CN108893475A

CN108893475A - 烟草14-3-3蛋白、编码基因及其在烟草低钾反应中的应用

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Publication number: CN108893475A
Application number: CN201810790482.3A
Authority: CN
Inventors: 李立芹; 鲁黎明; 陈倩; 卓维; 吕承承; 鲁逸飞
Original assignee: Sichuan Agricultural University
Current assignee: Sichuan Agricultural University
Priority date: 2018-07-18
Filing date: 2018-07-18
Publication date: 2018-11-27

Abstract

本发明涉及基因领域，提供一种烟草耐低钾胁迫基因14‑3‑3，所述烟草耐低钾胁迫基因14‑3‑3的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。试验表明，将本发明提供的烟草耐低钾胁迫基因14‑3‑3构建为表达载体后转入到烟草中得到转基因烟草，烟草的耐低钾胁迫基因14‑3‑3在转基因烟草中过量表达，在正常条件下转基因烟草与普通烟草的生长状况无显著差异；在低钾胁迫条件下，转基因烟草的长势明显优于普通烟草，烟草耐低钾胁迫基因14‑3‑3在低钾胁迫条件下超量表达，有效地提高了烟草耐低钾胁迫能力，能够用于培育获得耐低钾性能好的优异植物。

Description

烟草14-3-3蛋白、编码基因及其在烟草低钾反应中的应用

技术领域

本发明涉及基因领域，具体涉及一种烟草耐低钾胁迫基因14-3-3及其蛋白、表达载体和应用。

背景技术

1992年以来，在植物中发现多种14-3-3蛋白。例如，拟南芥(Arabidopsisthaliana)中有15个基因编码14-3-3蛋白，根据它们内含子插入位置的不同，可分为β类型和非β类型2类。14-3-3蛋白通过识别特异的磷酸化序列与靶蛋白相互作用，目前在植物中已发现有300多个靶蛋白能够与14-3-3蛋白相互作用。

拟南芥14-3-3蛋白14-3-3λ通过与CRPK1相互作用，在植物的冷冻胁迫响应中起着重要的作用(Liu，2017)；14-3-3λ通过与AtTPK1在N端的结合，使K⁺外排，从而响应于盐胁迫(Mélanie，2017)。二穗短柄草14-3-3基因BdGF14s受高盐、干旱、H₂0₂、ABA的诱导(Yuan，2017)。可以看出，不同的14-3-3蛋白同工型在植物不同组织中表达，并且差异很大，它们特异性地调控靶蛋白，参与植物细胞内一系列信号转导和代谢过程，影响植物的生长发育。目前还没有一种针对低钾胁迫有良好作用的14-3-3蛋白。

发明内容

本发明为了解决现有技术中14-3-3蛋白提高耐低钾胁迫性能不足的问题，提供了一种烟草耐低钾胁迫基因14-3-3，在植物中过表达后能够显著提高其耐低钾胁迫的性能，并且对于植株正常情况下的生长无影响。

为了解决上述问题，本发明提供了以下技术方案：

本发明提供了一种烟草耐低钾胁迫基因14-3-3，所述烟草耐低钾胁迫基因14-3-3的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明提供了上述技术方案所述烟草耐低钾胁迫基因14-3-3编码的14-3-3蛋白，所述14-3-3蛋白的氨基酸序列如何SEQ ID NO.2所示。

本发明提供了一种用于扩增前述技术方案所述烟草耐低钾胁迫基因14-3-3的引物对，上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

本发明提供了一种前述技术方案所述烟草耐低钾胁迫基因14-3-3的表达载体，所述表达载体通过PBI1221进行构建。

本发明前述技术方案所述烟草耐低钾胁迫基因14-3-3在培育转基因耐低钾植物中的应用。

优选的，所述烟草耐低钾胁迫基因14-3-3转入待转基因植物外植体中进行过表达。

优选的，所述过表达通过农杆菌介导法将权利要求4所述表达载体转入待转基因植物外植体后，组织培养得到过表达烟草耐低钾胁迫基因14-3-3的组培苗，培育所述组培苗即得转基因耐低钾植物。

