CN106834314A

CN106834314A - 谷子抗逆基因SiRLK35及编码蛋白与应用

Info

Publication number: CN106834314A
Application number: CN201710095954.9A
Authority: CN
Inventors: 刘炜; 王帆; 王一帆; 潘教文; 王庆国; 李臻
Original assignee: Biotechnology Research Center of Shandong Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Biotechnology Research Center of Shandong Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2017-02-22
Filing date: 2017-02-22
Publication date: 2017-06-13
Anticipated expiration: 2037-02-22
Also published as: CN106834314B

Abstract

本发明公开了一种谷子抗逆基因SiRLK35及编码蛋白与应用。本发明在谷子中分离获得类受体蛋白激酶SiRLK35，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，该基因编码蛋白产物属于丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶。本发明对该基因在逆境条件下的表达模式进行了研究，同时对该基因进行原核表达载体的构建，验证了该基因可在蛋白水平进行表达，利用斑点法和基因原核表达系统对该基因的功能进行了初步验证，同时检测了该基因在盐处理条件下的生长曲线，通过将该基因异源转化入水稻并获得相应的转基因植株，对其在抗盐及抗逆过程中的作用进行了初步鉴定，对进一步实现对谷子进行有目的，有针对性的品质、性状改良，创新谷子抗逆新种质，具有指导作用。

Description

谷子抗逆基因SiRLK35及编码蛋白与应用

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体说，涉及谷子抗逆基因SiRLK35及编码蛋白与应用。

背景技术

干旱是影响植物正常生长发育的重要限制性因素之一，由于水资源在时间和空间上的分布不均，以及环境变化而引起的世界性的水资源短缺，影响了全球64％的耕地。就我国现状，每年的农业生产缺水为300亿立方米，因干旱造成的粮食损失约为400亿斤/年，水资源短缺使得粮食安全问题受到严重威胁。

植物受到干旱胁迫时，最直接的影响就是植物细胞脱水。细胞脱水后，细胞膜细胞壁发生分离，细胞膜原有的结构遭到破坏，膜脂分子结构呈无序放射状排列，膜上出现空隙，膜透性增大，膜蛋白解离，胞质内的可溶性糖、电解质、氨基酸等外流；缺水使气孔关闭，CO₂扩散受阻，叶绿体结构改变，光系统II活性受到影响，酶活降低，光合磷酸化解偶联，导致光合作用减弱；水分不足时，分生组织分裂减弱或停止，细胞伸长速度减慢，从而使植物生长受到受抑；植物细胞脱水抑制合成代谢，加强了分解代谢，使细胞正常代谢遭到破坏。导致植物生长停滞甚至死亡。

植物在受到干旱胁迫时，细胞感知并将胞外信号传递到胞内，引起胞内第二信使(如Ca²⁺、活性氧(ROS)、NO、磷酸盐等)的产生，第二信使通过进一步调控相关蛋白激酶的活性，调节下游蛋白的磷酸化状态，最终通过磷酸化作用激活转录因子而调控相应的基因表达。

自从1990年首次报道从玉米中克隆到第一个S型植物类受体蛋白激酶(SRLKs)基因Zmpk1之后，在其它物种中也均有发现。目前已知在拟南芥中大约存在40个SRLKs，水稻中有147个。其中甘蓝中的SRK、SFR2；拟南芥中的ARK1、ARK2、ARK3、RLK1和PR5K，水稻中的OsPK10及烟草中的NTS16及BcRK，均属于SRLKs。目前，对于SRLKs功能研究的报道并不多，这类蛋白主要在植物种胚形态发生、发育及自交不亲和等方面具有重要的生物学功能。

含有S-结构域的RLKs(SRLKs)作为RLKs家族中第二大类，广泛存在于单子叶及双子叶植物中。近年来，随着对RLKs研究的深入，对SRLKs生物学功能的研究也越来越受到人们的关注。Kim等(2009)研究发现，CBRLK1(calmodulin-binding receptor-like proteinkinase)编码一个S-型的类受体蛋白激酶，能够通过调控PR1基因的表达负调拟南芥的抗病反应。进一步研究发现，CBRLK1能与钙调素互作，而钙调素(Calmodulin,CaM)通过与胞内重要第二信使Ca²⁺直接作用，在植物细胞感知外界刺激进行原初响应及信号向下游的转导过程中具有重要作用。水稻中OsSIK2编码一个SRLK蛋白，其表达能明显的被ABA、PEG、NaCl和4℃所诱导；过表达OsSIK2可增强转基因水稻对干旱和盐胁迫的抗性，而且过表达株系表现出叶片提前发育和延迟衰老的表型。最近在大豆中研究发现，GsSRK编码一个SRLK，其表达能够明显的被ABA、干旱和盐胁迫所诱导，在拟南芥中过表达GsSRK能明显增强转基因株系在盐胁迫下种子的萌发、主根的伸长及莲座叶的生长等。这些结果表明SRLKs可参与非生物胁迫响应，并可能通过对胁迫信号进行整合从而对植株的发育进行调控，使植株更好的适应不利的环境。

