CN112390866A - OsARF12基因在提高水稻对水稻矮缩病毒抗性中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了OsARF12基因在提高水稻对水稻矮缩病毒引发的水稻病毒病害抗性中的应用。本发明提供了OsARF12基因或其编码蛋白或含有所述编码基因的重组载体在调控植物抗水稻矮缩病毒引发的水稻病毒病害中的应用；所述基因编码的OsARF12蛋白的氨基酸序列具体为序列表中的序列3。实验证明，在OsARF12基因过表达的水稻中水稻抗病性增强，表明该基因编码的OsARF12蛋白在水稻抗水稻矮缩病毒侵染过程中发挥着重要的作用。

Description

OsARF12基因在提高水稻对水稻矮缩病毒抗性中的应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及OsARF12基因在提高水稻对水稻矮缩病抗性中的应用。

背景技术

水稻矮缩病是由水稻矮缩病毒(Rice dwarf virus，RDV)引起的严重的水稻病害。RDV由介体昆虫电光叶蝉(Recilia dorsalis)和两点黑尾叶蝉(Nephotettix cincticeps)进行传播，感染RDV的水稻植株显著矮缩，分孽增多，叶色浓绿，叶片短粗而僵直。新生叶片上沿叶脉出现断续点线状黄白色小斑点，在叶片的基部更加明显。不同时期发病在症状表现上会有所差别，若侵染发生在早期，则感病水稻不能产生种子，若在孕穗后期发病，只在剑叶及其叶鞘上出现清晰的点线状病斑。感病水稻还表现为根系发育不良，多老朽根。

水稻矮缩病毒的基因组由12条双链RNA组成，根据它们在聚丙烯酰胺凝胶电泳中的迁移率由慢到快依次命名为S1到S12。在非降解条件下提纯的病毒粒子含有P1、P2、P3、P5、P7、P8和P9这7种结构蛋白，分别由S1、S2、S3、S5、S7、S8和S9编码，此外，RDV还会编码Pns4、Pns6、Pns10、Pns11、Pns12这五种非结构蛋白来帮助其侵染复制等，它们分别由S4、S6、S10、S11、S12编码。S1编码的P1为依赖RNA的RNA聚合酶(RNA dependent RNApolymerase，RdRp)，存在于病毒核心颗粒中。S2编码的P2由1116个氨基酸组成，分子量约为123kDa，存在于病毒粒子的最外层。S3编码的P3存在RdRp的保守序列模式，推测P3可能在病毒的复制和转录过程中有一定的作用。S4编码的Pns4是RDV的非结构蛋白，推测RDV引起植株矮化的能力与Pns4密切相关。S5编码的P5由801个氨基酸组成，是RDV的微核心蛋白，具有AA-Pi交换活性，推测P5为RDV的鸟苷转移酶，在病毒mRNA合成时5’甲基帽子结构形成中起到了重要作用。S6编码的Pns6为RDV的细胞间运动蛋白。S7编码的P7能结合RDV的12条dsRNA，在病毒的复制，病毒粒子的组装过程中发挥关键作用。S8编码的P8是RDV的主要外壳蛋白，可与RDV同属的RGDV核心颗粒共同进行体外包被形成病毒粒子。S9编码的P9是RDV的结构蛋白，可与P2和P8共同组成病毒粒子的最外层壳。S10编码的Pns10为RDV的RNA沉默抑制子，在抵抗宿主防御中起作用。S11编码的Pns11可能是RDV除Pns10外的又一个基因沉默抑制子。S12编码的Pns12可能在病毒的侵染和组装中起作用。

水稻条矮缩病毒是严重危害我国水稻生产的主要病毒，由于对水稻病毒和寄主之间的相互作用机制缺乏系统了解，因而长期以来，尚无法设计出一些能彻底控制病毒病危害的策略。自上世纪七十年代中期以来，分子生物学快速发展，使人们对于病毒基因结构、病毒致病及植物抗病机理等有了一定的了解，并启发了利用基因工程手段防治病毒病的一系列策略，如利用外壳蛋白介导的抗性及利用转录后的基因沉默介导的抗性等。随着病毒全基因组序列的分析完成、部分病毒重要功能基因的解析、水稻高效转基因技术的成熟应用与突变体库的建成以及病毒与寄主相互作用机制，尤其是对转录后基因沉默机制的认识，为从转基因分子水平鉴定病毒基因致病性和其与寄主分子相互作用，以及从基因工程水平实施高效抗病育种提供了创新可能。

ARF是生长素响应因子，多数生长素响应基因的转录和表达都受ARF的调控，在生长素信号通路中发挥重要作用。水稻中有25个成员，ARF蛋白家族通常具有四个结构域：位于N末端的结构域I是DNA结合区(DNA binding domain，DBD)，负责结合下游基因的启动子，它与AuxREs中特定的保守序列(TGTCTC)结合，但DBD区域本身不响应生长素。结构域II为中间区域(Middle Region，MR)，结构域III-IV是C端与IAA蛋白的结构域III-IV具有序列相似性的两个结构域。ARF在转录过程中起激活或抑制效应取决于MR区的氨基酸组成，根据其氨基酸组成可分为“富谷氨酰胺(Q-rich)”转录激活因子和“non-Q-rich”转录抑制因子，分别激活和抑制下游含有AuxRE启动子基因的转录。C端的结构域III-IV可使ARF形成同源二聚体，也可使ARF和IAA形成异源二聚体。在低生长素浓度时，转录激活作用的ARFs和Aux/IAA蛋白结合，下游基因的转录被抑制，当生长素浓度升高时，Aux/IAA蛋白被泛素化降解，从而释放IAA蛋白对ARF的抑制，具有转录激活作用的ARFs被释放，从而启动下游调控基因的表达。

发明内容

本发明人通过深入研究发现，OsARF12蛋白及其编码基因可用于调控植物抗水稻矮缩病毒病害，提高水稻抵抗水稻矮缩病毒侵染的能力。

根据本发明的第一个方面，提供了OsARF12蛋白在如下a1)或a2)中的应用：

a1)调控植物对水稻矮缩病毒引发的病毒病害的抗性；

a2)选育对水稻矮缩病病害抗性增强的植物品种；

所述蛋白质由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成或具有与序列3相同生物活性且与该序列3的氨基酸一致性在95％以上，优选99％以上的氨基酸序列。这里所述的生物活性是指增强植物对水稻矮缩病毒引发的水稻病毒病害抗性。

根据本发明的第二个方面，提供了OsARF12蛋白的编码基因或含有所述编码基因的重组载体，在如下a1)或a2)中的应用：

a1)调控植物对水稻矮缩病毒引发的水稻病毒病害的抗性；

a2)选育对水稻矮缩病毒引发的水稻病毒病害抗性增强的植物品种；

所述蛋白质的编码基因，是如下1)至2)中任一所述的DNA分子：

1)序列表中序列1所示的DNA分子；

2)序列表中序列2所示的DNA分子；

3)编码序列3所示的蛋白的DNA分子；

其中，由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成蛋白质命名为OsARF12蛋白(编码基因为序列1，命名为OsARF12基因组序列)。

根据本发明的第三个方面，提供了含有本发明的第二个方面的编码基因的过表达载体。该过表达载体可以通过如下步骤构建：根据序列2设计引物，并在引物两端加上所需酶切位点和保护碱基；提取中花11水稻的总RNA；反转录得到cDNA，以反转录所得cDNA为模板，以上述基因特异性引物进行PCR)反应，该PCR产物具有序列表中序列2所示的核苷酸，回收PCR产物后用限制性内切酶Xba I进行酶切，回收2494bp带有粘性末端的PCR产物；将载体pCAMBIA2300-Actin(Clontech公司，产品目录号：630442)用限制性内切酶Xba I酶切，回收10379bp载体骨架；将上述2494bp带有粘性末端的PCR产物与10379bp载体骨架用T₄连接酶连接，转化大肠杆菌菌株DH5α，得到转化子，提取转化子的质粒为将序列表中序列2所示的基因OsARF12插入载体pCAMBIA2300-Actin的Xba I酶切位点间得到的载体，将该质粒命名为pCAMBIA2300-Actin-HA-OsARF12，即为重组载体。

