CN112812162A - 一种水稻抗性相关基因及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种水稻抗性相关基因及其应用，属于植物分子生物学与植物遗传工程领域。本发明提供一种水稻蛋白质及其编码基因的应用：调控水稻对水稻黑条矮缩病和南方水稻黑条矮缩病的抗性；选育对水稻黑条矮缩病和南方水稻黑条矮缩病抗性增强的水稻品种；所述蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。所述编码基因的序列如SEQ ID NO.2所示。本发明OsAP47基因负调控水稻对水稻黑条矮缩病毒和南方水稻黑条矮缩病毒的抗性，可以运用在作物育种抗病性改良方面，有望提高植物对水稻黑条矮缩病毒和南方水稻黑条矮缩病毒的抗病性，从而达到增产减药的目的。

Description

一种水稻抗性相关基因及其应用
技术领域
本发明属于植物分子生物学与植物遗传工程领域，具体涉及一种水稻抗性相关基因及其应用。
背景技术
水稻(Oryza sativa L.)是世界上最重要的粮食作物之一，同时也是我国最主要的栽培作物之一，但其每年都遭受到严重的病虫害的侵扰，给农业生产带来了巨大的损失。
水稻黑条矮缩病是由介体灰飞虱以持久性不经卵方式传播的一种恶性病毒病，能够侵染水稻、玉米和小麦，分别引起水稻黑条矮缩病、玉米粗缩病和小麦绿矮病。水稻黑条矮缩病毒(Rice black-streaked dwarf virus,RBSDV)侵染引起严重的植物生长异常，导致植物矮缩、无法正常抽穗结实，发病后损失高达50％。植物一旦受到侵染，通常无法治愈，因此被称作水稻的“癌症”。水稻黑条矮缩病在我国东部、东南亚、欧洲及南美洲大面积蔓延，造成严重的产量损失。
南方水稻黑条矮缩病是由介体白背飞虱不经卵方式传播的一种恶性病毒病，可侵染水稻、玉米、薏米和稗草等。植物受南方水稻黑条矮缩病毒(Southern rice black-streaked dwarf virus,SRBSDV)侵染后，也表现出明显的矮缩症状，节间粗肿，果实畸形，不结实或结实很少。迄今，南方水稻黑条矮缩病毒在越南及我国南部迅速扩散，引起水稻及玉米严重发病。由于缺乏抗病品种，目前延迟播种时间和喷施农药广泛用于控制植物病毒病，这些措施往往会导致作物大面积减产和严重的环境污染。
病毒主要通过侵入、复制增殖和移动扩散的方式完成对植物的侵染致病过程，植物则会进化出相应的抗病反应抵抗病毒的攻击，实现对病毒的抗性。病毒侵入植物导致两种结果：(1)病毒成功的在寄主植物内繁殖，引起相关炎症；(2)寄主植物产生抗病反应，杀死病毒或阻止其复制。
植物的抗病反应是多基因参与调控的复杂过程。参与植物抗病反应的基因分为两类：抗病基因，又称R(resistance)基因和抗病相关基因。但是目前已知的水稻中的抗病毒基因和抗病相关基因很少，且并无水稻黑条矮缩病和南方水稻黑条矮缩病抗性相关基因报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种蛋白及其编码基因在调节水稻对水稻黑条矮缩病和南方水稻黑条矮缩病的抗性方面的应用。
本发明的目的采用如下技术方案实现：
一种蛋白质在如下(1)或(2)中的应用：
(1)调控水稻或玉米对水稻黑条矮缩病和南方水稻黑条矮缩病的抗性；
(2)选育对水稻黑条矮缩病和南方水稻黑条矮缩病抗性增强的水稻或玉米品种；
所述蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示或者与SEQ ID NO.1所示序列具有90％以上的同源性的序列。
蛋白质的编码基因在如下(1)或(2)中的应用：
(1)调控水稻或玉米对水稻黑条矮缩病和南方水稻黑条矮缩病的抗性；
(2)选育对水稻黑条矮缩病和南方水稻黑条矮缩病抗性增强的水稻或玉米品种；
所述编码基因的序列如SEQ ID NO.2所示或者与SEQ ID NO.2所示序列具有90％以上的同源性的序列。
本发明还提供含有所述基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。
本发明还提供含有所述基因的遗传转化株系，是含有OsAP47基因的过表达载体所转化的转基因植物。
在本发明中，所述转化株系，是敲除所述基因的转基因植物。
在本发明中，所述转化株系，其是含有所述基因编辑载体所转化的转基因植物。
本发明还提供所述重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌、所述的转基因植物在提高植物抗病毒中的应用。
本发明还提供所述重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌、所述的转基因植物在植物育种中的应用。