优选的，所述植物为双子叶植物。

优选的，所述双子叶植物为茄科植物。

与现有技术相比，本发明提供的技术方案具有以下优点：

本发明提供了一种烟草耐低钾胁迫基因14-3-3，所述烟草耐低钾胁迫基因14-3-3的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明提供的烟草耐低钾胁迫基因14-3-3的全长758bp。该烟草耐低钾胁迫基因14-3-3仅在低钾胁迫条件下发挥作用，其在转基因植物中过量表达能够显著提高植物在低钾条件下的长势，而在正常条件下与普通植株无显著差异。

试验表明，将本发明提供的烟草耐低钾胁迫基因14-3-3构建为表达载体后转入到烟草中得到转基因烟草，烟草的耐低钾胁迫基因14-3-3在转基因烟草中过量表达，在正常条件下转基因烟草与普通烟草的生长状况无显著差异；在低钾胁迫条件下，转基因烟草的长势明显优于普通烟草，烟草耐低钾胁迫基因14-3-3在低钾胁迫条件下超量表达，有效地提高了烟草耐低钾胁迫能力，能够用于培育获得耐低钾性能好的优异植物。

附图说明

图1为从烟草cDNA中扩增得到的烟草耐低钾胁迫基因14-3-3电泳图；

图2为转基因烟草与普通烟草在正常栽培和低钾处理下的生长状态；

图3为转基因烟草与普通烟草在正常和低钾培养基上的萌发情况；

图4为转基因烟草与普通烟草在正常栽培和低钾处理下的基因相对表达量；

图5为转基因烟草与普通烟草在正常栽培和低钾处理下的叶绿素含量；

图6为转基因烟草与普通烟草在正常栽培和低钾处理下的过氧化物酶的比活力；

图7为转基因烟草与普通烟草在正常栽培和低钾处理下的可溶性蛋白含量。

具体实施方式

本发明提供的烟草耐低钾胁迫基因14-3-3能够明显提高植物耐低钾胁迫的能力，本发明将所述烟草耐低钾胁迫基因14-3-3在植物中过表达后能够使转基因植物获得显著的耐低钾能力，提高植物在低钾条件下的存活能力，减少逆境对植物生长状况的不利影响。

本发明所述烟草耐低钾胁迫基因14-3-3从烟草cDNA中扩增获得，所述烟草耐低钾胁迫基因14-3-3的编码区cDNA全长758bp，核苷酸序列如下：

ATGGACAAGGAAAGAGAGAAACAGGTTTACTTGGCTAGGCTGGCTGAACAAGCTGAGAGATAGATGAAATGGTAGAAGCAATGAAGACGGTTGCTAAGATGGATGTCGAACTGACTGTTGAGGAGAGGAATTTGGTGTCAGTTGGGTATAAGAATGTTATTGGAGCAAGAAGGGCTTCATGGCGGATATTGTCTTCAATTGAACAAAAGGAGGAGAGTAAGGGTCATGACCAGAATGTTAAGAGAATAAAGACTTACCAACAGAGGGTTGAAGATGAGCTTACAAAAATATGCATTGACATTTTGTCCGTGATAGATGAGCACCTTGTTCCTTCGTCCACTACTGGAGAATCTACTGTCTTCTACTATAAGATGAAGGGAGACTACTATCGCTATTTAGCAGAGTTCAAATCAGGGGATGATCGTAAAGAGGCAGCTGATCAGTCACTTAAAGCTTATGAGGCTGCTACTGCCACAGCTAGCGCAGATCTTGCTCCTACTCACCCAATTAGACTTGGACTTGCATTGAACTTCTCAGTCTTCTACTATGAGATTCTAAATTCACCTGAGAGGGCATGTCACTTGGCCAAGCAAGCATTTGACGAAGCTATTGCCGAGCTTGATAGCCTTAGTGAAGAATCCTACAAGGACAGTACCCTTATCATGCAGCTCCTAAGGGATAATCTCACTTTGTGGACCTCAGACCTTGAAGAGGGAGGTGAACATTCTAAGGGTGATGAGCGTCAAGGGGAGAACTAA

本发明还提供了由上述技术方案所述烟草耐低钾胁迫基因14-3-3编码得到的14-3-3蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。具体的，本发明所述14-3-3蛋白氨基酸序列共252个，其序列如下：