在本发明中，以上所有a1)中的所述调控植物对水稻矮缩病毒引发的水稻病毒病害病的抗性均具体体现在：促进所述蛋白质或其编码基因的表达，则所述植物对水稻矮缩病毒引发的病毒病害抗性增强。以上所有a2)中的所述选育对水稻矮缩病毒引发的水稻病毒病害增强的植物品种的方法，均具体可包括将所述蛋白质或其编码基因的表达量较高的植株作为亲本进行杂交的步骤。

本发明的再一个目的是提供一种培育对水稻矮缩病毒引发的水稻病毒病害抗性增强的转基因植物的方法。

本发明所提供的培育对水稻矮缩病毒引发的水稻病毒病害抗性增强的转基因植物的方法，具体可包括如下步骤：

a)向目的植物中导入蛋白质的编码基因，得到表达所述编码基因的转基因植物；

b)从步骤a)所得转基因植物中得到与所述目的植物相比，对由水稻矮缩病毒引发的水稻病毒病害抗性增强的转基因植物，

其中，所述蛋白质的编码基因，是如下1)至2)中任一所述的DNA分子：

1)序列表中序列1所示的DNA分子；

2)序列表中序列2所示的DNA分子；

3)编码序列3所示蛋白的DNA分子；

其中，序列1由7458个核苷酸组成，其中第1-7458位为所述OsARF12基因的编码序列包含5’UTR、外显子、内含子和3’UTR；序列2由2469个核苷酸组成，其中第1-2469位为所述OsARF12基因的外显子序列；序列3由822个氨基酸组成，为OsARF12基因编码的蛋白序列。

在所述方法中，所述蛋白质的编码基因是通过含有所述蛋白质的编码基因的重组表达载体导入所述目的植物中的。

所述重组表达载体可用现有的植物表达载体构建。所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等，如pCAMBIA3301、pCAMBIA2300、pCAMBIA2301、pCAMBIA1300、pCAMBIA 1301、pWM101、pGreen0029、pBI121、pBin19、pCAMBIA1301-UbiN等或其它衍生植物表达载体。所述植物表达载体还可包含外源基因的3’端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3’端。使用所述基因构建重组表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型、组成型、组织特异型或诱导型启动子，例如花椰菜花叶病毒(CAMV)35S启动子、泛素基因Ubiquitin启动子(pUbi)、胁迫诱导型启动子Rd29A等，它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建重组表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用重组表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因、具有抗性的抗生素标记物或是抗化学试剂标记基因等。也可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。

在本发明中，所述重组表达载体中启动所述编码基因转录的启动子具体为Actin启动子。更为具体的，所述重组表达载体为将所述编码基因构建到pCAMBIA2300-Actin表达载体上得到的重组质粒。在该重组表达载体中，启动所述编码基因转录的启动子为Actin启动子。

在上述方法中，将携带有所述编码基因的所述重组表达载体导入所述目的植物，具体可为：通过农杆菌介导法、基因枪法、电击法、花粉管导入法、脂质体融合法以及其他任意可将质粒导入的方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物组织培育成植株。

在上述应用或方法中，所述植物可为单子叶植物。

所述单子叶植物为禾本科植物。

在本发明中，所述植物优选为水稻。更加具体的，在本发明的实施例中，所述植物的背景为中花11(Oryza sativa L.japonica cv.Zhonghua 11)，即如未做具体说明，所用转基因材料的背景为中花11水稻。

在上述应用或方法中，所述水稻矮缩病的病原菌具体为水稻矮缩病毒(Ricedwarf virus)，传毒介体为黑尾叶蝉。

在本发明中所用的OsARF12 OE水稻以及OsARF12基因敲除突变体水稻均由武汉伯远生物技术有限公司转化。

实验证明，本发明发现OsARF12在RDV病毒侵染的过程中发挥作用的抗病基因，在水稻矮缩病毒(RDV)侵染过表达OsARF12转基因水稻后，病毒各个RNA链积累量明显低于野生型水稻，病症也较轻，发病率下降；在水稻矮缩病毒(RDV)侵染OsARF12基因敲除突变体和osarf12突变体水稻后，病毒各个RNA链积累量明显高于野生型水稻，病症也更严重，发病率更高；以上结果表明OsARF12基因具有提高水稻抗病毒的能力。文中实例表明OsARF12 OE对水稻矮缩病毒的抗性增强、OsARF12基因敲除突变体和osarf12突变体对病毒抗性减弱，通过实验结果表明OsARF12蛋白或其编码基因能够提高水稻抵抗水稻矮缩病毒侵染的能力。

附图说明

图1为OsARF12的mRNA在OsARF12 OE各株系中的检测结果。q-Real time PCR分析OsARF12 mRNA的表达量，其中，内参基因为OsEF-1α，所述结果为相对于中花11的表达，即定义中花11表达量为1。

图2为OsARF12的蛋白在OsARF12 OE各株系中的检测结果。其中，Actin为内参蛋白。

图3为OsARF12过表达转基因株系接种RDV病毒后的病症图。其中，Mock表示未被RDV侵染的野生型水稻品种中花11；RDV-infected表示被RDV侵染发病的水稻，ZH11为野生型水稻，OsARF12 OE为ZH11背景的转基因水稻。OsARF12 OE侵染RDV病毒后的症状相对于野生型水稻ZH11明显减弱。

图4为OsARF12过表达转基因水稻株系在RDV侵染后病毒蛋白相对表达量。

图5为OsARF12基因敲除突变体水稻的鉴定结果。

图6为OsARF12基因敲除突变体水稻接种RDV病毒后的病症图。其中，Mock表示未被RDV侵染的野生型水稻品种ZH11；RDV-infected表示被RDV侵染发病的水稻品ZH11为野生型水稻，osarf12 KO为ZH11背景的OsARF12基因敲除突变体水稻。osarf12 KO侵染RDV病毒后的症状相对于野生型水稻ZH11更加严重。

图7为OsARF12基因敲除突变体水稻接种RDV病毒后病毒RNA积累量。其中，Mock表示未被RDV侵染的野生型水稻品种ZH11；RDV-infected表示被RDV侵染发病的水稻品ZH11为野生型水稻，osarf12KO为ZH11背景的OsARF12基因敲除突变体水稻。侵染RDV病毒后osarf12 KO水稻中的RDV病毒的RNA积累相对于野生型水稻ZH11更多。

图8为OsARF12基因敲除突变体水稻接种RDV病毒后病毒蛋白积累量。其中，Mock表示未被RDV侵染的野生型水稻品种ZH11；RDV-infected表示被RDV侵染发病的水稻品ZH11为野生型水稻，osarf12 KO为ZH11背景的OsARF12基因敲除突变体水稻。侵染RDV病毒后osarf12 KO水稻中的RDV病毒蛋白的积累相对于野生型水稻ZH11更多。

图9为OsARF12基因Tos17插入突变体水稻的鉴定。

图10为OsARF12基因Tos17插入突变体中OsARF12基因的RT-PCR检测。

图11为OsARF12基因Tos17插入突变体接种RDV病毒后的病症图。其中，Mock表示未被RDV侵染的野生型水稻品种ZH11；RDV-infected表示被RDV侵染发病的水稻，ZH11为野生型水稻，OsARF12基因Tos17插入突变体的背景为ZH11，osarf12为OsARF12基因Tos17插入突变体。OsARF12基因Tos17插入突变体突变体侵染RDV病毒后的症状相对于野生型水稻ZH11更加严重

