CN111253480A

CN111253480A - 水稻转录因子OsARF17基因及其在抗黑条矮缩病毒植物育种中的应用

Info

Publication number: CN111253480A
Application number: CN202010143469.6A
Authority: CN
Inventors: 孙宗涛; 张合红; 魏中艳; 陈剑平
Original assignee: Ningbo University
Current assignee: Ningbo University
Priority date: 2020-03-04
Filing date: 2020-03-04
Publication date: 2020-06-09
Anticipated expiration: 2040-03-04
Also published as: CN111253480B

Abstract

本发明涉及一种水稻生长素转录因子OsARF17基因及其在抗水稻黑条矮缩病毒中的应用，本发明通过将植物激素生长素途径转录因子OsARF17过表达后，获得稳定遗传的转基因植株，通过实验证实OsARF17基因过表达后能够增强水稻对水稻黑条矮缩病毒的抗性，具体表现为接种病毒后与对照相比，本发明获得的转基因植株的发病症状减轻、发病率降低，病毒含量减少，为水稻抗病育种提供重要的基因库及新的种质资源。

Description

水稻转录因子OsARF17基因及其在抗黑条矮缩病毒植物育种中的应用

技术领域

本发明涉及转基因技术领域及植物病害防治领域，具体涉及水稻素转录因子OsARF17基因及其在抗水稻黑条矮缩病毒植物育种中的应用。

背景技术

水稻黑条矮缩病毒(Rice black-streaked dwarf virus,RBSDV)是一种具有重要危害的水稻病毒，该病毒是正二十面体球状结构，直径为75-80 nm，其寄主范围主要在禾本科植物。受感染的植物表现出严重的发育迟缓，叶片背面出现白色的蜡状或瘤状突起，对经济作物水稻、玉米、小麦和大麦产量造成严重影响。该病曾在2009-2011年间出现大爆发，造成严重的经济损失。从致病机理层面而言，水稻黑条矮缩病毒(RBSDV)是由灰飞虱(Nilaparvata lugens)经卵传播(Shikata and Kitagawa 1977； Ruan et al.1984)，一旦植物被感染，通常是无法治愈的；因此，水稻黑条矮缩病毒病在水稻中也被称为“癌症”(Azuhata et al.2019)。

RBSDV是呼肠孤病毒科(Reoviridae)斐济病毒属(Fijivirus)的重要成员之一，近年来，国内外学者对RBSDV分子生物学功能开展了大量的研究，包括基因组学、蛋白组学以及病毒蛋白与寄主因子互作等方面。例如，研究人员发现RBSDV P5-1，P6,P9是病毒复制毒质的重要组成部分。P7-2与S-phase kinase-associated protein 1(OsSKP1)相互作用形成 SCF复合物。P8蛋白编码病毒的内层衣壳蛋白，具有抑制转录活性的功能。P10编码的外壳蛋白，能够激发内质网应激反应。这些报道有助于我们对RBSDV致病机制的进一步研究。

RBSDV侵染的植株表现出的明显发病症状为植株矮缩、叶色浓绿、分蘖增加。RBSDV侵染的寄主范围很广，像禾本科的水稻、玉米、小麦等经济作物都能侵染，目前主要侵染玉米和水稻两种重要的经济作物。气候变化及耕作制度等因素的影响，水稻黑条矮缩病毒病的发生越来越严重，同时防治难度加大。传统的防治是通过喷洒杀虫剂来减少灰飞虱的数量，但喷施杀虫剂会带来一系列的农药残留问题。因此，防治黑条矮缩病毒病最经济有效的措施是培育抗病性品种。近年来，越来越多的水稻转基因抗性材料，为作物抗病育种提供重要的理论及实际意义。

生长素作为植物生长类激素(IAA)，不仅参与调节植物生长发育，而且在植物抗病免疫方面扮演着重要的角色。关于生长素信号途径的研究发现，当植物细胞中IAA含量比较低时，生长素转录抑制蛋白(AUX/IAA) 会与生长素转录因子(ARF)结合，抑制ARF的转录活性，进而调控生长素相关基因的表达。当细胞内生长素含量较高时，IAA与生长素受体 TIR1一起去结合AUX/IAA蛋白，在E3泛素连接酶SCF^TIR1复合物的作用下促使AUX/IAA蛋白发生泛素化降解，同时释放出ARF，调控生长素相关应答基因的转录。ARF能够特异性结合生长素初期响应基因的启动子，对生长素响应基因的表达起激活或抑制作用。目前，关于植物生长素途径参与植物抗病的研究发现，生长素信号能拮抗SA介导的对病原细菌的抗性；生长素信号在植物应对营腐生生活的病原菌侵染时发挥重要的作用；此外，烟草花叶病毒(TMV)能与ARF相互作用，从而影响植物的症状发生。但目前，关于水稻中生长素转录因子OsARF17参与抗RBSDV 侵染还没有相关报道。

