CN107446934B

CN107446934B - 一种参与烟草盐胁迫反应的基因、蛋白及其应用

Info

Publication number: CN107446934B
Application number: CN201710919983.2A
Authority: CN
Inventors: 李立芹; 鲁黎明; 张雪微; 卓维; 陈倩; 杨尚瑜; 鲁逸飞
Original assignee: Sichuan Agricultural University
Current assignee: Sichuan Agricultural University
Priority date: 2017-09-30
Filing date: 2017-09-30
Publication date: 2019-11-26
Anticipated expiration: 2037-09-30
Also published as: CN107446934A

Abstract

本发明涉及一种参与烟草盐胁迫反应的基因、蛋白及其应用，属于分子生物学技术领域。本发明提供了一种参与烟草盐胁迫反应的基因CBL3，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明提供的基因CBL3通过在烟草中过量表达，使得烟草抵抗盐胁迫的能力得到大幅度提升，本申请提供的CBL3基因具有很好的抗盐作用。

Description

一种参与烟草盐胁迫反应的基因、蛋白及其应用

技术领域

本发明涉及分子生物学技术领域，具体涉及一种参与烟草盐胁迫反应的基因、蛋白及其应用。

背景技术

表达植物类钙调神经磷酸酶B亚基蛋白(calcineurin B-like protein，CBL)家族基因在逆境响应过程中具有重要功能，目前已经从许多植物(拟南芥，甜瓜，林烟草等)中克隆到这个家族基因(徐江等2006；刘明毓等2015；董红连，2015)。拟南芥中CBL1功能缺失突变体对铝敏感(Osena,2017),林烟草CBL10能响应高盐，低钾，高温和干旱的生理过程。西兰花中克隆到13个CBL基因，其中CBL10参与盐胁迫反应，目前，普通烟草中不同CBL基因的功能未知。

发明内容

本发明的目的在于提供一种参与烟草盐胁迫反应的基因、蛋白及其应用。本发明提供的基因CBL3通过在烟草中过量表达，使得烟草抵抗盐胁迫的能力得到大幅度提升，本申请提供的CBL3基因具有很好的抗盐作用。

本发明提供了一种参与烟草盐胁迫反应的基因CBL3，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明还提供了一种参与烟草盐胁迫反应的蛋白CBL3，所述蛋白的氨基酸序列包括SEQ ID NO.2所示序列和终止子。

本发明还提供了一种参与盐胁迫反应的基因CBL3的克隆载体，所述克隆载体包括权利要求1所述基因和pMD19-T载体。

本发明还提供了一种参与盐胁迫反应的基因CBL3的表达载体，所述表达载体包括权利要求1所述基因和PBI121载体。

本发明还提供了上述技术方案所述基因或上述技术方案所述蛋白在烟草抵抗盐胁迫中的应用。

本发明还提供了上述技术方案所述克隆载体在烟草抵抗盐胁迫中的应用。

本发明还提供了上述技术方案所述表达载体在烟草抵抗盐胁迫中的应用。

本发明提供了一种参与烟草盐胁迫反应的基因、蛋白及其应用。本发明提供的基因CBL3通过在烟草中过量表达，使得烟草抵抗盐胁迫的能力得到大幅度提升，本申请提供的CBL3基因具有很好的抗盐作用。

附图说明

图1为本发明实施例1提供的CBL3基因的电泳图；

图2为本发明实施例1提供的转基因烟草表达量检测结果图；

图3为本发明实施例1提供的转基因烟草水培盐处理表型检测结果图；

图4为本发明实施例1提供的转基因烟草土壤盐处理表型检测结果图；

图5为本发明实施例1提供的叶绿素含量测定结果图；

图6为本发明实施例1提供的过氧化物酶(POD)含量测定结果图；

图7为本发明实施例1提供的脯氨酸含量测定结果图；

图8为本发明实施例1提供的丙二醛含量测定结果图。

具体实施方式

本发明提供了一种参与烟草盐胁迫反应的基因CBL3，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。所述CBL3片段长度为669bp。本发明通过特异引物的设定，实现CBL3基因的扩增和定量检测，所述特异引物的序列如表1所示，其中引物NtCBL3-F/R用于扩增全长目的基因cds，引物NtCBL3Q-F/R用于定量检测CBL3目的基因的表达量，引物18SF/R是在检测CBL3目的基因表达量时的内参18S的定量引物。本发明所述定量检测方法优选为采用荧光定量PCR，本发明对所述荧光定量PCR的检测没有特殊的限定，采用本领域技术人员熟知的定量检测条件参数即可。本发明引物的设计优选参照GenBank收录的CBL序列，登录号是LOC104211231。

