CN109913446A - 一种烟草NtNHX2基因的克隆及在不同逆境下表达模式的分析方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种烟草NtNHX2基因的克隆及在不同逆境下表达模式的分析方法，以烟草幼苗总RNA反转录合成的cDNA为模板进行PCR扩增，1%琼脂糖凝胶电泳结果显示在1500‑2000bp的位置上有一条清晰的条带，条带单一，无弥散现象，长度大小与预期目标相符,对该条带进行回收、纯化测序，测序结果显示目的片段大小为1605bp；然后根据该NtNHX2基因序列，采用DNAMAN设计qRT‑PCR引物NtNHX2‑qF、NtNHX2‑qR，以烟草的18S rRNA为内参基因进行表达差异分析，基因相对表达水平用2‑ΔΔCt方法进行计算；3次重复，运用qRT‑PCR分析NtNHX2在不同组织中的特异性表达及其在高盐、低钾、干旱、4℃、ABA胁迫下的基因表达水平，为NtNHX2的功能研究、探讨其耐盐机制及基因利用提供理论依据。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种烟草NtNHX2基因的克隆及在不同逆境下表达模式的分析方法。
背景技术
烟草是我国重要的经济植物，提高烟草的品质与产量对我国的经济收入及烟区农业经济发展有着重要作用。如今土壤盐碱化、干旱、低温等胁迫严重影响烟草的产量与品质，因此如何提高其抗逆性已然成为了目前烟草研究的一个重要课题。
烟草为响应外界逆境胁迫及自身生长发育的信号，必须通过保持细胞内离子平衡来维持自身正常的生理代谢，而含有Na+/H+ 交换结构域（Pfam：PF00999）的一类离子转运蛋白NHX(Na+/H+反向转运载体)，则在离子转运及平衡过程中起了重要作用，其中NHX1属于NHX Ⅰ类，为Na+/H+逆向转运蛋白，有利于植物提高耐盐性。
因此，研究烟草NtNHX2基因不仅可明确NtNHX2在烟草中的功能，而且有助于理解烟草对非生物逆境胁迫的应答机制。
发明内容
针对上述问题，本发明提供一种烟草NtNHX2基因的克隆以及烟草NtNHX2基因在不同逆境下表达模式的分析方法。本发明科学合理，为NtNHX2的后续功能研究、探讨其响应非生物逆境胁迫机制奠定基础。具体技术方案如下：
一种烟草NtNHX2基因的克隆方法，其特征在于，包括以下步骤：
a. 依据GenBank收录的NtNHX2基因序列LOC107808863，用DNAMAN 软件设计出基因克隆引物：正向引物：NtNHX2-F：ATGGCGTCTGAGCTGGC；反向引物NtNHX2-R：TCATGGTTCCTGTTCCGTTG；
b. 利用Trizol试剂提取烟草幼苗总RNA，经cDNA合成试剂盒反转录为cDNA，以cDNA为模板，用引物NtNHX2-F/NtNHX2-R进行PCR扩增；
c. 使用DNA凝胶纯化回收试剂盒将目的片段纯化，将其与pMD19-T载体在16℃条件下连接过夜，连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态，然后将感受态细胞加入到含氨苄青霉素（Amp）的LB固体培养基上涂板，37℃过夜倒置培养;
d. 用牙签挑取少量菌落进行PCR检测，筛选出阳性克隆进行测序。
进一步地，对阳性克隆测序结果显示目的片段大小为1605bp。
进一步地，步骤b中所述的扩增反应程序为95℃预变性5min；95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，34个循环；最后72℃延伸8min。
进一步地，步骤b中所述的烟草幼苗由烤烟K326种子培育而得。
一种烟草NtNHX2基因在不同逆境下表达模式的分析方法，包括以下步骤：
①对烟草幼苗进行高盐、低钾处理：挑取长势一致的的烟草幼苗分别进行高盐、低钾处理，每种处理设五个组，各组对应的处理时间依次为0h、3h、6h、12h和24h，以0h处理为对照，每个处理时间分别设置3次生物学重复，进行整株取样冻存；
