CN101205534A - 一种抑制水稻矮缩病毒侵染植物的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种抑制水稻矮缩病毒侵染植物的方法。该抑制水稻矮缩病毒侵染植物的方法，是抑制宿主植物细胞中的乙醇酸氧化酶的表达；所述宿主植物为水稻矮缩病毒能够侵染的植物。本发明的方法可以有效的阻止病毒到达特定的细胞器开始其复制，对于病毒防治具有十分重要的意义。
Description
技术领域
本发明涉及一种抑制水稻矮缩病毒侵染植物的方法。
背景技术
病毒是一种严格的细胞寄生物，病毒与宿主的相互作用关系是病毒学面临的重要课题。病毒与宿主细胞表面受体结合后，通过各自的方式进入宿主细胞，利用宿主细胞的某些蛋白因子完成其一系列高度调控的复制、转录过程，并引起宿主细胞信号传导途径的变化，导致宿主细胞裂解、凋亡或使病毒处于隐性潜伏感染状态等。病毒作为宿主细胞的外来物质，一方面，宿主表现出对病毒感染的主动限制作用，保护宿主细胞免受病毒感染的侵犯；另一方面，病毒会主动地对宿主细胞的分子事件和某些蛋白因子进行修饰，使宿主细胞能为病毒感染和复制提供必需的细胞机器。病毒-宿主细胞相互作用关系必将引起宿主细胞基因表达谱的变化；同时，病毒感染细胞后，病毒的基因表达也呈现时间和空间上的程序性。这种基因表达上的变化决定了病毒复制、感染、致病和免疫的分子基础，这方面的研究进展将为病毒病的预防和治疗提供理论依据。
病毒在宿主细胞内的复制和聚集均定位于特定的亚细胞结构中，如线粒体膜(flock house virus)，叶绿体囊膜(tymoviruses)，细胞骨架(human parainfluenzavirus type 3)，胞质内涵体(vaccinia virus)和核质内涵体(herpes simplex virus)等等。早期对水稻病毒侵染的植物宿主和昆虫宿主细胞的病理研究中，人们发现病毒复合体在感染的细胞中呈点状分布。这种点状分布必然与某种细胞器相关。
乙醇酸氧化酶是植物过氧化物体(过氧化物酶体)(Peroxisome)中的一种重要的酶，研究发现：外来蛋白通过与乙醇酸氧化酶基因相互作用而被带入过氧化物体中行使功能。对兰花环斑病毒的研究表明，该病毒在复制的过程中聚集在过氧化物体处，过氧化物体被推测为某些植物dsRNA病毒的dsRNA复制场所。
水稻矮缩病毒(rice dwarf virus，RDV)为等轴粒体，直径70nm，具有32个衣壳蛋白亚单位，为双链RNA病毒。只侵染水稻和少数几种禾本科植物。水稻矮缩病毒RDV病毒粒子内有单拷贝基因组12条双链RNA，依次命名为S1到S12。组成病毒颗粒的蛋白称为结构蛋白，是由S1、S2、S3、S5、S7、S8和S9分别编码的蛋白P1、P2、P3、P5、P7、P8和P9。P8是病毒粒子最外层壳的组成部分。
发明内容
本发明的目的是提供一种抑制水稻矮缩病毒侵染植物的方法。
本发明所提供的抑制水稻矮缩病毒侵染植物的方法，是抑制宿主植物细胞中的乙醇酸氧化酶的表达；所述宿主植物为水稻矮缩病毒能够侵染的植物。
所述宿主植物具体可为水稻，稗等禾本植物。
当所述宿主植物为水稻时，所述乙醇酸氧化酶是如下(a)或(b)的蛋白质：
(a)由GenBank Accession Number AAB82143的自氨基末端第1-369位氨基酸残基序列组成的蛋白质；
(b)将GenBank Accession Number AAB82143的自氨基末端第1-369位氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有乙醇酸氧化酶活性的由(a)衍生的蛋白质。
所述方法中，采用RNA干扰法、PTGS法抑制宿主植物细胞中的乙醇酸氧化酶的表达。
本发明的方法可以有效的阻止病毒到达特定的细胞器开始其复制，对于病毒防治具有十分重要的意义。
附图说明
图1为pGAD-cDNA与不同组合质粒转化的酵母细胞在SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp/X-α-gal培养基上的显色反应。
