620

gaatgctgaa ggggcaaaac gagaagattg aatccatgta tagggagaat caagaactca 1680

gagaaaaggt ttccttccta acagcggtaa tttttttgtt cttcactttc acttcctaaa 1740

agcaaaatgc atgcttaagc ctagatggtg ggtataaact ttgtgccata tggcccaatt 1800

aaatatgcct atttgttggg aacccctaga agtacttagt tggagagtca ttggattgtt 1860

ctgtgctcaa gagttaagag gcaagacaca tgcatgacct cagaagaaaa agttggaccc 1920

aatcgtttaa tagtctacct cctacttaag atatttacac tgacacgtgc atcaattact 1980

ttgttgtttt cttttttgtg gaactaggta tttttattat tattgcagat caacttgctt 2040

ttcacatatg ttaaattata tcttttaaat tttgttgata ggatataacc agacttggtg 2100

gttaccttca gcaatcccct gcccctaggt tggtaatatt tgcatgatac tatgagtctc 2160

tatctctctc tctctctccc tggcttaaaa gttttagaat tggatattga gatacatcgt 2220

agcttttgtc ttcttaaaca ttgagctata tattgctgca aatatgttct ctggtatctt 2280

aactaatgct acaagtgcgc aaccaattaa gatgcacatt ttgttaaact tatcatttct 2340

acttccatat attatgttaa attttacatc tatggactga caaatgaata tttttgtcta 2400

gaacatacaa ctttgtctaa ctatattgca attgatataa ctgcaaaatg tcctgtaaca 2460

ctgtggctgc ttttctcctg cttacctttt cttttccttt tgctacatca gttattaacc 2520

aaagcataga ctatcctttt cttggaagtc atgacatgac gcccattcat caaatctcat 2580

ctgatgtcta cagtaatagt aacaaatgga caagttatta agtcatttag taattaccaa 2640

cttcaataca aaaaaggtga ctaaataaaa tattgaaaag acctgcaaag ggtgctgttg 2700

cacgtgcttt gttcaccgaa ggttccagct actctattga tctccaattc ttttctcact 2760

tctacttgtt ttaaaaataa aaaagaagtc ttggctttct tggtaacgga agataacatc 2820

aattggtgaa agggctcagc ttacttgatt gcctaatgcg aaccttggat ttttcgcatg 2880

gaatctctag tgtcaaaaag gattgaattt tgaggtctga ataattgcca cttaagcaga 2940

gtactgaaaa gttaatcaaa cttcctgtat ctttactcct ttaaatgttc cttgtggtgg 3000

tgcctcacca ccaccaccca ctgatatttg ggtcccacat gaccagtagt tccaaaaatc 3060

taatatctga agtaactgaa gaattgtcac tgtttttcca gctgaagtaa tttattgtac 3120

ctcccaagta tattaagaag ttgcattcat atgtaaaatg acaattcctg tctcatgatg 3180

cttacatgtc catggtgctg tgttcatctc atgtgttcat ctcattgttt ttgtgtgtaa 3240

tttgtataag tagctaccat taactaaaat tcagtatgct acgcatgtga cttcttttct 3300

ctactttcag gatgttatct gatcagaata gcagtatgca acttcgattg caatttgtga 3360

attcatgcag taacagtaag tactcaacac gtaaaattga agcagatgac gagacccccc 3420

ttaaggtagc catatacgat cataacaacg agatcatgac ttgtgaacca ttttcttcaa 3480

tgagagttca cattgtagca attcatggtg actttgacga tgatcataaa ggccactgga 3540

ctgaagaaca ctttcgtagt aaaatagtaa ctggacgacc tggaaaagaa catttattat 3600

ctgggaagct gtattttagg ctgcaaggtg gtgtgggtta tctaaacagt gccaaattcc 3660

aagacaattc cagttttgtt ccaagcaaaa gattgaagtt gggggtcatg gctgctgatg 3720

aaagaatctc tcaaagaatt caggaaggaa taactgaatc ttttgctgta aaggatgttc 3780

ggggatactg tgagttcatt ctattttatt ctagtataag tacttatttt cctcatatgt 3840

gcttcgttta aaaataaaca tgtctatatg gactttatct gccatgcaca gccgttttgc 3900

cttaggaacg gcaccgacag aatcaactgt aacatcaatt agtgcttatg ataaccaatt 3960

aactagtttc atgttggcca ttttctttta aatttctatc ccttaggctg tagctgtgta 4020

gatgtgtagt gactctatgc aggacattat tatccattca ttcatatggt ggggaataaa 4080

atctgtcatc cccgcatatg gtgtactctt tatcttaaag tttctcctaa agactaaagc 4140

