CN116024259A - 菊花转录因子CmMYB基因在矮化植株或缩短根长中的应用 - Google Patents

Abstract

本申请公开了一种菊花转录因子CmMYB蛋白或其编码基因在矮化萱草植株或缩短萱草植株根长中的应用以及一种矮化萱草植株或缩短萱草植株根长的方法，属于生物技术领域。本发明研究证明，CmMYB的转基因萱草与WT萱草相比，植株矮化且根系变短。本发明为矮化植株或根系缩短植株的培育提供了一种新途径，对探究CmMYB的功能，揭示植株矮化或根系缩短性状形成机理具有重要意义，并为萱草植株的分子育种提供了重要的参考依据。

Description

菊花转录因子CmMYB基因在矮化植株或缩短根长中的应用

技术领域

本申请公开了一种菊花转录因子CmMYB蛋白或其编码基因在矮化萱草植株或缩短萱草植株根长中的应用以及一种矮化萱草植株或缩短萱草植株根长的方法，属于生物技术领域。

背景技术

萱草因花型独特，花色繁多且易于栽培繁殖，既可以用于布置各式花坛、道路隔离带、疏林草坡，亦是很好的地被植物，具有很好的园林应用效果。目前，国内对萱草的研究主要集中在杂交及倍性育种、孢粉学、引种栽培和品种筛选评价等方面，国外对萱草的研究主要集中在衰老基因、抗病基因、倍性育种和遗传特性等方面，然而关于萱草株高及株型的研究却很少，而萱草的株高会对萱草的例如抗倒伏效果产生影响，并且在萱草根系的长度也会对移植过程产生影响，例如根系缩短移植时则不易对根系造成大量破坏，使得移植成功率更高，因此作为景观植物的萱草，其株高和根系长度也是进行品种选育时需要着重考虑的因素。

MYB转录因子在植物中广泛存在，参与了植物生长发育过程中的多种活动，包括细胞形态建成和分化、植物激素合成、抗病反应以及细胞周期调控和细胞程序化死亡等，MYB转录因子在木质部合成和分化过程中也起到非常重要的调控作用。目前，对于MYB基因的功能研究尚不深入，尚未有研究表明菊花转录因子CmMYB与萱草的植株矮化或根系缩短相关。

发明内容

本发明的目的在于提供菊花转录因子CmMYB蛋白或其编码基因在矮化萱草植株或缩短萱草植株根长中的应用，本发明为矮化植株或根系缩短植株的培育提供了一种新途径，对探究CmMYB的功能，揭示植株矮化或根系缩短性状形成机理具有重要意义，并为萱草植株的分子育种提供了重要的参考依据。

一方面，本发明提供了菊花转录因子CmMYB蛋白或其编码基因在矮化萱草植株或缩短萱草植株根长中的应用。

优选的，所述菊花转录因子CmMYB蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。

优选的，所述菊花转录因子CmMYB蛋白的编码基因如SEQ ID No.1所示。

另一方面，本发明还提供了一种矮化萱草植株或缩短萱草植株根长的方法，包括提高目的植物中菊花转录因子CmMYB蛋白表达水平或mRNA转录水平的步骤。

优选的，所述方法包括向萱草中导入所述菊花转录因子CmMYB蛋白的步骤。

优选的，导入所述菊花转录因子CmMYB蛋白通过导入菊花转录因子CmMYB蛋白的编码基因来实现。

优选的，所述导入通过含有重组载体的根癌农杆菌进行，所述重组载体上含有所述菊花转录因子CmMYB蛋白的编码基因。

优选的，采用冻融法将所述重组载体转化所述根癌农杆菌。

优选的，所述重组载体为在植物表达载体PBI121-GFP的多克隆位点处插入所述菊花转录因子CmMYB蛋白的编码基因。

优选的，所述根癌农杆菌为根癌农杆菌GV3101。

本申请的有益效果包括但不限于：

1.本申请公开了一种菊花转录因子CmMYB基因在矮化萱草植株或缩短萱草根长中的应用，不仅为萱草植物的品种选育和改良有着重要的意义，而且对于揭示植株矮化以及根系缩短性状的形成机理具有重要意义，并且对于探究CmMYB的功能具有重要的意义。