表1引物列表

本发明对所述CBL3基因的扩增模板没有特殊的要求，采用基因扩增常用模板即可，如烟草总RNA。本发明对烟草总RNA的提取方法没有特殊的限定，采用本领域技术人员熟知的总RNA提取试剂盒进行提取即可。本发明所述CBL3扩增的反应程序优选为：95℃预变性5min；95℃变性30s；55℃退火30s；72℃延伸1min；35个循环。本发明对所述CBL3基因的扩增反应体系没有特殊的限定，采用本领域技术人员熟知的常规PCR扩增体系即可。

本发明还提供了一种参与盐胁迫反应的基因CBL3的克隆载体，所述克隆载体包括权利要求1所述基因和pMD19-T载体。本发明对所述pMD19-T载体的来源没有特殊的限定，采用本领域技术人员熟知的pMD19-T载体的市售产品即可。本发明对CBL克隆载体的制备方法没有特殊的限定，采用本领域技术人员熟知的克隆载体构建方法即可，如16℃连接过夜，本发明所述连接产物优选转化大肠杆菌DH5α进行克隆，随后优选在涂有氨苄青霉素的LB平板上，采用菌落PCR进行阳性克隆的筛选。

本发明还提供了一种参与盐胁迫反应的基因CBL3的表达载体，所述表达载体包括权利要求1所述基因和PBI121。本发明对所述CBL3表达载体的构建方法没有特殊的限定，采用本领域技术人员熟知的织物表达载体构建方法进行即可。本发明得到表达载体后，优选采用农杆菌介导法进行烟草的遗传转化，本发明所述烟草的品种优选为烟草K326。

下面结合具体实施例对本发明所述的一种参与烟草盐胁迫反应的基因、蛋白及其应用做进一步详细的介绍，本发明的技术方案包括但不限于以下实施例。

实施例1

1、基因克隆

取0.5g烟草新鲜叶片，采用Trizol法提取烟草细胞的总RNA，然后采用TaKaRa公司的cDNA合成试剂盒合成cDNA，进一步采用Primer5.0软件设计引物对cDNA进行PCR扩增。扩增目的基因检测结果如图1，片段长度约为700bp，目的片段纯化后与pMD19-T载体16℃连接过夜，连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态，随后在涂有氨苄青霉素的LB平板上进行筛选，采用菌落PCR检测阳性克隆。检测后随机选取3个独立的阳性克隆送生物技术公司进行测序，基因序列如SEQ ID NO.1所示。

2、目的基因连接表达载体

将上述转化好的T-载体与表达载体PBI121分别进行双酶切(酶切位点为：XbaⅠ和SmaⅠ)，回收目的基因和表达载体PBI121，然后用连接酶连接，将连接后的重组载体转入大肠杆菌DH5α的感受态细胞，对转化后的大肠杆菌单菌落进行PCR扩增、也可挑取单菌落扩繁、提取质粒进行酶切来检测是否构建成功。

3、冻融法转化农杆菌和PCR检测

取100μL感受态细胞，室温融化后加入10μL构建好的重组质粒DNA(PBI121-CBL3)，混匀后冰浴30min，液氮中速冻1min，37℃水浴5min，然后加入500μL含利福平和链霉素的LB培养基，28℃慢速振荡培养4h，10000r/min离心1min集菌，弃上清，加入500μL含利福平和链霉素的LB培养基重新悬浮细胞，涂布于含有50μg/mL利福平、50μg/mL链霉素和50μg/mL卡那霉素的平板上，28℃避光培养约48h。待平板上长出的单菌落，直接用灭菌的牙签蘸取单菌落，在PCR体系中晃动几下后进行PCR扩增反应。