本发明的有益效果：申请人研究发现OsAP47基因负调控水稻对水稻黑条矮缩病毒和南方水稻黑条矮缩病毒的抗性。敲除感病品种NPB(Nipponbare)中的OsAP47基因不会影响植物农艺性状，但可以显著增强植物对水稻黑条矮缩病毒和南方水稻黑条矮缩病毒的抗病性；OsAP47基因可以运用在作物育种抗病性改良方面，有望提高植物对水稻黑条矮缩病毒和南方水稻黑条矮缩病毒的抗病性，从而达到增产减药的目的。
附图说明
图1：pEXT06f::OsAP47过量表达转基因水稻的验证。其中，图1a是OsAP47在W44(VANDANA)中过量表达构建示意图，35Sp：35S驱动的启动子，NOTT：NOT终止子；图1b是过表达株系35S:OsAP(#1)、35S:OsAP(#2)、35S:OsAP(#3)、35S:OsAP(#4)、35S:OsAP(#5)和35S:OsAP(#6)的OsAP47基因转录水平检测；图1c是过表达株系35S:OsAP(#1)、35S:OsAP(#2)中OsAP47蛋白表达水平的检测(Western Blot电泳图)。
图2：Crispr-OsAP47基因编辑株系的验证。其中，图2a是sgRNA1相关的OsAP47基因编辑所得突变基因原理示意图；图2b是Crispr-OsAP(2-3)纯合子株系OsAP47基因突变位点正向和反向测序结果；图2c是Crispr-OsAP(2-3)株系中OsAP47氨基酸序列与NPB中OsAP47氨基酸序列的比对；图2d是sgRNA2相关的OsAP47基因编辑所得突变基因原理示意图；图2e是Crispr-OsAP(4-4)纯合子株系OsAP47基因突变位点正向和反向测序结果；图2f是Crispr-OsAP(4-4)株系中OsAP47与NPB中OsAP47的氨基酸序列比对。
图3：OsAP47基因能增强水稻对水稻黑条矮缩病毒的感病性。其中，图3a是W44、OsAP47过表达株系35S:OsAP(#1)和35S:OsAP(#2)接种水稻黑条矮缩病毒30天发病率统计；图3b是W44过表达株系35S:OsAP(#1)和OsAP47过表达株系35S:OsAP(#2)接种水稻黑条矮缩病毒30天记录发病表型；图3c是NPB、Crispr-OsAP47基因编辑株系Crispr-OsAP(2-3)和Crispr-OsAP(4-4)接种水稻黑条矮缩病毒30天发病率统计；图3d是NPB、Crispr-OsAP基因编辑株系Crispr-OsAP(2-3)和Crispr-OsAP(4-4)接种水稻黑条矮缩病毒30天记录发病表型。其中Mock表示无毒灰飞虱对照，RBSDV表示携带水稻黑条矮缩病毒灰飞虱处理。
图4：OsAP47基因增强了水稻对南方水稻黑条矮缩病毒的感病性。图4a是W44、OsAP47过表达株系35S:OsAP(#1)和35S:OsAP(#2)接种南方水稻黑条矮缩病毒30天发病率统计；图4b是W44、OsAP47过表达株系35S:OsAP(#1)和35S:OsAP(#2)接种接种南方水稻黑条矮缩病毒30天记录发病表型；图4c是NPB、Crispr-OsAP47基因编辑株系Crispr-OsAP(2-3)和Crispr-OsAP(4-4)接种南方水稻黑条矮缩病毒30天发病率统计；图4d是NPB、Crispr-OsAP47基因编辑株系Crispr-OsAP(2-3)和Crispr-OsAP(4-4)接种南方水稻黑条矮缩病毒30天记录发病表型。其中Mock表示无毒白背飞虱对照，SRBSDV表示携带南方水稻黑条矮缩病毒白背飞虱处理。
图5：NPB、Crispr-OsAP47基因编辑株系Crispr-OsAP(2-3)和Crispr-OsAP(4-4)的农艺性状。其中，图5a和b是不同株系种子的粒长统计；图5c和图5d是不同株系种子的粒宽统计；图5e是不同株系种子千粒重统计；图5f和图5g是不同株系生长30天的株高统计；图5h是不同株系结实率统计。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。本发明实施例所涉及引物来自于南京金斯瑞生物科技有限公司。
1.供试植物和供试病毒的保存和培养
(1)供试的水稻为NPB(Nipponbare)和W44(VANDANA)，W44可从国际水稻研究所(International Rice Research Institute，IRRI)购买，为本发明水稻遗传转化的背景植株。其中，NPB为水稻黑条矮缩病毒和南方水稻黑条矮缩病毒的感病品种，W44为水稻黑条矮缩病毒和南方水稻黑条矮缩病毒的抗病品种。
(2)大肠杆菌(E.coli)菌株TOP10、农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)菌株EHA105，购买自北京全式金生物技术有限公司。
(3)水稻黑条矮缩病毒于2018年采集自河南开封、江苏建湖、江苏南京等地区，采集4-5叶龄的水稻黑条矮缩病疑似病株，经过检测确认后移栽到本实验室试验田保存毒源，用于饲毒试验。
