CN113293169A - 一种芍药PlMYB108基因及其在植物抗旱中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了芍药PlMYB108基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。本发明还公开了扩增所述的芍药PlMYB108基因的引物，本发明还公开了所述的芍药PlMYB108基因编码的蛋白、表达盒、重组载体或细胞，本发明还公开了重组表达载体的构建方法以及芍药PlMYB108基因、所述的蛋白、所述的表达盒、重组载体或细胞在植物抗旱中的应用。本发明首次从干旱胁迫下芍药叶片中克隆得到1个PlMYB108基因cDNA全长序列，并确定了该基因的氨基酸序列，另外将PlMYB108基因的超表达载体转化到植物中，超表达该基因的植株具有显著增强的耐干旱能力。

Description

一种芍药PlMYB108基因及其在植物抗旱中的应用

技术领域

本发明属于植物生物技术领域，具体涉及一种芍药PlMYB108基因及其在植物抗旱中的应用。

背景技术

芍药(Paeonia lactiflora Pall.)属芍药科芍药属的多年生宿根草本花卉，素有“花相”的美誉。作为传统名花，芍药在我国栽培历史悠久，分布也十分广泛。芍药在我国北方地区栽培较多，而北方地区多为干旱或半干旱地区，气候总体表现为春季干燥、降水少，夏季炎热、干旱少雨，干旱胁迫已成为影响北方地区芍药栽培的主要逆境因子之一，而系统研究芍药对干旱胁迫的分子响应，筛选和克隆与芍药抗旱性密切相关的基因，探究其分子机制，对于培育芍药耐干旱品种和芍药在北方干旱半干旱地区的推广种植意义重大。

MYB作为植物中最大的转录因子家族之一，不仅与花青苷调控、次生壁形成、木质素合成和参与信号转导等功能有关，还在植物的逆境胁迫中发挥着重要作用(郭凯，侯留迪，张莹莹，等.植物MYB基因家族研究进展.长江大学学报(自然科学版)，2020，17(6)：93-98)。根据MYB结构域重复的数量和类型，可以将其分为1R-、R2R3-、3R-和4R-四类，其中R2R3-MYB蛋白是MYB转录因子家族中最大的一类，对植物具有特异性，参与调节了植物对非生物胁迫的反应(Jin H，Martin C.Multifunctionality and diversity within theplant MYB-gene family.Plant Mol Biol.1999，41：577-585)。前人仅发现拟南芥AtMYB12和AtMYB75(Nakabayashi R，Yonekura-Sakakibara K，Urano K，et al.Enhancement ofoxidative and drought tolerance in Arabidopsis by overaccumulation ofantioxidant flavonoids.Plant Journal.2014，77：367-739)、拟南芥AtMYB60(Oh JE，Kwon Y，Hyeok J，et al.A dual role for MYB60 in stomatal regulation and rootgrowth of Arabidopsis thaliana under drought stress.Plant Molecular Biology，2011，77：91-103)、菊花CmMYB2(Hong S，Chen S，Jiang J，et al.Heterologousexpression of the chrysanthemum R2R3-MYB transcription factor CmMYB2 enhancesdrought and salinity tolerance，increases hypersensitivity to ABA and delaysflowering in Arabidopsis thaliana.Molecular Biotechnology，2012，51：160-173)、小麦TaMYB33(Qin Y，Wang M，Tian Y，et al.Over-expression of TaMYB33 encoding anovel wheat MYB transcription factor increases salt and drought tolerance inArabidopsis.Molecular Biology Reports，2012，39：7183-7192)、苹果MdMYB88/124(耿达立.苹果砧木根系抗旱基因的发掘与MdMYB88/124功能鉴定[D].西北农林科技大学，2019)能够提高植物的耐干旱功能。

芍药的遗传背景比较薄弱，还没有基因组方面的报道，而关于芍药PlMYB108基因也一直未见报道。在其他植物上，MYB108目前也仅在黄瓜和月季等极少数植物中有研究。在黄瓜上，基于超亲优势的黄瓜杂交种C15-114筛选出与父母本有差异的黄瓜CsMYB108基因，并对其进行基因克隆和蛋白生物信息学分析，但未对其功能展开研究(张文烁，王新国，宋林等.黄瓜CsMYB108基因的克隆与序列分析.分子植物育种，2020，18(14)：4555-4561)；在月季上，克隆了月季RhMYB108基因并在烟草中超表达和病毒诱导基因沉默，发现该基因可减缓乙烯和茉莉酸对月季花朵衰老的促进作用(Zhang S，Zhao QC，Zeng DX，etal.RhMYB108，an R2R3-MYB transcription factor，is involved in ethylene-and JA-induced petal senescence in rose plants.Horticulture Research，2019，6：131)；但有关MYB108基因在抗旱性功能方面的研究一直未见报道。然而，对芍药PlMYB108基因的深入研究不仅可以丰富该物种的生物信息学资源，拓展芍药分子生物学研究领域，还可以为今后采用基因工程手段调控芍药耐干旱能力奠定理论基础。