②对烟草幼苗进行干旱、4℃、ABA处理：挑取长势一致的的烟草幼苗分别进行干旱、4℃、ABA处理，每种处理设五个组，各组对应的处理时间依次为0h、3h、6h、12h和24h，以0h处理为对照，每个处理时间分别设置3次生物学重复，进行整株取样冻存；
③不同非生物逆境胁迫下对烟草NtNHX2基因的表达分析：根据NtNHX2基因序列LOC107808863，采用DNAMAN设计qRT-PCR引物：
正向引物：NtNHX2-qF：CACCGCAGAGGCAGTTAA；
反向引物：NtNHX2-qR：GTTGGCGCAGAAAGTAGC，分别采用经步骤①、步骤②处理所得烟草幼苗的18S rRNA为内参基因进行表达差异分析，基因相对表达量用2-ΔΔCt方法进行计算；3次重复，试验结果以测定的基因相对表达水平平均值表示。
本发明从烟草栽培品种K326 中克隆获得NtNHX2 基因，利用生物信息学对NtNHX2编码的蛋白进行相关分析，运用qRT-PCR 分析NtNHX2 在高盐、低钾、干旱、4℃、ABA 胁迫下的基因表达水平，为NtNHX2的功能研究、探讨其耐盐机制及基因利用提供理论依据。
附图说明
图1为NtNHX2基因PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳图，NtNHX2大小为1605bp； 图中M为Marker2000bp；1. 为NtNHX2基因扩增条带；
图2为ExPASy-ProtScale在线工具进行疏水性分析的结果图；
图3为NtNHX2基因的二级级结构预测图；
图4为NtNHX2基因的三级级结构预测图；
图5为NtNHX2基因的结构域分析图；
图6为NtNHX2基因的系统进化分析图
图7为 NtNHX2基因在不同组织中的相对表达分析图；
图8为NtNHX2在低钾和高盐处理下的相对表达量条形图；
图9为 NtNHX2在干旱、4℃、ABA处理下的相对表达量条形图。
具体实施方式
下面结合附图对本发明的原理和特征做进一步详细描述，所举实例只用于解释发明，并非用于限定本发明的范围。
本发明所用材料与设备有：采用的植物材料为烟草栽培品种K326 ( Nicotianatabacum cv．K326)，取自四川农业大学农学院； Trizol试剂、载体pMD19-T、Pfu高保真酶、cDNA合成试剂盒、SYBR Green Master mix、限制性内切酶、DNA Ligation Kit 2.0均购自TaKaRa公司、大肠杆菌感受态DH5α购自Vazyme Biotech公司、DNA凝胶纯化回收试剂盒购自天根公司。
一、试验材料处理：
首先挑选籽粒饱满、大小一致的烤烟K326种子，用75%的乙醇消毒1min，20%的次氯酸钠溶液消毒20min，最后用无菌水反复清洗5~6次，之后播种于MS固体培养基中，每个培养基中播种40粒，在5℃，16h/8h光暗周期的恒温光照培养箱中培养15d后，挑取长势一致的幼苗分别进行高盐、低钾、4℃、干旱、ABA处理，每种处理设五个组，各组对应的处理时间依次为0h、3h、6h、12h和24h，以0h处理为对照，每个处理时间分别设置3次生物学重复，进行整株取样冻存。对MS培养基进行ABA、干旱、高盐处理时，是在MS培养基中分别加入浓度为1μmol/L 的ABA、浓度为5%PEG6000、浓度为200mmol/L 的NaCl；低钾处理时是将待处理材料转移至低钾MS培养基中，低钾MS培养基是将MS培养基中的KH2PO4替换为NH4H2PO4，并去掉KNO3，其余成分相同。
二、烟草NtNHX2基因克隆，包括以下步骤：
a. 依据GenBank（美国国家生物技术信息中心）收录的NtNHX2基因序列LOC107808863，用DNAMAN 软件（美国 Lynnon Biosoft 公司开发的高度集成化的分子生物学综合应用软件）设计出基因克隆引物：正向引物：NtNHX2-F：ATGGCGTCTGAGCTGGC；反向引物NtNHX2-R：TCATGGTTCCTGTTCCGTTG；（如表 1所示）；