谷子(Setaria italica L.Beauv.)又称为粟，是我国传统优势作物及粮饲兼用作物，在我国北方地区种植广泛，其种植面积占世界的80％。但由于基因组测序工作的滞后，长期以来谷子未受到国际科学界的关注。进入21世纪以来，谷子因其抗旱耐瘠、高光效、耐储藏、基因组小以及生育期短等突出优势迅速发展成为功能基因组研究新的候选模式作物。近年来其营养保健价值、国际竞争力和产量潜力被重新认识。因此，对谷子进行抗逆研究也越来越有必要，可以为对谷子进行有目的、有针对性的品质、性状研究及抗旱机制的解析提供理论依据。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供了一种新的谷子抗逆基因SiRLK35。本发明以自然干旱处理的“豫谷1号”为材料，通过iTRAQ技术筛选到一表达量发生明显变化的S型类受体蛋白激酶基因，命名为SiRLK35。通过构建SiRLK35基因的植物双元表达载体，利用基因工程手段获得了该基因的转基因植物材料，对该基因的生物学功能及其在植物抗旱抗逆等方面的应用进行了研究。通过构建该基因的原核表达载体，检测蛋白水平的表达情况，分析其在原核菌株中的功能，初步验证了该基因的抗逆能力。通过对获得的转基因水稻植株进行干旱胁迫处理，初步验证转基因植株的抗逆能力，揭示该基因在植物抗逆过程中的作用。

因此，本发明还有一个目的是在于提供了一种谷子抗逆基因SiRLK35在植物抗逆(抗旱和耐盐)育种中的应用，提高了植物对逆境(干旱和水渍)的耐受能力，保证了作物的产量和品质免受或少受逆境胁迫的不利影响。

为此，本发明采用的技术方案是：谷子抗逆基因SiRLK35，克隆该基因的方法是，首先提取谷子叶片的RNA，反转录得到单链cDNA，以单链cDNA为模板，以SEQ ID No.3和SEQ IDNo.4序列所示的特异引物，通过PCR获得SiRLK35基因的全长序列。引物序列如下：

SiRLK35S11:5’-ACGGTTTATTTGCTTGGA-3’(SEQ ID No.3)

SiRLK35A1:5’-TCATAAATTTGACTTCATTTCA-3’(SEQ ID No.4)

所述谷子抗逆基因SiRLK35，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，氨基酸序列如SEQID No.2所示，该基因编码产物属于S型类受体蛋白激酶。

本发明谷子抗逆基因SiRLK35的生物信息学分析显示，该蛋白属于S型类受体蛋白激酶(SRLKs)家族，基因序列分析显示，SiRLK35包含1989个碱基，含有相对保守的蛋白激酶区，但进化分析显示，其与拟南芥、水稻、玉米、大麦等植物中的SRLKs同源性较低，为7％-23％，与我们之前在水稻中分离到的种胚特异基因OsESG1的序列同源性也仅为9％。这种序列上的差异性，结合对其表达模式的初步分析，暗示SiRLK35在与SRLKs家族成员功能上具有一定的共性，但同时也具有特异的、独特的功能，并可能在谷子抗旱的过程具有重要作用。

为进一步研究SiRLK35基因的功能，本发明使用RT-PCR对该基因的表达模式进行研究，结果表明，SiRLK35可以被干旱、盐胁迫、植物激素GA、ABA、MeJA等诱导表达，暗示该基因在植物抗逆和体内信号转导方面发挥一定的作用。

本发明还根据谷子SiRLK35基因序列设计特异引物，通过PCR方法扩增得到目的基因，酶切后，将目的基因SiRLK35与PET28a载体连接，获得重组质粒pET28a-SiRLK35，以此质粒转化大肠杆菌菌株BL21(DE3)，原核表达载体构建完成，IPTG诱导表达融合蛋白，SDS-PAGE电泳分析，获得预期大小的蛋白条带，证明该基因在蛋白水平完成了表达，并同时对其原核表达系统进行了优化。

本发明同时利用斑点法对SiRLK35基因功能进行验证，将成功转入pET28a质粒和pET28a-SiRLK35重组质粒的大肠杆菌BL21(DE3)经IPTG诱导后，在含有不同浓度NaCl的LB平板培养基上点样，37℃倒置过夜培养，观察比较菌斑的数量及大小，对该基因的原核蛋白表达菌株的抗盐能力进行验证。

本发明还通过液体培养法检测含有SiRLK35基因的菌株的生长曲线，将成功转入pET28a质粒和pET28a-SiRLK35重组质粒的大肠杆菌BL21(DE3)经IPTG诱导后，在含有250mmol L^-1NaCl的液体LB培养基中培养，每隔2h取样，紫外分光光度计下测定OD₆₀₀的吸光值。结果显示，含有重组质粒pET28a-SiRLK35的大肠杆菌比含有空载体的菌株生长速度快，经8h培养后，两种菌液浓度相差最大，显示含有SiRLK35基因的菌株具有一定的抗盐能力。

本发明还提供一个pCAMBIAI1301P-SiRLK35植物表达载体，由目的基因SiRLK35酶切后与pCAMBIAI1301P连接构建的植物双元表达载体，并借助基因工程手段将表达载体转入水稻，提高水稻的抗逆能力。

本发明将经过潮霉素筛选的T₁代种子进行水培培养，待其长至三叶期时，使用0mmol/L、100mmol/L和250mmol/L不同浓度梯度的NaCl溶液进行胁迫处理，观察幼苗长势及叶片生长情况，结果显示转基因水稻植株对盐胁迫的耐受性高于对照，SiRLK35基因在水稻抗盐胁迫过程中发挥作用。