2.OsAP47基因克隆
(1)提取NPB的总RNA，利用Takara反转录试剂合成cDNA。以NPB的cDNA为模板，利用OsAP47基因的正向引物pEXT06f-OsAP47-F和反向引物pEXT06f-OsAP47-R进行PCR扩增OsAP47编码序列。其中正反向引物的序列如下：
pEXT06f-OsAP47-F:gacaagcttggtacctctagaATGGCAATGGCTTGTGCAG，
pEXT06f-OsAP47-R:gtctttgtagtccatactagtGCAGGCGGCATGGCGGAA。
(2)PCR反应体系为：10×buffer 10.0μL，2.5mM dNTPs 8.0μL,Primer STAR Taq酶(Takara)1.0μL,模板cDNA 4.0μL，正反向引物各5.0μL(引物浓度10μM)，加水至100μL。
(3)PCR扩增程序为：98℃预变性3min；98℃变性30s，52℃退火30s，72℃延伸1kb/1min，循环34次；72℃再延伸6min。
(4)在1％琼脂糖凝胶上对PCR扩增产物进行核酸电泳分离，核酸染料染色后在紫外灯下拍照，记录结果，并切胶回收OsAP47基因PCR产物。用Axygen胶回收Kit对电泳条带进行回收。
3.水稻转基因过表达载体的构建和遗传转化及验证
(1)将回收的OsAP47基因的PCR产物，利用通用生物同源重组酶连接到XbaI/SpeI双酶切的pEXT06f载体(购买自常州百格生物技术有限公司)上，得到携带有OsAP47基因的重组载体。其中，载体pEXT06f的C端含有Flag标签(图1a)；
(2)将携带有OsAP47基因的重组载体，转化大肠杆菌感受态细胞TOP10，然后均匀的涂在LB平板上(含卡纳霉素50μg/mL)，37℃培养12-16h，取单菌落；
(3)利用pEXT06f-OsAP47-F引物和载体下游引物pEXT06f-Reverse对步骤(2)所得单菌落进行菌落PCR验证，将PCR产物在琼脂糖凝胶上进行核酸电泳，拍照记录阳性克隆；
载体下游引物pEXT06f-Reverse序列如下:caggaaacagctatgac。
(4)挑取经菌落验证正确的阳性单菌落摇菌扩培，并按照质粒提取试剂盒使用说明的要求(Axygen)提取质粒，送安徽滁州通用生物股份有限公司测序；
(5)测序结果显示，扩增到OsAP47基因的序列如SEQ ID NO.2所示，符合预期。该基因编码的OsAP47蛋白的序列如SEQ ID NO.1所示。将测序结果正确的质粒，通过电击转化到农杆菌EHA105中，加入LB培养基，在28℃扩培2h，然后均匀的涂在LB平板(含50μg/mL卡纳霉素和50μg/mL利福平)上，于28℃培养48h，取单菌落。
(6)利用pEXT06f-OsAP47-F引物和载体下游引物pEXT06f-Reverse对步骤(5)所得单菌落进行菌落PCR验证。菌落PCR验证正确的克隆为携带OsAP47基因的EHA105农杆菌，-70℃保存甘油菌。
(7)将携带OsAP47基因的EHA105农杆菌转化到W44中，获得多株过表达OsAP47基因的独立的遗传转化株系，分别编号为过表达株系35S:OsAP(#1)、35S:OsAP(#2)、35S:OsAP(#3)、35S:OsAP(#4)、35S:OsAP(#5)和35S:OsAP(#6)。
(8)过表达OsAP47基因的水稻株系中转录水平检测：以各转化株系的cDNA为模板，用OsAP基因特异性引物pEXT06f-OsAP47-F和pEXT06f-OsAP47-R扩增OsAP基因，以进行PCR验证。其中还设有未转化农杆菌的W44作为阴性对照。结果如图1b，可以看到OsAP47基因能够在W44中转录表达；
(9)过表达OsAP47基因的水稻株系中蛋白水平检测：采集过表达OsAP47基因的水稻叶片，进行OsAP47蛋白表达水平的检测。将收集的水稻叶片液氮研磨后加入蛋白提取液，混匀后冰浴10分钟。然后在13000g离心，收集上清液80uL，加入20uL的5倍蛋白上样缓冲液混匀，沸水浴8分钟。取10uL样品在SDS-PAGE凝胶上进行电泳分离，120V电泳1.5小时。电泳结束后，将蛋白样品转到PVDF膜上，用含有5％牛奶的1*TBST孵育封膜。加入1:5000稀释的Flag偶联HRP抗体(购自Sigma，产品编号F1804-50UG)，孵育2小时后用TBST洗膜5分钟三次，扫膜拍照。从图1c可见，western blot显示OsAP47-Flag的融合蛋白(55kDa)在W44中成功表达。
4.OsAP47基因编辑载体的构建和遗传转化及验证
(1)利用华南农业大学刘耀光院士课题组设计的单子叶植物CRISPR/Cas9载体系统(发表于2015年的Molecular Plant 8,1274-1284)，设计了两对靶点接头引物OsAP-U6a-gRNA-F1和OsAP-U6a-gRNA-R1，OsAP-U6b-gRNA-F2和OsAP-U6b-gRNA-R2。