MDKEREKQVYLARLAEQAERYDEMVEAMKTVAKMDVELTVEERNLVSVGYKNVIGARRASWRILSSIEQKEESKGHDQNVKRIKTYQQRVEDELTKICIDILSVIDEHLVPSSTTGESTVFYYKMKGDYYRYLAEFKSGDDRKEAADQSLKAYEAATATASADLAPTHPIRLGLALNFSVFYYEILNSPERACHLAKQAFDEAIAELDSLSEESYKDSTLIMQLLRDNLTLWTSDLEEGGEHSKGDERQGEN

本发明从烟草中通过同源克隆得到所述耐低钾胁迫基因14-3-3，通过设计引物将烟草耐低钾胁迫基因14-3-3从烟草cDNA中的钾运转体序列中扩增得到。即本发明还提供了一种用于扩增所述烟草耐低钾胁迫基因14-3-3的引物对，即上述设计的引物对，上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

在本发明中，所述用于扩增烟草耐低钾胁迫基因14-3-3的上下游引物序列如下所示：

上游引物：5'-ATGGACAAGGAAAGAGAG-3'；

下游引物：5'-TTAGTTCTCCCCTTGACG-3'。

利用本发明提供的引物对能够从烟草中扩增得到烟草耐低钾胁迫基因14-3-3，所述引物能够用于烟草耐低钾胁迫基因14-3-3的表达载体构建以及转基因耐低钾植物的构建中。

本发明提供了一种前述技术方案所述烟草耐低钾胁迫基因14-3-3的表达载体，所述表达载体通过PBI1221进行构建，并利用上述技术方案所述的引物对对烟草耐低钾胁迫基因14-3-3进行扩增。

具体的，本发明所述所述烟草耐低钾胁迫基因14-3-3的表达载体的构建包括以下步骤：

(1)以烟草cDNA为模板，利用上述技术方案所述引物对进行PCR扩增，得到烟草耐低钾胁迫基因14-3-3片段；

(2)将步骤(1)中扩增得到的烟草耐低钾胁迫基因14-3-3片段连接到pMD19-T载体上，得到重组T-载体；

(3)将步骤(2)得到的重组T-载体与植物表达载体PBI1221分别进行SmaⅠ和XbaⅠ双酶切，连接得到烟草耐低钾胁迫基因14-3-3的表达载体。

在本发明中，所述步骤(1)中的PCR扩增体系为：

在本发明中，所述步骤(1)中PCR扩增反应程序为：

得到PCR扩增产物后，本发明对其进行电泳检测，电泳图如图1所示，扩增产物在750bp左右，即为本发明的目的基因烟草耐低钾胁迫基因14-3-3片段。

本发明将扩增产物与pMD19-T载体在16℃下过夜连接，将连接后的载体转入大肠杆菌中进行阳性克隆筛选、测序，得到重组T-载体。

得到重组T-载体后，本发明将重组T-载体与重组表达载体PBI1221分别进行双酶切，所述双酶切位点为SmaⅠ和XbaⅠ；将双酶切后的产物用连接酶连接，转化大肠杆菌感受态细胞DH5α，对转化后的大肠杆菌感受态细胞进行PCR扩增验证是否正确连接，当所述PCR扩增得到的片段大小在750bp作用，即为正确连接。从验证的阳性克隆中提取质粒，即得烟草耐低钾胁迫基因14-3-3的表达载体。本发明对于所述提取质粒的方法无特殊限定，可以采用本领域已知的质粒提取试剂盒进行，比如使用生工SanPrep柱式质粒DNA小量抽提试剂盒提取。

本发明构建的烟草耐低钾胁迫基因14-3-3的表达载体能够用于表达烟草耐低钾胁迫基因14-3-3编码的14-3-3蛋白，也可用于转导如植物中构建转基因耐低钾植物。

本发明还提供了所述烟草耐低钾胁迫基因14-3-3在培育转基因耐低钾植物中的应用。具体的，本发明将所述烟草耐低钾胁迫基因14-3-3在转基因植物中过表达，从而有效改善植物在低钾环境下的耐受能力，提高植物在逆境下的生长状态。