发明内容

发明目的：本发明首次从干旱胁迫下芍药叶片中克隆得到1个PlMYB108基因cDNA全长序列，并确定了该基因的氨基酸序列，另外将PlMYB108基因的超表达载体转化到植物中，超表达该基因的植株具有显著增强的耐干旱能力。本发明所要解决的技术问题是提供具有耐干旱功能的芍药PlMYB108基因cDNA全长序列。

本发明还要解决的技术问题是提供了扩增所述的芍药PlMYB108基因的引物。

本发明还要解决的技术问题是提供了所述的芍药PlMYB108基因编码的蛋白。

本发明还要解决的技术问题是提供了表达盒、重组载体或细胞。

本发明还要解决的技术问题是提供了重组表达载体的构建方法。

本发明还要解决的技术问题是提供了所述的芍药PlMYB108基因、所述的蛋白、所述的表达盒、重组载体或细胞在植物抗旱中的应用。

本发明还要解决的技术问题是提供了获得抗旱植物的方法。

本发明最后要解决的技术问题是鉴定所述的方法获得的植物的方法。

技术方案：为了解决上述技术问题，本发明提供了芍药PlMYB108基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。

芍药PlMYB108基因cDNA全长序列(SEQ ID NO.6)如下：

CTAATACGACTCACTATAGGGCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACATGGGGAAGAATTAATCCAATTCTCTCTCTCTCTCTCTCTTTAGAAAACTCTGTATATCGATCATCAAACCCTTTTCATTTCAATCAATCAGTCTGTCCAATTACGGGAATGGATGTTAATGGGAGAGGATCGTCATCAAGCAACTCCACCCCCACTCAAAGTGAAGAAGATCAGATGGATTTGAGAAGGGGTCCATGGACTGTTGAAGAAGACCTCACCCTCATGAATTACATTGCCAACAACGGTGAAGGTCGCTGGAATTCTCTTGCCCGTTGTGCCGGTCTAAAACGAACTGGAAAGAGCTGCAGATTAAGATGGCTGAACTATTTACGTCCAGATGTTCGTCGTGGAAACATTACCCTTGAAGAGCAGCTTCTGATTCTTGAGCTTCATTCTCGCTGGGGAAATCGGTGGTCGAAAATAGCCCAGCACTTGCCTGGAAGAACAGATAACGAGATCAAAAACTATTGGAGAACACGAGTTCAAAAGCATGCCAAACAGCTCAAATGTGACGTGAACAGCAAGCAATTCAAGGACACCATGCGTTATTTATGGATGCCAAGGTTGGTAGAGAGAATTCAAGCCGCCTCTAATGTTGTTGGAGCTTCTTCATCCTCCACCGTCTTACCACCAACGGCAATCTCCGGCGACTTTGCCGGCGTGCATGTGAATTCAACTAGTTGCATTCCCGAGAATTCTAGCACGGGAGTTTCTTCTGACTCATTTGGGACCAGTCAAGTTTCTCCGCTATCTGACCTCGCCGAAAATAATTACAATTTCCCACTTAATTGTCATCCGGATAATTATTTCCAAGGCGGTCAAGCTGGTTACTCAGATACGCTAATCAGCCCATCTGGTTATTACAATCCTGCCATGGATTTTCAAGCTATGGAATATCAAAACAATAACCAGTATATATCCGACAATTTGTGGAATGTTGAAGACAATTGGTTCTTACAACAACAGTTCTCCAGCAATATTTAAGACGGTTCCAGGTAGCGTGTACGATAATTAGGATGACGGGTTATGTAGGGTTACTCCATCGTTATCTGAAGATTATGATTTCGAACAAGACTGCGTACAGCGATCCTGAGGTAGCCATTTTATGTATGATAATTTAGGTTATACCGGACAGAATTTGTGAAGAAAAGACAGGTTTTTACAGTTGTATGGATTGTATTTCGTTTGTGTACTTTTTATTTGTTTGGGTGGGGAGAAAATTTGTAATTTGAGATTGTTTTAATCTCATTCTTGGAAAAAAAAAAA

作为优选，本发明内容还包括扩增所述的芍药PlMYB108基因的引物，所述引物包括SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.9所示中的一种或几种。

作为优选，为了首次从芍药中克隆得到PlMYB108基因的cDNA全长序列，本发明采用RACE技术获得了1条cDNA全长序列，并在此基础上推测得到其相关的氨基酸序列。所述方法的3′-RACE引物：5′-AACAACGGTGAAGGTCGC-3′(SEQ ID NO.1)和5′-TTCAAGCCGCCTCTAATG-3′(SEQ ID NO.2)；所述方法的5′-RACE引物：5′-CGAGGTCAGATAGCGGAGAAACTTGACTGG-3′(SEQ ID NO.3)。该cDNA全长序列为1314bp，开放阅读框为876bp，共编码291个氨基酸。

作为优选，构建pBWA(V)HS-PlMYB108-GLosgfp超表达载体，将构建好的质粒转化到农杆菌EHA105中，利用叶盘法侵染烟草，经过培养，获得了转入PlMYB108基因的烟草，通过自然干旱胁迫进行比较，转入PlMYB108基因的烟草显著较野生型烟草耐干旱能力强，表明芍药PlMYB108基因具有调控耐干旱的功能。