靶点接头引物对U6a包括：OsAP-U6a-gRNA-F1和OsAP-U6a-gRNA-R1。
OsAP-U6a-gRNA-F1序列如下：CCGCCCGTACGGTCGGCTCAAC；
OsAP-U6a-gRNA-R1序列如下：AAACGTTGAGCCGACCGTACGGG。
靶点接头引物对U6b包括：OsAP-U6b-gRNA-F2和OsAP-U6b-gRNA-R2。
OsAP-U6b-gRNA-F2序列如下：TTGCGCCGACTACATACAGTGG；
OsAP-U6b-gRNA-R2序列如下：AACCCACTGTATGTAGTCGGCG。
(2)靶点接头U6a制备：将OsAP-U6a-gRNA-F1和OsAP-U6a-gRNA-R1分别用ddH2O溶解成100μM的母液，各取1μl加入到同一容器内，ddH2O补足体积指100μl，然后在90℃处理30s，移至室温冷却完成退火，得到靶点接头U6a。
靶点接头U6b制备：将OsAP-U6b-gRNA-F2和OsAP-U6b-gRNA-R2分别用ddH2O溶解成100μM的母液，各取1μl加入到同一容器内，用ddH2O补足体积至100μl，然后在90℃处理30s，移至室温冷却完成退火，得到靶点接头U6b。
(3)U6a相关gRNA载体酶切和表达盒连接：在1μl的10x Bsa I内切酶Buffer中加入ATP至终浓度为1.0mM，然后加入20ng/μl的pYLgRNA-OsU6a/6b质粒(发表于2015年的Molecular Plant 8,1274-1284)1μl、0.5μl靶点接头U6a、5U BsaI和35U T4 DNA ligase。将反应体系置于PCR仪，按照下列程序反应：37℃5min，20℃5min，5个循环。反应结束后，得到连接产物1。
U6b相关gRNA载体酶切和表达盒连接：反应体系和条件同U6a相关gRNA载体酶切和表达盒连接，不同之处仅在于采用靶点接头U6b代替靶点接头U6a。反应结束后，得到连接产物2。
(4)扩增gDNA表达盒
扩增U6a相关的gDNA表达盒U6a-gRNA：
取1μl步骤(3)所得连接产物1为模板，加入0.2μM的表达盒引物U-F、0.2μM的接头反向引物OsAP-U6a-gRNA-R1和适量高保真PCR酶(Takara)，按照如下程序进行第一轮PCR反应，得到产物1：98℃10s，60℃15s，68℃20s，25-28个循环。
取1μl步骤(3)所得连接产物1为模板，加入0.2μM接头正向引物OsAP-U6a-gRNA-F1、0.2μM表达盒引物gRNA-R和适量高保真PCR酶(Takara)，按照如下程序进行第一轮PCR反应，得到产物2：98℃10s，60℃15s，68℃20s，25-28个循环。
将连接产物1的第一轮PCR反应产物1和2分别用ddH2O稀释10倍，然后各取1μl混合为模板，加入位置特异引物Uctcg-B1'和gRcggt-BL(最终浓度0.15μM)，采用高保真酶扩增20-25循环，每个循环的程序如下：98℃10s，58℃15s，68℃20s。反应结束后，取2-3μl PCR产物电泳，检查长度是否符合，U6a-gRNA＝599bp。使用Axygen纯化Kit纯化U6a-gRNA。
表达盒引物U-F：CTCCGTTTTACCTGTGGAATCG。
表达盒引物gRNA-R：CGGAGGAAAATTCCATCCAC。
位置特异引物Uctcg-B1'：TTCAGAggtctcTctcgACTAGTGGAATCGGCAGCAAAGG。
位置特异引物gRcggt-BL：AGCGTGggtctcGaccgACGCGTCCATCCACTCCAAGCTC。
扩增U6b相关的gDNA表达盒U6b-gRNA：反应体系和条件同扩增U6a相关的gDNA表达盒，不同之处仅在于以OsAP-U6b-gRNA-R2替代OsAP-U6a-gRNA-R1，以OsAP-U6b-gRNA-F2替代OsAP-U6a-gRNA-F1。反应结束后，取2-3μl PCR产物电泳检查长度是否符合，U6b-gRNA＝485bp，使用Axygen纯化Kit纯化U6b-gRNA。
(5)边切边连：取约50ng U6a-gRNA，加入约70ng pYLCRISPR/Cas9-MH质粒(发表于2015年的Molecular Plant 8,1274-1284)，1x Bsa I-内切酶Buffer，10U BsaI，反应体系为15μl，在37℃酶切10min。然后，加入ATP至终浓度为0.8mM，加入35U T4 DNA ligase，在PCR仪中进行酶切连接反应，具体程序如下：37℃2min；10℃3min，20℃5min，15循环；最后37℃2min。最终得到重组质粒1。