2.本申请公开了一种矮化萱草植株或缩短萱草植株根长的方法，具体的通过将菊花转录因子CmMYB蛋白的编码基因导入萱草，使得萱草的形状改变，具体的植株矮化、根长缩短，萱草作为一种园艺植物，矮化植株形状更加抗倒伏、易移植，根长缩短也使得萱草在移植过程中，其根系更不易受到损伤，使得移植成活率更高。

附图说明

此处所说明的附图用来提供对本申请的进一步理解，构成本申请的一部分，本申请的示意性实施例及其说明用于解释本申请，并不构成对本申请的不当限定。在附图中：

图1为CmMYB转录因子扩增产物凝胶电泳图，其中M：Marker DL2000；1-4：基因PCR产物；

图2为转基因萱草阳性植株扩增产物凝胶电泳图，其中M：Marker DL2000；1-15：阳性材料PCR产物；

图3为转基因萱草阳性植株荧光检测图，其中A-C为CmMYB转化材料在自然光下图；F-H为CmMYB转化材料在荧光下图；D为pBI121-GFP空载转化材料在自然光下图；I为pBI121-GFP空载转化材料在荧光下图；E为野生型在自然光下图；J为野生型在荧光下图；

图4为CmMYB转基因萱草与野生型萱草植株的根长与株高表型图，WT表示野生型植株，Line1，3分别表示转基因萱草的不同株系；

图5为CmMYB转基因萱草与野生型萱草植株整体株型图，其中WT表示野生型植株，CmMYB表示转基因萱草。

具体实施方式

下面结合实施例详述本申请，但本申请并不局限于这些实施例。

如无特别说明，本申请的实施例中的原料和试剂均通过商业途径购买。

菊花CmMYB基因的克隆

1、总RNA的提取及质量检测

提取总RNA(核糖核酸ribonucleic acid)前，将提取过程中用到的所有容器做无RNase(核糖核酸酶ribonuclease)处理，以除基因组DNA的干扰。将离心管等塑料器皿、研钵、研杵等研磨工具和镊子在0.1％(质量分数)DEPC(diethyl pyrocarbonate，焦碳酸二乙酯)水中浸泡过夜，将水沥干后用报纸包好，高温高压灭菌；所有试剂的配置均用无RNase水，之后采用TRIZOL法提取总RNA，具体包括以下步骤：

1)取50～100μg菊花叶片(在-80℃下保存的)加入液氮充分冷却过的研钵中，研磨至粉末状并转入预冷过的1.5mL离心管中，加入1mL TRIZOL，震荡混匀静置5min；

2)200μL的氯仿加入上述离心管，混匀静置5min，并提前准备冷冻离心机；

3)12000rpm，4℃离心10min，可见离心管底有沉淀，转上述上层水相约400μL于另一离心管，加入等体积的异丙酮，混匀放置10min，12000rpm，4℃离心10min；

4)汲取掉上层清液用75％(体积分数)乙醇漂洗2次，混匀静置5min，12000rpm，4℃离心1min，弃上清，置超净台干燥10min；

5)加入经过DEPC处理的水至30μL，混匀；

6)所得总RNA用琼脂糖凝胶电泳检测，琼脂糖凝胶电泳采用0.5×TBE电泳缓冲液和1.5％(质量分数)的琼脂糖凝胶，电泳结果两个条带清楚，无降解现象，再用Nanodrop2000分光光度计检测260nm和280nm的OD值，RNA纯度与质量达到实验要求，所提取的RNA可立即使用，或-20℃短期保存。