其中，所述构建的超表达载体方法的引物F：5′-CAGTGGTCTCACAACATGGATGTTAATGGGAGAGG-3′(SEQ ID NO.4)和R：5′-CAGTGGTCTCATACAAATATTGCTGGAGAACTGTT-3′(SEQ IDNO.5)。

本发明内容还包括所述的芍药PlMYB108基因编码的蛋白，其氨基酸序列如SEQ IDNO.7所示。

芍药PlMYB108基因cDNA全长序列的氨基酸序列(SEQ ID NO.7)如下：

MDVNGRGSSSSNSTPTQSEEDQMDLRRGPWTVEEDLTLMNYIANNGEGRWNSLARCAGLKRTGKSCRLRWLNYLRPDVRRGNITLEEQLLILELHSRWGNRWSKIAQHLPGRTDNEIKNYWRTRVQKHAKQLKCDVNSKQFKDTMRYLWMPRLVERIQAASNVVGASSSSTVLPPTAISGDFAGVHVNSTSCIPENSSTGVSSDSFGTSQVSPLSDLAENNYNFPLNCHPDNYFQGGQAGYSDTLISPSGYYNPAMDFQAMEYQNNNQYISDNLWNVEDNWFLQQQFSSNI

本发明内容还包括表达盒、重组载体或细胞，其含有所述的芍药PlMYB108基因。

其中，所述的重组载体为超表达载体pBWA(V)HS-Glosgfp。

本发明内容还包括所述的重组表达载体的构建方法，将芍药PlMYB108基因与超表达载体pBWA(V)HS-Glosg印连接并转化即得。

本发明内容还包括所述的芍药PlMYB108基因、所述的蛋白、所述的表达盒、重组载体或细胞在植物抗旱中的应用。

本发明内容还包括获得抗旱植物的方法，包括如下步骤：

1)使植物包含所述的芍药PlMYB108基因；

2)使植物表达所述的蛋白。

本发明内容还包括鉴定所述的方法获得的植物的方法，包括以下步骤：

1)鉴定所述植物是否包含所述的芍药PlMYB108基因；

2)鉴定所述植物是否表达所述的蛋白。

其中，所述鉴定方法中的引物序列如SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5；SEQ ID NO.12和SEQ ID NO.13所示。

有益效果：本发明首次从干旱胁迫下芍药叶片中克隆得到1个PlMYB108基因cDNA全长序列，并确定了该基因的氨基酸序列，另外将PlMYB108基因的超表达载体转化到植物中，超表达该基因的植株具有显著增强的耐干旱能力。

附图说明

图1、芍药PlMYB108基因cDNA全长的RACE结果检测；其中，M：DL2000 marker；1：3′-RACE扩增产物；2：5′-RACE扩增产物；

图2、转基因植株的PCR鉴定；其中，A：NtActin扩增胶图；B：PlPM19L基因扩增胶图；M：DL 2000Maker；1：野生型烟草；2-4：转基因烟草；

图3、转基因植株的qRT-PCR鉴定；

图4、10天自然干旱胁迫后烟草植株的表型；其中，野生型烟草叶片萎蔫、下垂；转入PlMYB108基因的烟草保持正常生长状态；

图5：10天自然干旱胁迫后烟草植株的叶片相对含水量；其中，不同字母表示差异显著，采用Duncan多重极差检验(P＜0.05)，下同；

图6、10天自然干旱胁迫后烟草植株H₂O₂积累量的DAB染色法观测；

图7、10天自然干旱胁迫后烟草植株的保护酶活性；

图8、10天自然干旱胁迫后烟草植株的光合特性；

图9、10天自然干旱胁迫后烟草植株的叶绿素荧光参数；

图10、10天自然干旱胁迫后烟草植株的类黄酮含量。

具体实施方式

在下面的具体实施例中进一步说明了本发明，这并不限制本发明的范围。

实施例1芍药PlMYB108基因cDNA全长序列的克隆

PlMYB108基因3′端cDNA序列的获得：选用5年生芍药‘大富贵’盆栽苗(壤土∶泥炭∶粗砂＝1∶1∶1)为材料进行自然干旱胁迫处理，以干旱胁迫处理21天后的芍药叶片为材料，采用MiniBEST Plant RNA Extraction Kit(TaKaRa)试剂盒提取总RNA。采用3′full RACECore Set Ver.2.0(TaKaRa)反转录生产cDNA的第一条链，反转录体系为：1μL RNA、1μL 3′-RACE Adaptor、1μL dNTP Mixture(10mM each)、2μL 5×M-MLV Buffer、0.25μL RNaseInhibitor、0.25μL Reverse Transcriptase M-MLV(RNase H^-)、4.5μL RNase Free ddH₂O；反转录程序：42℃反应60min，70℃延伸15min。在此基础之上，3′-RACE扩增由两轮PCR完成。第一轮PCR扩增体系为：2μL cDNA、8μL 1×cDNA Dilution Buffer II、2μL 3′-RACE OuterPrimer、2μL Gene specific Outer Primer(10μM)(5′-AACAACGGTGAAGGTCGC-3′(SEQ IDNO.1))、5μL 10×LA PCR Buffer II(Mg⁺Plus)、0.5μL LA DNA pdymerase(5U/μL)、30.5μLRNase Free ddH₂O。反应条件为：94℃预变性3min；94℃变性30s，52℃退火30s，72℃延伸60s，循环20次；72℃延伸10min。第二轮PCR扩增体系为：1μL第一轮PCR扩增产物、8μL dNTPMixture(2.5mM each)、2μL 3′-RACE Inner Primer、2μL Gene Specific Inner Primer(5′-TTCAAGCCGCCTCTAATG-3′(SEQ ID NO.2))、5μL 10×LA PCR Buffer II(Mg⁺Plus)、0.5μL LA DNA pdymerase(5U/μL)、31.5μL RNase Free ddH₂O。反应条件为：94℃预变性3min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸60s，循环30次；72℃延伸10min。将产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，结果见图1。