本发明还提供一种谷子抗逆基因SiRLK35在植物抗逆(抗旱和耐盐)育种中的应用，其应用过程是：将克隆得到的SiRLK35基因酶切后与pCAMBIAI1301P连接构建的植物双元表达载体——pCAMBIAI1301P-SiRLK35。将该载体转入农杆菌LBA4404中，再导入目标植物中，筛选阳性植株。

本发明中所提到的植物包括水稻、小麦、玉米、谷子等受干旱和水渍逆境影响较大的粮食作物，也包括油菜、大豆、棉花等经济作物，还包括夏季生长的黄瓜、番茄等蔬菜作物。

本发明与现有技术相比，具有如下有益效果：

(1)本发明克隆得到谷子SiRLK35基因并研究了该基因的功能，该基因编码蛋白为S型类受体蛋白激酶。基因序列分析显示，SiRLK35包含1989个碱基，含有相对保守的蛋白激酶区，但进化分析显示，其与拟南芥、水稻、玉米、大麦等植物中的SRLKs同源性较低。暗示SiRLK35与SRLKs家族成员功能上具有一定的共性，但同时也具有特异的、独特的功能，并可能在谷子抗旱的过程具有重要作用。

(2)本发明对该基因在逆境中的表达模式进行了分析，结果表明，SiRLK35可以被干旱、盐胁迫、植物激素GA、ABA、MeJA等诱导表达，暗示该基因在植物抗逆和体内信号转导方面发挥一定的作用。

(3)本发明构建了该基因的原核表达载体，验证了该基因可在蛋白水平表达，利用液体培养法绘制转基因菌株在盐处理条件下的生长曲线，同时利用斑点法对该基因进行了初步的功能验证，通过将该基因利用基因工程技术转化水稻并获得相应的转基因植株，对基因在抗逆方面的功能进行了初步验证，对下一步实现对谷子进行有针对性的性状改良，培育谷子抗逆新品种，具有积极的指导作用。

(4)本发明提出可利用转基因SiRLK35来增强植物抗逆性以便用于农作物及蔬菜的抗逆品种选育，由此减缓干旱和水渍逆境对经济作物产量和品质造成的伤害。

附图说明

图1：SiRLK35全长序列PCR扩增的电泳结果，其中，M为Plus DNAMarker，1-5为经PCR扩增获得的SiRLK35目的条带。

图2：荧光定量PCR检测20％PEG处理谷子幼苗后SiRLK35基因的表达模式。

图3：荧光定量PCR检测200mmol/L NaCl处理谷子幼苗后SiRLK35基因的表达模式。

图4：荧光定量PCR检测200mg/L GA处理谷子幼苗后SiRLK35基因的表达模式。

图5：荧光定量PCR检测100μmol/L ABA处理谷子幼苗后SiRLK35基因的表达模式。

图6：荧光定量PCR检测100μmol/L MeJA处理谷子幼苗后SiRLK35基因的表达模式。

图7：SiRLK35基因在原核表达载体中表达蛋白SDS-PAGE电泳结果，其中，M为BlueII Protien Marker 1、2、3分别为含pET-28a-SiRLK35菌株诱导12h后的上清、破碎菌液、沉淀，4、5、6分别为含pET-28a菌株诱导12h后的上清、菌体上清混合物、沉淀。

图8：斑点法检测分别含有pET28a质粒、pET28a-SiRLK35重组质粒的大肠杆菌BL21(DE3)在含有不同浓度NaCl的LB平板培养基上的生长情况；其中，A组为含有pET28a-SiRLK35重组质粒的大肠杆菌BL21；B组为含有pET28a质粒的大肠杆菌BL21。

图9：液体培养法检测分别含有pET28a质粒、pET28a-SiRLK35重组质粒的大肠杆菌BL21(DE3)在盐溶液(250mmol L^-1NaCl的液体LB培养基)中的生长情况。

图10：植物双元表达载体pCAMBIAI1301P-SiRLK35的构建过程示意图。

图11：利用GUS组织染色法，对获得的转基因水稻组织化学鉴定结果，其中CK为对照，T1代表转入SiRLK35基因的转基因水稻，经GUS染色后呈蓝色。

图12：通过PCR分子检测法对转基因水稻的鉴定，其中M为Plus DNAMarker，1为中花11；2-8：目的条带，与预期大小一致，为转基因植株。

图13：SiRLK35转基因水稻抗盐性初步分析，其中，CK为中花11，FK3-2、FK3-4及FK3-7为转基因株系，A：0mmol/L NaCl溶液处理3d，B：100mmol/L NaCl溶液处理3d，C：250mmol/LNaCl溶液处理3d。

图14：100mmol/L NaCl溶液处理3d的生长情况图及局部放大图；其中A为100mmol/L NaCl溶液处理3d的CK中花11、FK3-2、FK3-4及FK3-7生长情况；B-E分别为CK、FK3-2、FK3-4及FK3-7局部放大图。

具体实施方式

下面结合具体试验方法和附图对本发明的技术方案及其所产生的技术效果进行进一步的阐述，下述说明仅是为了解释本发明，但不以任何方式对本发明加以限制，基于本发明教导所作的任何变换或替换，均属于本发明的保护范围。

本发明中所使用的方法如无特殊说明，均为本领域常规方法。下述实施例中所用的试验材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1：谷子中SiRLK35基因的克隆