为了克服现有技术的困难，进一步了解病毒致病机制以及水稻自身抗病途径，本发明提供了一种水稻生长素转录因子OsARF17基因在抗水稻黑条矮缩病毒中的应用。本发明利用植物转基因技术将全长的OsARF17 基因导入水稻，进一步筛选到表达量较高的转基因株系，并对其进行接种 RBSDV，获得具有显著增强RBSDV抗性的水稻株系，具体而言：本发明通过构建OsARF17的过表达载体，利用农杆菌介导法导入水稻品种中花11中，获得可稳定遗传的转基因水稻。通过人工接种水稻黑条矮缩病毒(RBSDV)实验，发现在水稻中过表达OsARF17基因，能显著增强水稻对RBSDV侵染的抗性，表现为植株发病症状减轻、发病率降低，病毒含量减少等技术效果。这为我们更好的防控水稻病毒病提供重要的理论依据和新策略，同时也为生产实践中选育水稻抗病毒新品种提供一种新的种质资源。

发明内容

在一个实施方案中,本发明涉及一种水稻生长素转录因子OsARF17 基因；

一方面，一种水稻生长素转录因子OsARF17基因,其核苷酸序列如 SEQ ID NO.1所示或与SEQ ID NO:1具有至少75％、80％、85％、90％、 95％、96％、97％、98％、99％序列同一性的氨基酸或由其组成。

另一方面，一种水稻生长素转录因子OsARF17蛋白,其氨基酸序列为SEQ ID NO.1所编码的氨基酸或与SEQ ID NO:1编码的氨基酸具有至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％序列同一性的氨基酸或由其组成。

在一个实施方案中，本发明涉及所述水稻生长素转录因子OsARF17 在抗斐济病毒(Fijivirus)禾本科粮食作物育种中的应用；

一方面，所述斐济病毒属(Fijivirus)包括玉米粗缩病毒(Maize Rough DwarfVirus，MRDV)、水稻黑条矮缩病毒(Rice black streaked dwarf virus，RBSDV)；最优选水稻黑条矮缩病毒；

另一方面，所述禾本科粮食作物优选水稻，玉米，小麦，燕麦和大麦；更优选水稻，最优选淮稻5号、日本晴、武育粳3号等粳稻品种；

在一个实施方案中，本发明涉及一种转基因水稻的构建方法，包括如下步骤：

1.克隆OsARF17基因,将其构建到植物表达载体pCAMBIA1300 上，获得pCAMBIA1300-OsARF17重组表达载体；

2.将重组表达载体转染农杆菌，愈伤组织诱导培养，农杆菌转染愈伤组织、抗性愈伤组织的筛选培养、获得绿色植株；

3.对绿色植株进行培养，通过RT-PCR及qRT-PCR进行检测，获得表达量较高的OsARF17转基因植株；

一方面，所述克隆OsARF17基因的步骤包括：根据OsARF17的开放阅读框设计引物OsARF17-F和OsARF17-R，所用的引物序列如下：

OsARF17-F：5’-ATGAGGCTTTCGTCGTCGT-3；

OsARF17-R：5’-GAATTCAACTGAGCCGACAG-3’；

所述PCR扩增体系：总体积50μL，包括10×PCR buffer 5μL，上下游引物(10μM)各1.5μL，dNTP Mix(2.5mM)5μL，cDNA模板1μL， Taq酶(5U/μL)1μL，ddH₂O 35μL。

PCR扩增程序：94℃预变性3min；94℃变性30s，58℃复性30s， 72℃延伸3min，40个循环；72℃终延伸10min，将PCR产物回收；

将PCR产物回收产物连接pMD18-T载体，挑克隆，送测，获得正确pMD18-T-OsARF17重组表达载体，测序确认克隆基因的正确性。

另一方面，所述转染农杆菌的步骤如下：

取目的质粒加到EHA105农杆菌感受态中，轻轻混匀，加入到清洗干净并且预冷的电极杯中，电击转化，加入无抗性的LB液体培养基，摇床震荡培养后,涂布在含卡纳霉素及利福平的平板上，28℃培养箱培养3 d；