具体来说，本发明所述过表达是通过农杆菌介导法将前述技术方案所述的烟草耐低钾胁迫基因14-3-3转入待转基因植物外植体后，组织培养得到过表达烟草耐低钾胁迫基因14-3-3的组培苗，培育所述组培苗即得转基因耐低钾植物。本发明所述烟草耐低钾胁迫基因14-3-3在转基因植株中过量表达，在正常生长条件下对植物生长无影响，在缺少钾的逆境下能够保持较好的生长状态，有效地提高了植物耐低钾胁迫的能力。

在本发明中，所述植物优选为双子叶植物，更优选为双子叶植物中的茄科植物，最优选为烟草。

为了进一步说明本发明，下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

1、烟草耐低钾胁迫基因14-3-3的克隆

取0.5g烟草新鲜叶片，采用Trizol法提取烟草细胞的总RNA，然后采用TaKaRa公司的cDNA合成试剂盒合成cDNA。采用下述引物对烟草cDNA进行PCR扩增：

Nt14-3-3-F：5'-ATGGACAAGGAAAGAGAG-3'；

Nt14-3-3-R：5'-TTAGTTCTCCCCTTGACG-3'。

以烟草cDNA为模板进行PCR，PCR扩增体系：

所述PCR扩增反应程序为：

对PCR扩增产物进行电泳，电泳图如图1所示，片段在750bp左右。

经分析，最终获得烟草耐低钾胁迫基因14-3-3的编码区全长序列，如SEQ ID NO.1所示：

所述PCR扩增得到的烟草耐低钾胁迫基因14-3-3共编码252个氨基酸，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示：

实施例2转基因耐低钾植株的获得

1、烟草耐低钾胁迫基因14-3-3表达载体的构建

将实施例1得到的PCR扩增产物纯化后与pMD19-T在16℃下过夜进行连接，过夜后得到的连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞中，将转化后的大肠杆菌在涂有氨苄青霉素的LB平板上进行筛选，采用菌落PCR检测阳性克隆。检测后随机选取3个独立的阳性克隆送生物技术公司进行测序，即得重组T-载体。

将上述得到的重组T-载体与表达载体PBI1221分别进行双酶切(酶切位点为：XbaⅠ和SmaⅠ)，回收目的基因和表达载体PBI1221，然后用连接酶连接。

取200μL大肠杆菌感受态细胞，室温融化后加入10μL连接好的质粒载体，混匀后冰浴30min，液氮中速冻1min，37℃水浴5min，然后加入500μL含利福平和链霉素的LB培养基中，28℃慢速振荡培养4h。培养后10000r/min离心1min集菌，弃上清，加入500μL含利福平和链霉素的LB培养基重新悬浮细胞，涂布于含有50μg/mL利福平、50μg/mL链霉素和50μg/mL卡那霉素的平板上，28℃避光培养约48h。待平板上长出的单菌落，直接用灭菌的牙签蘸取单菌落，在PCR体系中晃动几下后进行PCR扩增反应。设置未转化的大肠杆菌感受态细胞作为空白对照。

采用1.0％的琼脂糖凝胶电泳检测上述PCR产物，若空白对照没有条带，但转录PCR产物有明亮且大小正确的条带，证明转化成功。选取转化成功的大肠杆菌感受态细胞，提取质粒，得到烟草耐低钾胁迫基因14-3-3表达载体。

2、转基因耐低钾烟草的获得

利用农杆菌介导的植物遗传转化体系，以烟草无菌苗为外植体，将过上一步骤制备得到的烟草耐低钾胁迫基因14-3-3表达载体通过农杆菌介导法转化，组织培养为转基因烟草组培苗，培育所述组培苗，即得转基因耐低钾烟草。具体过程为：

(1)烟草无菌苗的培养和预培养

选取籽粒饱满无病虫害的烟草种子装入1.5mL EP管中先用70％的乙醇消毒30s，无菌水冲洗3-5次，然后用1mL30％次氯酸钠溶液消毒5min，吸出消毒液，再加入1mL30％次氯酸钠溶液消毒25min，消毒期间都要不断地振荡EP管。最后用无菌水反复清洗6-7次后，吸干种子表面水分，布于MS培养基上，于光照培养箱最大光强度、温度20℃、光照16h/d培养30d左右备用。选取约30d苗龄且长势良好的烟草无菌苗，用灭菌刀片将烟草叶片切下，放置在预培养基上培养2d(注意培养基要倒置，即叶的正面朝下)。