采用上述相同方法，仅将U6a-gRNA换成U6b-gRNA，得到重组质粒2。
(6)分别将重组质粒1和2转化大肠杆菌感受态细胞TOP10，均匀的涂在LB平板上(含卡纳霉素50μg/mL)，37℃培养12-16h，取单菌落。
(7)利用载体引物SP-F和SP-R分别对步骤(6)所得单菌落进行PCR验证，将PCR产物在琼脂糖凝胶上进行核酸电泳，出现2000bp的条带即为阳性，拍照记录阳性克隆。
载体引物SP-F：GCGCGGTGTCATCTATGTTACTAGATCG。
载体引物SP-R：CCCGACATAGATGCAATAACTTC。
(8)取分别携带重组质粒1和2的阳性单菌落摇菌扩培，并按照质粒提取试剂盒使用说明的要求(Axygen)提取质粒，送安徽滁州通用生物股份有限公司测序。
(9)将测序正确的重组质粒1和2，分别通过电击转化到农杆菌EHA105中，加入无抗LB培养基，28℃扩培2h，然后均匀的涂在LB(含卡纳霉素50μg/mL，利福平50μg/mL)平板，28℃培养48h。分别取单菌落。
(10)利用载体引物SP-F和SP-R分别对步骤(9)所得各单菌落进行PCR验证，挑取正确克隆，将携带候选基因靶标位点的EHA105农杆菌转化到NPB中，获得多株独立的遗传转化株系。
(11)遗传转化株系打靶效果检测：以各遗传转化株系的基因组DNA为模板，使用靶点检测引物Crispr-OsAP-F和Crispr-OsAP-R，扩增靶点序列，然后将T0代或T1代植株的靶点PCR产物直接测序。其中两个株系的测序结果为突变单峰，表明该株系为纯合突变。其中一个株系，是1个碱基插入的纯合突变(图2a，2b)，因此，该株系命名为Crispr-OsAP(2-3)为。另外一个株系为2个碱基缺失的纯合突变(图2d，2e)，因此，该株系命名为Crispr-OsAP(4-4)。对突变体的氨基酸序列进行比对，结果表明上述1个碱基插入或2个碱基的缺失导致OsAP47蛋白翻译提前终止(图2c，2f)。
Crispr-OsAP-F：ACTCTTTACTAGACTTTGCCGTC。
Crispr-OsAP-R：CTTCTTTTTGCATATGTGTGGGTT。
5.OsAP47过表达和CRISPR/Cas9编辑纯合子株系水稻黑条矮缩病抗性评价
(1)将不带毒的灰飞虱在水稻黑条矮缩病毒毒源上饲喂7天获毒，移入有武育粳3幼苗的烧杯中饲养，度过循回期约7天；
(2)从度完循回的灰飞虱中随机取出50头灰飞虱，通过DOT-ELISA方法检测灰飞虱的带毒率，并测算接种虫量(接种虫量＝有效接虫量/带毒率)；
(3)按照2头有效接虫量/苗的强度，分别对W44、NPB、OsAP47过表达株系35S:OsAP(#1)和35S:OsAP(#2)，Crispr-OsAP基因编辑株系Crispr-OsAP(2-3)和Crispr-OsAP(4-4)后代进行人工接种，以考察各转基因植株的抗性水平；另外设置各植株接种无毒灰飞虱的对照。
(4)接种2天后，人工去除灰飞虱，移栽到试验田中显症，30天后统计各植株的发病率并拍照记录发病表型(图3)。实验结果显示，敲除NPB中OsAP47的Crispr-OsAP(2-3)和Crispr-OsAP(4-4)株系，发病率低于40％，NPB的发病率接近80％，因此OsAP47敲除株系对水稻黑条矮缩病毒的抗性显著高于NPB；在W44中过表达OsAP47基因的35S:OsAP(#1)和35S:OsAP(#2)株系，发病率接近30％，W44发病率接近5％，因此，过表达OsAP47基因的株系对水稻黑条矮缩病毒的敏感性显著高于抗病水稻品种W44。上述结果表明OsAP47为感病基因，负调控水稻对水稻黑条矮缩病毒的抗性。
6.OsAP47过表达和CRISPR/Cas9编辑纯合子株系南方水稻黑条矮缩病抗性评价
(1)将不带毒的白背飞虱在南方水稻黑条矮缩病毒毒源上饲喂3天获毒，移入有武育粳3幼苗的烧杯中饲养，度过循回期约7-10天；
(2)从度完循回的白背飞虱中随机取出50头，通过DOT-ELISA方法检测白背飞虱的带毒率，并测算接种虫量(接种虫量＝有效接虫量/带毒率)；
(3)按照2头有效接虫量/苗的强度，分别对W44、NPB、OsAP47过表达株系35S:OsAP(#1)和35S:OsAP(#2)，Crispr-OsAP47基因编辑株系Crispr-OsAP(2-3)和Crispr-OsAP(4-4)后代进行人工接种，以考察各转基因植株的抗性水平；
(4)接种2天后，人工去除白背飞虱，移栽到试验田中显症，30天后统计发病率并拍照记录发病表型(图4)。实验结果显示，敲除NPB中OsAP47的Crispr-OsAP(2-3)和Crispr-OsAP(4-4)株系，发病率低于15％，而NPB的发病率接近40％，因此，敲除OsAP47的植株对南方水稻黑条矮缩病毒的抗性显著高于NPB；在W44中过表达OsAP47的35S:OsAP(#1)和35S:OsAP(#2)株系，发病率接近30％，而W44发病率低于5％，因此，过表达OsAP47的株系对南方水稻黑条矮缩病毒的敏感性显著高于抗病水稻品种W44。上述结果表明OsAP为感病基因，负调控水稻对南方水稻黑条矮缩病毒的抗性。