1.0％的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物结果：若阴性对照(PCR反应不加模板)没有条带，但转录PCR产物有明亮且大小正确的条带，证明转化成功。

4.农杆菌转化烟草方法

4.1烟草无菌苗的培养和预培养

选取籽粒饱满无病虫害的烟草种子装入1.5mLEP管中先用70％的乙醇消毒30s，无菌水冲洗3～5次，然后用1mL30％次氯酸钠溶液消毒5min，吸出消毒液，再加入1mL30％次氯酸钠溶液消毒25min，消毒期间都要不断的振荡EP管。最后用无菌水反复清洗6～7次后，吸干种子表面水分，布于MS培养基上，于光照培养箱最大光强度、温度20℃、光照16h/d培养30d左右备用。选取约30d苗龄且长势良好的烟草无菌苗，用灭菌刀片将烟草叶片切下，放置在预培养基上培养2d。

4.2侵染菌液的制备

(1)将含有目的基因的农杆菌在固体LB培养基上划板，28℃下暗培养2d。

(2)用灭菌牙签挑取菌落，接种于2mL液体LB培养基中，28℃下振荡培养过夜(12h左右)。

(3)活化过夜的农杆菌，按1:50的比例，取100μL稀释到5mLLB培养基中，继续培养至OD₆₀₀值为0.5(约3h检测一次)。

(4)取培养物1mL置于无菌离心管中，12000r/min离心1min，弃上清。加入100mL的MS₀培养基，混匀备用。

4.3侵染叶片、共培养和分化培养

将在预培养基上培养2d的烟草叶片切成1cm²左右的叶盘，置于悬菌液中(MS₀悬浮，可以稀释50～100倍)浸泡3～5min。然后取出，用无菌滤纸吸去其表面的液体。将侵染过的叶盘分别接种在覆有一层滤纸的共培养基上面，放到恒温培养箱20℃暗培养2d。用100mL含有200μL头孢霉素，100μL羧苄青霉素的无菌水清洗4min，重复一次后再用无菌水清洗8min，最后用无菌滤纸吸去其表面的液体再转入分化培养基进行分化培养，前期3d继代一次，每次继代需在无菌条件下进行，连续继代3次后就每隔两周继代一次。

4.4生根培养和繁殖

待抗性芽长至1～2cm时，在超净台上切去芽基部的所有愈伤组织及基部叶片，植于生根培养基上。待根长至2～3cm时，取出无菌苗，轻轻打碎固体培养基，洗去残留的培养基，去掉下部叶，然后将无菌苗植入土壤，室内培养大约一周后移到室外(最初的3d应在阴暗处生长且要盖上透明塑料)。经过PCR检测为阳性的植株进行繁殖T2代，采用荧光定量PCR的方法检测CBL3的表达量，见图2，选择超量表达的植株(OE1，OE2，OE3)繁殖到T3代。

5. T3代转基因烟草表型观察

采用漂浮育苗的方法，对3个T3代转基因烟草和烟草栽培品种K326(Nicotianatabacumcv.K326)进行培养。15天后移苗到Hogland营养液中进行氯化钠胁迫实验，氯化钠溶液的浓度为100mM，处理15天后进行照相，从图3明显看到盐胁迫后3个转基因株系(OE1，OE2，OE3)明显长势优于对照K326，K326叶片已经发白，死亡，3个转基因株系一部分叶片是绿色的，而且根系比K326发达，同时正常培养的植株没有明显差异。漂浮育苗30天后种植在土壤中进行氯化钠胁迫实验，氯化钠溶液的浓度为200mM，每次处理使用氯化钠溶液的体积是500毫升，处理15天后进行照相和生理指标的测定。从图4明显看到盐胁迫后3个转基因株系(OE1，OE2，OE3)明显长势优于对照K326，K326新叶已经死亡。同时正常培养的植株没有明显差异。

6. T3代转基因烟草盐处理后生理指标测定

3个转基因株系盐处理15天后进行生理指标的测定。叶绿素含量，过氧化物酶(POD)和脯氨酸测定结果表明在盐处理后3个转基因株系中这三个生理指标含量明显高于对照，而在正常的生长条件下，3个转基因株系与对照没有明显差异(图5-7)。