(2)侵染菌液的制备

将步骤1中制备得到的烟草耐低钾胁迫基因14-3-3表达载体转入到农杆菌中，得到含有目的基因(烟草耐低钾胁迫基因14-3-3)的农杆菌，将含有目的基因的农杆菌在固体LB培养基上划板，28℃下暗培养2d。用灭菌牙签挑取菌落，接种于2mL液体LB培养基中，28℃下振荡培养过夜(12h左右)。

将活化过夜的农杆菌按1:50的比例稀释，即取100μL活化过夜的农杆菌稀释到5mLLB培养基中，继续培养至OD₆₀₀值为0.5(约3h检测一次)。

取培养物1mL置于无菌离心管中，12000r/min离心1min，弃上清。加入100mL的MS₀培养基，混匀备用。

(3)侵染叶片、共培养和分化培养

将在预培养基上培养2d的烟草叶片切成1cm²的叶盘，置于步骤(2)中制备得到的侵染菌液中浸泡3～5min。然后取出，用无菌滤纸吸去其表面的液体。将侵染过的叶盘分别接种在覆有一层滤纸的预培养基上面，放到恒温培养箱20℃暗培养2d。

预培养基(1L)：MS基本培养基的基础上加入100x微量有机物10mL；2.0mg/mL 6-BA1mL。高温湿热灭菌20min；待冷却至60℃左右时加入IAA至0.2mg/L，即得。

所述100x微量有机物(1L)：肌醇10g，烟酸0.05g，盐酸硫胺素(维B₁)0.01g，盐酸吡哆辛(维B₆)0.05g，甘氨酸0.2g。

用100mL含有200μL头孢霉素，100μL羧苄青霉素的无菌水清洗4min，重复一次后再用无菌水清洗8min，最后用无菌滤纸吸去其表面的液体再转入分化培养基进行分化培养，前期3d继代一次，每次继代需在无菌条件下进行，连续继代3次后就每隔两周继代一次。

分化培养基(1L)：MS基本培养基的基础上加入100x微量有机物10mL；2.0mg/mL 6-BA 1mL。高温湿热灭菌20min；待冷却至60℃左右时加入IAA至0.2mg/L，卡那霉素(Kn)至50mg/L，头孢霉素(Cef)至200mg/L，羧苄青霉素(Carb)至500mg/L。

(4)生根培养和繁殖

待分化后的芽长至1～2cm时，在超净台上切去芽基部的所有愈伤组织及基部叶片，植于生根培养基上。待无菌苗在生根培养基中的根长至2～3cm时，取出无菌苗，轻轻打碎固体培养基，洗去残留的培养基，去掉下部叶，然后将无菌苗植入土壤，室内培养一周后移到室外。(最初的3d应在阴暗处生长且要盖上透明塑料)。经过PCR检测为阳性的植株进行繁殖到T3代，得到转基因耐低钾烟草。

生根培养基(1L)：在1/2MS基本培养基的基础上添加100x微量有机物5mL。灭菌20min；待冷却至60℃左右时加入IAA至0.2mg/L，Kn至50mg/L，Cef至200mg/L，Carb至500mg/L。

实施例3转基因植株的抗逆性分析

1、试验过程

采用漂浮育苗的方法，对实施例2得到的T1～T3代转基因烟草和普通烟草K326进行培养。前15天进行正常栽培，观察正常生长状况下转基因烟草与普通烟草的生长状态并对各项生理指标进行检测。正常培育时，培养基中的钾元素含量为20mM。

15天后移苗进行水培试验，采用低钾培养液对转基因烟草和普通烟草进行培育，所述低钾培养液中包含10μmol.L^-1K⁺(低钾处理)，每次处理使用低钾培养液的体积是6000毫升，每隔3d更换一次。处理15天后观察低钾胁迫下的转基因烟草与普通烟草的生长状态并对各项生理指标进行检测。