7.NPB和Crispr-OsAP基因编辑株系的农艺性状评价
(1)对NPB和Crispr-OsAP基因编辑株系Crispr-OsAP(2-3)和Crispr-OsAP(4-4)的籽粒长度进行拍照和统计(图5a和5b)，结果表明敲除NPB中OsAP47不会影响籽粒的长度；
(2)对NPB和Crispr-OsAP基因编辑株系Crispr-OsAP(2-3)和Crispr-OsAP(4-4)的籽粒宽度进行拍照和统计(图5c和5d)，结果表明敲除NPB中OsAP47不会影响籽粒的宽度；
(3)对NPB和Crispr-OsAP基因编辑株系Crispr-OsAP(2-3)和Crispr-OsAP(4-4)的籽粒千粒重进行统计(图5e)，结果表明敲除NPB中OsAP47不会影响籽粒的重量；
(4)NPB和Crispr-OsAP基因编辑株系Crispr-OsAP(2-3)和Crispr-OsAP(4-4)在自然田间下生长30天后对植株高度进行拍照和统计(图5f和5g)，结果表明敲除NPB中OsAP47不会影响植株的高度；
(5)对NPB和Crispr-OsAP基因编辑株系Crispr-OsAP(2-3)和Crispr-OsAP(4-4)的结实率进行统计(图5h)，结果表明敲除OsAP47不会影响植株的结实率；综上所述，敲除OsAP47不会影响植株的农艺性状。
SEQUENCE LISTING
<110> 江苏省农业科学院
<120> 一种水稻抗性相关基因及其应用
<130> 20210207
<160> 2
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 494
<212> PRT
<213> 水稻
<400> 1
Met Ala Met Ala Cys Ala Ala Leu Val Pro Leu Leu Leu Leu Leu Leu
1 5 10 15
Val Val Leu Ser Gly Ser Thr Ser Leu Ala Asp His Ser Ala Gly Val
20 25 30
Asp Glu Val Asn Tyr Ile Val Val Leu Thr Ser Ser Trp Leu Lys Pro
35 40 45
Asn Ser Val Cys Ser Ser Leu Met Ser Pro His Pro Asn Val Thr Asn
50 55 60
Trp Val Pro Leu Ser Arg Pro Tyr Gly Pro Cys Ser Ser Ser Pro Ala
65 70 75 80
Lys Gly Arg Ala Ala Pro Ser Thr Val Asp Gly Met Leu Trp Ser Asp
85 90 95
Gln His Arg Ala Asp Tyr Ile Gln Trp Arg Leu Ser Gly Ser Val Ala
100 105 110
Gly Val Leu Gln Pro Ala Asp Asp Val Pro Val Ser Thr Asn Tyr Glu
115 120 125
Gln Gln Ser Ile Glu Gly Asp Leu Asn Tyr Gly Thr Tyr Tyr Pro Ala
130 135 140
Pro Ala Pro Met Ser Ser Lys Ala Met Asn Pro Ala Ala Thr Gly Gly
145 150 155 160
Gly Gly Gly Gly Pro Gly Val Thr Gln Thr Met Val Leu Asp Thr Ala
165 170 175
Ser Asp Val Thr Trp Val Gln Cys Ser Pro Cys Pro Thr Pro Pro Cys
180 185 190
Tyr Pro Gln Lys Asp Val Leu Tyr Asp Pro Thr Lys Ser Ser Ser Ser
195 200 205
Gly Val Phe Ser Cys Asn Ser Pro Thr Cys Thr Gln Leu Gly Pro Tyr
210 215 220
Ala Asn Gly Cys Thr Asn Asn Asn Gln Cys Gln Tyr Arg Val Arg Tyr
225 230 235 240
Pro Asp Gly Thr Ser Thr Ala Gly Thr Tyr Ile Ser Asp Leu Leu Thr
245 250 255