另一方面，所述愈伤组织诱导培养步骤为：取成熟的水稻种子，脱壳，用75％的酒精浸泡,ddH₂O清洗去除酒精；用30％的次氯酸钠溶液，浸泡半小时；用ddH₂O清洗后再浸泡半小时，用镊子放入成熟胚诱导培养基中，放入28℃光照培养箱培养，将长出的愈伤组织转移到继代培养基中，28℃光照培养箱继代培养；

成熟胚诱导培养基包括：N6培养基24.1g/L、2mg/L 2,4-D、PH＝5.8。

继代培养基包括：N6培养基24.1g/L、2,4-D、50mg/L潮霉素、300mg/mL头孢霉素、PH＝5.8。

另一方面，所述农杆菌转染愈伤组织步骤为：挑取农杆菌的单克隆接种到LB液体培养基，培养OD₆₀₀＝0.6左右；集菌用含AAM的农杆菌悬浮培养液悬浮菌体，使OD₆₀₀的终浓度为0.1。将诱导好的愈伤组织放入 AAM农杆菌悬浮培养液中浸泡。将愈伤组织取出，放入共培养基中，光照培养箱培养。

另一方面，所述抗性愈伤组织的筛选培养步骤为：将愈伤组织放在含有潮霉素B的培养基上经30-45d的筛选，将筛选后的愈伤组织放入生根培养基中，光照培养，产生带根的绿色植株，培养2周，通过筛选获得转基因植株。

生根培养基包括：1/2MS 39.45g/L、0.5mg/L NAA、50mg/L潮霉素、PH＝5.8。

附图说明

图1：OsARF17过表达转基因水稻OsARF17的相对表达量

图2：RBSDV侵染30d后，OsARF17过表达转基因及对照ZH11的发病率情况对比

图3：RBSDV侵染30d后，OsARF17过表达转基因及对照ZH11的发病症状情况对比其中，mock:空白对照；RB：病毒侵染

图4：RBSDV侵染30d后，OsARF17过表达转基因及对照ZH11中的病毒含量检测情况对比

具体实施方式

本发明所转水稻品种为中花11，简称ZH11；

实例1:水稻OsARF17植物表达载体构建

(1)水稻叶片总RNA的提取及cDNA序列的合成

用RNA提取试剂TRIzol reagent提取植物总RNA，并利用Tiangen fast quant RTkit反转录试剂盒把提取的RNA反转录为cDNA。

(2)水稻OsARF17基因的克隆

根据OsARF17的开放阅读框设计引物OsARF17-F和OsARF17-R，所用的引物序列如下：

OsARF17-F：5’-ATGAGGCTTTCGTCGTCGT-3’(SEQ ID No:3)；

OsARF17-R：5’-GAATTCAACTGAGCCGACAG-3’(SEQ ID No:4)；

PCR扩增体系：总体积50μL，包括10×PCR buffer 5μL，上下游引物(10μM)各1.5μL，dNTP Mix(2.5mM)5μL，cDNA模板1μL，Taq 酶(5U/μL)1μL，ddH₂O 35μL。

PCR扩增程序：94℃预变性3min；94℃变性30s，58℃复性30s， 72℃延伸3min，40个循环；72℃终延伸10min。

将PCR产物回收，连接pMD18-T载体(Takara生物公司，货号 D101A)，挑克隆，送测，获得正确pMD18-T-OsARF17重组表达载体，送杭州擎科生物公司测序。得到如SEQ ID No:1所示，长度为2754bp，编码971个氨基酸的OsARF17基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示：

其CDS序列如SEQ ID NO.2所示：

植物过表达载体的构建

设计带有酶切位点的引物，利用引物pCAMBIA1300-OsARF17-F、 pCAMBIA1300-OsARF17-R扩增OsARF17，用于OsARF17双元表达载体的构建。

将pCAMBIA1300载体(公司：上海柯雷生物科技有限公司，货号： kl-zl-0829)用BamH1与Sac1双酶切，将获得的PCR产物及载体酶切回收，连接，挑取单克隆，送杭州擎科生物公司测序。获得正确的 pCAMBIA1300-OsARF17重组表达载体，所用引物序列如下：

pCAMBIA1300-OsARF17-F:

GTTCCAGATTACGCTGGATCCATGAGGCTTTCGTCGTCGT

(SEQ ID NO:5)

pCAMBIA1300-OsARF17-R:

ATCGGGGAAATTCGAGCTCTTAGAATTCAACTGAGCCGAC

(SEQ ID NO:6)

实例2水稻遗传转化

农杆菌转化：取保存在-80℃冰箱pCAMBIA1300-OsARF17的重组载体转化根瘤农杆菌EHA105(厂家：上海唯地生物技术有限公司，货号：AC1012)，具体步骤如下：取2μL目的质粒加到50μL EHA105农杆菌感受态中，轻轻混匀，加入到清洗干净并且4℃预冷的电极杯中，用2200V 的电压点击转化，加入600μL无抗性的LB液体培养基，28℃,200rpm 摇床震荡培养2-3h,涂布在含50μg/ml卡纳霉素及50μg/ml的利福平平板上，28℃培养箱培养3d。

(2)水稻愈伤组织诱导培养：成熟的水稻种子(本实验选用成熟的中花11水稻种子)，脱壳，用75％的酒精浸泡1min,ddH2O清洗2-3遍去除酒精；用30％的次氯酸钠溶液，浸泡半小时；用ddH2O清洗后再浸泡半小时。用镊子放入成熟胚诱导培养基中，放入28℃光照培养箱，培养3周，将长出的愈伤组织用灭菌的镊子转移到继代培养基中，28℃光照培养箱继代培养1周。

成熟胚诱导培养基成分：N6培养基(厂家：海博生物科技有限公司，货号：HBZ0601)24.1g/L、2mg/L 2,4-D、PH＝5.8。

继代培养基成分：N6培养基(厂家：海博生物科技有限公司，货号： HBZ0601)24.1g/L、2,4-D、50mg/L潮霉素、300mg/mL头孢霉素、PH＝5.8。

农杆菌转染愈伤组织：挑取EHA105的单克隆接种到LB液体培养基，培养OD600＝0.6左右。集菌用含AAM的农杆菌悬浮培养液(厂家：今品化学技术上海有限公司，货号：B01154)悬浮菌体，使OD600的终浓度为0.1。将诱导好的愈伤组织放入AAM农杆菌悬浮培养液中浸泡5min。将愈伤组织取出，放入共培养基中，26℃光照培养箱培养2.5d。

共培养基成分：N6培养基(厂家：海博生物科技有限公司，货号：HBZ0601)24.1g/L、2mg/L 2,4-D、200μmol/L的乙酰丁香酮、PH＝5.2。

(4)抗性愈伤组织的筛选与培养：将愈伤组织放在含有潮霉素B的培养基上经30-45d的筛选，将筛选后的愈伤组织放入生根培养基中，光照培养，产生带根的绿色植株，培养2周，通过筛选获得转基因植株 OE17-2-5和OE17-3-2。

生根培养基：1/2MS(厂家：海博生物科技有限公司，货号：HB8469-6) 39.45g/L、0.5mg/L NAA、50mg/L潮霉素、PH＝5.8。

实例3转基因植株的阳性鉴定

RT-PCR检测

用SDS法提取转基因水稻的基因组DNA。

步骤如下：称取1-2mg新鲜水稻叶片于2mL EP管中，液氮研磨，震碎。加入400μLTP，震荡混匀，放于65℃金属浴中，30min。4℃， 1,3000g离心，10min。取上清于新的1.5mLEP管中，加入等体积的异丙醇，4℃，30min。4℃，1,3000g离心，10min。弃上清。加入700μL 的75％的酒精洗，4℃，1,3000g离心，2min(可再重复一次)。弃上清，空离，1min，室温干燥10-20min，加入适量的MQ水，得到的DNA 可用于后续实验或保存于-20℃。

取0.5μL DNA模板，进行PCR扩增，扩增体系10μL，PCR产物大小2754bp。检测引物如下：

OsARF17-detect-F:ATGAGGCTTTCGTCGTCGT(SEQ ID No:7)

OsARF17-detect-R:GAATTCAACTGAGCCGAC(SEQ ID No:8)

转基因植株qRT-PCR验证分析

提取阳性转基因植株叶片总RNA，反转录为cDNA，以水稻的多聚泛素酶UBQ基因作为内参。定量引物采用qRT-OsARF17，OsARF17的相对表达量如图1所示，2个过表达株系(OE17-2-5和OE17-3-2)OsARF17 基因的相对表达量显著高于对照组ZH11。定量引物序列如下：

qRT-OsARF17-F:GCTTTGGGAGATTGAGCCCT(SEQ ID No:9)

qRT-OsARF17-R:TCTCGGAGCCACATGAGAGA(SEQ ID No:10)