PlMYB108基因5′端cDNA序列的获得：采用SMARTer^TM RACE cDNA AmplificationKit User Manual(Clontech)反转录生产cDNA的第一条链，反转录反应分为三步，体系一：1μL RNA、1μL5′-RACE CDS Ptimer A、9μL Deionized H₂O。反应程序为：72℃反应3min后42℃反应2min。体系二：11μL体系一的反应液、4μL5×Frist-stand Buffer、0.5μLDithiothreitol(100mM)、1μL dNTP Mixture(20mM each)、0.5μL RNase Inhibitor、2μLSMAR Tscribe Reverse Transcriptase、1μL SMARTER IIA Oligonudeatide。反应程序为：42℃反应90min后，70℃反应10min。体系三：20μL体系二的反应液、50μL Tricine-EDTABuffer。反应程序为：25℃条件下静置15min，稀释cDNA。在此基础之上，5′-RACE进行PCR扩增，反应体系为：2.5μL 5′cDNA、25μL 2×SeqAmp Buffer、1μL SeqAmp DNA Polymerase、5μL 10×UPM、1μL 5′Gene Specific Primer(5′-CGAGGTCAGATAGCGGAGAAACTTGACTGG-3′(SEQID NO.3))、15.5μL RNase Free ddH₂O。反应条件为：94℃反应30s、72℃反应3min，循环5次；94℃反应30s、70℃反应30s、72℃反应3min，循环5次；94℃反应30s、68℃退火30s、72℃延伸3min，循环25次。将产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，结果见图1。

实施例2芍药超表达载体pBWA(V)HS-PlMYB108-GLosgfp在烟草中的表达

芍药PlMYB108超表达载体pBWA(V)HS-PlMYB108-GLosgfp构建：将已获得的PlMYB108基因全长序列送武汉伯远生物科技有限公司进行全基因合成，并获得cDNA模板，再进行PCR扩增，体系为：4μL Mg²⁺、2μL dNTP Mixture(2.5mM each)、1μL cDNA模板、2μLPlMYB108-Forward Primer(5′-CAGTGGTCTCACAACATGGATGTTAATGGGAGAGG-3′(SEQ IDNO.4))、2μL PlMYB108-Reverse Primer(5′-CAGTGGTCTCATACAAATATTGCTGGAGAACTGTT-3′(SEQ ID NO.5))、5μL 10×LA PCR Buffer II、0.5μL TaKaRa LA Taq(5U/uL)和33.5μLddH₂O。扩增程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，50℃退火45s，72℃延伸52s，循环30次；72℃延伸10min，16℃30min。将目的片段切下，进行胶回收，检测无误后与载体进行连接。用BsaI对载体pBWA(V)HS-GLosgfp(武汉伯远生物科技有限公司购买)和扩增的片段PlMYB108进行酶切。载体酶切体系为：2μL Buffer II、1μL BsaI、4μL pBWA(V)HS-GLosgfp和13μLddH₂O。扩增片段酶切体系为：2μL Buffer II、1μL BsaI、4μL PCR产物和13μL ddH₂O。以上体系放入37℃恒温水浴锅中反应1h。对酶切的产物进行胶回收，洗脱后备用。再将目的片段与表达载体进行连接、转化，连接体系为：1μL10×T4 DNA ligase Buffer、1μL T4 DNAligase(350U/μL)、2μL酶切载体、1μL酶切目的片段和5μL ddH₂O，然后16℃水浴2h即可。取10μL重组产物加入到200μL预冷的DH5α感受态中，42℃热击90s，冰上静置2min，加入9mL无抗生素的LB液体培养基，37℃下100rpm培养1h，铺板后放入恒温培养箱，37℃倒置培养18h。挑取培养基上的单菌株放入3mL LB液体培养基(50mg/L Kan)中，37℃下200rpm过夜培养后进行菌液PCR验证。PCR验证体系：2.5μL 10×PCR Buffer II(Mg²⁺)、2μL dNTP Mixture(2.5mM each)、2μL质粒DNA、1.25μL Forward Primer(5′-GGAGAGAACACGGGGGAC-3′(SEQ IDNO.8))、1.25μL Reverse Primer(5′-AGCTGGTCAGTCTTCGGG-3′(SEQ ID NO.9))、0.25μL LATaq DNA聚合酶(5U/μL)、15.75μL ddH₂O。反应程序：94℃预变性3min；94℃变性30s，52℃退火30s，72℃延伸1min，循环32次；72℃延伸10min。进行10个25μL体系的PCR反应，目标条带为534bp左右的片段。选取1-3个阳性条带，取对应菌液100μL送样测序，再取400μL菌液接种到含有5-10mL(Kana)抗性LB中，试管摇菌，待测序结果出来后，将测序正确的菌液进行质粒提取。将提取的质粒进行Ecor V酶切验证，体系为：1μL Buffer、3μL质粒DNA、0.5μL Ecor V(15U/μL)和5.5μL ddH₂O，37℃反应2h，直至芍药PlMYB108超表达载体pBWA(V)HS-PlMYB108-GLosgfp构建成功。