图12为OsARF12基因Tos17插入突变体接种RDV病毒后病毒的RNA积累量检测。内参基因为OsEF-1α，所述结果为相对于Mock的表达，即定义Mock表达量为1。其中，Mock表示未被RDV侵染的野生型水稻品种ZH11；RDV-infected表示被RDV侵染发病的水稻，ZH11为野生型水稻，OsARF12基因Tos17插入突变体的背景为ZH11，osarf12为OsARF12基因Tos17插入突变体。OsARF12基因Tos17插入突变体突变体侵染RDV病毒后的RNA积累量相对于野生型水稻ZH11明显更多。

图13为OsARF12基因Tos17插入突变体接种RDV病毒后病毒的蛋白积累量检测。其中，Mock表示未被RDV侵染的野生型水稻品种ZH11；RDV-infected表示被RDV侵染发病的水稻，ZH11为野生型水稻，OsARF12基因Tos17插入突变体的背景为ZH11，osarf12为OsARF12基因Tos17插入突变体。Actin为内参蛋白。OsARF12基因Tos17插入突变体突变体侵染RDV病毒后的蛋白积累量相对于野生型水稻ZH11明显更多。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

水稻(Oryza.sativa L.)品种中花11：即中花11水稻(Oryza sativa L.japonicacv.Zhonghua 11)，参考文献：许昱等《“中花11”水稻谷蛋白Gt1基因克隆及蜡质基因启动子引导Gt1基因表达载体的构建》，上海师范大学学报(自然科学版)，2010年4月第39卷第2期，204页。公众可从北京大学获得。

水稻矮缩病毒(Rice Dwarf Virus，RDV)：记载于The Rice Dwarf Virus P2Protein interacts with ent-Kaurene Oxidases in vivo,leading to reducedbiosynthesis of Gibberellins and rice dwarf symptoms.Plant Physiology.139:1935-1945.”一文，公众可从北京大学获得。

农杆菌EHA105：记载于“Zhu et al.,2005.The Rice Dwarf Virus P2 Proteininteracts with ent-Kaurene Oxidases in vivo,leading to reduced biosynthesisof Gibberellins and rice dwarf symptoms.Plant Physiology.139:1935-1945.”一文，公众可从北京大学获得。

pCAMBIA2300载体：记载于“Lian Jin et al.,2016.Rice dwarf virus P2protein hijacks auxin signaling by directly targeting the rice OsIAA10protein.PLoS Pathogens.12(9):e1005847.”一文，公众可从北京大学获得。

实施例1、OsARF12过表达转基因水稻对水稻矮缩病毒的抗性增强

本实施例中所涉及的OsARF12基因来源于水稻(Oryza.sativa L.)，OsARF12基因的基因组编码序列如序列表中序列2所示，序列2由2469个核苷酸组成；序列2编码序列表中序列3所示的蛋白质，序列3由822个氨基酸残基组成。

一、OsARF12过表达转基因水稻的构建及鉴定。

1、OsARF12全长序列的克隆及含有该片段的重组载体的获得

根据序列2设计引物，并在引物两端加上所需酶切位点和保护碱基，引物序列为

HA-OsARF12-F-Xba I：5’-GCTCTAGAATGTACCCATACGATGTTCCAGATTACGCGAGCTCGTCGTCGGCG-3’，

OsARF12-R-Xba I：5’-GCTCTAGATCAGGACAGATACCGTGGATC-3’。

依照Invitrogen公司的TRIzol Reagent说明书(Invitrogen Trizol Reagent，cat No.15596-018)提取中花11水稻的总RNA。测定总RNA浓度后，取10μg总RNA，按照RQ1Dnase(Promega，货号：M610A)的说明书对总RNA中的水稻基因组DNA进行消化。消化反应体系：总RNA10μg，10×Dnase缓冲液10μl，DNase10μl，DEPC水补足100μl。将整个消化反应体系于37℃孵育35min。孵育后向体系中加入4μl RQ1DNase终止反应液，65℃孵育10min，使DNase灭活。

消化基因组DNA后，再利用氯仿抽提法浓缩总RNA，测定RNA浓度，取2μg RNA参照Invitrogen公司的SuperScript II逆转录酶进行反转录得到cDNA，所用引物为16个核苷酸的Oligo d(T)引物。

以逆转录所得cDNA为模板，以上述基因特异性引物HA-OsARF12-F-Xba I和OsARF12-R-Xba I进行PCR(Polymerase Chain Reaction)反应，得到2500bp的PCR产物，该PCR产物具有序列表中序列2所示的核苷酸。

回收PCR产物后用限制性内切酶Xba I进行酶切，回收2494bp带有粘性末端的PCR产物；将载体pCAMBIA2300-Actin(Clontech公司，产品目录号：630442)用限制性内切酶XbaI酶切，回收10379bp载体骨架；将上述2494bp带有粘性末端的PCR产物与10379bp载体骨架用T₄连接酶连接，转化大肠杆菌菌株DH5α，得到转化子。提取转化子的质粒送去测序，该质粒为将序列表中序列2所示的基因OsARF12插入载体pCAMBIA2300-Actin的Xba I酶切位点间得到的载体，将该质粒命名为pCAMBIA2300-Actin-HA-OsARF12，即为重组载体。

2、OsARF12过量表达转基因水稻的获得

1)愈伤组织的诱导培养

中花11水稻(以下也称为野生型水稻)种子去壳，先用70％乙醇浸泡10min，再用0.1％升汞浸泡30min；进行表面除菌。用大量无菌水洗去种子表面的溶液，用无菌滤纸吸去种子表面的水分。将种子置于成熟胚愈伤诱导培养基平板上，用Parafilm膜封闭平皿边缘，于26℃温箱内避光培养。大约15天后，小心取下长出的愈伤组织，转移到成熟胚继代培养基上，同样条件继续进行培养。每两周需进行一次继代培养。用于转化时，需挑选继代培养5天左右、呈淡黄色的颗粒状愈伤组织。

2)农杆菌的培养

将pCAMBIA2300-actin-HA-OsARF12电转入农杆菌EHA105中，得到重组菌EHA105/pCAMBIA2300-actin-HA-OsARF12。

将EHA105/pCAMBIA2300-actin-HA-OsARF12在含有抗生素(50mg/L Kanamycin，50mg/L Rifampicin)的LB平板上划线，28℃培养2天。挑取单菌落接入液体LB培养基中，28℃振荡培养至OD₆₀₀约为0.5，加入乙酰丁香酮至终浓度100mM，得到用于转化水稻愈伤组织的农杆菌悬液。

3)水稻愈伤组织与农杆菌的共培养

将继代愈伤组织放入灭过菌的锥形瓶中，倒入农杆菌悬液使之浸没愈伤组织。室温放置20min，并不时轻轻晃动使愈伤组织与菌液充分接触。用无菌的镊子轻轻取出愈伤组织，放于无菌滤纸上吸去多余的菌液，转移到铺有一层无菌滤纸的共培养培养基平板上。28℃暗培养3天，得到经过共培养的愈伤组织。

4)抗性愈伤组织的筛选与分化

将经过共培养的愈伤组织用适量无菌水清洗，除去表面残余的农杆菌，放在筛选培养基上，26℃避光培养进行筛选，两周后转移到新的筛选培养基上继续筛选两周。挑选经过两轮筛选后状态较好的愈伤组织，将其转移到分化培养基平板上，先避光培养3天，然后再转至光照培养箱中(15hr/day)进行光照培养。一个月后可见分化出的小苗。当分化的小苗长至约2cm时，将其转移到锥形瓶中的生根培养基上，继续培养两周左右。选择长势较好、根系发达的小苗，用自来水洗去根部的培养基后移栽入土壤中，收取种子，得到T₁代转HA-OsARF12水稻种子，播种得到T₁代转HA-OsARF12水稻。