所述低钾培养液为1/30低钾MS培养基，将低钾MS培养基稀释30倍得到。

所述低钾MS培养基(1L)：20x低钾大量元素100mL；100x低钾微量元素10mL；100x低钾铁盐10mL；

其中：低钾大量元素(1L)：硝酸铵(NH₄NO3)46g，硝酸钾(KNO₃)19.00g，硫酸镁(MgSO₄·7H₂O)3.70g，磷酸二氢钾(KH₂PO₄)1.70g，氯化钙(CaCl₂·2H₂O)4.40g；20x低钾大量元素即稀释20倍的低钾大量元素。

低钾微量元素(1L)：硫酸锰(MnSO₄·4H₂O)2.23g，碘化钾(KI)0.083g，硫酸铜(CuSO₄·5H₂O)0.0025g，硼酸(H₃BO₅)0.625g，氯化钴(CoCl·6H₂O)0.0025g，硫酸锌(ZnSO₄·7H₂O)0.865g，钼酸钠(Na₂MoO₄·2H₂O)0.025g；100x低钾微量元素即稀释100倍的低钾微量元素。

低钾铁盐(1L)：硫酸亚铁(FeSO₄·7H₂O)2.78g，乙二胺四乙酸二钠(Na₂EDTA)3.73g；100x低钾铁盐素即稀释100倍的低钾铁盐。

2、结果

(1)生长状态

如图2、3所示，正常栽培下的转基因烟草与K326植株无的生长状态无显著差异，表明本发明所述烟草耐低钾胁迫基因14-3-3在正常环境下对烟草表型无明显作用。受到低钾胁迫处理的3个转基因烟草株系，其长势明显优于K263植株，这表明，本发明所述烟草耐低钾胁迫基因14-3-3在低钾环境下能够显著提高植物长势，减少逆境对植物生长的影响。

(2)烟草耐低钾胁迫基因14-3-3-的相对表达量检测

分别取0.5g实施例2培育得到的T1～T3代转基因耐低钾烟草及普通烟草K326新鲜叶片，采用Trizol法提取烟草细胞的总RNA，然后采用TaKaRa公司的cDNA合成试剂盒合成cDNA。根据基因序列，设计目的基因实时荧光定量RT-PCR引物：

Nt14-3-3-qF：5'-TCCTACTCACCCAATCAG-3'(SEQ ID NO.5)；

Nt14-3-3-qR：5'-TCGCCAAGTGTATCCAAC-3'(SEQ ID NO.6)。

采用烟草的18SrRNA作为内参基因进行基因表达差异研究，18SrRNA的引物序列为：

18S-F：5'-CCTACGCTCTGTATACATTAGC-3'(SEQ ID NO.7)，

18S-R：5'-GTGTTGAGTCAAATTAAGCCGC-3'(SEQ ID NO.8)。

荧光定量PCR扩增程序为：50℃反应2min，95℃预变性3min，然后对95℃变性10s和65℃延伸45s进行39个循环。所有的样品都设置3个生物学重复，反应结束后，基因相对表达水平用2^-△△Ct方法进行计算。

荧光定量PCR的测定结果如图4所示，可以看出，转基因耐低钾烟草中的14-3-3基因表达量显著高于普通烟草，表明本发明是通过在烟草中过表达所述14-3-3基因实现的提高植物耐低钾性能。

(3)叶绿素含量测定(分光度法)

a)色素提取

称取实施例2培育得到的T1～T3代转基因烟草和普通烟草K326的绿色叶片各0.1g，剪碎置于研钵中，加入少许碳酸钙、石英砂和80％乙醇充分研磨，过滤，滤液转入5ml容量瓶中。用80％乙醇反复洗涤残渣，滤纸至无绿色，合并滤液，定容至5ml，得到叶绿素提取液。

b)比色

取步骤a)得到的叶绿素提取液1ml稀释至10ml，摇匀。以80％乙醇为参比液，在分光光度计663nm、645nm下测定其光密度。叶绿素的计算公式如下：

其中，OD:测定波长下的光密度；

V:叶绿素提取液总体积(ml)(若用的稀释液，则应乘稀释倍数)；

W:材料鲜重(g)。

叶绿素含量测定结果如图5所示，可以看出，转基因耐低钾烟草中的叶绿素含量相对于普通烟草有显著提高，在同等时间内能够积累更多的糖分等有效物质，从而在处于逆境的情况下也能够维持较为旺盛的生长状态。