芍药PlMYB108超表达载体pBWA(V)HS-PlMYB108-GLosgfp转化烟草：将100mL由Kana 50mg/L和Rif 50mg/L配制的YEB固体培养基分装至5个培养皿中，之后在培养基上用接种环蘸取农杆菌菌液分区划线，暗培养3-4d；挑取培养基上长出的单菌落并放入YEB液体培养基中，28℃200rpm过夜培养后取2mL菌液加入50mL YEB液体培养基中，之后继续在28℃200rpm的条件下培养OD₆₀₀为0.3-0.4；③将摇好的菌液分次倒入50mL的离心管中，25℃5,000rpm离心10min后去上清；向灭好菌的小三角瓶中加入5mL MS₀液体培养基(不加蔗糖和琼脂，不调pH)和400μL AS(20mg/mL)，用枪打匀后加MS₀液体培养基定容至50mL备用；再取一个灭过菌的小三角瓶，在其中加入50mL MS₀备用；将纱布和烧杯灭菌，然后用橡皮筋将纱布绑紧覆盖在烧杯口备用；将无菌烟草苗(由武汉伯远生物科技有限公司提供)的叶片切成1cm×1cm若干小块，放入加了MS₀的小三角瓶中，之后将其倒入纱布覆盖的烧杯中，再把叶片过滤出来后放到之前加了MS₀和AS的小三角瓶中不断摇晃侵染8min；倒去菌液后取出叶片，用无菌滤纸将叶片表面菌液吸干，接在由MS₀、0.1mg/LNAA、3.0mg/L 6-BA、6.66％琼脂和30g/L蔗糖配制的共培养的培养基中暗培养3d左右；共培养结束后，转入到由MS₀、0.1mg/LNAA、3.0mg/L 6-BA、30g/L蔗糖、6.66％琼脂、25mg/L Hyg和100mg/L Cb配制的抗性芽筛选分化培养基中，每两周继代一次，直至分化出芽；在分生不定芽长到高于2cm时，用刀切下，转接到由1/2MS、50mg/L Cb、3.0mg/L IBA、8mg/L Hyg、6.66％琼脂和30g/L蔗糖配制的生根筛选培养基中进行生根筛选。

转PlMYB108基因烟草植株鉴定：

(1)PCR鉴定：采用MightyAmp^TM DNA Polymerase Ver.3(TaKaRa)试剂盒提取烟草叶片DNA。在此基础之上，以烟草NtActin(AB158612)基因为内参(Forward Primer：5′-TCCTCATGCAATTCTTCG-3′(SEQ ID NO.10)、Reverse Primer：5′-ACCTGCCCATCTGGTAAC-3′(SEQ ID NO.11))，同时设计PlMYB108基因的特异性引物(Forward Primer：5′-CAGTGGTCTCACAACATGGATGTTAATGGGAGAGG-3′(SEQ ID NO.4)、Reverse Primer：5′-CAGTGGTCTCATACAAATATTGCTGGAGAACTGTT-3′(SEQ ID NO.5))进行PCR扩增。反应体系：12.5μL2×Taq MasterMix、1μL Forward Primer、1μL Reverse Primer、2μL DNA模板、8.5μL ddH₂O。反应程序：95℃预变性3min；95℃变性15s，52℃退火15s，72℃延伸90s，共35个循环；72℃延伸5min。反应结束后将PCR反应液进行凝胶电泳检测。从图2可以看出，野生型烟草和转PlMYB108基因烟草中均检测到单一而明亮的NtActin条带，而就扩增PlMYB108条带而言，仅在转PlMYB108基因烟草中检测到单一、明亮、清晰的条带，在野生型烟草中未检测到。

(2)qRT-PCR鉴定：采用MiniBEST Plant RNA Extraction Kit(TaKaRa)试剂盒提取总RNA，反转录获得的cDNA用

Premix Ex Taq^TM(Peffect Real Time)试剂盒进行qRT-PCR测定，在此基础之上，以烟草NtActin(AB158612)基因为内参(Forward Primer：5′-TCCTCATGCAATTCTTCG-3′(SEQ ID NO.10)、Reverse Primer：5′-ACCTGCCCATCTGGTAAC-3′(SEQ ID NO.11))，同时设计PlMYB108基因的特异性引物(Forward Primer：5′-AGAAGAAACTCCCGTGCTA-3′(SEQ ID NO.12)、Reverse Primer：5′-GCGTTATTTATGGATGCC-3′(SEQ ID NO.13))。反应体系：2μL cDNA、12.5μL SYBRPremix Ex TaqTM (2×)、1μLForward Primer、1μL Reverse Primer、8.5μL ddH₂O。反应程序：95℃预变性3min；95℃变性5s，55℃退火30s，72℃延伸30s，共40个循环；72℃延伸10min。反应结束后采用2^-ΔΔCt方法进行基因相对表达水平的分析。qRT-PCR鉴定结果表明，PlMYB108在转基因烟草中具有显著较高的表达水平(图3)。