检索NCBI数据库，根据数据库中提供的序列，以此为基础设计特异引物，以提取谷子RNA为模板，PCR反应体系(20μl)：cDNA：1μl，上、下游引物各0.5μl，dNTP:2μl，HiFi：1μl，10×BufferII：2μl，ddH2O：13μl；PCR反应步骤：94℃5min，94℃30s、53℃30s、72℃1min20s，34个循环，72℃10min；PCR产物电泳检测结果如图1所示。获得一全长为1188bp的SiRLK35基因全长序列(图1)。将PCR得到的序列经T₄连接酶接入pMD18T转化大肠杆菌DH5α，进行测序，序列如SEQ ID No.1所示。生物信息学分析显示，该基因编码392个氨基酸，序列如SEQ IDNo.2所示。属于丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶。

所述特异性引物为：

SiRLK35S11:5’-ACGGTTTATTTGCTTGGA-3’(SEQ ID NO.3)

SiRLK35A1:5’-TCATAAATTTGACTTCATTTCA-3’(SEQ ID NO.4)

实施例2：基因SiRLK35在干旱、盐胁迫及不同激素处理时的表达模式分析

一、基因SiRLK35在干旱、盐胁迫处理时的表达模式分析

1.谷子中RNA的提取

以生长一致的谷子幼苗做如下处理，(1)20％PEG模拟干旱，分别处理0h、6h、12h、24h；(2)200mmol/L NaCl，分别处理0h、6h、12h、24h。每种处理取1g，液氮速冻，于-80℃冰箱保存。

所有试验用具高压灭菌1h，研钵、研棒、药匙烘干，锡箔纸包好于180℃烘箱烘6-8h，备用；

按照Trizol试剂盒提供的方法，取0.1g植物材料于液氮预冷的研钵中，研磨至粉末状，转移到1.5ml离心管中，加1mlTrizol混匀；室温放置5min，4℃，12000rpm离心10min；

取上清，加200μl氯仿，震荡15s，室温放置5min，4℃，12000rpm离心15min；

取上清，加等体积-20℃预冷的异丙醇，混匀，-20摄氏度放置至少30min，4℃，13000rpm离心20min，弃上清；

加入1ml75％乙醇(DEPC水配制)，洗涤沉淀及离心管壁，4℃，13000rpm离心1min，弃上清；

将沉淀晾干，加30-50μl DEPC水至沉淀完全溶解，分光光度计测其浓度，取4ug电泳检测。

2.单链cDNA的获得及表达模式分析：

以生长3周的谷子品种“豫谷1号”总RNA为材料，使用PrimeScript II 1st StrandcDNA Synthesis Kit(TAKARA)试剂盒反转录成单链cDNA，用于之后的荧光定量PCR。

设计荧光定量引物，引物序列为SiRLK35S3:5’-AGAGACTACTTGGTGAAG-3’(SEQ IDNo.5)、SiRLK35A3:5’-TGAGAACAATAGCCTACA-3’(SEQIDNo.6)，以谷子SiActin为内对照，引物序列为SiActin1S1:5’-CTTCCAACCTTCCT TCAT-3’(SEQ ID No.7)、SiActin1A1:5’-GGGCACCTAAATCTCTCTGC-3’(SEQ ID No.8)。反应在ABI PRISM 7900HT(AppliedBiosystems)荧光定量PCR仪上进行，反应体系为：SYBR Green Master(Rox)10μl，上游引物、下游引物各1μl，cDNA1μl，ddH₂O补齐至20μl，反应参数设置如下：95℃10min；95℃10s，60℃20s，72℃20s，40个循环。按照2^-ΔΔCT法计算基因的相对表达量。

20％PEG模拟干旱条件下，处理6h后，SiRLK35基因表达量明显上调至未处理时的41倍，处理12h后，基因表达量下调至未处理时的5倍，并随处理时间的延长，在处理24h后表达量回升(图2)。

200mmol/L NaCl处理时，6h后，基因的表达量较未处理稍有下调，处理12h后，基因表达量上调至未处理的11倍，之后随处理时间的延长，在24h基因表达量下调至未处理时的0.2倍(图3)。以上结果表明SiRLK35基因可被干旱及盐胁迫诱导表达，暗示其在谷子抗旱抗盐过程中具有一定作用。

二、SiRLK35基因在不同激素处理时的表达模式分析

1.谷子中RNA的提取

以生长一致的谷子幼苗做如下处理，(1)200mg/L GA喷洒处理0h、6h、12h、24h；(2)100μmol/L ABA喷洒处理0h、6h、12h、24h；(3)100μmol/L MeJA喷洒处理0h、6h、12h、24h。每种处理取1g，液氮速冻，于-80℃冰箱保存。参照实施例2的一、1的方法分别提取RNA。

2.单链cDNA的获得及表达模式分析：

以谷子SiActin为内对照，分别对经GA、ABA、MeJA处理后SiRLK35基因的表达模式进行分析。具体实验步骤及引物序列参照实施例2的一、2中提供的实验方法。

实验结果显示，200mg/L GA处理时，30min时SiRLK35基因表达量略有上调，在处理2h后基因表达量下调至处理前的0.8倍，6h后基因的表达量与处理2h后的表达量基本持平，之后随处理时间的延长，基因表达量呈持续下降的趋势，处理12h后表达量下调至处理前的0.1倍，处理24h后基因的表达量与处理12h后的表达量基本持平(图4)。