图2为P8与GOX相互作用的免疫共沉淀实验。
图3为P8与GOX在细胞中的亚定位。
图4为P8在Sf9中表达不同时间的亚细胞定位。
具体实施方式
本发明发明人的研究证实，水稻矮缩病毒外壳蛋白P8(RDV-P8)可以通过与水稻乙醇酸氧化酶的相互作用，帮助RDV进入宿主细胞过氧化物酶体，开始复制。
具体来讲，通过酵母双杂交和免疫共沉淀实验表明，水稻矮缩病毒外壳蛋白P8与水稻乙醇酸氧化酶(Glycolate Oxidase，GOX)具有相互作用。免疫荧光试验表明当P8与GOX在昆虫细胞内共表达时可共定位于过氧化物酶体中。当将P8单独在细胞内表达时，其定位受内源表达的GOX影响，从最初的弥散状分布，到后来的点状分布，是一个在胞质内向过氧化物酶体聚集的过程。P8与GOX的相互作用导致P8在GOX的影响下定位于过氧化物酶体，进而影响病毒在宿主细胞内向过氧化物酶体聚集，进而在那里开始复制。
该结果对于认识病毒如何在宿主细胞内聚集到特定的亚细胞结构，开始复制过程具有提供了一个全新的思路。根据这一结果，在宿主细胞内抑制GOX的表达，可以有效的阻止病毒到达特定的细胞器开始其复制，对于病毒防治具有十分重要的意义。
下述实施例中所用方法如无特别说明，均为常规方法。
实施例1、与水稻矮缩病毒(RDV)的外壳蛋白具有相互作用蛋白的筛选及鉴定
一、水稻矮缩病毒外壳蛋白基因S8和宿主细胞因子相互作用的筛选
通过酵母双杂交实验以水稻矮缩病毒的P8为诱饵从水稻cDNA文库中获得4个片段。
本实验中所用的质粒、菌株都是MatchMaker GAL4 Two-Hybrid System 3试剂盒的组成成分，购自Clontech公司。其中pGBKT7带有酵母转录因子GAL4的DNA结合区(AA1-147)的编码序列，而pGADT7-Rec则带有GAL4的转录激活区(AA768-881)的编码序列。另外，本实验中用到的酵母菌株是AH109[MATa，trp1-901，leu2-3，112，ura3-52，his3-200，gal4Δ，gal80，LYS2：：GAL1-HIS3，GAL2-ADE2，URA3：：MEL1-LacZ]和Y187[MATα，ura3-52，his3-200，ade2-101，trp1-901，leu2-3，112，gal4Δ，met’，gal80Δ，URA3：：GAL1-LacZ，MEL1]。AH109编码了HIS3、ADE2、LacZ和MEL1等四种报告基因，因而用于生长活性检测试验。
本试验中所用的健康水稻cDNA文库由试剂盒(MatchMaker GAL4 Two-HybridSystem 3试剂盒，购自Clontech公司)提供的RT-PCR方法合成，利用MMLV(MoloneyMurine Leukemia Virus)逆转录酶进行cDNA一链的合成。得到的是PCR产物混合物，两端含有重组序列，可在酵母体内与用SmaI线性化的pGADT7-Rec重组，使cDNA插入到pGADT7-Rec质粒中GAL4转录激活区编码序列的下游。
将水稻矮缩病毒外壳蛋白基因S8(GenBank Accession Number NC_003764)的编码序列插入到pGBKT7的限制性内切酶NcoI和BamHI的识别位点间，得到重组载体pGBK-S8。
当含有目的基因的pGBK-S8、线性化的pGADT7-Rec与水稻cDNA文库共同转化酵母AH109细胞后，由于水稻cDNA两端与pGADT7-Rec有同源序列，在酵母细胞中通过同源重组形成具有功能的GAL4 AD/cDNA表达载体，然后在筛选培养基(SD/Trp-Leu-His-Ade-/X-α-gal)上进行筛选工作。并检测转化子在营养缺陷培养基上的生长能力，以验证该质粒是否是目的质粒。
图1显示的是pGBK-S8与水稻cDNA和pGADT7-Rec形成的四个重组质粒(pGAD-D1、pGAD-D2、pGAD-D3和pGAD-D4)之一，共同转化的酵母AH109细胞在SD/Trp-Leu-His-Ade-/X-α-gal培养基上的显色反应；以及用pGBKT7作为对照的相应结果。