这些结果均表明，构建的超表达载体pBWA(V)HS-PlMYB108-GLosgfp已成功导入模式烟草植株中。

转PlMYB108基因烟草耐干旱能力鉴定：将烟草植株置于22℃、10h光照条件下进行自然干旱胁迫，10天后可以观察到野生型烟草叶片出现萎蔫、下垂等症状，而转PlMYB108基因烟草仍然保持正常的生长状态。表明转PlMYB108基因烟草具有较强的耐干旱能力，结果见图4。

实施例3干旱胁迫下烟草植株的叶片相对含水量测定

将用天平(BSA224S，德国Sartorius公司)称取的适量新鲜叶片重量记为鲜重(FW)，在105℃烘箱中处理5min，再将温度调至65℃后处理2h以上，之后称量烘干恒重的样品并记为干重(DW)，按以下公式计算叶片相对含水量：叶片相对含水量(％)＝(FW-DW)/FW×100％。从图5可以看出，与野生型烟草相比，转PlMYB108基因烟草具有显著较高的叶片相对含水量。

实施例4干旱胁迫下烟草植株的H₂O₂积累量测定

用50mM Tris-acetate缓冲液配制pH为5.0、浓度为0.1mg/mL的二氨基联苯胺(DAB)染色液。将新鲜叶片充分浸泡在染色液中，黑暗下处理24h后取出叶片，将叶片放入体积浓度95％的酒精中进行沸水浴，15min后观察、拍照，用以观察研究H₂O₂的积累量。从图6可以看出，与野生型烟草相比，转PlMYB108基因烟草叶片颜色较浅，表明其具有较低的H₂O₂积累量。

实施例5干旱胁迫下烟草植株的保护酶活性测定

干旱胁迫下烟草植株的保护酶活性测定：

(1)SOD活性测定参照SOD试剂盒(苏州科铭生物技术有限公司)说明书，具体操作步骤如下：①称取0.1g样品于研钵中，向其中加入1mL提取液冰浴研磨至匀浆，8,000rpm，4℃离心10min，取上清液置于冰上待测；②紫外分光光度计预热30min以上，用蒸馏水调零。将试剂盒中的各试剂按要求处理后与相应量的上清液加入充分混匀后室温静置30min。③于1mL比色皿中加入以上混合液，于波长560nm处测定各管吸光值，分别记为A对照管和A测定管；④计算公式：抑制百分率(P)＝(A对照管-A测定管)/A对照管×100％，SOD活性(U/gFW)＝114×P/(1-P)。

(2)POD活性测定参照POD试剂盒(苏州科铭生物技术有限公司)说明书，具体操作步骤如下：①称取0.1g样品于研钵中，向其中加入1mL提取液冰浴研磨至匀浆，8,000rpm，4℃离心10min，取上清液置于冰上待测；②紫外分光光度计预热30min以上，用蒸馏水调零。根据试剂盒要求配置工作液，充分混匀后25℃预热30min。③于1mL比色皿中加入50μL上清液和950μL工作液，混匀，记录470nm下1min时吸光值A1和2min后的吸光值A2；④计算公式：ΔA＝A2-A1，POD活性(U/g FW)＝20000×ΔA。

(3)CAT活性测定参照CAT试剂盒(苏州科铭生物技术有限公司)说明书，具体操作步骤如下：①称取0.1g样品于研钵中，向其中加入1mL提取液冰浴研磨至匀浆，8,000rpm，4℃离心10min，取上清液置于冰上待测；②紫外分光光度计预热30min以上，用蒸馏水调零。将试剂盒中的各试剂按要求处理后与相应量的上清液加入充分混匀；③于1mL比色皿中加入以上混合液，于波长405nm处测定各管吸光值，分别记为A空白管和A测定管；④计算公式：ΔA＝A空白管-A测定管，CAT活性(μmol/min/g FW)＝2222.2×(ΔA-0.0013)。

(4)APX活性测定参照APX测定试剂盒(苏州科铭生物技术有限公司)说明书，具体操作步骤如下：①称取0.1g样品于研钵中，向其中加入1mL提取液冰浴研磨至匀浆，8,000rpm，4℃离心20min，取上清液置于冰上待测；②紫外分光光度计预热30min以上，蒸馏水调零。将试剂盒中的各试剂按要求处理后与相应量的上清液加入充分混匀；③于1mL比色皿中加入以上混合液，于波长290nm处分别测定10s和130s的吸光值，并分别记为A1和A2；④计算公式：ΔA＝A1-A2，APX活性(μmol/min/g FW)＝17.9×ΔA。从图7可以看出，与野生型烟草相比，转PlMYB108基因烟草具有较高的保护酶活性，尤其是POD、CAT和APX。