3、OsARF12过表达转基因水稻中OsARF12的mRNA水平检测。

T₁代的水稻种子通过G418初步筛选(pCCAMBIA2300载体带有G418抗性筛选基因)，发芽的种子，表明载体转入水稻。将发芽的种子种入土中，生长2周后，取0.1g叶片，用液氮磨成粉末。依照Invitrogen公司的TRIzol Reagent说明书(Invitrogen Trizol Reagent，cat No.15596-018)提取总RNA。测定总RNA浓度后，取10μg总RNA，按照RQ1Dnase(Promega，货号：M610A)的说明书对总RNA中的水稻基因组DNA进行消化。消化基因组DNA后，再利用氯仿抽提法浓缩总RNA，测定RNA浓度，取2μg RNA参照Invitrogen公司的M-MLV ReverseTranscriptase逆转录酶进行反转录，所用引物为16个核苷酸的Oligod(T)引物，具体方法参见Invitrogen M-MLV Reverse Transcriptase(货号：28025-021)。以反转录获得水稻cDNA为模板，利用qRT-PCR的方法对OsARF12基因的转录水平进行检测，实验方法参照TOYOBO

Green Realtime PCR Master Mix(货号QPK-201)说明书，引物序列如下：

OsARF12-qRT-F：5’-TTGCTTGGACGACTCTTC-3’；

OsARF12-qRT-R：5’-AACCGAACCTGACTTGTAA-3’。

内参基因为水稻EF，引物为：

OsEF-1a-F：5’-GCACGCTCTTCTTGCTTTCACTCT-3’；

OsEF-1a-R：5’-AAAGGTCACCACCATACCAGGCTT-3’。

数据处理方法，参照Bio-rad公司CFX96型号实时定量荧光PCR仪自带软件CFXmanager^TMSoftware(Version2.1)。

结果如图4所示，由图可见，与未转基因的野生型水稻ZH11相比，HA-OsARF12过表达株系#2、#3、#5、#6中的OsARF12基因的表达量升高，说明在这几个株系中OsARF12基因过量表达。

4、OsARF12过表达转基因水稻中OsARF12的蛋白水平鉴定。

取OsARF12过表达转基因水稻以及野生型ZH11的部分叶片，约0.5g，在液氮中研磨后，加入蛋白提取缓冲液(0.25M Tris-Hcl，pH6.8，8％SDS，8％β-巯基乙醇，20％甘油)200μl,冰上孵育10min，100℃煮沸10min，4℃，12000rpm离心10min后取上清，进行SDS-PAGE，转膜之后用Western检测。SDS-PAGE及Western Blot依照公知方法及产品说明书进行。所用抗体为anti-HA-HRP(sigma)，抗体anti-Actin检测水稻内源Actin蛋白，作为内参。如图5，在OsARF12目的大小处出现条带者为阳性，表明基因转入且蛋白表达，选择三个株系#2，#3和#5用于之后的抗病分析实验(图中WT为野生型中花11水稻，用作负对照；“+”为pWM101-HA-OsARF12瞬时表达烟草材料所提取蛋白，用作正对照)。

二、OsARF12过表达转基因水稻对RDV的抗性增强

1、RDV侵染OsARF12过表达转基因水稻后，病症减轻，发病率明显降低

用携带RDV(参见Zhu et al.,2005.The Rice Dwarf Virus P2 Proteininteracts with ent-Kaurene Oxidases in vivo,leading to reduced biosynthesisof Gibberellins and rice dwarf symptoms.Plant Physiology.139:1935-1945.公众可从北京大学获得)的叶蝉(病原菌为水稻矮缩病毒)接种OsARF12过表达转基因水稻和野生型水稻中花11，每种水稻接种25株，白天30度，晚上22度，湿度60％培养，每株接2只叶蝉，咬食三天后将叶蝉捉出，咬食过的水稻在阳光温室培养(自然光，温度。实验重复3次，结果取平均值)。

侵染4周后，观察发病情况(其中感染RDV病毒的为植株矮缩，叶色浓绿，叶片僵硬，在叶片或叶鞘上出现白色斑点并与叶脉平行排列成虚线状，无感染RDV病毒的为叶片或叶鞘上不出现白色斑点)，统计发病水稻株数，计算带毒率＝(有表型株数/总株数)*％。

结果统计如下表2：

表2为OsARF12转基因水稻侵染后带毒率统计结果

可以看出，OsARF12过量表达水稻带毒率更低。除此以外，我们对不同株系感病水稻进行了拍照，如图8所示，为侵染后4周健康，OsARF12过量表达转基因水稻的感病症状图。可以看出，OsARF12过量表达的水稻感病症状更相对更弱，表现为矮化程度相对野生型更弱，而病斑数量更少(图8，图中WT代表野生型中花11水稻，OsARF12 OE代表OsARF12过量表达转基因水稻)。与野生型水稻相比，OsARF12过量表达转基因水稻更加抗病。

为了进一步证实病毒积累量的差异，以步骤1中获得的发病的野生型水稻品种中花11、OsARF12 OE株系与未发病的各个株系为实验材料。分别取各水稻材料叶片2g，在液氮中研磨成粉末，通过western blot实验来检测病毒蛋白P2和Pns11的积累量，实验结果如图5所示，在发病的OsARF12 OE株系中病毒蛋白的积累量比对照组要少。因此我们可以得出结论，OsARF12 OE水稻更加抗病。

实施例2、OsARF12基因敲除突变体水稻对水稻矮缩病毒的抗性减弱。

一、OsARF12基因敲除突变体水稻的鉴定。

我们通过Crispr/Cas9技术构建了OsARF12基因敲除的转基因水稻(由武汉伯远生物技术有限公司完成)，得到T0代转基因株系(osarf12 KO)。我们首先对转基因水稻进行了鉴定，提取基因组DNA，通过测序得到了三种不同突变形式的突变体，测序引物序列如下：

OsARF12-F：5’-ATGAGCTCGTCGTCGGCG-3’；

OsARF12-R：5’-TCAGGACAGATACCGTGGATC-3’。

结果如图4所示，由图可见，与未转基因的野生型水稻(Oryza.sativa L.)品种相比，osarf12 KO#1株系在其CDS编码区缺失了27到31位碱基，osarf12 KO#5株系在其CDS编码区第27和28位碱基之间插入一个“T”，osarf12 KO#6株系在其CDS编码区第27和28位碱基之间插入一个“C”，造成了氨基酸序列的移码和提前终止，从而使得OsARF12蛋白缺失。接下来选取这三个阳性株系进行RDV侵染，分析其抗病性。

二、OsARF12基因敲除突变体水稻对RDV的抗性减弱

用携带RDV的叶蝉(病原菌为水稻矮缩病毒)接种OsARF12基因敲除转基因水稻和野生型水稻中花11，具体操作步骤见实施例1。接毒4周后，观察发病情况，统计发病水稻株数，计算带毒率＝(有表型株数/总株数)*％。

结果统计如下表2：

表2为OsARF12基因敲除突变体水稻侵染后带毒率统计结果

可以看出，相较于野生型水稻，OsARF12基因敲除突变体水稻带毒率更高。除此以外，我们对不同株系感病水稻进行了拍照，如图8所示，为侵染后4周健康，OsARF12基因敲除突变体水稻的感病症状图。可以看出，OsARF12基因敲除突变体水稻感病症状更相对更强，表现为矮化程度相对野生型更强，而病斑数量更多(图8，图中WT代表野生型中花11水稻，osarf12 KO代表OsARF12基因敲除突变体水稻)。与野生型水稻相比，OsARF12基因敲除突变体水稻更加感病。

为了进一步证实病毒积累量的差异，以步骤1中获得的发病的野生型水稻品种中花11、osarf12 KO株系与未发病的各个株系为实验材料。分别取各水稻材料叶片2g，在液氮中研磨成粉末，通过western blot实验来检测病毒蛋白P2和Pns11的积累量，实验结果如图5所示，在发病的osarf12 KO株系中病毒蛋白的积累量比对照组更多。通过qRT-PCR检测病毒基因组RNA的积累量，实验结果如图5所示，在发病的osarf12 KO株系中病毒RNA的积累量比对照组要多。因此我们可以得出结论，OsARF12基因敲除突变体水稻更加感病。