表 引物序列
b.利用Trizol试剂提取烟草幼苗总RNA，经cDNA合成试剂盒反转录为cDNA，以cDNA为模板，用引物NtNHX2-F/NtNHX2-R进行PCR扩增；扩增反应程序为95℃预变性5min；95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，34个循环；最后72℃延伸8min；PCR扩增产物的1%琼脂糖凝胶电泳结果显示在1500-2000bp的位置上有一条清晰的条带（如图1所示），条带单一，无弥散现象，长度大小与预期目标相符。
c. 使用DNA凝胶纯化回收试剂盒将目的片段纯化，将其与pMD19-T载体在16℃条件下连接过夜，连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态，然后将感受态细胞加入到含氨苄青霉素（Amp）的LB固体培养基上涂板，37℃过夜倒置培养;
d. 用牙签挑取少量菌落进行PCR检测，筛选出阳性克隆进行测序，对如图1所示清晰的条带进行测序，结果显示目的片段大小为1605bp。
步骤b中所述的烟草幼苗由烤烟K326种子培育而得。
二、烟草NtNHX2蛋白生物信息学分析
利用ExPASy-ProtParam tool（http://web.expasy.org/protparam/）对NtNHX2蛋白质进行理化性质分析；利用ExPASy-ProtScale（http://web.expasy.org/protscale）对蛋白进行亲疏水性分析；利用NCBI数据库中的SMART软件（http://smart.embl-heidelberg.de/）对其进行结构域分析；利用PSORT（http://psort.hgc.jp/form.html）软件在线预测NtNHX2的亚细胞定位；利用IBCP（http://npsa-pbil.ibcp.fr）的在线工具SOPMA，对NtNHX2的二级结构进行预测， SWISS-MODEL进行三级结构预测；利用MEGA7.0软件以邻近法构建系统进化树。
（1）NtNHX2蛋白的理化性质和疏水性分析
NtNHX2蛋白的理化性质分析结果显示：NtNHX2基因共编码534个氨基酸，其中亮氨酸Leu（12%）含量最高，其次为丝氨酸Ser（9.6%），而半胱氨酸Cys（0.9%）含量最低，带正电荷氨基酸（Arg + Lys）39个，带负电荷氨基酸（Asp + Glu）35个。NtNHX2蛋白质分子式为C2728H4255N675O733S24，组成原子总数为8415个，预测相对分子量为59.0kDa，理论等电点pI 为8.67，不稳定系数为38.04，说明其属于稳定碱性蛋白。该蛋白预测亲水性平均指数为0.553，用ExPASy-ProtScale在线工具进行疏水性分析结果如图 2所示，与其预测亲水性平均指数结果相一致，表明其为疏水性蛋白。
（2）烟草NtNHX2蛋白的二级、三级结构预测
利用SOPMA对烟草NtNHX2蛋白的二级结构进行预测，结果显示该蛋白中46.63%的氨基酸参与α-螺旋（Alpha helix），3.93%参与β-折叠（Beta turn），30.90%参与无规则卷曲（Random coil），18.54%参与延伸链（Extended strand），即该蛋白二级结构的最大元件为无规则卷曲（如图 3所示）。运用SWISS-MODEL对NtNHX2蛋白的三级结构预测，RasTop软件进行显示（如图 4所示），并将结果与二级结构预测进行对比，结果较为统一。
（3）烟草NtNHX2蛋白的结构域及亚细胞定位分析