实施例6干旱胁迫下烟草植株的光合特性测定

利用便携式光合仪(LI-6400，美国LI-COR公司)于当地时间上午8：00对各个植株相同部位叶片进行光合特性测定，并做好相应标记以便测定之后的叶绿素荧光参数。标准叶室为2cm×3cm，采用内置LI-6400红蓝发光二极管(LED)光源，光合量子通量密度(PPFD)设定为1,000μmol·m^-2·s^-1。数值稳定后通过系统记录净光合速率(Pn)、气孔导度(Gs)、细胞间隙CO₂浓度(Ci)和蒸腾速率(Tr)4个光合参数。从图8可以看出，与野生型烟草相比，转PlMYB108基因烟草的Pn、Gs、Ci和Tr均显著较高，表明其光合能力较强。

实施例7干旱胁迫下烟草植株的叶绿素荧光参数测定

将叶片用叶夹夹住，用叶绿素荧光仪(PAM-2500，德国Walz公司)对在黑暗中静置2h后标记过的叶片进行叶绿素荧光参数测定。系统记录了Fm、Fo、执行饱和脉冲前的实时荧光产量(Fv’)、PSII处于关闭时的最大荧光产量(Fm’)和Y(II)，此外可变荧光(Fv＝Fm-Fo)、光化学效率(Fv/Fm)、PSII的潜在量子产率(Fv/Fo＝(Fm-Fo)/Fo)和非光化学猝灭系数(qN＝(Fv-Fv’)/Fv)采用仪器自带数据处理软件PAM Win计算得到。从图9可以看出，与野生型烟草相比，转PlMYB108基因烟草具有显著较高的Fm、qN、Y(II)、Fv/Fm和Fv/Fo而Fo显著较低。

实施例8干旱胁迫下烟草植株的类黄酮含量测定

类黄酮含量测定参考类黄酮试剂盒(苏州科铭生物技术有限公司)说明书，具体操作步骤如下：①烟草叶片置于烘箱内烘干至恒重，粉碎后过40目筛后称取0.02g于试管中；②向试管中加入2mL 60％乙醇，60℃振荡提取2h，10,000rpm，25℃离心10min后取上清；③紫外分光光度计预热30min以上，用蒸馏水调零，于1mL比色皿中加入上清液，按要求加样后于波长510nm处分别测定A空白管和A测定管；④计算公式：ΔA＝A测定管-A空白管，类黄酮含量(mg/g FW)＝19.9×(ΔA-0.0007)。从图10可以看出，与野生型烟草相比，转PlMYB108基因烟草具有显著较高的类黄酮含量，表明芍药PlMYB108基因能够促进类黄酮积累。

综上所述，本发明获得了1个芍药PlMYB108基因cDNA全长序列，并通过将构建的PlMYB108基因超表达载体转化到烟草中进行表达，提高了烟草植株类黄酮含量，创制了耐干旱能力强的烟草新种质。

序列表

<110> 扬州大学

<120> 一种芍药PlMYB108基因及其在植物抗旱中的应用

<160> 13

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

aacaacggtg aaggtcgc 18

<210> 2

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ttcaagccgc ctctaatg 18

<210> 3

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

cgaggtcaga tagcggagaa acttgactgg 30

<210> 4

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

cagtggtctc acaacatgga tgttaatggg agagg 35

<210> 5

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

cagtggtctc atacaaatat tgctggagaa ctgtt 35

<210> 6

<211> 1314

<212> DNA

<213> 芍药PlMYB108基因(Artificial Sequence)