2、cDNA第一链的合成

采用Vazyme公司反转录提取试剂盒(Vazyme R211-01

II 1st StrandcDNA Synthesis Kit 50rxn(20μl/rxn))，进行菊花cDNA合成。制备步骤如下：

1)RNA模板变性：在RNase-free离心管中配置如下混合液A。将配置的混合液A65℃加热5min，迅速置于冰上骤冷，并在冰上静置2min。

混合液A配置体系：

试剂名称	模板总RNA	Oligo(dT)23Primer	<![CDATA[RNase free dH<sub>2</sub>O]]>
				含量	6μL	1μL	1μL

2)反转录合成cDNA第一链：配置第一链cDNA合成反应液B，50℃反应45min，85℃反应5min。合成的cDNA可立即使用，或-20℃短期保存。

合成反应液B配置体系：

3、PCR引物的设计与合成

根据数据库中搜索到的MYB菊花家族蛋白序列，设计合成基因的特异引物如下：

CmMYB-F：5’-GC TCTAGA GC TGGAGCCCAGACGAGGAC-3’，

CmMYB-R：5’-G CTCGAG C CATTCCGTTACCACCACCAC-3’。

“”区域为XbaⅠ和BamHⅠ酶切位点。

4、PCR扩增目的基因序列片段

以菊花叶片cDNA第一链为模板(用量为1～5μL，不超过PCR反应总体积的1/10)，以基因的特异引物为上下游引物按照PCR反应体系和PCR反应程序进行PCR扩增，采用vazyme公司高保真酶扩增目的基因。

PCR反应体系：

PCR反应程序：94℃预变性5min，94℃1min，Tm 1000kb/min，72℃1min45s，共30个循环，72℃5min结束反应(PCR产物若不能及时使用，-20℃保存，避免反复冻融)。

5、电泳检测并回收目的DNA片段

1)用1.5％琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，根据天根公司的凝胶回收试剂盒(DP219-03)步骤回收。回收的DNA目的片段可立即使用，也可以-20℃短期保存备用；

2)1.5％琼脂糖凝胶电泳检测结果显示均成功扩增到单一条带，且与Marker比较符合预期大小，CmMYB扩增到的是一条约750bp的DNA片段(如图1所示)，则对PCR产物进行纯化回收。

6、目的DNA片段连接18-T载体

将高保真酶扩增的PCR产物纯化回收后，按TaKaRa公司pMD18-T Vector载体提供的方法，将PCR回收产物与pMD18-T Vector载体连接。将连接反应体系放入22℃恒温水浴锅中反应60min以上或者4℃过夜，反应结束后将离心管置于冰上。

连接反应体系：

7、连接产物转化大肠杆菌感受态细胞

1)在100μL大肠杆菌感受态细胞中加10μL连接产物，冰浴30min，42℃水浴热激90s，再冰浴2min。加入800μL LB(Lysogeny broth)液体培养基，摇床培养；

2)离心弃去上清，涂在含有Amp(氨苄西林Ampicillin)的LB固体培养基上；

3)37℃倒置培养挑选白色菌落，在96孔板中，每孔加入100μL含有Amp的LB液体培养基；

4)将挑选的菌落加入液体培养基中摇床培养；

5)取1μL菌液进行PCR阳性测定，并-20℃短期保存。

8、阳性菌落PCR检测

采用Vazyme公司2×Taq酶体系，按照菌落PCR反应体系和反应程序对菌液进行PCR扩增。

把扩增的菌液PCR取出进行凝胶电泳检测，将电泳图中条带和目的片段大小差不多且明亮清晰的菌液，即阳性克隆菌液取样送公司测序，测序通用引物M13-47/M13-48。测序结果用BLAST(http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)软件进行序列比对，检查是否得到正确的目的基因。将克隆测序序列和参考序列一致的进行过表达载体构建。

菌落PCR反应体系：

反应程序为：94℃预变性5min，94℃1min，Tm 1000kb/min，72℃1min45s，共30个循环，72℃5min结束反应。PCR产物若不能及时使用，-20℃保存，避免反复冻融。