UBQ-F:ACCACTTCGACCGCCACTACT(SEQ ID No:11)

UBQ-R:ACGCCTAAGCCTGCTGGTT(SEQ ID No:12)

实例4转基因水稻接种RBSDV

将需要接种病毒的转基因水稻株系及对照组ZH11浸种2d，用湿润的纱布覆盖催芽1d，播种于1L烧杯中，每杯30-35株苗，3个生物学重复，30℃，16h光照8h黑暗培养。

刚孵化出1-2龄的无毒灰飞虱，在RBSDV侵染的水稻苗上获毒3-5d，转移至健康的水稻苗上度循回期(RBSDV在灰飞虱体内完成侵染循环所需时间)10d后，得到可用来传播RBSDV的灰飞虱。

用龄期相同携带RBSDV和健康的灰飞虱进行病毒接种实验，按3头每株苗接的比例，将带毒/不带毒灰飞虱接种于三～四叶期(15d左右的苗) 水稻苗上，接毒3d后扫出所有的虫子。

将接毒的水稻苗移栽至人工智能温室(30℃，16h光照8h黑暗)培养观察。30d后，观察植株发病症状并通过qRT-PCR确定水稻的发病情况。

实例5接种RBSDV后水稻抗性分析

RT-PCR检测水稻带毒率

以RBSDV的基因组S10设计病毒特异性检测引物，序列如下：

RB-S10-F:AACAACCGACCAACAATCAC(SEQ ID No:13)

RB-S10-R:GAGCAGGAACTTCACGACAG(SEQ ID No:14)

10μL PCR体系，PCR扩增条件为：94℃3min；94℃30s，58℃ 30s，72℃30s，共30个循环；最后72℃10min终延伸，4℃保存。根据水稻的发病症状及RT-PCR检测结果判断水稻是否携带RBSDV。

如图2所示，OsARF17两个过表达转基因株系(OE17-2-5和 OE17-3-2)发病率为40％和39％,而对照发病率为51％。以上结果表明，过表达OsARF17后显著降低转基因的发病率。

注：发病率＝发病株数/总株数*100％

qRT-PCR检测病毒含量

水稻移栽30d后，与对照ZH11相比较，OsARF17两个过表达转基因株系(OE17-2-5和OE17-3-2)未出现明显的矮缩症状，而对照表现出明显的矮缩，如图3所示。发病的水稻植株混池取样，每个样品3个生物学重复，进一步通过qRT-PCR检测病毒S4、S6、S10基因表达量，如图 4所示，转基因株系病毒S4、S6、S10基因的表达量显著性低于对照分别约为0.4、0.5、0.6倍。上述结果表明转基因植株对RBSDV侵染的抗性受 OsARF17基因的影响，水稻中过表达OsARF17后可以显著的增强水稻对 RBSDV侵染的抗性。

qRT-PCR检测引物如下：

qRT-S4-F:ATTTGCGTTTTGCAATTTCC(SEQ ID No:15)

qRT-S4-R:GCTCTACGACGACCAAATCC(SEQ ID No:16)

qRT-S6-F:AGCGTGTTGAAAACGAGATC(SEQ ID No:17)

qRT-S6-R:CGCTTTGCAAATTCAACAAG(SEQ ID No:18)

qRT-S10-F:AACAACCGACCAACAATCAC

qRT-S10-R:GAGCAGGAACTTCACGACAG

综合以上实验数据可知：

本发明通过将植物重要激素生长素途径转录因子OsARF17过表达获得稳定遗传的转基因植株，通过实验证实：OsARF17基因过表达能够提高水稻对黑条矮缩病毒的抗性，丰富了抗水稻黑条矮缩病毒病的种质资源；此外，本发明将植物激素途径与抗病结合起来，开拓了水稻病毒病致病机理的研究方向；最后，本发明可以为水稻基因工程抗病育种提供新的基因源和新种质，对提高水稻农业作物产量起到极大的促进作用。