<400> 6

ctaatacgac tcactatagg gcaagcagtg gtatcaacgc agagtacatg gggaagaatt 60

aatccaattc tctctctctc tctctcttta gaaaactctg tatatcgatc atcaaaccct 120

tttcatttca atcaatcagt ctgtccaatt acgggaatgg atgttaatgg gagaggatcg 180

tcatcaagca actccacccc cactcaaagt gaagaagatc agatggattt gagaaggggt 240

ccatggactg ttgaagaaga cctcaccctc atgaattaca ttgccaacaa cggtgaaggt 300

cgctggaatt ctcttgcccg ttgtgccggt ctaaaacgaa ctggaaagag ctgcagatta 360

agatggctga actatttacg tccagatgtt cgtcgtggaa acattaccct tgaagagcag 420

cttctgattc ttgagcttca ttctcgctgg ggaaatcggt ggtcgaaaat agcccagcac 480

ttgcctggaa gaacagataa cgagatcaaa aactattgga gaacacgagt tcaaaagcat 540

gccaaacagc tcaaatgtga cgtgaacagc aagcaattca aggacaccat gcgttattta 600

tggatgccaa ggttggtaga gagaattcaa gccgcctcta atgttgttgg agcttcttca 660

tcctccaccg tcttaccacc aacggcaatc tccggcgact ttgccggcgt gcatgtgaat 720

tcaactagtt gcattcccga gaattctagc acgggagttt cttctgactc atttgggacc 780

agtcaagttt ctccgctatc tgacctcgcc gaaaataatt acaatttccc acttaattgt 840

catccggata attatttcca aggcggtcaa gctggttact cagatacgct aatcagccca 900

tctggttatt acaatcctgc catggatttt caagctatgg aatatcaaaa caataaccag 960

tatatatccg acaatttgtg gaatgttgaa gacaattggt tcttacaaca acagttctcc 1020

agcaatattt aagacggttc caggtagcgt gtacgataat taggatgacg ggttatgtag 1080

ggttactcca tcgttatctg aagattatga tttcgaacaa gactgcgtac agcgatcctg 1140

aggtagccat tttatgtatg ataatttagg ttataccgga cagaatttgt gaagaaaaga 1200

caggttttta cagttgtatg gattgtattt cgtttgtgta ctttttattt gtttgggtgg 1260

ggagaaaatt tgtaatttga gattgtttta atctcattct tggaaaaaaa aaaa 1314

<210> 7

<211> 291

<212> PRT

<213> 芍药PlMYB108基因(Artificial Sequence)

<400> 7

Met Asp Val Asn Gly Arg Gly Ser Ser Ser Ser Asn Ser Thr Pro Thr

1 5 10 15

Gln Ser Glu Glu Asp Gln Met Asp Leu Arg Arg Gly Pro Trp Thr Val

20 25 30

Glu Glu Asp Leu Thr Leu Met Asn Tyr Ile Ala Asn Asn Gly Glu Gly

35 40 45

Arg Trp Asn Ser Leu Ala Arg Cys Ala Gly Leu Lys Arg Thr Gly Lys

50 55 60

Ser Cys Arg Leu Arg Trp Leu Asn Tyr Leu Arg Pro Asp Val Arg Arg

65 70 75 80

Gly Asn Ile Thr Leu Glu Glu Gln Leu Leu Ile Leu Glu Leu His Ser

85 90 95

Arg Trp Gly Asn Arg Trp Ser Lys Ile Ala Gln His Leu Pro Gly Arg

100 105 110

Thr Asp Asn Glu Ile Lys Asn Tyr Trp Arg Thr Arg Val Gln Lys His

115 120 125

Ala Lys Gln Leu Lys Cys Asp Val Asn Ser Lys Gln Phe Lys Asp Thr

130 135 140

Met Arg Tyr Leu Trp Met Pro Arg Leu Val Glu Arg Ile Gln Ala Ala

145 150 155 160

Ser Asn Val Val Gly Ala Ser Ser Ser Ser Thr Val Leu Pro Pro Thr

165 170 175

Ala Ile Ser Gly Asp Phe Ala Gly Val His Val Asn Ser Thr Ser Cys

180 185 190

Ile Pro Glu Asn Ser Ser Thr Gly Val Ser Ser Asp Ser Phe Gly Thr

195 200 205

Ser Gln Val Ser Pro Leu Ser Asp Leu Ala Glu Asn Asn Tyr Asn Phe

210 215 220

Pro Leu Asn Cys His Pro Asp Asn Tyr Phe Gln Gly Gly Gln Ala Gly

225 230 235 240

Tyr Ser Asp Thr Leu Ile Ser Pro Ser Gly Tyr Tyr Asn Pro Ala Met

245 250 255

Asp Phe Gln Ala Met Glu Tyr Gln Asn Asn Asn Gln Tyr Ile Ser Asp

260 265 270

Asn Leu Trp Asn Val Glu Asp Asn Trp Phe Leu Gln Gln Gln Phe Ser

275 280 285

Ser Asn Ile

290

<210> 8

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

ggagagaaca cgggggac 18

<210> 9

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

agctggtcag tcttcggg 18

<210> 10

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

tcctcatgca attcttcg 18

<210> 11

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

acctgcccat ctggtaac 18

<210> 12

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

agaagaaact cccgtgcta 19

<210> 13

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

gcgttattta tggatgcc 18

Claims (10)

1.芍药PlMYB108基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。

2.扩增权利要求1所述的芍药PlMYB108基因的引物，其特征在于，所述引物包括SEQ IDNO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.9所示中的一种或几种。

3.权利要求1所述的芍药PlMYB108基因编码的蛋白，其特征在于，其氨基酸序列如SEQID NO.7所示。

4.表达盒、重组载体或细胞，其含有权利要求1所述的芍药PlMYB108基因。

5.根据权利要求4所述的重组载体，其特征在于，所述载体为超表达载体pBWA(V)HS-Glosgfp。

6.权利要求5所述的重组表达载体的构建方法，其特征在于，将芍药PlMYB108基因与超表达载体pBWA(V)HS-Glosgfp连接并转化即得。

7.权利要求1所述的芍药PlMYB108基因、权利要求3所述的蛋白、权利要求4所述的表达盒、重组载体或细胞在植物抗旱中的应用。

8.获得抗旱植物的方法，其特征在于，包括如下步骤：

1）使植物包含权利要求1所述的芍药PlMYB108基因；

2）使植物表达权利要求3所述的蛋白。

9.鉴定权利要求8所述的方法获得的植物的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1）鉴定所述植物是否包含权利要求1所述的芍药PlMYB108基因；

2）鉴定所述植物是否表达权利要求3所述的蛋白。

10.根据权利要求9所述的鉴定方法，其特征在于，所述鉴定方法中的引物序列如SEQID NO.4和SEQ ID NO.5；SEQ ID NO.12和SEQ ID NO.13所示。

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