(4)过氧化物酶(POD)活性测定(愈创木酚法)

a)反应混合液配制

取100mmol/L磷酸缓冲液(PH6.0)50ml于烧杯中，加入愈创木酚28μL，水浴加热搅拌，直至愈创木酚完全溶解，待溶液冷却后，加入30％过氧化氢19μL，混合均匀。

b)酶液制备

称取待检测的植物材料0.25g，加入20mmol/l KH₂PO₄溶液少许，于研钵中研磨成匀浆。将研磨液转入5ml容量瓶中，用KH₂PO₄溶液反复洗涤研钵，至无色，洗液转入容量瓶中，定容至5ml。在3000r/min条件下离心10min，上清液转入5ml离心管中，用KH₂PO₄溶液定容至5ml。

c)比色测定

取光径1cm比色杯两只，于一只中加入KH2PO4溶液2ml，反应混合液3ml，作参比；另一只加入酶液2ml，反应混合液3ml，立即计时并置于分光光度计中。在470nm下测定光密度，每隔1min读数一次，连续测5min，每次测定前重新用对照校准。过氧化物酶比活力的计算公式如下：

其中，A₂-A₁：吸光度的变化；t₂-t₁:时间变化；

D：稀释倍数，即提取的酶液总量为反应体系内酶液的倍数

μ：酶活力单位，即0.01A₄₇₀·min^-1。

过氧化物酶的活力测定结果如图6所示，在正常生长情况下转基因烟草与普通烟草的过氧化物酶比活力无显著差异，而在低钾胁迫条件下转基因烟草的过氧化物酶比活力显著高于普通烟草，表明在低钾胁迫下烟草耐低钾胁迫基因14-3-3能够显著提高植物的抗氧化能力，缓解逆境对植物生长的影响。

(5)可溶蛋白含量测定(考马斯亮蓝G-250法)

a)样品液提取

称取各植株的绿色叶片0.25g剪碎置于研钵中，加入少许蒸馏水，研磨至匀浆。将研磨液转入5ml容量瓶中，用蒸馏水反复洗涤研钵至无色，洗液转入容量瓶中，定容至5ml。

b)离心

将样品转入5ml离心管中，在1000r/min条件下，离心1min。

c)比色

取上清液200至刻度管中，加入3ml考马斯亮蓝溶液，摇匀。另取一只相同试管，加入200蒸馏水及3ml考马斯亮蓝溶液，摇匀作参比，在分光光度计595nm下，测其光密度。

d)查找标准曲线，从标准曲线上查出样品蛋白质浓度。

其中，C:查标准曲线值(μg)；VT:提取液总体积(ml)；WF:样品鲜重(g)；VS:测定时加样量(ml)。

可溶性蛋白含量检测结果如图7所示，正常生长条件下转基因植株与普通烟草的可溶性蛋白含量无显著差异；在低钾胁迫条件下，转基因植株的可溶性蛋白含量显著高于普通烟草。

综合上述生理指标的测定可以看出，低钾处理后3个转基因株系中这三个生理指标含量明显高于普通烟草，而在正常的生长条件下，3个转基因株系与对照没有明显差异。

以上结果表明，烟草的14-3-3基因超量表达后能够提高烟草耐低钾胁迫的能力。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 四川农业大学

<120> 烟草14-3-3蛋白、编码基因及其在烟草低钾反应中的应用

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 758

<212> DNA

<213> Nicotiana tabacum L.

<400> 1

atggacaagg aaagagagaa acaggtttac ttggctaggc tggctgaaca agctgagaga 60

tagatgaaat ggtagaagca atgaagacgg ttgctaagat ggatgtcgaa ctgactgttg 120

aggagaggaa tttggtgtca gttgggtata agaatgttat tggagcaaga agggcttcat 180

ggcggatatt gtcttcaatt gaacaaaagg aggagagtaa gggtcatgac cagaatgtta 240

agagaataaa gacttaccaa cagagggttg aagatgagct tacaaaaata tgcattgaca 300

ttttgtccgt gatagatgag caccttgttc cttcgtccac tactggagaa tctactgtct 360

tctactataa gatgaaggga gactactatc gctatttagc agagttcaaa tcaggggatg 420

atcgtaaaga ggcagctgat cagtcactta aagcttatga ggctgctact gccacagcta 480

gcgcagatct tgctcctact cacccaatta gacttggact tgcattgaac ttctcagtct 540

tctactatga gattctaaat tcacctgaga gggcatgtca cttggccaag caagcatttg 600

acgaagctat tgccgagctt gatagcctta gtgaagaatc ctacaaggac agtaccctta 660

tcatgcagct cctaagggat aatctcactt tgtggacctc agaccttgaa gagggaggtg 720

aacattctaa gggtgatgag cgtcaagggg agaactaa 758

<210> 2

<211> 252

<212> PRT

<213> Nicotiana tabacum L.