SEQUENCE LISTING

<110> 宁波大学

<120> 水稻转录因子OsARF17基因及其在抗黑条矮缩病毒植物育种中的应用

<130> CP120130116C

<160> 18

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 2754

<212> DNA

<213> Rice

<400> 1

atgaggcttt cgtcgtcgtc cggcagcgtc ctcccggctc aggcggcgtc gccggaagct 60

gtagaagaac aaaaatgcct gaattcggag ctctggcatg cgtgtgccgg tccccttgtt 120

tcgttgcctg cagtgggtag ccgagtggtt tatttcccac agggtcacag cgaacaggta 180

gctgcatcaa caaataaaga aatggagtct cagatcccca attatcctaa cttgcctcca 240

caacttattt gccaacttca caatgtgacg atgcatgcag atgcagaaac agatgaggtt 300

tacgctcaga tgacgctaca accacttagc ccgcaagagc tcaaggaccc atatctacca 360

gctgaattag gttctgccaa caaacagcca acgaattatt tttgcaaaac attaacggca 420

agtgacacaa gtacgcatgg cggattctct gttccccgtc gagcagctga gaaagtgttc 480

cctccgctgg attttactca gcagcctcca gcacaggagt taattgcaaa agatcttcat 540

ggcaatgagt ggaagtttcg tcatatcttt cgtggtcagc caaagcgaca ccttctaact 600

acaggctgga gcgtctttgt aagtgcaaag agacttgtcg ccggggattc tgtcctattt 660

atctggaatg acaacaacca gcttcttctg ggaattcgtc gagctaaccg cccacaaact 720

gttatgccat cttcagtcct atctagtgat agcatgcata ttggtcttct tgctgcggct 780

gctcatgctg cttcaacaaa tagccggttt acaatttttt ataacccaag agcaagccct 840

tcagagtttg ttatcccact ttctaaatat gttaaggctg tatatcatac ccgtatatct 900

gtgggcatgc gtttcaggat gctttttgag acagaagagt caagtgtacg gagatacatg 960

ggcacgataa caggaattag tgatcttgat gctgctcgtt ggccaaactc acattggcgt 1020

tctgtaaagg ttggctggga tgaatcaact gccggagaga ggcagccaag ggtgtcgctt 1080

tgggagattg agcccttgac aactttccca atgtacccat ctccttttcc actcagactg 1140

aagcgtccat ggccaacagg cttgccttca ttacatggtg gtaaggatga cgacttgact 1200

tcttctctca tgtggctccg agacagcgca aatcctggtt tccaatcatt gaatttcggg 1260

ggtctcggta tgaatccttg gatgcagcca aggtttgatg cttccttact tggtctgcaa 1320

cctgacatgt atcaaacgat agctgcgact gctttccagg acccaacaaa gcaggtctct 1380

cccacgatat tgcagttcca gcagccgcag aacataggtg gcagagctaa tacacttctg 1440

ccaagtcaga ttttgcagca agtgcagcct cagtttcagc agcagcaata cctccaaaac 1500

atcaacgaga ccacaatcca agggcatgct cagtctgagt tccttcagca gcagctccaa 1560

cgctgccagt cgtttactga gcagaagcca cagctgcaaa cccagcaaca acagcaagaa 1620

tcacagcaac aacagcagca gcaatcgcag tgtatgcaag tcccacaaca tcagcaaatg 1680

caacagcaga agaacatgac caactatcag tctgtaccta atgcattgtc accgttttct 1740

caactctcct ctccttctca gtcttcacct atgacactgc aaacagtatt accattctcc 1800

cagccacaga gctatccaga cacgagtatg agctcattgt caccatccaa cacatccacc 1860

atgcataatg cattgaggcc attttcatcg gaagcacctt cgcacctaag catgccaaga 1920

ccgactgcag tacctgtccc tgacccatgg tcatcgaagc gagttgcagt ggagtctttg 1980

cttccctctc gtcctcaggt tacatcgcag atggagcagt tggactcaac agcacctagt 2040

ataccacaaa gctctgcgtt ggcgccgctt cctggaagag gatgcttggt ggatcaagat 2100

gggaactctg atcctcaaaa ccatctgtta tttggcgtta acatagattc acagtcactt 2160

ctaatgcaag gtggcatccc aagcctccag ggtgagaatg attcgacggc aattccttat 2220

tccacctcca atttcctgag cccgtcgcag aatgatttcc ccttggatca aacactaagt 2280

agtgcagact gcttagatga atcaggatat gtgccgtgtt cacagaattc tgatcaagtg 2340

attaatcgac cacctgcgac ctttgtgaag gtttacaaat cgggaaccta tggaaggtca 2400

cttgatatca ctagatttag tagctatcat gaacttcgta gagaactagg gcgcctattt 2460

ggccttgagg gccagttgga aaaccctttg agatcaggct ggcagcttgt attcgtcgac 2520

cgagaggatg atgtcctcct cgttggcgac gacccttggc aggaattcgt gaatagcgtc 2580

tcctgcataa agatactttc accacaggag gtgcagcaga tgggcaagcc ctttgagctt 2640

ttgagctcgg ctcccggaaa gaggctaggt agcagctgtg atgactatgt gagcaggcag 2700

gaatcaagaa gcctgagcac aggaattgca tctgtcggct cagttgaatt ctaa 2754

<210> 2

<211> 1633

<212> DNA

<213> Rice

<400> 2