实施例3、OsARF12基因T-DNA插入突变体水稻对水稻矮缩病毒的抗性减弱。

一、OsARF12基因T-DNA插入突变体水稻的鉴定。

本实验室从水稻的Tos17突变体库(https://tos.nias.affrc.go.jp/)购买了osarf12突变体的种子，编号RMD_ATosR-04Z11AG72，播种后约两周，

1、osarf12突变体中T-DNA插入位点分析

取适量新鲜植物叶片提取基因组DNA，步骤如下：取适量叶片于液氮中研磨成粉；加入700μl 2×CTAB提取缓冲液，65℃保温1-1.5hr，期间不时上下颠倒混匀；加入等体积的氯仿，轻缓颠倒离心管混匀，室温下，12000rpm离心10min；将上清液转入另一离心管中，加入0.7倍体积的异丙醇，混匀，-20℃放置30min；12000rpm离心10min，去上清；75％乙醇漂洗两次，沉淀风干后加入40μl的无菌水溶解DNA。

通过PCR鉴定突变体是否为阳性，根据购买突变体网站说明设计基因上引物LP和RP，插入的T-DNA上引物BP；以基因组DNA为模板，用不同的引物LP(RP)+BP和LP+RP通过PCR扩增目的条带；PCR产物跑琼脂糖凝胶电泳，观察结果如果LP(RP)+BP有条带，而LP+RP没有，则是纯合突变体；如果LP(RP)+BP有条带，而LP+RP也有，则是杂合突变体；如果LP(RP)+BP没有条带，而LP+RP有条带，则是野生型。通过PCR产物测序分析发现osarf12突变体Tos17插入到OsARF12基因的2203位。

2、osarf12突变体中无法扩增出OsARF12基因

取上述鉴定出的阳性突变体osarf12突变体，取适量叶片液氮研磨，按照说明书提取RNA，消化基因组DNA，反转录得cDNA，然后通过RT-PCR鉴定突变体中是否可以扩增出OsARF12基因，扩增产物为OsARF12部分蛋白的编码序列；得到约500bp大小条带的为野生型水稻，没有条带的为阳性。

引物序列如下：

OsARF12-RT-F：5’-CAGCCTGTAGCTAGTGAGCAG-3’；

OsARF12-RT-R：5’-TCCCAAGGGTCGTCTCCAAG-3’。

结果如图4所示，osarf12突变体中无法扩增出OsARF12基因，而在野生型水稻中则可以正常扩增出OsARF12基因(图)。

二、OsARF12基因Tos17插入突变体水稻对RDV的抗性减弱

用携带RDV的叶蝉接种osarf12突变体水稻和野生型水稻中花11，具体步骤见实例1，接毒4周后，观察发病情况，统计发病水稻株数，计算带毒率。

结果统计如下表2：

表2为osarf12突变体水稻侵染后带毒率统计结果

可以看出，osarf12突变体水稻带毒率更高。除此以外，我们对不同株系感病水稻进行了拍照，如图8所示，为侵染后4周健康，osarf12突变体水稻的感病症状图。可以看出，osarf12突变体水稻感病症状更相对野生型更明显，表现为矮化程度相对野生型更强，而病斑数量更多(图8，图中WT代表野生型中花11水稻)。与野生型水稻相比，osarf12突变体水稻更加抗病。

为了进一步证实病毒积累量的差异，以步骤1中获得的发病的野生型水稻品种中花11、osarf12与未发病的各个株系为实验材料。分别取各水稻材料叶片2g，在液氮中研磨成粉末，通过western blot实验来检测病毒蛋白P2和Pns11的积累量，实验结果如图5所示，在发病的osarf12株系中病毒蛋白的积累量比对照组更多。通过qRT-PCR检测病毒基因组RNA的积累量，实验结果如图5所示，在发病的osarf12株系中病毒RNA的积累量比对照组更多。因此我们可以得出结论，osarf12突变体水稻更加感病。

综合上述实验结果，表明OsARF12在水稻抗RDV过程中发挥功能，能够增强水稻对水稻矮缩病毒的抗性。

序列表

<110> 北京大学

<120> OsARF12基因在提高水稻对水稻矮缩病毒抗性中的应用

<130> 1908265F

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 7458

<212> DNA

<213> 水稻(Oryza sativa)