经100μmol/L ABA处理后，SiRLK35基因表达量在处理30min后下调至处理前的0.2倍，处理2h后下调至处理前的0.1倍，6h时基因表达量上调至处理前的2倍，伴随处理时间的延长基因表达量持续上调，处理12h后上调至未处理的8倍，处理24h后基因的表达量回落到未处理时的表达量(图5)。

经100μmol/L MeJA处理后，SiRLK35基因表达量在处理30min后下调至未处理时的0.3倍，2h时持续下调至未处理时的0.2倍，6h后表达量回升至处理前的水平，处理12h后表达量上调至处理前的4倍，之后基因表达量随处理时间的延长而逐渐回落，在处理24h后表达量下调至处理前的0.8倍(图6)。总体结果表明SiRLK35基因不同程度的受GA、ABA、MeJA诱导表达，暗示其在植物体内信号转导方面发挥一定的作用。

实施例3：SiRLK35原核表达载体的构建及鉴定

一、SiRLK35基因原核表达载体的构建

1.以实施例1的SiRLK35全长基因的PCR产物为模板，以SiRLK35S12:5’-GGATCCATGGAAGCCTTCATGGGCATC-3’(下划线显示酶切位点)(SEQ ID NO.9)，SiRLK35A12：5’-GTCGACTAAATTT GACTTCATTTCAGCCAGCTG-3’(下划线显示酶切位点)(SEQ ID NO.10)为引物；

2.PCR反应体系(20μl)：cDNA：1μl，上、下游引物各0.5μl，dNTP：2μl，HiFi：1μl，10×BufferII：2μl，ddH2O：13μl；PCR反应步骤：94℃5min，94℃30s、53℃30s、72℃1min20s，34个循环，72℃10min；得到目的条带；

3.用BamH I/Sal I酶切原核表达载体pET28a及SiRLK35基因片段，纯化回收后，用T₄连接酶于22℃循环泵中连接5min，得到重组质粒pET28a-SiRLK35，转化大肠杆菌DH5α；

4.挑取阳性克隆送到山东省农业科学院生物技术研究中心测序部测序；

5.原核表达载体对大肠杆菌BL21(DE3)的转化：

1)从-70℃冰箱取出感受态细胞置于冰上溶解；

2)取载体pET28a及SiRLK35基因的连接产物10μl加至感受态细胞中，充分混匀，冰上放置30min；

3)42℃热激90s；

4)立即取出放于冰上2min；

5)加入800μl液体LB培养基，37℃，200rpm孵育1h；

6)将菌液涂布在Kna抗性的LB固体平板上，37℃倒置过夜培养。

二、SiRLK35基因的诱导表达、优化及SDS-PAGE电泳：

1.接种100ul经过PCR鉴定并保存的菌液于25ml LB液体培养基中，并加入25μl卡那霉素至终浓度为50mg/L，37℃条件下180rpm摇床培养至OD₆₀₀＝0.6左右；

2.向培养液中加入25ul IPTG至终浓度为0.5mmol/L，25℃、200rpm摇床培养12h，诱导重组蛋白表达；

3.收集菌液经超声波破碎后，5000rpm离心10min，分别取破碎菌液、上清、沉淀，进行12％S SDS-PAGE电泳,经考马斯亮蓝R-250染色后在凝胶成像仪上对电泳结果进行鉴定并拍照(图7)。从图7可以看出，经0.5mmol/L IPTG诱导，可以得到预期大小的44.6kDa蛋白条带。

实施例4：斑点法对SiRLK35基因功能的初步验证

一、分别配置0mol/L、100mol/L、250mol/L、500mol/L和750mol/L不同浓度的的NaCl固体培养基；

二、将分别含有pET28a-SiRLK35和pET28a空载体的BL21菌株于37℃下培养至OD₆₀₀到0.6，加入IPTG至终浓度为0.5mmol/L，25℃条件下180rpm摇床培养12h后，将菌液稀释到10^-3，各吸取10μl点于不同NaCl浓度的LB培养基上，晾干封口；

三、37℃培养箱倒置过夜培养，对菌株在培养板上的生长情况进行拍照(图8)。随着NaCl浓度的提高，含有pET28a-SiRLK35和pET28a空载体的BL21菌株的菌斑都呈减少趋势。但是含有pET28a-SiRLK35的BL21菌株生长情况明显优于含有pET28a空载体的BL21菌株。

实施例5：液体培养法检测含有SiRLK35基因的大肠杆菌的生长情况

一、将分别含有pET28a-SiRLK35和pET28a空载体的BL21菌株活化，加入Kna至终浓度为50mg/ml，同时加入IPTG至终浓度为0.5mmol/L；

二、取1ml活化的菌液加入300ml含有250mmol/L NaCl的液体LB培养基中，加入Kna至终浓度为50mg/ml；37℃，180rpm摇菌；

三、每隔2h取一次菌液，至菌液浓度OD₆₀₀达到2.0左右；

四、紫外分光光度计下测量OD₆₀₀的吸光值，并记录；

五、整理记录结果，绘制菌株生长曲线(图9)。从图9可以看出：含有pET28a-SiRLK35的BL21菌株比含有pET28a空载体的BL21菌株生长速度快，经8h培养后，差值最大，显示含有pET28a-SiRLK35的BL21菌株具有一定的抗盐性。