Ile Thr Pro Ala Thr Ala Val Arg Ser Phe Gln Phe Gly Cys Ser His
260 265 270
Gly Val Gln Gly Ser Phe Ser Phe Gly Ser Ser Ala Ala Gly Ile Met
275 280 285
Ala Leu Gly Gly Gly Pro Glu Ser Leu Val Ser Gln Thr Ala Ala Thr
290 295 300
Tyr Gly Arg Val Phe Ser His Cys Phe Pro Pro Pro Thr Arg Arg Gly
305 310 315 320
Phe Phe Thr Leu Gly Val Pro Arg Val Ala Ala Trp Arg Tyr Val Leu
325 330 335
Thr Pro Met Leu Lys Asn Pro Ala Ile Pro Pro Thr Phe Tyr Met Val
340 345 350
Arg Leu Glu Ala Ile Ala Val Ala Gly Gln Arg Ile Ala Val Pro Pro
355 360 365
Thr Val Phe Ala Ala Gly Ala Ala Leu Asp Ser Arg Thr Ala Ile Thr
370 375 380
Arg Leu Pro Pro Thr Ala Tyr Gln Ala Leu Arg Gln Ala Phe Arg Asp
385 390 395 400
Arg Met Ala Met Tyr Gln Pro Ala Pro Pro Lys Gly Pro Leu Asp Thr
405 410 415
Cys Tyr Asp Met Ala Gly Val Arg Ser Phe Ala Leu Pro Arg Ile Thr
420 425 430
Leu Val Phe Asp Lys Asn Ala Ala Val Glu Leu Asp Pro Ser Gly Val
435 440 445
Leu Phe Gln Gly Cys Leu Ala Phe Thr Ala Gly Pro Asn Asp Gln Val
450 455 460
Pro Gly Ile Ile Gly Asn Ile Gln Leu Gln Thr Leu Glu Val Leu Tyr
465 470 475 480
Asn Ile Pro Ala Ala Leu Val Gly Phe Arg His Ala Ala Cys
485 490
<210> 2
<211> 1485
<212> DNA
<213> 水稻
<400> 2
atggcaatgg cttgtgcagc actagtgccg ttgctactgt tgcttcttgt tgtgctctct 60
ggctctacat ctctcgctga ccacagtgca ggtgtagatg aggtcaacta catcgtggtg 120
ctaaccagca gctggctcaa gccaaattcc gtctgctcca gcctgatgag cccacacccc 180
aacgtgacca actgggtccc gttgagccga ccgtacgggc cgtgcagctc ctcgccggcg 240
aagggtaggg cggcgccgtc caccgtcgac ggcatgctct ggtcggacca gcaccgcgcc 300
gactacatac agtggaggct ctccggctcg gtcgccggcg tgctgcagcc ggccgacgac 360
gtgccggtgt caactaacta cgaacagcag tccatagaag gagatcttaa ctatggcacg 420
tactaccctg cacctgcacc aatgtcatca aaggcgatga atccggccgc caccggcggc 480
ggcggcggcg ggccgggagt gacccagacg atggtgctgg acacggcgag cgacgtgaca 540
tgggtgcagt gctcgccgtg ccccacgccg ccgtgctacc cgcaaaagga cgtcctctac 600
gaccccacca agtcgtcgtc gtccggcgtc ttctcctgca actcgccgac gtgcacccag 660
ctcggcccct acgccaatgg ctgcaccaac aataaccagt gccagtaccg cgtccggtac 720
cccgacggca cgtcgacggc gggcacctac atctccgacc tgctgaccat cacccccgcc 780