atgaggcttt cgtcgtcgtc cggcagcgtc ctcccggctc aggcggcgtc gccggaagct 60

gtagaagaac aaaaatgcct gaattcggag ctctggcatg cgtgtgccgg tccccttgtt 120

tcgttgcctg cagtgggtag ccgagtggtt tatttcccac agggtcacag cgaacaggta 180

gctgcatcaa caaataaaga aatggagtct cagatcccca attatcctaa cttgcctcca 240

caacttattt gccaacttca caatgtgacg atgcatgcag atgcagaaac agatgaggtt 300

tacgctcaga tgacgctaca accacttagc ccgcaagagc tcaaggaccc atatctacca 360

gctgaattag gttctgccaa caaacagcca acgaattatt tttgcaaaac attaacggca 420

agtgacacaa gtacgcatgg cggattctct gttccccgtc gagcagctga gaaagtgttc 480

cctccgctgg attttactca gcagcctcca gcacaggagt taattgcaaa agatcttcat 540

ggcaatgagt ggaagtttcg tcatatcttt cgtggtcagc caaagcgaca ccttctaact 600

acaggctgga gcgtctttgt aagtgcaaag agacttgtcg ccggggattc tgtcctattt 660

atctggaatg acaacaacca gcttcttctg ggaattcgtc gagctaaccg cccacaaact 720

gttatgccat cttcagtcct atctagtgat agcatgcata ttggtcttct tgctgcggct 780

gctcatgctg cttcaacaaa tagccggttt acaatttttt ataacccaag agcaagccct 840

tcagagtttg ttatcccact ttctaaatat gttaaggctg tatatcatac ccgtatatct 900

gtgggcatgc gtttcaggat gctttttgag acagaagagt caagtgtacg gagatacatg 960

ggcacgataa caggaattag tgatcttgat gctgctcgtt ggccaaactc acattggcgt 1020

tctgtaaagg ttggctggga tgaatcaact gccggagaga ggcagccaag ggtgtcgctt 1080

tgggagattg agcccttgac aactttccca atgtacccat ctccttttcc actcagactg 1140

aagcgtccat ggccaacagg cttgccttca ttacatggtg gtaaggatga cgacttgact 1200

tcttctctca tgtggctccg agacagcgca aatcctggtt tccaatcatt gaatttcggg 1260

ggtctcggta tgaatccttg gatgcagcca aggtttgatg cttccttact tggtctgcaa 1320

cctgacatgt atcaaacgat agctgcgact gctttccagg acccaacaaa gcaggtctct 1380

cccacgatat tgcagttcca gcagccgcag aacataggtg gcagagctaa tacacttctg 1440

ccaagtcaga ttttgcagca agtgcagcct cagtttcagc agcagcaata cctccaaaac 1500

atcaacgaga ccacaatcca agggcatgct cagtctgagt tccttcagca gcagctccaa 1560

cgctgccagt cgtttactga gcagaagcca cagctgcaaa cccagcaaca acagcaagaa 1620

tcacagcaac aac 1633

<210> 3

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

atgaggcttt cgtcgtcgt 19

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

gaattcaact gagccgacag 20

<210> 5

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

gttccagatt acgctggatc catgaggctt tcgtcgtcgt 40

<210> 6

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

atcggggaaa ttcgagctct tagaattcaa ctgagccgac 40

<210> 7

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

atgaggcttt cgtcgtcgt 19

<210> 8

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

gaattcaact gagccgac 18

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

gctttgggag attgagccct 20

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

tctcggagcc acatgagaga 20

<210> 11

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

accacttcga ccgccactac t 21

<210> 12

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

acgcctaagc ctgctggtt 19

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

aacaaccgac caacaatcac 20

<210> 14

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

gagcaggaac ttcacgacag 20

<210> 15

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

atttgcgttt tgcaatttcc 20

<210> 16

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 16

gctctacgac gaccaaatcc 20

<210> 17

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 17

agcgtgttga aaacgagatc 20

<210> 18

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 18

cgctttgcaa attcaacaag 20

Claims

1.一种水稻生长素转录因子OsARF17基因,其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.一种水稻生长素转录因子OsARF17蛋白,其氨基酸序列为SEQ ID NO.1所编码的氨基酸。