<400> 1

cttcagacac tgtgcgggag ctcacgctac tgtacggccc cctgcgctgc gccccccctc 60

gtcgcgcaca cgcacacacg cactcgcact actcgaacca cgcgaacccc tctctttctc 120

tctctctctc tctctcgctt aaatgccaca aacctaatca tttccacccc tcttgcgctc 180

tctctctctc tctccaaccc caccctttct ccccaccatg gtggcgatct ccgagctcgg 240

gtgagcggaa gagaaaggtt ggttggtccc ttgccggcgg ggtgggggtt ggattgattt 300

tgctttgctt tgctctgtgg tttgttgatg cttgttgttg gtgttggtgt tggtggtggt 360

ggtgcagaat gcggccgatt tgaggagggg gatggggttt tcgggtggat ttgtgagggg 420

atagattaag agtttgtgct tctctggttt ggtcggagga ggaggagatg agctcgtcgt 480

cggcggccag catcgggccg ccgcagccgc cgccgccccc cgcgccgccc gaggaaggtg 540

ggtggctagg tttgtttccg ccgcttcgct tcgcggttcg ctttacttcc cttctcgttt 600

ggttgatgac tcgatctgct gctgctgctg ctgctgcaga gaagaagtgc ctcaactcgg 660

agctatggca cgcctgcgcc ggcccgctcg tctgcctccc caccgtcggc acgcgcgtcg 720

tctacttccc gcaaggccac agcgagcagg tgaggctgag ctcacctcct cagccgtctc 780

gtgggcgcgc ttgctttgct tctctctctc tatctctgct ggtttctctt gtttctgacg 840

cgggtgagct ttgcatacgt gaaggtggcg gcgtcgacga acaaggaggt ggagggtcac 900

atcccgaact accccaacct gccggcgcag ctgatctgcc agctccacga tgtcacaatg 960

catgtacgtg gttccttgcc ctaatttctc ggggcatttc tcagatcgat gcggcgtcac 1020

ctccactcca ctcctccggt ttatctccat ggctgtcggt gctgacttgg gctggcaatt 1080

tttttgcagg cggatgtgga gactgacgag gtgtacgcgc agatgacgct ccagccactg 1140

aacccagtaa ggcgcctggg gtttttgcat gatgtttgca gtgctgaggt tttgatggtt 1200

tgaaggcgtg aaatattcta agcggttaat ttgatggttt ttttggatgt gttcattcgt 1260

gcagcaggag cagaacgatg cgtaccttcc cgcggagatg gggataatga gcaagcagcc 1320

gacgaattac ttctgcaaga cattgacggc gagcgacacc agcacgcacg gggggttctc 1380

cgtgccccgc cgtgctgctg agcgcgtctt ccctcctttg gtgtgatgag tggtgtaatt 1440

tggggctgtg ctcctttctt gtacttcttg ggtggttggg ttttgctgtt gccaataaca 1500

ggtggtatag tgtggtttgt aggatttcac acagcagcct ccagcccagg agctaattgc 1560

acgggatatt catgacatcg agtggaagtt caggcacatc tttcgaggta acttcttaaa 1620

aatctgtaga gcttatggca gtcttgaatt cttcataacg gtgaattatg atattcttaa 1680

agggaatttc ctaataatca tctctgcccc ttttccattc gataagttca ccctttgtaa 1740

tcatggctta aaaccttcct aataaaaacg ttttcaagtg ttctgagaaa aacttcaacc 1800

attctcacac aatgtgatgt aagcgtcttt ttcacttaaa aatcagttgg tgtgaatgga 1860

gcaagagata cttgattgaa ttagggttat gcatagaaat gaagttacga gatcattaat 1920

tggataagca cataaaaaat atcaaatttt aatatgttag gatagttagc agtggatcaa 1980

gttacaattg acatatgaat acatgatact ttcagaggcg tactgaaata tttactagag 2040

ttcgcaggtc ttacaaaatt gcacaatgag caatcactgt actggacagt ataattctcg 2100

gtgtaggctt ctttttgtat gccttgaatt cccatctttc tgcagggttg aacttattgt 2160

tagtgtgttt tctgacacag aatgtacttt gtattgatca caataactaa aaaaatgttg 2220

tcttaacata aatgttgata gtacatatgc ttgaggtact tgtgctgtat tgattatgaa 2280

atgggatctg ctcaacacta atgatgttgt tagtaattgt gtttagtagt tttatatttt 2340

tgaacatgcc atgttactat cttttgtagt aatatgctgt ttttgacagg ccaacccaaa 2400

cgacacctgc taaccactgg ctggagcgtt tttgtcagtg ctaagagact tgttgctgga 2460

gattctgtgc ttttcatatg gtttgttttc catctctctt gcatttgtga ttttcttttt 2520

tacctgtgct aatgagtagg gcgcattgtt gattctctga ctcaggaacg agaaaaacca 2580

gcttttactt ggaataagac gtgccagtcg gccacagact gtgatgcctt cctctgttct 2640

ttcaagcgat agcatgcaca taggtctcct tgcagcagca gctcatgctg ctgctacaaa 2700

cagccgtttc actattttct acaacccccg gtaagttgga cttttaaatt agtatatatg 2760

cattgttgtt tttcctcccc atgtacaccg ttaatagaaa gagtgtttgt agggcaagtc 2820

catcagaatt tgtcatacca ctgtcaaaat acatcaaggc tgtttttcac acccggatat 2880

cggttgggat gcggttcagg atgttgtttg agactgagga atcaagcgtt cgcaggtgac 2940

ctagcaaatg tcaatgctca gtccttattc tataatctag gccaaatata taaatgatgg 3000

tacttttttt agataatact tggttaccta gcaccaggag atcctataca tgtttgtagg 3060

atgtatgtga ctatgccagt ggctgaaatt gccattatct gtacttttta tgctttcacg 3120

cgttgatgtt cttgaaaaat ctgcgcatct gtcaggacat caccccatta tttatgggaa 3180

ttttataatt gggcctctat aaaaatccat aatatactaa tgcgcccaat gcacacttta 3240

atgaaacaca ggtatatggg gactataact gaagttagtg atgcagaccc agtccgttgg 3300

cctagttcct attggagatc tgtgaaggta atttttatat tacttgaggt tgttctaaag 3360

agctgtgggg gtttaaacgt gatttgtgtt gtctttcctg attatcttca tcttctttag 3420

ttgcattttc ttatgatctg tacctctggt tttcattata acaatcatgg aactgccttc 3480

agatgttatt gcactagtgc ttgcttccac agttccacta actagtgtga tattttcagg 3540

ttggttggga tgaatcaact gcaggggaaa gaccaccaag agtttcttta tgggaaattg 3600

aaccattgac aacctttcca atgtatccat ctctgttccc actgagagtt aagcatcctt 3660

ggtattcagg agttgcttcc ctgcatggta cgcttaagat tcttgttact gtgtgtcagg 3720

cataaactag ttttgaagct attttgctgt atgcttgcta tgtgtgtgcg cctatcatgt 3780

ggaagtttat ttggtgcatt tacatagtgt tttagccatc acactcaaat tactgaagcc 3840

acagccttaa taaatttctg aacctgccac atcaaccagc tgatgattct aactaaaata 3900

acctgaagtt gagattgtgg tgcaagagca agaggctata gttcaagtca gtgttctcta 3960

ctgtgaacaa tatgcctcaa atgatggttc tggatacaga gattgatcag ggaactttat 4020

aaaatgctca tataggctaa aagtaaaaca agttatggtg taagtgaaaa gttgatctct 4080

tccttccatt tcttaagcac ccaaggtgga tcaatgttat ttgataaggc tcttccgtag 4140

caaatgtaac gttctataat atgcattctt tttattcatt gtctttctgt gcattcttgt 4200

tatggagaat gcattgatct gcctgacata attccatttt ctagtatctc tcattcatat 4260

ttctgttctt ttattaactg ctgtatcaca cttaagatga cagcaatgct ttaatgtggc 4320

tgagaggagt tgctggtgag ggaggttttc agtctctgaa ctttcagtca cctggtattg 4380

gctcctgggg acaacagagg ctccatccat ccttactgag cagcgatcac gatcagtacc 4440

aagcagtagt tgctgctgct gctgcttccc aatctggtgg ttacttaaaa cagcaattct 4500

tgcaccttca gcaacctatg cagtcccctc aagaacactg caacctcaac ccattattgc 4560

agcaacaaat tctgcagcaa gcaagccagc aacagataat taatcctgat gcccaaaata 4620

tccaaacgat gttgagccca agtgctatac aacagcaact ccagcaacta cagcaaatgc 4680

agcaagttca gaatgatcag aagcagaaga ttcaaccaga tcaaagctac caagttccta 4740

caagtgcagt tctcccaagt ccaacatcat taccgagtca tttgcgagaa aaatttggct 4800

tctctgatcc taatgcgaat tcttcaagct tcatcacctc tagcagtagt gataacatgt 4860

tggattcgag cttccttcag ggaagttcga aagctgtgga cttatctcga tttaatcagc 4920

ctgtagctag tgagcagcag cagcagcagc aacaggcatg gaagcagaag tttatgggtt 4980

cacagtcagt gtcttttggg ggctcggttt tgcataactc acccacaagc aaagatggtt 5040