cccttgccgc ttcagccaac aagtgttcca tccagtgtac aatatctacc cataatgatg 4200

taaggatcag cattctcatt tatcatccca gaattcttaa ttacaaaact atttttatat 4260

aagctaaatt tgttcagtaa atgaacaaag ggaactggag ttagtttttc ctttgtttat 4320

gctggcaaaa ttctgcacca tgtaaggata ctcttctgaa acttagtcat catccactat 4380

tttcacaaag aaccttttca ttcatctata cttttgaagg atcaaaacca gggtaaactg 4440

cattatttct attacagagg cggttgagat tgcttctttc atagtggatt caaaaattga 4500

tatctgatat ctttctttac agcaacaaaa aagaatctca atccatcccc atgcgatcct 4560

gtatacaaac tgaataaaat tgcaatgaac ggagatagac acaagttact agagaagaat 4620

ggtatcaaga cagtggggga ttttttgtct ttctatgata gaagtcctga agatctgcgt 4680

aaagtatggt attgcttttt tatttgttct ctgatatgtt cttgctgcga caatctgtct 4740

aatatcaccc tgtgtagatt ttgggaaaga tttctgacca agattgggaa acaatcatta 4800

gtcacgctca gaaatgcact ccaagaccag gaatttactc tagttgcata caagagagga 4860

atgggtctga cgaacatcag acattttcta aaagcaatgg cagttgttac cttaaggggt 4920

catgctcaga gcaaccaagc tctatgctgc gaagtaagta tggtgtggtc tcttttcagt 4980

aattggatcg ttcccattat gccttcatgg tttggtgtgg aaagatgttg aatgcaattt 5040

tgtttgtgcc tttttctgtg gatatcacaa atcatagtat actggttcca tgaaatctca 5100

cagaacaact tgatgtccaa gtagtacgcc agcaaacttc ttcagtgtgt aatggacttc 5160

aatctggtgc atcactaggg aatctgccaa gtaagtccaa gttgcaacaa agtacttcga 5220

accagagcgt gactccccgt ggtaattggc tttttctttt tatggcacat attttatgtt 5280

gatggctttc ataggaactt aaccatccaa ttttactcta atgttccaca gaacttgaga 5340

gcttccaagt tgccaatgag gaagttttgt ccataagaaa tgaggcttcg tcagttccat 5400

ccatggataa taatacctta ggagggtcta gcacacagca acagtgtttt ttggaacaca 5460

acacaacatc tgaatctgat ggtaataact tgaattgaat tttctattac tgtttcttga 5520

caaaggtttt cgaagaagag ttttgatgtt tgcataaccc tccctctttc tgctacaaca 5580

gggaattcat tcttacctgg taatccatcc acggacgacg ccgtcagaga tcatctagca 5640

gagctggaaa aagctctcct tgaagatgag tcatggggtg actttgattt caatgaagct 5700

tgggcaaatc cctacagtgc agtggagcat agcacggggc tttcttctgt caatggagca 5760

cataataata atattaacca cggtggactt tcagctgcca gtgaagcagg cagtgtaagc 5820

tatggcggac tttcaccacc tgtcagtgaa gtagggagta gaaggtatat ggggtattcg 5880

ccttcaccag ccagcaaacc ctggagctgc aggttcaggg gactttagcc tgtcagggag 5940

tcgagctagc agaattaaga atgctcaccg cgaacatgga ttaattaaca cccggctatt 6000

tgcttcctag gctcctagct acgtgcattt tttttgctat gtaaagttga taatgaggat 6060

ttacatattc tttctttttt tttgacgtga tattctttca ttttggttat gtcaaacttc 6120

ttacagaaaa taaatgggca tagtcatccc ttgtttcttc tc 6162

<210> 4

<211> 2001

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 4

ggaagcttct gcagtgcagc gtgacccggt cgtgcccctc tctagagata atgagcattg 60

catgtctaag ttataaaaaa ttaccacata ttttttttgt cacacttgtt tgaagtgcag 120

tttatctatc tttatacata tatttaaact ttactctacg aataatataa tctatagtac 180

tacaataata tcagtgtttt agagaatcat ataaatgaac agttagacat ggtctaaagg 240

acaattgagt attttgacaa caggactcta cagttttatc tttttagtgt gcatgtgttc 300

tccttttttt ttttgcaaat agcttcacct atataatact tcatccattt tattagtaca 360

tccatttagg gtttagggtt aatggttttt atagactaat ttttttagta catctatttt 420

attctatttt agcctctaaa ttaagaaaac taaaactcta ttttagtttt tttatttaat 480