accgcagtca ggagcttcca gttcggctgc agccacggcg tgcagggcag cttcagcttc 840
ggcagcagcg ccgccgggat catggcactc ggcggcgggc cggagtcact ggtgtcgcag 900
acggcggcga cctacggccg cgtcttctcc cactgcttcc cgccgccgac gcgccgggga 960
ttcttcaccc tcggcgtgcc gagggtggcc gcctggaggt acgtgctgac gccgatgctc 1020
aagaacccgg ccatcccgcc cacgttctac atggtgcgcc tcgaggccat cgccgtcgcc 1080
gggcagcgga tcgccgtgcc gcccaccgtg ttcgccgccg gcgccgcgct cgactcccgc 1140
accgccatca ccaggctgcc gccgacggcg taccaggcgc tgaggcaggc gttcagggac 1200
cggatggcga tgtaccagcc ggcgccgccc aagggcccgc tcgacacctg ctacgacatg 1260
gccggcgtcc gcagcttcgc gctgccgagg atcacgcttg tgttcgacaa gaacgccgcc 1320
gtcgagctcg atccgtcggg cgtcctcttc cagggctgcc tcgccttcac cgccggcccc 1380
aacgaccagg tccccgggat catcggcaac atccagcttc agacgctcga ggtgctctac 1440
aacatccccg ccgccctcgt cggattccgc catgccgcct gctga 1485

Claims (8)

1.一种蛋白质在如下（1）或（2）中的应用：
（1）调控水稻或玉米对水稻黑条矮缩病和南方水稻黑条矮缩病的抗性；
（2）选育对水稻黑条矮缩病和南方水稻黑条矮缩病抗性增强的水稻或玉米品种；
所述蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示或者与SEQ ID NO.1所示序列具有90％以上的同源性的序列。
2.蛋白质的编码基因在如下（1）或（2）中的应用：
（1）调控水稻或玉米对水稻黑条矮缩病和南方水稻黑条矮缩病的抗性；
（2）选育对水稻黑条矮缩病和南方水稻黑条矮缩病抗性增强的水稻或玉米品种；
所述编码基因的序列如SEQ ID NO.2所示或者与SEQ ID NO.2所示序列具有90％以上的同源性的序列。
3.含有权利要求2所述基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。
4.含有权利要求2所述基因的遗传转化株系，其特征是含有OsAP47基因的过表达载体所转化的转基因植物。
5.根据权利要求4所述转化株系，其特征在于是敲除权利要求2所述基因的转基因植物。
6.根据权利要求5所述转化株系，其特征在于是含有权利要求2所述基因编辑载体所转化的转基因植物。
7.权利要求3所述重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌、权利要求4所述的转基因植物在提高植物抗病毒中的应用。
8.权利要求3所述重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌、权利要求4所述的转基因植物在植物育种中的应用。
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CN105624170A (zh) * 2014-10-28 2016-06-01 北京大学 OsAGO18蛋白或其编码基因在调控植物对水稻矮缩病毒或其同科病毒的抗性中的应用
CN107868123A (zh) * 2017-12-25 2018-04-03 中国农业科学院作物科学研究所 一种同时提高植物产量和抗性的基因及其应用

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105624170A (zh) * 2014-10-28 2016-06-01 北京大学 OsAGO18蛋白或其编码基因在调控植物对水稻矮缩病毒或其同科病毒的抗性中的应用
CN107868123A (zh) * 2017-12-25 2018-04-03 中国农业科学院作物科学研究所 一种同时提高植物产量和抗性的基因及其应用

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