ctgttgaaaa caaaattggt cgtgatgtgc aaaaccagtc cctttttagt ccacaagttg 5100

actcttcatc cctcctgtac aacatggttc ctaatctgac ttcgaatgtt tcggatggca 5160

acttatcaac gatcccttct ggatcaactt atctgcagaa tgcaatgtat ggttgcttgg 5220

acgactcttc tggtttattg caaaatacag gagagaacga tccagcaacc agaacatttg 5280

tgaaggtaac tagtataatt tgcattgttg ctaggtcaaa tatgagctcc tctttttcct 5340

ccaaaaaata tatattcttc ttttcatgga accattgtaa aattgcaggt ttacaagtca 5400

ggttcggttg ggaggtcgtt ggacataacc cggttctcta attatgctga acttcgagaa 5460

gaactgggtc agatgttcgg cattaagggt caattggacg accctgatag atcaggctgg 5520

cagcttgtat tcgtcgacag ggagaatgat gtgcttctcc ttggagacga cccttgggag 5580

taagaaatat tctcagaatt ctgatttatt tattagtttt agtaatcaat atccatgcat 5640

gcgcactaca aattcaagtt ttagtaagca atataaattt aagtttcatc ttaccgttct 5700

atgatttggt tgcaaaaaaa tctgcttaaa ttttagtact acacttggca taccctgtcc 5760

atgtgtgcac actacaaact gaatctctta attgatgttg gcctcaaaac ggccaagtta 5820

acatgctaag taaaaatttc aaatctacat caggcattgt aacttcattg tatatctaaa 5880

taatttaaag atattaaacg tgcctaagat caacaaaatt tggcttgact agcaagtgca 5940

aaagtggctg tcttatactt cctccgtttc ataatgtaag actttctagc attgcccaca 6000

ttcatataga tgttaatgaa tctagaaata tatgtgtgtc tagattcatt aacatctata 6060

tgaatgtgag caatgctaaa aagtcttaca ttatgaaacg gagggagtac aatactttgg 6120

tttcctggtt tccacaacta atagcttatc gaggaaaggt atgtacaatg tgaatggata 6180

tcccttcttc attcactgaa agacatgttg acagctcatg gacagtatct aatgaatatg 6240

tttaaaagta ctagtgttat atggagtata tttttgcaat gttcggtgcc taattgtgat 6300

ctcaaacaga attcatgtgc attcagtcat acatctttaa tgtgtattaa tatgttaaat 6360

ttttttacta gactgttctt ccttcaataa tatgtgttgg tcagtcacta tatgttgatg 6420

ctcagttacc caagaccctt cgtgagagta aacatcagac atgattcttc ttgaaactga 6480

ccttcctcat atgatgtagg tcctttgtga atagtgtatg gtacatcaag atactttcac 6540

ctgaggatgt gcataagatg ggaaagcaag gaaatgatcc acggtatctg tcctgaagtg 6600

agagaacatg gtgccatttc tggtaagatg tcataattat atttattgta acgattacca 6660

aatcccacac taatccttaa aaacctatga ctggatagag atgttctttt ctgagtaaat 6720

ctgttatcat gttgtgtact tcgatagttg ttgacatatt ggcatcatgt gttttttgtc 6780

ccttattgaa tgtaaaatgg tctcattgtg cgggttgaag aatgtctgtt tgctctaatt 6840

tttattgctc ggaataactc acatcttaat tgacgactca aatttaattt agagtctttt 6900

tatgcatatt catctctgca tactaacatg tcctggtata ctatcacagg gcttccagga 6960

ggattctgca gtgcatggtg gcactcttgc tctcgacaat gcacgtcgtc agaagtccca 7020

aatttgtatc ttgcatgtac gccgtacatg tttccagaac tctctgttac ctattcggtg 7080

caggccaccg gaaccacgaa acctgatatt ttgtaggttc cacttaggaa tcagtatcgg 7140

tttaactctt atcctagatg atttgtaact cgcacggcag tccactgttt tcatgtttca 7200

tcgagtcttc ctagacatta aacttagttg atattgtatc aggatttatg tgtattgaga 7260

ttcctctaca tgctttcaac caaaaaaaac tgcaataatc gaagcgcacg aggattgttt 7320

caattcgtgt tgtaggatct ggattttcac cgattgtccg gttatgtcag tttcgagagg 7380

agctgtcaat ctgaagtttt ttctgtagtg cctaatattt tgcttttatt attaatgcta 7440

atcatatact gttgtgat 7458

<210> 2

<211> 2469

<212> DNA

<213> 水稻(Oryza sativa)

<400> 2

atgagctcgt cgtcggcggc cagcatcggg ccgccgcagc cgccgccgcc ccccgcgccg 60

cccgaggaag gtgggtggct agagaagaag tgcctcaact cggagctatg gcacgcctgc 120

gccggcccgc tcgtctgcct ccccaccgtc ggcacgcgcg tcgtctactt cccgcaaggc 180

cacagcgagc aggtggcggc gtcgacgaac aaggaggtgg agggtcacat cccgaactac 240

cccaacctgc cggcgcagct gatctgccag ctccacgatg tcacaatgca tgcggatgtg 300

gagactgacg aggtgtacgc gcagatgacg ctccagccac tgaacccaca ggagcagaac 360

gatgcgtacc ttcccgcgga gatggggata atgagcaagc agccgacgaa ttacttctgc 420

aagacattga cggcgagcga caccagcacg cacggggggt tctccgtgcc ccgccgtgct 480

gctgagcgcg tcttccctcc tttggatttc acacagcagc ctccagccca ggagctaatt 540

gcacgggata ttcatgacat cgagtggaag ttcaggcaca tctttcgagg ccaacccaaa 600

cgacacctgc taaccactgg ctggagcgtt tttgtcagtg ctaagagact tgttgctgga 660

gattctgtgc ttttcatatg gaacgagaaa aaccagcttt tacttggaat aagacgtgcc 720

agtcggccac agactgtgat gccttcctct gttctttcaa gcgatagcat gcacataggt 780

ctccttgcag cagcagctca tgctgctgct acaaacagcc gtttcactat tttctacaac 840

ccccgggcaa gtccatcaga atttgtcata ccactgtcaa aatacatcaa ggctgttttt 900

cacacccgga tatcggttgg gatgcggttc aggatgttgt ttgagactga ggaatcaagc 960

gttcgcaggt atatggggac tataactgaa gttagtgatg cagacccagt ccgttggcct 1020

agttcctatt ggagatctgt gaaggttggt tgggatgaat caactgcagg ggaaagacca 1080

ccaagagttt ctttatggga aattgaacca ttgacaacct ttccaatgta tccatctctg 1140

ttcccactga gagttaagca tccttggtat tcaggagttg cttccctgca tgatgacagc 1200

aatgctttaa tgtggctgag aggagttgct ggtgagggag gttttcagtc tctgaacttt 1260

cagtcacctg gtattggctc ctggggacaa cagaggctcc atccatcctt actgagcagc 1320

gatcacgatc agtaccaagc agtagttgct gctgctgctg cttcccaatc tggtggttac 1380

ttaaaacagc aattcttgca ccttcagcaa cctatgcagt cccctcaaga acactgcaac 1440

ctcaacccat tattgcagca acaaattctg cagcaagcaa gccagcaaca gataattaat 1500

cctgatgccc aaaatatcca aacgatgttg agcccaagtg ctatacaaca gcaactccag 1560

caactacagc aaatgcagca agttcagaat gatcagaagc agaagattca accagatcaa 1620

agctaccaag ttcctacaag tgcagttctc ccaagtccaa catcattacc gagtcatttg 1680

cgagaaaaat ttggcttctc tgatcctaat gcgaattctt caagcttcat cacctctagc 1740

agtagtgata acatgttgga ttcgagcttc cttcagggaa gttcgaaagc tgtggactta 1800

tctcgattta atcagcctgt agctagtgag cagcagcagc agcagcaaca ggcatggaag 1860

cagaagttta tgggttcaca gtcagtgtct tttgggggct cggttttgca taactcaccc 1920

acaagcaaag atggttctgt tgaaaacaaa attggtcgtg atgtgcaaaa ccagtccctt 1980

tttagtccac aagttgactc ttcatccctc ctgtacaaca tggttcctaa tctgacttcg 2040

aatgtttcgg atggcaactt atcaacgatc ccttctggat caacttatct gcagaatgca 2100

atgtatggtt gcttggacga ctcttctggt ttattgcaaa atacaggaga gaacgatcca 2160

gcaaccagaa catttgtgaa ggtttacaag tcaggttcgg ttgggaggtc gttggacata 2220

acccggttct ctaattatgc tgaacttcga gaagaactgg gtcagatgtt cggcattaag 2280

ggtcaattgg acgaccctga tagatcaggc tggcagcttg tattcgtcga cagggagaat 2340

gatgtgcttc tccttggaga cgacccttgg gagtcctttg tgaatagtgt atggtacatc 2400

aagatacttt cacctgagga tgtgcataag atgggaaagc aaggaaatga tccacggtat 2460

ctgtcctga 2469

<210> 3

<211> 822

<212> PRT

<213> 水稻(Oryza sativa)