<400> 2

Met Asp Lys Glu Arg Glu Lys Gln Val Tyr Leu Ala Arg Leu Ala Glu

1 5 10 15

Gln Ala Glu Arg Tyr Asp Glu Met Val Glu Ala Met Lys Thr Val Ala

20 25 30

Lys Met Asp Val Glu Leu Thr Val Glu Glu Arg Asn Leu Val Ser Val

35 40 45

Gly Tyr Lys Asn Val Ile Gly Ala Arg Arg Ala Ser Trp Arg Ile Leu

50 55 60

Ser Ser Ile Glu Gln Lys Glu Glu Ser Lys Gly His Asp Gln Asn Val

65 70 75 80

Lys Arg Ile Lys Thr Tyr Gln Gln Arg Val Glu Asp Glu Leu Thr Lys

85 90 95

Ile Cys Ile Asp Ile Leu Ser Val Ile Asp Glu His Leu Val Pro Ser

100 105 110

Ser Thr Thr Gly Glu Ser Thr Val Phe Tyr Tyr Lys Met Lys Gly Asp

115 120 125

Tyr Tyr Arg Tyr Leu Ala Glu Phe Lys Ser Gly Asp Asp Arg Lys Glu

130 135 140

Ala Ala Asp Gln Ser Leu Lys Ala Tyr Glu Ala Ala Thr Ala Thr Ala

145 150 155 160

Ser Ala Asp Leu Ala Pro Thr His Pro Ile Arg Leu Gly Leu Ala Leu

165 170 175

Asn Phe Ser Val Phe Tyr Tyr Glu Ile Leu Asn Ser Pro Glu Arg Ala

180 185 190

Cys His Leu Ala Lys Gln Ala Phe Asp Glu Ala Ile Ala Glu Leu Asp

195 200 205

Ser Leu Ser Glu Glu Ser Tyr Lys Asp Ser Thr Leu Ile Met Gln Leu

210 215 220

Leu Arg Asp Asn Leu Thr Leu Trp Thr Ser Asp Leu Glu Glu Gly Gly

225 230 235 240

Glu His Ser Lys Gly Asp Glu Arg Gln Gly Glu Asn

245 250

<210> 3

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

atggacaagg aaagagag 18

<210> 4

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ttagttctcc ccttgacg 18

<210> 5

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

tcctactcac ccaatcag 18

<210> 6

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

tcgccaagtg tatccaac 18

<210> 7

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

cctacgctct gtatacatta gc 22

<210> 8

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

gtgttgagtc aaattaagcc gc 22

Claims

1.一种烟草耐低钾胁迫基因14-3-3，其特征在于，所述烟草耐低钾胁迫基因14-3-3的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.权利要求1所述烟草耐低钾胁迫基因14-3-3编码的14-3-3蛋白，其特征在于，所述14-3-3蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

3.一种用于扩增权利要求1所述烟草耐低钾胁迫基因14-3-3的引物对，其特征在于，上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

4.一种权利要求1所述烟草耐低钾胁迫基因14-3-3的表达载体，其特征在于，所述表达载体通过PBI1221进行构建。

5.权利要求1所述烟草耐低钾胁迫基因14-3-3在培育转基因耐低钾植物中的应用。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述烟草耐低钾胁迫基因14-3-3转入待转基因植物外植体中进行过表达。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述过表达通过农杆菌介导法将权利要求4所述表达载体转入待转基因植物外植体后，组织培养得到过表达烟草耐低钾胁迫基因14-3-3的组培苗，培育所述组培苗得转基因耐低钾植物。

8.根据权利要求5～7任意一项所述的应用，其特征在于，所述植物为双子叶植物。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述双子叶植物为茄科植物。