实施例6：SiRLK35植物双元表达载体的构建

一、SiRLK35植物双元表达载体pCAMBIAI1301P-SiRLK35的构建(图10)

1.pCAMBIAI1301P的构建：

将克隆得到的CAMV35S promoter序列插入到商业化的pCAMBIAI1301载体的多克隆位点EcoR I和Kpn I之间，命名为pCAMBIAI1301P；

2.酶切及连接反应：

(1)酶切反应：将实施例1的pMD18T-SiRLK35重组质粒和pCAMBIAI1301P载体进行双酶切，酶切体系为：重组质粒(载体)10μl，BamH I 3μl，Pst I 3μl，10×Buffer 5μl，加ddH₂O至50μl；37℃酶切30min；

(2)连接反应：回收酶切的SiRLK35片段与pCAMBIAI1301P载体进行连接，反应体系为：SiRLK35片段7μl，pCAMBIAI1301P载体1μl，T₄连接酶1μl，5×Rapid Buffer 4μl，ddH₂O 7μl，共20μl；22℃循环泵连接5min。

二、农杆菌LBA4404感受态的制备

1.划线法挑取农杆菌LBA4404单菌落，接种到含有100μg/ml Rif的LB液体培养基中，220rpm，28℃震荡培养过夜；

2.取1ml活化菌液接种于50ml含有100μg/ml Rif的LB液体培养基，220rpm，28℃震荡培养至OD₆₀₀＝0.5；

3.冰浴30-60min，充分冷却至0℃；

4.置于50ml离心管中，5000rpm，4℃离心5min，弃上清，收集菌体；

5.用10ml预冷的0.15mol/L NaCl重悬菌液；

6.5000rpm，4℃离心5min，弃上清；

7.用1ml 20mmol/L CaCl₂悬浮，分装为100μl/管，液氮冷冻后至-80℃冰箱保存；

8.质粒转化农杆菌LBA4404

(1)将农杆菌感受态细胞从-80冰箱取出后于冰上融化；

(2)吸取10μl质粒加入100μl感受态细胞中，轻轻混匀，冰浴30min；

(3)液氮速冻5min，立即置于37℃水浴锅5min；

(4)加入500μl液体LB培养基，28℃，220rpm，震荡培养3-5h；

(5)取出菌液，涂布于含50μg/ml Kna和100μg/mlRif的LB固体培养板上，28℃倒置培养2-3天。

9.农杆菌阳性克隆的PCR鉴定

(1)用枪头挑取单克隆于50μg/ml Kna和100μg/mlRif的LB液体培养基中，28℃，220rpm摇床培养过夜；

(2)菌液PCR体系：Supermix 10μl，上、下游引物：1μl，菌液1μl，ddH₂O，共20μl；

(3)PCR反应步骤：94℃5min，94℃30s、53℃30s、72℃1min20s，34个循环，72℃10min；

(4)PCR产物琼脂糖凝胶电泳检测。

实施例7：农杆菌介导转化水稻愈伤组织

一、水稻愈伤组织的培养

1.选取成熟饱满的水稻种子，去壳后(此后操作全部在超净工作台中进行)，置于100ml锥形瓶中，70％酒精消毒1min；无菌水冲洗2次，100ml 30％次氯酸钠溶液浸泡20min；用无菌蒸馏水清洗种子5遍，最后一遍浸泡20min；

2.种子放在灭菌滤纸上晾干，将种子种植于诱导培养基中，每皿12-14粒，封口膜封口，置于30℃光照培养箱培养4周；

3.4周后，从培养皿上挑取淡黄色、致密的愈伤组织，置于继代培养基中，在30℃光照培养箱，继代培养2周，获得成熟的愈伤组织。

二、转化及植株的获得

1.将转化成功的农杆菌菌液200μl接种于5ml含50μg/ml Kna和100μg/mlRif的LB液体培养基中，28℃，220rpm摇床培养过夜；

2.取1ml此菌液接种于30ml含50μg/ml Kna和100μg/mlRif的LB液体培养基中，28℃，220rpm摇床培养至OD₆₀₀为0.8-1.0；

3.将菌液转入离心管，4℃，4000rpm，离心5min，去上清，用30ml含200μmol/L乙酰丁香酮(AS)的农杆菌液体培养基悬浮沉淀菌体制成悬浮液。将成熟的愈伤组织放入农杆菌悬浮液中侵染10min；

4.将愈伤组织取出，置于无菌滤纸上晾30-40min，随后将愈伤组织转移至共培养基上，21℃培养3d；

5.取出愈伤组织放入100ml灭菌锥形瓶中，用无菌水清洗6次，并充分震荡。再用含500mg/L羧苄青霉素的无菌水浸泡1h，期间不停摇晃，置于无菌滤纸沥干2h；

6.将晾干的愈伤组织至于含250mg/L羧苄青霉素和30mg/L潮霉素的选择培养基进行筛选，30℃光照培养箱培养14d，筛选2次；

7.选择具有抗性的愈伤组织转移到含200mg/L羧苄青霉素的预分化培养基上，光照培养15d后，转入正常分化培养基中，光照培养至成苗；

8.幼苗长至1cm左右时，转移到生根培养基，1-2周后，移栽于小盆中，光照培养箱炼苗1-2周，移入温室培养。

实施例8：转基因水稻植株的鉴定

一、GUS组织化学染色鉴定

按照GUS:GUS缓冲液＝1:9的比例配制GUS染液，剪取1-1.5cm转基因水稻叶片置于GUS染液中，以中华11为阴性对照，37℃过夜，使用75％酒精脱色至阴性对照为白色，观察染色结果并拍照记录(图11)。其中T1代表转入SiRLK35基因的转基因水稻，经GUS染色后呈蓝色；鉴定结果表明本发明成功获得的转基因水稻。