3.权利要求1所述水稻生长素转录因子OsARF17在抗斐济病毒(Fijivirus)禾本科粮食作物育种中的应用。

4.权利要求3所述的应用，所述斐济病毒属(Fijivirus)优选玉米粗缩病毒(MaizeRough Dwarf Virus，MRDV)、水稻黑条矮缩病毒(Rice black streaked dwarf virus，RBSDV)；最优选水稻黑条矮缩病毒。

5.权利要求4所述的应用，所述禾本科粮食作物优选水稻，玉米，小麦，燕麦和大麦；更优选水稻，最优选淮稻5号、日本晴、武育粳3号。

6.一种转基因水稻的构建方法，其步骤包括：

1).克隆OsARF17基因,将其构建到植物表达载体pCAMBIA1300上，获得pCAMBIA1300-OsARF17重组表达载体；

2).将所述重组表达载体转染农杆菌，愈伤组织诱导培养，农杆菌转染愈伤组织、抗性愈伤组织的筛选培养、获得绿色植株；

3).对绿色植株进行培养，通过RT-PCR及qRT-PCR进行检测，获得表达量较高且稳定遗传的OsARF17转基因植株。

7.权利要求6所述方法，所述克隆OsARF17基因步骤为：根据OsARF17的开放阅读框设计引物OsARF17-F和OsARF17-R，所用的引物序列如下：

OsARF17-F：5’-ATGAGGCTTTCGTCGTCGT-3；

OsARF17-R：5’-GAATTCAACTGAGCCGACAG-3’；

PCR扩增体系：总体积50μL，包括10×PCR buffer 5μL，10μM上下游引物各1.5μL，2.5mMdNTP Mix 5μL，cDNA模板1μL，5U/μL Taq酶1μL，ddH₂O 35μL；

PCR扩增程序：94℃预变性3min；94℃变性30s，58℃复性30s，72℃延伸3min，40个循环；72℃终延伸10min，4℃保存；

将PCR产物回收，连接到pMD18-T载体上，挑克隆，送测，获得正确pMD18-T-OsARF17重组表达载体，测序确认克隆OsARF17基因的正确性。

8.权利要求6-7任一项所述方法，所述重组表达载体转染农杆菌步骤为：

取所述重组表达载体加到EHA105农杆菌感受态中，混匀，加入到清洗干净并且预冷的电极杯中，电击转化，加入无抗性的LB液体培养基，摇床震荡培养后,涂布在含卡纳霉素及利福平的平板上，28℃培养箱培养3d；所述LB液体培养基包括以下成分：蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠10g/L。

9.权利要求6-8任一项所述方法，所述愈伤组织诱导培养步骤为：取成熟的水稻种子，脱壳，用75％的酒精浸泡,ddH2O清洗去除酒精；用30％的次氯酸钠溶液，浸泡半小时；用ddH2O清洗后再浸泡半小时，用镊子放入成熟胚诱导培养基中，放入28℃光照培养箱培养，将长出的愈伤组织转移到继代培养基中，28℃光照培养箱继代培养；所述成熟胚诱导培养基成分包括：N6培养基24.1g/L、2mg/L 2,4-D、PH＝5.8；所述继代培养基包括：N6培养基24.1g/L、2mg/L 2,4-D、50mg/L潮霉素、300mg/mL头孢霉素、PH＝5.8。

10.权利要求6-9任一项所述的方法，所述农杆菌转染愈伤组织步骤为：挑取农杆菌的单克隆接种到LB液体培养基，培养OD₆₀₀＝0.6左右；收集菌体用含AAM的农杆菌悬浮培养液悬浮菌体，使OD₆₀₀＝0.1；将诱导好的愈伤组织放入AAM农杆菌悬浮培养液中浸泡；将愈伤组织取出，放入共培养基中，光照培养箱培养。

11.权利要求6-10任一项所述的方法，所述抗性愈伤组织的筛选培养步骤为：将愈伤组织放在含有潮霉素B的培养基上经30-45d的筛选，将筛选后的愈伤组织放入生根培养基中，光照培养，产生带根的绿色植株，培养2周，通过筛选获得转基因植株；所述生根培养基包括：1/2MS 39.45g/L、0.5mg/L NAA、50mg/L潮霉素、PH＝5.8。