aatttagata taaaatagaa taaaataaag tgactaaaaa ttaaacaaat accctttaag 540

aaattaaaaa aactaaggaa acatttttct tgtttcgagt agataatgcc agcctgttaa 600

acgccgtcga cgcagtctaa cggacaccaa ccagcgaacc agcagcgtcg cgtcgggcca 660

agcgaagcag acggcacggc atctctgtcg ctgcctctgg acccctctcg agagttccgc 720

tccaccgttg gacttcgtcc gctgtcggca tccagaaatt gcgtggcgga gcggcagacg 780

tgagccggca cggcaggcgg cctcctcctc ctctcacggc accggcagct acgggggatt 840

cctttcccac cgctccttcg ctttcccttc ctcgcccgcc gtaataaata gacaccccct 900

ccacaccctc tttccccaac ctcgtgttgt tcggagcgca cacacacaca accagatctc 960

ccccaaatcc acccgtcggc acctccgctt caaggtacgc cgctcgtcct ccccccccct 1020

ctctaccttc tctagatcgg cgttccggtc catggttagg gcccggtagt tctacttctg 1080

ttcatgtttg tgttagatcc gtgtttgtgt tagatccgtg ctgctagcgt tcgtacacgg 1140

atgcgacctg tacgtcagac acgttctgat tgctaacttg ccagtgtttc tctttgggga 1200

atcctgggat ggctctagcc gttccgcaga cgggatcgat ttcatgattt tttttgtttc 1260

gttgcatagg gtttggtttg cccttttcct ttatttcaat atatgccgtg cacttgtttg 1320

tcgggtcatc ttttcatgct tttttttgtc ttggttgtga tgatgtggtc tggttgggcg 1380

gtcgttctag atcggagtag aattctgttt caaactacct ggtggattta ttaattttgg 1440

atctgtatgt gtgtgccata catattcata gttacgaatt gaagatgatg gatggaaata 1500

tcgatctagg ataggtatac atgttgatgc gggttttact gatgcatata cagagatgct 1560

tttgttcgct tggttgtgat gatgtggtgt ggttgggcgg tcgttcattc gttctagatc 1620

ggagtagaat actgtttcaa actacctggt gtatttatta attttggaac tgtatgtgtg 1680

tgtcatacat cttcatagtt acgagtttaa gatggatgga aatatcgatc taggataggt 1740

atacatgttg atgtgggttt tactgatgca tatacatgat ggcatatgca gcatctattc 1800

atatgctcta accttgagta cctatctatt ataataaaca agtatgtttt ataattattt 1860

tgatcttgat atacttggat gatggcatat gcagcagcta tatgtggatt tttttagccc 1920

tgccttcata cgctatttat ttgcttggta ctgtttcttt tgtcgatgct caccctgttg 1980

tttggtgtta cttggatccc g 2001

Claims

1.COLD13蛋白或其相关生物材料在调控植物耐冷性中的应用；

所述相关生物材料为能够表达所述COLD13蛋白的核酸分子或含有所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组菌或转基因细胞系；

所述COLD13蛋白为如下任一所示蛋白质：

(A1)氨基酸序列为SEQ ID No.1的蛋白质；

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述COLD13蛋白或其编码基因在所述植物中的表达量和/或活性提高，植物的耐冷性提高；所述COLD13蛋白或其编码基因在所述植物中的表达量和/或活性降低，植物的耐冷性降低。

3.COLD13蛋白或其相关生物材料在植物育种中的应用；

所述COLD13蛋白为如下任一所示蛋白质：

(A1)氨基酸序列为SEQ ID No.1的蛋白质；

4.一种培育耐冷性提高的植物品种的方法，包括使受体植物中COLD13蛋白的表达量和/或活性提高的步骤；

所述COLD13蛋白为如下任一所示蛋白质：

(A1)氨基酸序列为SEQ ID No.1的蛋白质；

5.一种培育耐冷性降低的植物品种的方法，包括使受体植物中COLD13蛋白的表达量和/或活性降低的步骤；

所述COLD13蛋白为如下任一所示蛋白质：

(A1)氨基酸序列为SEQ ID No.1的蛋白质；

6.一种培育耐冷性提高的转基因植物的方法，包括如下步骤：向受体植物中导入能够表达COLD13蛋白的核酸分子，得到转基因植物；所述转基因植物与所述受体植物相比耐冷性提高；

所述COLD13蛋白为如下任一所示蛋白质：

(A1)氨基酸序列为SEQ ID No.1的蛋白质；

7.一种培育耐冷性降低的转基因植物的方法，包括如下步骤：对受体植物中能够表达COLD13蛋白的核酸分子进行抑制表达，得到转基因植物；所述转基因植物与所述受体植物相比耐冷性降低；

所述COLD13蛋白为如下任一所示蛋白质：

(A1)氨基酸序列为SEQ ID No.1的蛋白质；

8.根据权利要求6或7所述的方法，其特征在于：权利要求6中所述向受体植物中导入能够表达COLD13蛋白的核酸分子是通过向所述受体植物中导入含有所述核酸分子的重组载体实现的；

权利要求7中所述对受体植物中能够表达COLD13蛋白的核酸分子进行抑制表达是通过CRISPR/Cas9基因编辑技术实现的。

9.根据权利要求1-8中任一所述的应用或方法，其特征在于：所述能够表达COLD13蛋白的核酸分子为如下任一所示DNA分子：

(B1)SEQ ID No.2或SEQ ID No.3所示的DNA分子；

10.根据权利要求1-9中任一所述的应用或方法，其特征在于：所述植物为单子叶植物或双子叶植物；

进一步地，所述单子叶植物为禾本科植物；

更进一步地，所述禾本科植物为水稻。