利用推导出来的氨基酸序列，在NCBI数据库中的SMART软件进行NtNHX2编码蛋白氨基酸的结构域分析。结果如图 5所示NtNHX2编码蛋白含有Na+/H+交换结构域（Pfam：PF00999），位于第23-411位氨基酸，在第512~526位氨基酸上有一个低复杂度区域（lowcomplexity）。
利用PSORT软件在线预测NtNHX2蛋白的亚细胞定位，结果显示该蛋白在质膜上占0.800，在叶绿体类囊体膜上占0.653，在高尔基体上占0.400，在线粒体内膜上占0.339，预测NtNHX2蛋白可能定位在质膜上。
（4）烟草NtNHX2蛋白同源性分析。
把烟草NtNHX2基因编码的氨基酸序列在NCBI数据库中进行BLAST比对，按照相似程度高低选择20个基因编码的氨基酸序列（包括NtNHX2）运用MEGA7.0软件构建系统进化树，结果如图 6所示烟草NtNHX2与美花烟草（Nicotiana sylvestris）、野生烟草（Nicotiana attenuata）、柠檬辣椒（Capsicum baccatum）、辣椒(Capsicum annuum)等具有较高的氨基酸序列同源性，分别为98.70%、98.14%、92.01%、91.82%。
三、烟草NtNHX2基因的组织表达分析
以成熟期的烟草栽培品种K326根、茎、叶、花的cDNA为模板进行qRT-PCR检测，结果（如图 7所示）显示：NtNHX2在根、茎、叶、花中均有表达，表达量从高到低依次排序为叶>根>花>茎，说明NtNHX2主要在叶中表达。
四、烟草NtNHX2基因在不同逆境下表达模式的分析
一种烟草NtNHX2基因在不同逆境下表达模式的分析方法，包括以下步骤：
①对烟草幼苗进行高盐、低钾处理：挑取长势一致的的烟草幼苗分别进行高盐、低钾处理，每种处理设五个组，各组对应的处理时间依次为0h、3h、6h、12h和24h，以0h处理为对照，每个处理时间分别设置3次生物学重复，进行整株取样冻存；
②对烟草幼苗进行干旱、4℃、ABA处理：挑取长势一致的的烟草幼苗分别进行干旱、4℃、ABA处理，每种处理设五个组，各组对应的处理时间依次为0h、3h、6h、12h和24h，以0h处理为对照，每个处理时间分别设置3次生物学重复，进行整株取样冻存；
③不同非生物逆境胁迫下对烟草NtNHX2基因的表达分析：根据NtNHX2基因序列LOC107808863，采用DNAMAN设计qRT-PCR引物：
正向引物：NtNHX2-qF：CACCGCAGAGGCAGTTAA；
反向引物：NtNHX2-qR：GTTGGCGCAGAAAGTAGC，分别采用经步骤①、步骤②处理所得烟草幼苗的18S rRNA为内参基因进行表达差异分析，基因相对表达量用2-ΔΔCt方法进行计算；3次重复，试验结果以测定的基因相对表达水平平均值表示。
2-ΔΔCt方法如下：
首先，对所有的测试样和校准样本，用内参基因的CT 值归一目标基因的CT 值：
ΔCT(test) = CT(target, test) – CT(ref, test)
ΔCT(calibrator) = CT(target, calibrator) – CT(ref, calibrator)
其次，用校准样本的ΔCT 值归一试验样本的ΔCT 值：
ΔΔCT = ΔCT(test) – ΔCT(calibrator)
最后，计算表达水平比率：
2-ΔΔCt = 表达量的比值
（1）NtNHX2在高盐、低钾处理下的表达分析；
对低钾、高盐处理0h、3h、6h、12h、24h的烟草幼苗中NtNHX2表达量进行qRT-PCR检测，结果如图 8所示：NtNHX2高盐处理1-12h内表达量下降，12h时达到最低为对照（0h）的37.89%；随后表达量上升，但仍低于对照（0h）；NtNHX2低钾处理3h明显下降，为对照（0h）的21.42%，随后表达量上升，在处理24h时表达量降到最低，仅为对照（0h）的10.40%，说明在高盐和低钾胁迫下NtNHX2的表达受到明显抑制。
（2）NtNHX2在干旱、4℃、ABA处理下的表达分析