将pGAD-D1、pGAD-D2、pGAD-D3、pGAD-D4所含的cDNA分别进行测序，选用的引物为位于重组位点上游的T7启动子引物。测序结果表明pGAD-D1中所含的cDNA片段长822bp，编码181个氨基酸，在基因库中BLAST-EST结果表明，该cDNA片段与来自水稻的乙醇酸氧化酶(Glycolate Oxidase，GOX)基因有99％的相似性，在氨基酸组成上与GOX蛋白有81％的相似性。
二、P8与GOX的免疫共沉淀研究
为了进一步研究二者之间是否有相互作用，采用免疫共沉淀的方法在体外进行研究。首先按照如下方法将GOX与水稻矮缩病毒外壳蛋白基因S8(RDV-S8)分别克隆到哺乳动物细胞表达载体中：
以pGBK-S8为模板，用引物F1和R1进行PCR得到RDV P8编码区序列(GenBankAccession Number NC_003764的自5′末端第22位至1287位)，XhoI和NotI酶切后插入哺乳动物细胞表达载体pRK-7-Flag-Neo(购自National Jewish Medical andResearch Center，University of Colorado Health Sciences Center，Denver，Colorado)的XhoI和NotI酶切位点中，得到哺乳动物细胞中表达的质粒pRK-Flag-P8。
提取水稻的总RNA，进行逆转录，以逆转录产物为模板，用引物F2和R2进行PCR，得到GOX编码区序列(GenBank Accession Number AF022740的自5′端第42位至1151位，编码GenBank Accession Number AAB82143的蛋白)，用SalI和NotI酶切后插入哺乳动物细胞表达载体pRK-7-HA-Neo(购自National Jewish Medical and ResearchCenter，University of Colorado Health Sciences Center，Denver，Colorado)的SalI和NotI酶切位点间，得到哺乳动物细胞中表达的质粒pRK-HA-GOX。
表1.引物序列及所含的限制性内切酶位点
| 名称 | 引物序列 | RE |
| F1 | CTGACTCGAGCTGGTTAGACACAAGTGCT | XhoI |
| R1 | CGATGCGGCCGCTAATTTGGTCTATAGTA | NotI |
| F2 | CAGTGTCGACTATGGGGGAGATCACCAATGT | SalI |
| R2 | ATTAGCGGCCGCTCACAACCTGGGGAAGGG | NotI |
将pRK-HA-GOX和pRK-FLAG-S8通过磷酸钙法共转染293T细胞。转染pRK-HA-GOX和pRK-FLAG-S8的293T细胞表达融合蛋白HA-GOX和FLAG-P8。
将转染细胞的裂解物用HA抗体(购自Sigma公司)、FLAG抗体(购自Sigma公司)或鼠IgG(对照)做共沉淀，然后用HA抗体(图2中左侧图片)和FLAG抗体(图2中右侧图片)做Western检测。结果如图2所示，表明GOX可以将RDV-P8从裂解液中沉淀下来，反之，RDV-P8也可以将GOX从裂解液中沉淀下来，而负对照(鼠IgG)则呈阴性。这说明RDV-P8与GOX在体外具有相互作用。图2中，L表示所转染细胞的裂解物上清，以表明质粒的表达；αHA表示用HA抗体共沉淀的裂解物上清；αF表示用FLAG抗体共沉淀的裂解物上清；C表示用鼠IgG共沉淀的裂解物上清；IgG-H表示抗体重链，IgG-L表示抗体轻链；蛋白的分子量标准在左侧标明。
实施例2、P8与GOX在细胞中的免疫荧光定位