丙二醛含量测定结果表明丙二醛含量在盐处理后3个转基因株系中丙二醛含量明显低于对照，而在正常的生长条件下，3个转基因株系与对照没有明显差异(图8)。以上结果表明，烟草的CBL3基因超量表达后能够提高烟草抵抗盐胁迫的能力。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 四川农业大学

<120> 一种参与烟草盐胁迫反应的基因、蛋白及其应用

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 669

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atgtcgcatt gtttagaggg gatcaagcat ttaggtgctt ccctgttgca ctgttgtgat 60

aggcaatcaa cgggccttga agatcccgag attcttgcac gagagacagt ttttagcgtc 120

agtgagatcg aagctcttta tgagcttttt gtgaagatta gcagcgcagt aattgatgat 180

gggctgatca acaaggaaga gtttcaattg gcgctattca agacaagcaa aaaagagagc 240

ttgtttgctg atagggtgtt tgacttgttt gacacaaagc acaatggact cttgggtttt 300

gaggagtttg cccgtgcgct ctctgttttc catccaaatg ctcctatcga cgataagatt 360

gggttttctt ttcagctata tgatctcaag caacaaggct tcattgagag gcaggaggtg 420

aagcaaatgg tggttgctac ccttgctgag actggtatga acctttcaga tgaaattatt 480

gagagcataa tcgacaagac gtttgaagaa gctgatacta aacatgacgg aaagattgat 540

aaggaagagt ggagaaattt ggtcctgcga catccttcac ttctgaagaa tatgaccctt 600

cagtatctta aggacattac gactacattc ccgagttttg tctttcactc aagagtcccg 660

gatacctga 669

<210> 3

<211> 222

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Met Ser His Cys Leu Glu Gly Ile Lys His Leu Gly Ala Ser Leu Leu

1 5 10 15

His Cys Cys Asp Arg Gln Ser Thr Gly Leu Glu Asp Pro Glu Ile Leu

20 25 30

Ala Arg Glu Thr Val Phe Ser Val Ser Glu Ile Glu Ala Leu Tyr Glu

35 40 45

Leu Phe Val Lys Ile Ser Ser Ala Val Ile Asp Asp Gly Leu Ile Asn

50 55 60

Lys Glu Glu Phe Gln Leu Ala Leu Phe Lys Thr Ser Lys Lys Glu Ser

65 70 75 80

Leu Phe Ala Asp Arg Val Phe Asp Leu Phe Asp Thr Lys His Asn Gly

85 90 95

Leu Leu Gly Phe Glu Glu Phe Ala Arg Ala Leu Ser Val Phe His Pro

100 105 110

Asn Ala Pro Ile Asp Asp Lys Ile Gly Phe Ser Phe Gln Leu Tyr Asp

115 120 125

Leu Lys Gln Gln Gly Phe Ile Glu Arg Gln Glu Val Lys Gln Met Val

130 135 140

Val Ala Thr Leu Ala Glu Thr Gly Met Asn Leu Ser Asp Glu Ile Ile

145 150 155 160

Glu Ser Ile Ile Asp Lys Thr Phe Glu Glu Ala Asp Thr Lys His Asp

165 170 175

Gly Lys Ile Asp Lys Glu Glu Trp Arg Asn Leu Val Leu Arg His Pro

180 185 190

Ser Leu Leu Lys Asn Met Thr Leu Gln Tyr Leu Lys Asp Ile Thr Thr

195 200 205

Thr Phe Pro Ser Phe Val Phe His Ser Arg Val Pro Asp Thr

210 215 220

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

atgtcgcatt gtttagaggg 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

tcaggtatcc gggactcttg 20

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

ccttatcaat ctttccgtca 20

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

tttccatcca aatgctccta 20

<210> 7

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

cctacgctct gtatacatta gc 22

<210> 8

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

gtgttgagtc aaattaagcc gc 22

Claims

1.核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的基因或氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的蛋白在烟草抵抗盐胁迫中的应用。

2.包含核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的基因的pMD19-T载体在烟草抵抗盐胁迫中的应用。

3.包含核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的基因的PBI121载体在烟草抵抗盐胁迫中的应用。