结果如图 9所示：干旱处理24h表达量上升达到最高，为对照（0h）的1.34倍；ABA处理下基因相对表达量持续上升，在24h达到最高，为对照（0h）的16.93倍，说明在干旱、ABA处理24h时，NtNHX2受干旱、ABA胁迫的诱导表达。4℃处理3h，表达量明显下降，为对照（0h）的22.97%，24h时表达量降到最低，为对照（0h）的9.36%，说明4℃胁迫下NtNHX2的表达明显受到抑制。
五、讨论
土壤盐碱化是目前世界上亟待解决的农业问题之一，极严重地影响了世界农业的正常发展，研究植物耐盐机理及耐盐作物品种的选育已经成为近年来植物研究领域亟需解决的重要问题。盐胁迫会导致植物细胞内Na+大量积累，影响细胞的pH值和渗透压，破坏离子平衡，使植物代谢紊乱，导致植物正常的发育和生长被破坏，此时植物体内的耐盐机制则会发生作用，即植物细胞会采用Na+的区室化、Na+的外排以及渗透调节等方式来降低体内Na+浓度，维持细胞内环境的稳定。研究表明，Na+ /H+逆向转运蛋白在耐盐调控中有着重要作用通过Na+的外排和Na+的区隔化来保持细胞内低Na+水平具有调节细胞质内pH值和Na+浓度功能，是抗旱耐盐的关键因子。
组织表达分析结果表明，烟草NtNHX2基因的表达具有组织特异性，与烟草NtNHX2-3基因表达模式较为一致，烟草NtNHX2基因与烟草NtNHX2-3基因在叶中表达量均最高，两者差别在于烟草NtNHX2基因在茎中表达最低，烟草NtNHX2-3基因则是根中最低；桑树MnNHX1基因的表达在不同的组织中均有表达，但表达不存在显著性差异，新疆无苞芥OpNHX1基因在茎中的表达量最高，叶中的表达量最低，且不具有明显的组织特异性。这表明尽管NHX1同源基因序列较为保守，但是NhaP2超级家族中不同成员的组织表达模式存在差异，不同物种间NHX1同源基因的功能也存在差异，并发挥着特定的作用。
植物遭受外界逆境胁迫会引起体内代谢水平的变化，ABA、H2O2、乙烯等一些信号分子会显著积累，这些信号分子通过参与多种信号转导途径的交互作用，形成复杂的信号网络调控植物对逆境胁迫的应答，在植物应对生物和非生物逆境胁迫的适应性过程中发挥着至关重要的作用。qRT-PCR分析结果表明：ABA信号分子处理后烟草NtNHX2基因的表达受到显著诱导，与互花米草SaNHX1基因在ABA处理后的表达模式相类似。非生物逆境胁迫下，烟草NtNHX2基因的转录水平均出现变化，该基因的表达在高盐、低钾和4℃的逆境胁迫下受到抑制，在干旱逆境胁迫下的表达受到诱导。因此，猜测烟草NtNHX2基因参与烟草抵御干旱、高盐、4℃及低钾非生物胁迫刺激的应答反应，调控着相关信号分子的转导途径。
研究烟草NtNHX2基因将有助于理解烟草对逆境胁迫的应答机制。在随后的研究工作中，将利用CRISPR/Cas9基因敲除技术构建转基因株系，通过分析转因株系应对非生物胁迫的表型，并测定相关的生理指标和检测Marker基因的表达，对其进行转基因功能验证。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (5)
1.一种烟草NtNHX2基因的克隆方法，其特征在于，包括以下步骤：
a. 依据GenBank收录的NtNHX2基因序列LOC107808863，用DNAMAN 软件设计出基因克隆引物：正向引物：NtNHX2-F：ATGGCGTCTGAGCTGGC；反向引物NtNHX2-R：TCATGGTTCCTGTTCCGTTG；
b. 利用Trizol试剂提取烟草幼苗总RNA，经cDNA合成试剂盒反转录为cDNA，以cDNA为模板，用引物NtNHX2-F/NtNHX2-R进行PCR扩增；
c. 使用DNA凝胶纯化回收试剂盒将目的片段纯化，将其与pMD19-T载体在16℃条件下连接过夜，连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态，然后将感受态细胞加入到含氨苄青霉素（Amp）的LB固体培养基上涂板，37℃过夜倒置培养;