利用杆状病毒表达系统，在Sf9细胞中分别单独表达Flag:P8、HA:Gox、Flag:P8+HA:GOX，转染后24h将细胞固定，使用鼠抗FLAG的单克隆抗体(Sigma公司产品)和FITC偶联的羊抗鼠二抗对Flag:P8进行标记，使用兔源HA多克隆抗体(Sigma公司产品)和TRITC偶联的马抗兔二抗对HA:GOX进行标记。具体的实验方法如下：
以pRK-Flag-S8为模板，用引物F3和R3进行PCR，扩增得到FLAG-S8的PCR产物。以pRK-HA-GOX为模板，用引物F4和R4进行PCR，扩增得到HA-GOX的PGR产物。将FLAG-S8的PCR产物和HA-GOX的PCR产物分别经XbaI和NcoI酶切后，克隆到pFASTBac(购自Invitrogen公司)的XbaI和NcoI酶切位点，从而得到重组供体质粒pFASTBac-FLAG-S8和pFASTBac-HA-GOX，经测序确认序列及读码框正确无误。
表2.引物序列及所含的限制性内切酶位点
| F3 | ATGCCCATGGGACTACAAGGACGACGAT | NcoI |
| R3 | CGCGTCTAGAGATTTGGTCTATAGTATCT | XbaI |
| F4 | ATGCCCATGGTACCCATACGATGTTCCTG | NcoI |
| R4 | ATTATCTAGATCACAACCTGGGGAAGGG | XbaI |
1、重组Bacmid的制备
取DH10Bac感受态细胞100μL，冰上融化，加入10ng(2ul)重组供体质粒(pFASTBac-FLAG-S8或pFASTBac-HA-GOX)，轻柔混匀，冰上30分钟，42℃热击45秒，冰浴2分钟，加入900mlS.O.C培养基(2％蛋白胨，0.5％酵母抽提物，10mM NaCl，2.5mM KCl，10mM MgCl2，10mM MgSO4，20mM葡萄糖)，37℃摇床(225rpm)培养4小时后，将菌液10-1，10-2，10-3依次稀释，从每种稀释液中取出100μL涂Luria Agar固体培养基(在LB固体培养基的基础上添加50μg/ml卡那霉素，7μg/ml硫酸庆大霉素，10μg/ml四环素，40μg/ml X-gal和40μg/ml IPTG)，37℃培养24小时。
用牙签挑取Luria Agar平板上白斑(蓝斑做为负对照)，进行菌落PCR。使用bacmid载体特异的PUC/M13正向引物(5’-GTAAAACGACGGCCAG-3’)和HA-GOX基因特异的反向引物R2筛选含有HA-GOX基因的重组Bacmid。使用bacmid载体特异的PUC/M13正向引物(5’-GTAAAACGACGGCCAG-3’)和FLAG-S8基因特异的反向引物R1筛选含有FLAG-S8基因的重组Bacmid。结果筛选到PCR扩增产物为1600bp+外源片段长度(1200bp)的带有HA-GOX基因重组Bacmid，PCR扩增产物为1600bp+外源片段长度(1300bp)的带有FLAG-S8基因重组Bacmid。
挑PCR鉴定阳性的白色菌落于3ml LB培养基(含50μg/ml卡那霉素，7μg/ml硫酸庆大霉素，10μg/ml四环素)，37℃摇床(250到300rpm)培养16个小时。取1.5ml培养物离心(12,000rpm，1分钟)，弃上清，加0.3ml solution I〔15mMTris-HCl(pH8.0)，10mM EDTA，100ug/ml RNaseA)，轻柔重悬菌体，再加0.3mlsolution II(0.2N NaOH，1％SDS)，上下颠倒混匀，室温放置5分钟，慢慢加入0.3ml 3M醋酸钾(pH5.5)，冰浴5-10分钟，13,000rpm，离心10分钟，取上清，加入0.8ml异丙醇轻柔混匀，冰浴5-10分钟，13,000rpm，离心15分钟，弃上清，70％乙醇洗涤，超净台内吹干，溶于40ul无菌TE(pH8.0)中，得到重组Bacmid DNA。
2、昆虫细胞的培养
Sf9细胞培养液为含有10％热灭活胎牛血清(FBS)的TNM-FH培养基(TNM-FH完全培养基购自GIBCL公司)。