阳性菌落PCR检测与分析：

菌检结果显示菌液PCR产物大小与目的片段大小基本一致，且无杂带，初步鉴定为重组子，CmMYB为750bp左右的DNA片段，用于载体构建的CDS序列如SEQ ID NO.1所示，其表达蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。序列分析表明，该基因全长为840bp，编码280个氨基酸，预测该基因编码的蛋白质分子量为60.02KD，等电点为4.92。

菊花CmMYB基因表达载体的构建

1、双酶切CmMYB菌液质粒和PBI121-GFP表达载体质粒

酶切体系为100μL，如下：

反应程序为：37℃酶切5min，65℃孵育20min使酶失活，4℃保存。

2、酶切产物进行胶回收

按天根公司的琼脂糖凝胶DNA回收Kit说明书进行操作，酶切产物经1％(质量分数)琼脂糖凝胶电泳检测，在紫外透射仪下切胶，分别回收DFR片段和PBI121-GFP载体大片段。

3、连接MYB和PBI121-GFP

连接体系为10μL，如下：

反应程序为：混匀后，16℃连接4-7h(时间过长会导致基因降解，过短会导致连接失败)。

4、连接产物PBI121-GFP-MYB转化大肠杆菌

1)取10μL的连接产物加入到50μL感受态细胞E.coli DH5a中混匀，冰中放置30min；

2)于42℃水中静止热激90s，迅速置于冰上冷却2min；

3)加600μL LB液体培养基，37℃振荡培养1h；

4)6,000rpm离心5min，弃上清，剩下约100μL上清用于悬浮沉淀，使用涂布棒均匀涂布于含有Amp的LB平板，37℃倒置培养过夜，挑选白色菌落；

5)如果不能及时实验，请将平板放置4℃冰箱保存；

6)无菌条件下挑取单个白色菌落，分别接种于含有Amp的LB(100μL/100mL)液体培养基的10-20mL管中，37℃摇菌过夜培养，培养时间12-16h。

5、PBI121-GFP-DFR大肠杆菌的阳性筛选

在涂过菌过夜培养后的平板上有单个白色菌落长出的地方做好标记，分别沾取少许作标记的单个菌落使用20μL无菌水稀释，取5μL作为模板进行PCR扩增，1％琼脂糖电泳鉴定，剩余15μL于4℃冰箱保存，用作摇菌。