二、水稻基因组DNA的提取

1.取0.2g新鲜水稻叶片，放入1.5ml EP管中，液氮速冻，用灭菌研磨棒研磨至碎末，加入500μlTPS抽提液；

2.75℃水浴20min，室温12000rpm，离心10min；

3.取200μl上清，加入等体积预冷异丙醇-20℃沉淀至少30min；

4.室温，12000rpm，离心10min；

5.弃上清，75％乙醇洗涤沉淀2次，12000rpm，离心5min；

6.弃上清，干燥沉淀，加入20μl灭菌ddH₂O溶解，-20℃保存。

三、对GUS组织化学染色为阳性植株进一步用PCR方法鉴定

以中花11为对照，并以上述提取基因组DNA作为模板，引物序列为：SiRLK35S11:5’-ACGGTTTATTTGCTTGGA-3’(SEQ ID NO.3)，SiRLK35A1:5’-TCATAAATTTGACTTCATTTCA-3’(SEQ ID NO.4)，PCR反应体系为：引物SiRLK35S11及引物SiRLK35A1各0.5μl、2×EasyTaqSuperMix 10μl、cDNA 1μl、ddH2O补齐到20μl，反应程序设置如下：94℃5min；94℃30s，53℃30s，72℃1min20s，34个循环；72℃10min。克隆出相应大小条带的为转基因株系(图12)。

实施例9：转基因水稻植株功能初步鉴定

一、分别挑选籽粒饱满的T1代水稻种子(编号为FK3-2、FK3-4、FK3-7)及中花11种子于培养皿中，浸泡筛选2-3d后，将萌发的种子移入广口玻璃瓶中，继续培养至三叶期；

二、分别配制0mmol/L、100mmol/L和250mmol/L的NaCl溶液；

三、培养至三叶期时，进行盐胁迫处理，观察比较转基因水稻与中花11在不同浓度盐胁迫下长势，并拍照记录。结果显示，不同浓度的NaCl溶液对转基因水稻植株及对照组水稻植株的生长均产生了不同程度的抑制及损伤，相同NaCl浓度下转基因水稻的生长状态优于对照组水稻。在100mmol/L NaCl处理3d后，对照组水稻植株失水明显，出现了明显的盐害反应，抗倒伏能力下降；而转基因水稻仅有轻微黄化现象，失水不明显，茎部粗壮，植株坚挺，抗倒伏能力优良，其中FK3-2，FK3-4尤为明显(图14)。250mmol/L NaCl处理3d后，转基因水稻植株及对照组水稻植株均受到很大程度损伤，黄化严重，失水明显，整体细弱，但FK3-2，FK3-4状态优于对照组及FK3-7(图13)。

SEQUENCE LISTING

<110> 山东省农业科学院生物技术研究中心

<120> 谷子抗逆基因SiRLK35及编码蛋白与应用

<130>

<160> 10

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1179

<212> DNA

<213> Setaria italica L.Beauv.

<400> 1

atggaagcct tcatgggcat ctttcagatg aatcttctgg gcttgattgg gacacactac 60

aaaattattg agggtatttg ctatggtttg cattatcttc atgagaagtg gcaagctggg 120

acccctatta ttcacatgga tcttaaaccg aagaacatat tgctcgatga caatatggtg 180

ccaaaaattg cagactttgg tttgtcgagg ctctttggtg tcgagcaaac tcaagcttgc 240

actacaagtc agtttggaac aatcggttac atggcgccag aataccgtga caaaggttta 300

atcacaaaaa agttagacat attcagtttg ggtgtgataa tcatagagat aatgacaggg 360

cgaagggact acccagatga gattgaaaca tcatcccagg aatttattga gctcgtgctt 420

aagaattgga gaaatagact agaaaaggca cagagatata catcaggcat ttcccccttt 480

ccttcttccc acagagaaat tgattaccta caaataagaa gatgcattca gattggtcta 540

gcttgcgtga aacatgatct ggcgaaaagg ccaacagcac tcaaaattat gaacatgctt 600

catggattgg aaggtccaga agaggaggta agagctggtt cagctagaag aattgatcca 660

actaagcggc atcgagattg tctgcttgag gtcgatgaca gtgaacctag aagtttaatg 720

ttggacgata tgaagtctaa agtagcaaag ttgacagaaa aaggtggact cctgaatgca 780

gaagcaattg agaagctagt acatcttctg caacttgatc aaactgagga aaagatggat 840

gtttctgatc gggttaaact tgctgatgtt attgctgcta cagaaaatcc tgtttggtta 900

gacagacttg ttcaatcaag gggccttttg gtgttaaata gttgggtaga cgaggctcac 960

caaaaagaag ctgataagcc tatgcaggaa cttctccttg ccctgcttcg tgccctagct 1020

atattgccta tcaatctcag tgcattgcaa agctgtagta ttgggaaatc tgtcaatcat 1080

ctgcgtagcc atagaaattt ggagattcag aagaaggcta agagtcttgt tgaggattgg 1140

aagagacgtg tggatactga aatgaagtca aatttatga 1179

<210> 2

<211> 392

<212> PRT

<213> Setaria italica L.Beauv.