<400> 3

Met Ser Ser Ser Ser Ala Ala Ser Ile Gly Pro Pro Gln Pro Pro Pro

1 5 10 15

Pro Pro Ala Pro Pro Glu Glu Gly Gly Trp Leu Glu Lys Lys Cys Leu

20 25 30

Asn Ser Glu Leu Trp His Ala Cys Ala Gly Pro Leu Val Cys Leu Pro

35 40 45

Thr Val Gly Thr Arg Val Val Tyr Phe Pro Gln Gly His Ser Glu Gln

50 55 60

Val Ala Ala Ser Thr Asn Lys Glu Val Glu Gly His Ile Pro Asn Tyr

65 70 75 80

Pro Asn Leu Pro Ala Gln Leu Ile Cys Gln Leu His Asp Val Thr Met

85 90 95

His Ala Asp Val Glu Thr Asp Glu Val Tyr Ala Gln Met Thr Leu Gln

100 105 110

Pro Leu Asn Pro Gln Glu Gln Asn Asp Ala Tyr Leu Pro Ala Glu Met

115 120 125

Gly Ile Met Ser Lys Gln Pro Thr Asn Tyr Phe Cys Lys Thr Leu Thr

130 135 140

Ala Ser Asp Thr Ser Thr His Gly Gly Phe Ser Val Pro Arg Arg Ala

145 150 155 160

Ala Glu Arg Val Phe Pro Pro Leu Asp Phe Thr Gln Gln Pro Pro Ala

165 170 175

Gln Glu Leu Ile Ala Arg Asp Ile His Asp Ile Glu Trp Lys Phe Arg

180 185 190

His Ile Phe Arg Gly Gln Pro Lys Arg His Leu Leu Thr Thr Gly Trp

195 200 205

Ser Val Phe Val Ser Ala Lys Arg Leu Val Ala Gly Asp Ser Val Leu

210 215 220

Phe Ile Trp Asn Glu Lys Asn Gln Leu Leu Leu Gly Ile Arg Arg Ala

225 230 235 240

Ser Arg Pro Gln Thr Val Met Pro Ser Ser Val Leu Ser Ser Asp Ser

245 250 255

Met His Ile Gly Leu Leu Ala Ala Ala Ala His Ala Ala Ala Thr Asn

260 265 270

Ser Arg Phe Thr Ile Phe Tyr Asn Pro Arg Ala Ser Pro Ser Glu Phe

275 280 285

Val Ile Pro Leu Ser Lys Tyr Ile Lys Ala Val Phe His Thr Arg Ile

290 295 300

Ser Val Gly Met Arg Phe Arg Met Leu Phe Glu Thr Glu Glu Ser Ser

305 310 315 320

Val Arg Arg Tyr Met Gly Thr Ile Thr Glu Val Ser Asp Ala Asp Pro

325 330 335

Val Arg Trp Pro Ser Ser Tyr Trp Arg Ser Val Lys Val Gly Trp Asp

340 345 350

Glu Ser Thr Ala Gly Glu Arg Pro Pro Arg Val Ser Leu Trp Glu Ile

355 360 365

Glu Pro Leu Thr Thr Phe Pro Met Tyr Pro Ser Leu Phe Pro Leu Arg

370 375 380

Val Lys His Pro Trp Tyr Ser Gly Val Ala Ser Leu His Asp Asp Ser

385 390 395 400

Asn Ala Leu Met Trp Leu Arg Gly Val Ala Gly Glu Gly Gly Phe Gln

405 410 415

Ser Leu Asn Phe Gln Ser Pro Gly Ile Gly Ser Trp Gly Gln Gln Arg

420 425 430

Leu His Pro Ser Leu Leu Ser Ser Asp His Asp Gln Tyr Gln Ala Val

435 440 445

Val Ala Ala Ala Ala Ala Ser Gln Ser Gly Gly Tyr Leu Lys Gln Gln

450 455 460

Phe Leu His Leu Gln Gln Pro Met Gln Ser Pro Gln Glu His Cys Asn

465 470 475 480

Leu Asn Pro Leu Leu Gln Gln Gln Ile Leu Gln Gln Ala Ser Gln Gln

485 490 495

Gln Ile Ile Asn Pro Asp Ala Gln Asn Ile Gln Thr Met Leu Ser Pro

500 505 510

Ser Ala Ile Gln Gln Gln Leu Gln Gln Leu Gln Gln Met Gln Gln Val

515 520 525

Gln Asn Asp Gln Lys Gln Lys Ile Gln Pro Asp Gln Ser Tyr Gln Val

530 535 540

Pro Thr Ser Ala Val Leu Pro Ser Pro Thr Ser Leu Pro Ser His Leu

545 550 555 560

Arg Glu Lys Phe Gly Phe Ser Asp Pro Asn Ala Asn Ser Ser Ser Phe

565 570 575

Ile Thr Ser Ser Ser Ser Asp Asn Met Leu Asp Ser Ser Phe Leu Gln

580 585 590

Gly Ser Ser Lys Ala Val Asp Leu Ser Arg Phe Asn Gln Pro Val Ala

595 600 605

Ser Glu Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Ala Trp Lys Gln Lys Phe Met

610 615 620

Gly Ser Gln Ser Val Ser Phe Gly Gly Ser Val Leu His Asn Ser Pro

625 630 635 640

Thr Ser Lys Asp Gly Ser Val Glu Asn Lys Ile Gly Arg Asp Val Gln

645 650 655

Asn Gln Ser Leu Phe Ser Pro Gln Val Asp Ser Ser Ser Leu Leu Tyr

660 665 670

Asn Met Val Pro Asn Leu Thr Ser Asn Val Ser Asp Gly Asn Leu Ser

675 680 685

Thr Ile Pro Ser Gly Ser Thr Tyr Leu Gln Asn Ala Met Tyr Gly Cys

690 695 700

Leu Asp Asp Ser Ser Gly Leu Leu Gln Asn Thr Gly Glu Asn Asp Pro

705 710 715 720

Ala Thr Arg Thr Phe Val Lys Val Tyr Lys Ser Gly Ser Val Gly Arg

725 730 735

Ser Leu Asp Ile Thr Arg Phe Ser Asn Tyr Ala Glu Leu Arg Glu Glu

740 745 750

Leu Gly Gln Met Phe Gly Ile Lys Gly Gln Leu Asp Asp Pro Asp Arg

755 760 765

Ser Gly Trp Gln Leu Val Phe Val Asp Arg Glu Asn Asp Val Leu Leu

770 775 780

Leu Gly Asp Asp Pro Trp Glu Ser Phe Val Asn Ser Val Trp Tyr Ile

785 790 795 800

Lys Ile Leu Ser Pro Glu Asp Val His Lys Met Gly Lys Gln Gly Asn

805 810 815

Asp Pro Arg Tyr Leu Ser

820

Claims (10)

1.蛋白质在如下a1)或a2)中的应用：

a1)调控植物对水稻矮缩病或由水稻矮缩病毒引发的水稻病毒病害的抗性；

a2)选育对由水稻矮缩病毒引发的病毒病害抗性增强的植物品种；

所述蛋白质是序列表中序列3所示的氨基酸序列，或者具有与序列3相同生物活性且与该序列3的氨基酸一致性在95％以上，优选99％以上的氨基酸序列。

2.蛋白质的编码基因或含有所述编码基因的重组载体在如下a1)或a2)中的应用：

a1)调控植物对水稻矮缩病或由水稻矮缩病毒引发的水稻病毒病害的抗性；

a2)选育对由水稻矮缩病毒引发的水稻病毒病害抗性增强的植物品种；

所述蛋白质的编码基因是：

1)序列表中序列1所示的DNA分子；

2)序列表中序列2所示的DNA分子；

3)编码序列3所示蛋白的DNA分子。

3.培育对水稻矮缩病或由水稻矮缩病毒引发的水稻病毒病害抗性增强的转基因植物的方法，包括如下步骤：

a)向目的植物中导入蛋白质的编码基因，编码获得的蛋白序列为序列3所示的氨基酸组成，得到表达所述编码基因的转基因植物；

b)从步骤a)所得转基因植物中得到与所述目的植物相比，对水稻矮缩病或由水稻矮缩病毒引发的水稻病毒病害抗性增强的转基因植物。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述蛋白质的编码基因是如下1)至2)中任一所述的DNA分子：

1)序列表中序列1所示的DNA分子；

2)序列表中序列2所示的DNA分子；

3)编码序列3所示蛋白的DNA分子。

5.根据权利要求3或4所述的方法，其特征在于：所述编码基因是通过含有所述蛋白质的编码基因的重组表达载体导入所述目的植物中的。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述重组表达载体中启动所述编码基因转录的启动子为Actin启动子。

7.根据权利要求3-6中任一所述的方法，其特征在于：所述植物为单子叶植物。

8.根据权利要求7所述的应用或方法，其特征在于：所述单子叶植物为禾本科植物。

9.根据权利要求8所述的应用或方法，其特征在于：所述禾本科植物为水稻。

10.根据权利要求1-9中任一所述的应用或方法，其特征在于：所述水稻矮缩病的病原体为水稻矮缩病毒，传毒介体为黑尾叶蝉。

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