6、PBI121-GFP-MYB大肠杆菌质粒的抽提

使用Magen公司的HiPure Plasmid Micro Kit试剂盒抽提质粒。

1)无菌条件下挑取单个白色菌落，分别接种于含有Amp的LB(100μL/100mL)液体培养基的30mL管中，37℃摇菌过夜培养，培养时间12-16h；

2)将培养物分装于1.5mL EP管，12000rpm离心2min，弃上清液，在吸水纸上轻轻拍打吸尽残液，收集菌株；

3)加入250μL Buffer P1/RNase A混合液，高速漩涡重悬菌株，重悬至看不到细菌菌块；

4)往重悬液中加入250μL Buffer P2，颠倒混匀8-10次；

5)加入350μL Buffer P3，立即颠倒8-10次让溶液彻底中和；

6)25℃，13,000rpm离心1min；

7)将HiPure DNAMini ColumnⅡ装在收集管中，将上清液倒入吸附柱中，13,000rpm离心1min；

8)弃废液，将吸附柱套回收集管中，加入500μL Buffer PW1至吸附柱中，13,000rpm离心1min；

9)弃废液，将吸附柱套回收集管中，加入600μL Buffer PW2至吸附柱中，13,000rpm离心1min；

10)重复9)；

11)弃废液，将吸附柱套回收集管中，13,000rpm离心1min；

12)将吸附柱放入灭菌的1.5mL离心管中，加入50μL Elution Buffer至吸附柱的膜中央，静置1min，13,000rpm离心1min；

13)将洗脱液重新加入吸附柱中间，二次洗脱。

14)弃去吸附柱，质粒-20℃保存。

7、冻融法转化根癌农杆菌GV3101

1)向感受态细胞加入10μL重组质粒，混匀，冰浴30min；

2)置液氮中速冻5min，迅速放入37℃水浴2min；

3)加入1000μL LB液体培养基，混匀后，置28℃摇床250rpm振荡培养3-5h；

4)将上述培养液于8000rpm离心2min，收集菌株，弃上清，留100μL重悬细胞；

5)将菌液涂布在含有卡那霉素的固体LB培养基平板上，28℃培养两天。

8、PCR鉴定阳性克隆

挑取单个菌落，进行菌落PCR鉴定，鉴定后得到阳性克隆。挑取单克隆菌落置于含有卡那霉素的LB(100μL/100mL)液体培养基的10-20mL管中，37℃摇菌过夜培养，培养时间12-16h，-80℃保存备用。

农杆菌介导的CmMYB基因对萱草的遗传转化

1、浸染材料的培养

使用MS培养基诱导萱草愈伤，选用继代1、2次后的萱草愈伤。种植在人工培养室，培养温度25℃，湿度75％。

2、农杆菌浸染的制备

1)从-80℃中取出带有正确目的基因的农杆菌菌液并活化；

2)涂平板后置于28℃中暗培养24h后，挑选单克隆菌液落入1.5mL离心管中震荡培养12h；

3)汲取100μL震荡培养的菌液扩大培养至250μL锥形瓶中摇菌培养，至菌液OD值0.6～0.8之间；

4)然后5000rpm，离心10min，弃上清液，收集农杆菌，并加入含5％(质量分数)蔗糖的MS液体培养基使菌液重悬；

5)在上述溶液中加入AS(Acetosyringone)乙酰丁香酮(100mg/ml)，充分震荡溶解菌落备用。

3、农杆菌侵染转化

1)将萱草愈伤切成小块，置于浸染液中；

2)浸染时间15min；

3)放入MS+AS(Acetosyringone，乙酰丁香酮)共培养基中，暗培养3d；

4)然后，使用羧苄青霉素洗液(100mg/ml)洗菌；

5)晾干后转入含有卡那霉素和羧苄青霉素的筛选培养基，筛选培养1个月后转入无抗生素培养基。

4、转基因植株的阳性鉴定

使用荧光显微镜对转化材料进行荧光检测，确定有荧光激发的为阳性材料(如图3所示)，然后随机选取15个样品进行PCR检测(如图2所示)。

5、萱草转基因株系与野生型的表型观察

观察萱草转基因阳性株系Line1和Line3与野生型WT，发现转基因株系变矮和根长变短(如图4、图5所示)。

以上所述，仅为本申请的实施例而已，本申请的保护范围并不受这些具体实施例的限制，而是由本申请的权利要求书来确定。对于本领域技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的技术思想和原理之内所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。

Claims (10)

1.菊花转录因子CmMYB蛋白或其编码基因在矮化萱草植株或缩短萱草植株根长中的应用。

2.根据权利要求1中所述的应用，其特征在于：所述菊花转录因子CmMYB蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。

3.根据权利要求2中所述的应用，其特征在于：所述菊花转录因子CmMYB蛋白的编码基因如SEQ ID No.1所示。

4.一种矮化萱草植株或缩短萱草植株根长的方法，其特征在于：其包括提高目的植物中菊花转录因子CmMYB蛋白表达水平或mRNA转录水平的步骤。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述方法包括向萱草中导入所述菊花转录因子CmMYB蛋白的步骤。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：导入所述菊花转录因子CmMYB蛋白通过导入菊花转录因子CmMYB蛋白的编码基因来实现。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述导入通过含有重组载体的根癌农杆菌进行，所述重组载体上含有所述菊花转录因子CmMYB蛋白的编码基因。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，采用冻融法将所述重组载体转化所述根癌农杆菌。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：所述重组载体为在植物表达载体PBI121-GFP的多克隆位点处插入所述菊花转录因子CmMYB蛋白的编码基因。

10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：所述根癌农杆菌为根癌农杆菌GV3101。

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