<400> 2

Met Glu Ala Phe Met Gly Ile Phe Gln Met Asn Leu Leu Gly Leu Ile

1 5 10 15

Gly Thr His Tyr Lys Ile Ile Glu Gly Ile Cys Tyr Gly Leu His Tyr

20 25 30

Leu His Glu Lys Trp Gln Ala Gly Thr Pro Ile Ile His Met Asp Leu

35 40 45

Lys Pro Lys Asn Ile Leu Leu Asp Asp Asn Met Val Pro Lys Ile Ala

50 55 60

Asp Phe Gly Leu Ser Arg Leu Phe Gly Val Glu Gln Thr Gln Ala Cys

65 70 75 80

Thr Thr Ser Gln Phe Gly Thr Ile Gly Tyr Met Ala Pro Glu Tyr Arg

85 90 95

Asp Lys Gly Leu Ile Thr Lys Lys Leu Asp Ile Phe Ser Leu Gly Val

100 105 110

Ile Ile Ile Glu Ile Met Thr Gly Arg Arg Asp Tyr Pro Asp Glu Ile

115 120 125

Glu Thr Ser Ser Gln Glu Phe Ile Glu Leu Val Leu Lys Asn Trp Arg

130 135 140

Asn Arg Leu Glu Lys Ala Gln Arg Tyr Thr Ser Gly Ile Ser Pro Phe

145 150 155 160

Pro Ser Ser His Arg Glu Ile Asp Tyr Leu Gln Ile Arg Arg Cys Ile

165 170 175

Gln Ile Gly Leu Ala Cys Val Lys His Asp Leu Ala Lys Arg Pro Thr

180 185 190

Ala Leu Lys Ile Met Asn Met Leu His Gly Leu Glu Gly Pro Glu Glu

195 200 205

Glu Val Arg Ala Gly Ser Ala Arg Arg Ile Asp Pro Thr Lys Arg His

210 215 220

Arg Asp Cys Leu Leu Glu Val Asp Asp Ser Glu Pro Arg Ser Leu Met

225 230 235 240

Leu Asp Asp Met Lys Ser Lys Val Ala Lys Leu Thr Glu Lys Gly Gly

245 250 255

Leu Leu Asn Ala Glu Ala Ile Glu Lys Leu Val His Leu Leu Gln Leu

260 265 270

Asp Gln Thr Glu Glu Lys Met Asp Val Ser Asp Arg Val Lys Leu Ala

275 280 285

Asp Val Ile Ala Ala Thr Glu Asn Pro Val Trp Leu Asp Arg Leu Val

290 295 300

Gln Ser Arg Gly Leu Leu Val Leu Asn Ser Trp Val Asp Glu Ala His

305 310 315 320

Gln Lys Glu Ala Asp Lys Pro Met Gln Glu Leu Leu Leu Ala Leu Leu

325 330 335

Arg Ala Leu Ala Ile Leu Pro Ile Asn Leu Ser Ala Leu Gln Ser Cys

340 345 350

Ser Ile Gly Lys Ser Val Asn His Leu Arg Ser His Arg Asn Leu Glu

355 360 365

Ile Gln Lys Lys Ala Lys Ser Leu Val Glu Asp Trp Lys Arg Arg Val

370 375 380

Asp Thr Glu Met Lys Ser Asn Leu

385 390

<210> 3

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

acggtttatt tgcttgga 18

<210> 4

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

tcataaattt gacttcattt ca 22

<210> 5

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

agagactact tggtgaag 18

<210> 6

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

tgagaacaat agcctaca 18

<210> 7

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

cttccaacct tccttcat 18

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

gggcacctaa atctctctgc 20

<210> 9

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

ggatccatgg aagccttcat gggcatc 27

<210> 10

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

gtcgactaaa tttgacttca tttcagccag ctg 33

Claims

1.谷子抗逆基因SiRLK35，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

2.一种权利要求1所述的谷子抗逆基因SiRLK35编码的蛋白质，其序列为SEQ ID NO.2所示。

3.权利要求1所述的谷子抗逆基因SiRLK35在提高作物的抗旱方面的应用。

4.权利要求1所述的谷子抗逆基因SiRLK35在提高作物的耐盐方面的应用。

5.克隆权利要求1所述的谷子抗逆基因SiRLK35的方法，其特征是，提取谷子RNA，反转录获得单链cDNA，以单链cDNA为模板，用序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示特异引物，通过PCR获得基因SiRLK35的全长序列。

6.一种含有权利要求1所述的谷子抗逆基因SiRLK35的表达载体。

7.如权利要求6所述的表达载体，其特征是，所述表达载体为重组原核表达载体pET28a-SiRLK35。

8.如权利要求6所述的表达载体，其特征是，所述表达载体为植物双元表达载体pCAMBIA1301P-SiRLK35；所述pCAMBIA1301P是将CAMV 35S promoter序列插入到pCAMBIA1301载体的多克隆位点EcoR I和Kpn I之间，改造得到的植物表达载体。

9.一种谷子抗逆基因SiRLK35在植物抗逆育种中的应用，其特征是，将权利要求8的植物双元表达载体pCAMBIA1301P-SiRLK352借助于基因工程手段介导作物遗传转化，获得转基因植株。