培养条件为：27℃，细胞无菌室内，25cm2细胞培养瓶、5mL培养液单细胞贴壁培养。待细胞长至90％覆盖率后(一般3天左右)，无菌条件下1∶5传代。
3、重组Bacmid DNA转染Sf9细胞
每个细胞培养皿(35mm)中接种1×106个细胞于2ml TNM-FH完全培养基，27℃培养1-2小时，使之贴壁。
转染试验中，所用培养液均不含血清和抗生素。每一个转染，准备两种溶液，
A液：将10ul重组Bacmid DNA加入到90ul TNM-FH培养液中；
B液：将20ul CELLFECTIN转染试剂(Invitrogen)加入到80ul TNM-FH培养液中。
将A溶液与B溶液混合，轻轻弹击使之混匀，室温下放置30-45分钟，得到DNA-CELLFECTIN混合液。期间用无血清培养液浸洗待转染贴壁细胞2-3次，吸去培养液，用DNA-CELLFECTIN混合液覆盖在细胞上，补充加入0.2mlTNM-FH培养液，27℃静置培养5小时。吸去转染溶液，加入2mlTNM-FH完全培养液(含10％FBS，50ug/mlgentamicin)，27℃培养约4-5天，收集培养液上清，1,000rpm，离心5分钟去除细胞，上清即为初代病毒贮液，可在4℃保存，-70℃长期保存。
以上涉及Bacmid的实验方法均参照Bac-to-Bac baculovirus expressionsystems Instruction Mannual，Invitrogen Company。
4、重组杆状病毒侵染Sf9细胞表达目的蛋白
(1)重组病毒的扩增
待Sf9细胞培养至70-80％覆盖率，吸掉培养液，加入适量病毒接种液(MOI＝0.01-0.2pfu/cell)，使之覆盖整层细胞，27℃培养1小时后，补加含10％胎牛血清(FBS)的完全细胞培养液至所需体积，27℃静置培养3-5天后收获病毒，病毒将得到约100倍的扩增。
其中，接种液体积由以下公式决定：
*MOI(Multiplility of Infection)：感染系数
*pfu(plaque formation unit)：空斑形成单位
(2)目的蛋白的表达
接种Sf9细胞于35mm培养皿中，培养过夜，去除培养液，分别加入适量下述三组重组病毒接种液(MOI＝5-10pfu/cell)：a、含有HA-GOX基因重组病毒；b、含有FLAG-S8基因重组病毒；c、含有HA-GOX基因重组病毒和含有FLAG-S8基因重组病毒。同时以野生型杆状病毒(Wild-type AcMNPV，WT)侵染等量细胞作为负对照，27℃1小时后，吸出病毒液，加入2mL TNM-FH完全培养基，27℃继续培养，24，48，72小时后，分别收获细胞，1,000rpm，离心2分钟，细胞沉淀立即用于免疫荧光检测。
免疫荧光实验结果如图3所示，P8在细胞中的定位受到了GOX影响。
1)单独表达P8的昆虫细胞内，P8为弥散状分布。
2)单独表达GOX的细胞内，GOX为点状分布(过氧化物酶体)。
3)P8与GOX共表达的细胞内，P8与GOX均为点状分布(过氧化物酶体)，图片叠加后红色荧光和绿色荧光完全重合为黄色，说明二者为共定位关系。
图3中，a-c为单独表达Flag-P8的细胞，d-f为单独表达HA-GOX的细胞，g-i为共表达FLAG:P8+HA:GOX的细胞。其中a、g为用FITC标记的Flag-P8的荧光图像，d、为FITC标记的HA-GOX的绿色荧光图像，h为TRITC标记的HA-GOX的红色荧光图像，b、e为DAPI标记的细胞核图像，c、f、i分别为其左边两张图像的叠加。
实施例3、P8在昆虫细胞内的分布受表达时间影响
按照实施例2的方法，用含有FLAG-S8基因的重组病毒转染Sf9细胞，分别在转染后24h、36h和48h进行免疫荧光检测。其中，一抗使用FLAG的单克隆抗体(Sigma公司产品)，二抗使用FITC偶联的马抗鼠IgG(Sigma公司产品)，在激光共聚焦显微镜下观察。结果如图4所示，在24h时，P8为弥散状分布，在36h时P8开始出现部分点状分布，在48h时P8为完全点状分布。这说明P8在细胞中的定位变化是一个渐进的过程，其合成是在胞质内进行的，随着时间的延长，P8逐渐向过氧化物酶体聚集。