d. 用牙签挑取少量菌落进行PCR检测，筛选出阳性克隆进行测序。
2.根据权利要求1所述烟草NtNHX2基因的克隆方法，其特征在于：对阳性克隆测序结果显示目的片段大小为1605bp。
3.根据权利要求1所述烟草NtNHX2基因的克隆方法，其特征在于：步骤b中所述的扩增反应程序为95℃预变性5min；95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，34个循环；最后72℃延伸8min。
4.根据权利要求1至3中任意一项所述烟草NtNHX2基因的克隆方法，其特征在于：步骤b中所述的烟草幼苗由烤烟K326种子培育而得。
5.一种如权利要求1所述烟草NtNHX2基因在不同逆境下表达模式的分析方法，其特征在于，包括以下步骤：
①对烟草幼苗进行高盐、低钾处理：挑取长势一致的的烟草幼苗分别进行高盐、低钾处理，每种处理设五个组，各组对应的处理时间依次为0h、3h、6h、12h和24h，以0h处理为对照，每个处理时间分别设置3次生物学重复，进行整株取样冻存；
②对烟草幼苗进行干旱、4℃、ABA处理：挑取长势一致的的烟草幼苗分别进行干旱、4℃、ABA处理，每种处理设五个组，各组对应的处理时间依次为0h、3h、6h、12h和24h，以0h处理为对照，每个处理时间分别设置3次生物学重复，进行整株取样冻存；
③不同非生物逆境胁迫下对烟草NtNHX2基因的表达分析：根据NtNHX2基因序列LOC107808863，采用DNAMAN设计qRT-PCR引物：
正向引物：NtNHX2-qF：CACCGCAGAGGCAGTTAA；
反向引物：NtNHX2-qR：GTTGGCGCAGAAAGTAGC，分别采用经步骤①、步骤②处理所得烟草幼苗的18S rRNA为内参基因进行表达差异分析，基因相对表达量用2-ΔΔCt方法进行计算；3次重复，试验结果以测定的基因相对表达水平平均值表示。
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|---|---|---|---|---|
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Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN108893475A (zh) * | 2018-07-18 | 2018-11-27 | 四川农业大学 | 烟草14-3-3蛋白、编码基因及其在烟草低钾反应中的应用 |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN108893475A (zh) * | 2018-07-18 | 2018-11-27 | 四川农业大学 | 烟草14-3-3蛋白、编码基因及其在烟草低钾反应中的应用 |
| CN109337918A (zh) * | 2018-11-13 | 2019-02-15 | 云南省烟草农业科学研究院 | 一种烟草蛋白激酶基因NtCIPK1及其克隆方法与应用 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| 张雪薇等: "烟草NtCBL1基因的克隆、表达载体构建及表达分析", 《植物研究》 * |
| 罗银等: "烟草NtNHX2基因的克隆及不同逆境下表达模式分析", 《分子植物育种》 * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN108753795A (zh) * | 2018-06-28 | 2018-11-06 | 云南省烟草农业科学研究院 | 一种提高烟草叶片钾含量的基因NtNHX1-3及其克隆方法与应用 |
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