GOX基因本身在各个物种间的相似性非常高，当在Sf9中单独表达P8时，P8也能发现点状的聚集，这说明Sf9内源的GOX也在发挥作用。P8在36h后出现的点状分布是受昆虫细胞内源GOX影响进入了过氧化物酶体。
实施例4、抑制水稻矮缩病毒侵染水稻
1、水稻突变体的获得及检测
日本晴野生型水稻及突变体(NF5050)购自：Rice Genome Resource Center，National Institute of Agrobiological Sciences，Japan。日本晴突变体NF5050为GOX插入突变水稻突变体，该突变体中GOX的表达受到抑制。提取水稻的总RNA，以引物F2和R2PCR得到的GOX编码区序列(GenBank Accession Number AF022740的自5′端第42位至1151位)为探针，对GOX基因进行Northern检测，用对显色条带进行吸光度检测后计算的比值来衡量转录量，结果表明日本晴突变体NF5050中GOX基因的转录量为野生型日本晴的20-30％。
按照如下方法检测日本晴突变体NF5050和野生型日本晴的乙醇酸氧化酶活性：
(1)酶粗制品的制备
取水稻叶片，自来水洗净，用吸水纸吸干，称取30g，加30-60ml蒸馏水，在0-4℃下研磨，经4层纱布过滤，滤液用1000r/min离心15分钟，弃去沉淀。然后用10％醋酸调节pH至5.4，用3500-4000r/min离心15分钟，除去蛋白质沉淀。于上清液中加硫酸铵，使达到20％饱和度，在磁力搅拌器上边加边不停地搅动30分钟，离心除去沉淀，于上清液中再加入硫酸铵，使达到30％饱和度，离心20分钟，沉淀即为酶的粗制品。用少量0.02mol/L磷酸钾缓冲液(pH8.0)溶解，使其体积为开始时提取液体积的1/10，保存于冰箱中，待测。
(2)酶活性测定
取一试管加入0.6-0.8ml 0.01mol/L KCN、0.5ml 0.04mol/L乙醇酸钾、0.5ml稀释5-10倍的酶液，加0.1mol/L磷酸钾缓冲液使体积达3.7ml，最后加入0.3ml二氯靛酚染料，使其总体积为4ml，迅速混匀倒入光径为1cm的比色杯中，于620nm读取吸光度。另取比色杯不加染料以缓冲液代之，作为空白调零用。
加入染料1分钟后开始读数，每隔30秒钟读数一次，大约在3-4分钟内吸光度A620成直线下降。
(3)计算
以每分钟使A620下降0.01所需的酶量定为1个酶活性单位。此方法可以分析酶活力为1-15单位。
结果如表3所示，表明野生型日本晴的乙醇酸氧化酶活性为11.5U，日本晴突变体NF5050的乙醇酸氧化酶活性为3U。
表3、日本晴突变体NF5050和野生型日本晴的乙醇酸氧化酶活性(U)
| 序号 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 平均值 |
| NF5050 | 3 | 5 | 3 | 2 | 2 | 3 | 3 |
| 野生型 | 13 | 11 | 12 | 11 | 10 | 12 | 11.5 |
2、水稻感病性检测
将经饥饿处理的无毒叶蝉转移到感染RDV且发病明显的水稻叶片上，饲毒48小时后，用毛笔轻轻触及叶蝉的腹管，待其口针从叶片中拔出后，将其分别转接到防虫温室内种植的无毒野生型日本晴水稻和无毒突变株水稻NF5050上，每种水稻各接毒100株，每株5头，实验重复3次，接毒后7天，提取水稻总蛋白，利用水稻矮缩病毒P8蛋白抗体对水稻总蛋白进行Western blot检测。同时对10株健康未感染RDV的野生型日本晴和10株健康未感染RDV的日本晴突变体NF5050进行Western blot检测。Western结果阳性的为感病株，按照下式计算感病率：感病率(％)＝(感病株数/调查总株数)×100。
结果如表4和表5所示，日本晴突变体NF5050感病率为4％，明显低于野生型水稻的31％。而10株健康未感染RDV的野生型日本晴，和10株健康未感染RDV的日本晴突变体NF5050的Western结果均为阴性。说明GOX表达量降低后，明显抑制了水稻矮缩病毒的侵染。证明抑制水稻中的GOX的表达，可抑制RDV对水稻的侵染。
表4日本晴突变体NF5050RDV病害情况
表5野生型日本晴RDV病害情况
其中，水稻矮缩病毒P8蛋白抗体是以大肠杆菌表达纯化的水稻矮缩病毒P8蛋白为抗原，按照常规方法免疫兔子得到的抗血清。水稻矮缩病毒P8蛋白按照如下方法制备：以pGBK-S8为模板，PCR得到RDV P8编码区序列(GenBank Accession NumberNC_003764的自5′末端第22位至1287位)，插入质粒pET-21d(+)(购自Novagen公司)的限制性内切酶NcoI及和BamHI位点间构建成表达载体，转化入大肠杆菌BL21(DE3)，经IPTG诱导表达，表达产物用S-Sepharose纯化，得到水稻矮缩病毒P8蛋白。
Claims (3)
1.一种抑制水稻矮缩病毒侵染植物的方法，是抑制宿主植物细胞中的乙醇酸氧化酶的表达；所述宿主植物为水稻矮缩病毒能够侵染的植物。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述宿主植物为水稻。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述乙醇酸氧化酶是如下(a)或(b)的蛋白质：
(a)由GenBank Accession Number AAB82143的自氨基末端第1-369位氨基酸残基序列组成的蛋白质；
(b)将GenBank Accession Number AAB82143的自氨基末端第1-369位氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有乙醇酸氧化酶活性的由(a)衍生的蛋白质。
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| CNA2006101707689A Pending CN101205534A (zh) | 2006-12-20 | 2006-12-22 | 一种抑制水稻矮缩病毒侵染植物的方法 |
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Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105794561A (zh) * | 2016-03-23 | 2016-07-27 | 浙江省农业科学院 | 油菜素唑提高水稻抗水稻黑条矮缩病毒病的应用及方法 |
| CN111253480A (zh) * | 2020-03-04 | 2020-06-09 | 宁波大学 | 水稻转录因子OsARF17基因及其在抗黑条矮缩病毒植物育种中的应用 |
-
2006
- 2006-12-22 CN CNA2006101707689A patent/CN101205534A/zh active Pending
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105794561A (zh) * | 2016-03-23 | 2016-07-27 | 浙江省农业科学院 | 油菜素唑提高水稻抗水稻黑条矮缩病毒病的应用及方法 |
| CN105794561B (zh) * | 2016-03-23 | 2019-01-01 | 浙江省农业科学院 | 油菜素唑提高水稻抗水稻黑条矮缩病毒病的应用及方法 |
| CN111253480A (zh) * | 2020-03-04 | 2020-06-09 | 宁波大学 | 水稻转录因子OsARF17基因及其在抗黑条矮缩病毒植物育种中的应用 |
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